Extracción del ADN:

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar, tiene que romperse la membrana
plasmática para poder acceder al núcleo de la célula, y posteriormente romperse también la membrana nuclear
para dejar libre el ADN. Además de proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo.
La lisis de las células se consigue mediante la adición de tampones con concentraciones elevadas de iones que
ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas y que forman parte de su
estructura celular. La adición de un detergente como el SDS (Dodecil Sultato Sódico) es necesaria a menudo
para eliminar las membranas. Generalmente, el ADN se encuentra asociado a proteínas, por lo que se suele
añadir proteasas al tampón de extracción, a la vez que usamos el acetato (amónico o sódico) para precipitar
dichas proteínas.
El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar con etanol frío o isopropanol y recuperar
mediante un proceso de centrifugación. El sedimento o pellet resultante se puede re-suspender posteriormente
en agua o tampón tras ser secado completamente. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo
mediante electroforesis en un gel de agarosa y que posteriormente se tiñe con Gel Red o Midori Green y
observación con luz UV. También se puede detectar directamente al espectrofotómetro mediante espectro de
absorción de 200 a 350nm. El ADN purificado se cuantifica con un espectrofotómetro midiendo la absorbancia
a 260nm de longitud de onda. O midiendo directamente las concentraciones en un Nanodrop.
La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las
características fisicoquímicas de la molécula.
Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura
helicoidal. Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga
neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. Tienen una
fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y
formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y
quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que
reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite. Por otro lado,
la carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente.
PCR:
Son pruebas de reacción en cadena de la polimerasa, que son una forma rápida y precisa de diagnosticar ciertas
enfermedades infecciosas y cambios genéticos. Estas detectan el ADN o ARN de un patógeno o células
anormales en una muestra. Las de PCR pueden encontrar signos de una enfermedad en las fases más tempranas
de la infección.
¿Cómo se usan?
Las pruebas de PCR se usan para:
Diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas
Identificar un cambio genético que puede causar una enfermedad
Encontrar cantidades pequeñas de células cancerosas que podrían pasar desapercibidas en otros tipos de
pruebas.
PCR convencional:
Consta de un ADN específico, un conjunto de cebadores oligonucleótidos sintéticos que flaquean la secuencia
de ADN específico, una ADN polimerasa termoestable (normalmente una polimerasa Taq) y nucleótidos.
PCR en tiempo real:
Es una modalidad del PCR de punto final, donde la acumulación de ADN amplificado es detectado y
cuantificado a medida que la reacción avanza, es decir: “En tiempo real” esto se logra incorporando una
molécula fluorescente que se asocia al ADN amplificado, donde el incremento de esta fluorescencia es la
proporcional al incremento de la cantidad de moléculas de ADN amplificadas en la reacción.
La gran ventaja de esta técnica es la flexibilidad en su diseño operativo ya que permite la detección cualitativa o
cuantitativa del ácido nucleico dependiendo del propósito por lo cual la prueba es solicitada.
En comparación a los otros métodos de aislamiento de virus, esta es bastante rápida y tiene menos posibilidades
de contaminación o error.
Las ventajas de la PCR en tiempo real incluyen:
Capacidad para monitorear el progreso de los ciclos individuales de amplificación, a medida que ocurren
en tiempo real.
Capacidad para medir con precisión la cantidad de amplicón en cada ciclo, en comparación con un
estándar de dilución conocido, lo que permite una cuantificación altamente precisa de la cantidad de
material de partida en las muestras.
Un mayor rango dinámico de detección.
La amplificación y la detección se realizan en un solo tubo, lo que elimina las manipulaciones
posteriores a la PCR.
Etapas:
1- Desnaturalización: La incubación a alta temperatura se utiliza para “separar” dsDNA en hebras simples
y aflojar la estructura secundaria en el DNA monocatenario (ssDNA). La temperatura más alta que
puede soportar la DNA polimerasa sin perder fidelidad suele ser de alrededor de 95 °C.
2- Alineamiento (hibridación): Durante el alineamiento, las secuencias complementarias tienen la
oportunidad de hibridar, por lo que se usa una temperatura apropiada basada en la temperatura de fusión
(Tm) del iniciador.
3- Extensión: La actividad de la DNA polimerasa es óptima a 70-72 °C, y la extensión del iniciador se
produce a velocidades de hasta 100 bases por segundo. Cuando un amplicón es pequeño, este paso a
menudo se combina con el paso de alineamiento, aplicando una temperatura de 60 °C.