HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTO Y MTODOS DE ENSAYO

ALUMNA: DIANA CAMACHO PLASCENCIA.

La hibridacin est basada en proceso de renaturalizacin de dos cadenas sencillas de un DNA, que se observa por ejemplo, al enfriar lentamente una solucin del DNA dplex previamente desnaturalizada por calor.

DESNATURALIZACIN Y RENATURALIZACIN DEL DNA

Al igual que las protenas, los cidos nucleicos se desnaturalizan por efecto de agentes qumicos o fsicos, perdiendo su conformacin tridimensional en especial la forma duplohelicoidal del DNA.

La desnaturalizacin se debe tanto a la rotura de los puentes de hidrogeno entre pares de base como las interacciones hidrofbicas entre bases apiladas. Al desnaturalizarse la dos hebras del DNA se separan y pasan a una conformacin al azar (o de ovillo aleatorio), sin que se altera la estructura primaria, pues no hay rotura de enlaces covalentes.

Agentes desnaturalizantes

Estos debilitan las interacciones por puentes de hidrogeno y/o de apilamiento de bases, conduciendo a un mismo proceso de desnaturalizacin y de separacin de las hebras.

DESNATURALIZACIN Y RENATURALIZACIN POR EFECTO DE LA TEMPERATURA.

El proceso de desnaturalizacin se emplea para el estudio de la estructura del DNA, mientras que la renaturalizacin es til como base de las tcnicas de hibridacin.

Desnaturalizacin por cidos y bases

El apareamiento de las bases disminuye o se debilita por valores de pH alejados de la neutralidad con la consiguiente desnaturalizacin del DNA. Sin embargo, un medio acido puede conducir tambin a la rotura de la estructura primaria de los cidos nucleicos. Por ello, para la desnaturalizacin del DNA es ms habitual usar condiciones alcalinas

Desnaturalizacin por agentes qumicos

Algunos de los compuestos empleados con frecuencia para desnaturalizar el DNA son molculas sencillas altamente polares, con grupos amino y carbonilo. Estos les permiten competir en la formacin de enlaces de hidrogeno con los grupos amino y carbonilo.

Influencia de la desnaturalizacin sobre las propiedades del DNA: La desnaturalizacin del DNA se puede seguir fcilmente midiendo aquellas propiedades fsicas que permiten diferenciar el DNA de doble hebra y de hebra sencilla.

Varias de ellas experimentan profundos cambios durante el proceso: Las mas utilizadas son la absorcin en el ultra violeta( a 260 nm ) y la viscocidad.

Influencia sobre la viscosidad

Influencia sobre la absorcin ultravioleta

Significado practico de las curvas de desnaturalizacin

ANLISIS MOLECULAR DE LA HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS

La renaturalizacin depende solo de la complementariedad de secuencias de las hebras. Por ello, aunque lo mas probable es que estas se reasocien formando las mismas parejas o dplex originales, pueden darse otras reasociaciones.

Al renaturalizar se producir la asociacin parcial de dos hebras procedentes de molculas dplex distintas. Se forman as DNAs hbridos de doble hebra, con regiones de apareamiento y de no apareamiento. Esta formacin de molculas dplex de DNA cuyas hebras tienen distinto origen (distante especie o, en general, distinto acido nucleico) reciben nombre de hibridacin.

El hecho de que cadenas diferentes de cidos nucleicos hibriden entre s indican que los organismos en donde proceden comparten un cierto grado de herencia evolutiva comn, y que sus RNAs y protenas tienen estructuras y funciones similares (secuencias homologas).

Las estabilidad del hibrido es tanto mayor cuanto ms elevado sea la proporcin de bases complementarias y mayor la longitud de las secuencias apareadas.

Principio bsico del ensayo de hibridacin

Todos los ensayos bsicos de hibridacin se basan en la gran especificidad de la interaccin ente bases complementarias. Requiere dos elementos bsicos: 1. La presencia de la secuencia diana en uno de los fragmentos. 2. Un fragmento corto de acido nucleico, llamado sonda, de secuencia conocida y complementaria ala secuencia diana marcado de forma que permita su deteccin (radioactivo, coloreado ,fluorescente)

Influencia de algunos factores sobre la hibridacin

Existe una serie de parmetros que afectan a la posibilidad de renaturalizacin de dos hebras sencillas y, por tanto, condicionan experimentalmente la realizacin de un ensayo de hibridacin Factores: La concentracin y tamao de la sonda La temperatura y tiempo de hibridacin Las caractersticas del medio de reaccin (fuerza inica, pH, concentracin de agentes desnaturalizantes, adicin de ciertos polmeros etc.)

Rigor de la hibridacin
Se define el rigor (en ingles, stringency) como el grado de especificidad en el apareamiento conseguido en los hbridos; es decir supone una medida de la capacidad de reconocimiento mutuo de dos secuencias. El rigor depende de diversos factores: Temperatura y tiempo de renaturalizacin Longitud y concentracin de las cadenas, composicin de bases y ambiente qumico ( presencia de cationes, formamida, urea, pH, tipo de disolucin, etc..)

MTODOS DE ENSAYO DE HIBRIDACIN

Hibridacin en fase liquida

Hibridacin en soporte solido

Hibridacion dot-blot y eslotblot

Hibridacin de southern

Hibridacin Northern

Transferencia Western

Gracias..