EXTRACCIÓN Y EVALUACIÓN CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DEL ADN

DE UN HÍGADO DE POLLO
Luis E. Sierra E.1, Wanda C. Lucena V.1 Robersis M. Ferrer., G.1
1Departamento de Biología. Facultad de Ciencias experimentales y Tecnología.
Universidad de Carabobo. Valencia. Venezuela.
luisierra99@hotmail.com, wandalucenav@gmail.com, andreina9775@hotmail.com

Resumen. El ADN (ácido desoxirribonucleico) es un polímero de nucleótidos cuya

unión covalente resulta de un enlace fosfodiéster. Los nucleótidos por su parte
contienen una pentosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada que puede ser una
pirimidina o una purina. En el presente trabajo se extrajo ADN del hígado de un pollo
de “Pollo de Broiler” siguiendo un protocolo de extracción simple con el uso de
cloroformo-fenol y centrifugación. También se cuantificó el contenido del mismo en el
hígado por espectrofotometría obteniendo 0,084 mg/g de ADN por gramo de hígado,
una cantidad de células de 91,456x106 cel/g por gramos de hígado, además de un peso
aproximado de 1,093x10-8 g para una célula hepática de pollo. Asimismo, se determinó
la presencia de grupos fosfatos y desoxirribosa llevando a cabo las pruebas cualitativas
de molibdato de amonio y Bial respectivamente con las cuales se confirmó la presencia
de dichos compuestos. A su vez, no se pudo evidenciar el efecto hipercrómico en el
ADN debido a la posibilidad de una renaturalización.
Palabras clave: pentosa, espectrofotometría, base nitrogenada, fosfato, centrifugación,
Bial.
1. Introducción
Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos que están unidos por enlaces
fosfodiéster, donde cada nucleótido está compuesto por una base nitrogenada, una
pentosa y un grupo fosfato (Lehninger et al, 2013). Existen además dos tipos de ácidos
nucleicos, el ácido ribonucleico (ARN) que contiene ribosa y el desoxirribonucleico que
contiene desoxirribosa (ADN). El ADN funciona como almacén de la información
genética y en él está codificada la información necesaria para la síntesis de proteínas
(Voet et al, 2016). Asimismo, los constituyentes de los ácidos nucleicos tienen
determinadas propiedades, tales como la insolubilidad y la capacidad de absorber la luz
de las bases y la característica hidrofílica de los residuos de azúcar por sus grupos
hidroxilo y de los grupos fosfatos por su carga negativa (Lehninger et al, 2013).
En cuanto al proceso de aislamiento del ADN de un hígado, es necesaria la
homogeneización de los tejidos y lisis de las membranas celulares, la separación de
lípidos y proteínas empleando solventes y sales tanto como la precipitación del ácido
nucleico mediante el uso de etanol y NaCl, además todas las muestras deben ser
manejadas con cuidado, independientemente del método de extracción de ADN
empleado para evitar la contaminación de la muestra (Butler, 2012). Por su parte, para
la determinación de la cantidad del ácido nucleico se puede realizar una medición de la
absorción de luz por espectrofotometría a 260 nm ya que a esa longitud de onda las
bases nitrogenadas muestran una absorción máxima. Mientras tanto que la medición de
la misma muestra de ADN a 280 nm se utiliza para proporcionar la absorbancia de
proteínas en la muestra lo cual facilita la determinación de la pureza del ADN extraído
al realizar el cociente A260/A280, cuyo rango aceptado como puro se encuentra entre
1,8 a 2,0 (Olson et al, 2012).
Por otro lado, la caracterización de los componentes del ADN incluye
procedimientos colorimétricos, como la reacción del fosfomolibdato de amonio en la
cual se determina la presencia de los grupos fosfatos en la muestra de ADN mediante
una reacción de oxidación entre el molibdato de amonio y los grupos fosfatos que forma
un precipitado amarillo (Talarico et al, 2015). Ahora bien, la evaluación de la presencia
de desoxirribosa (una pentosa) puede efectuarse a través de la prueba de Bial llevándose
a cabo una reacción de deshidratación que da lugar a un compuesto coloreado verde-
azul, cuya coloración es indicativa indicador positivo de la presencia de pentosas
(Elzagheid, 2018).
En lo que respecta al efecto hipercrómico en el ADN, este se relaciona al aumento
de la absorción cuando se produce la desnaturalización del ADN pasando al estado de
hélice sencilla, esta evaluación se puede realizar comparando la absorbancia del ácido
nucleico no desnaturalizado y el desnaturalizado mediante espectrofotometría (Devlin,
2004). Asimismo la desnaturalización puede producirse por calentamiento provocando
la ruptura de enlaces y separación de ambas hélices (Nwokeoji et al, 2017). Finalmente
el propósito de este trabajo consistió en el aislamiento, cuantificación y la aplicación de
pruebas cualitativas a una muestra de ADN proveniente del hígado de un pollo de marca
“Pollo de Broiler”.
2. Materiales y métodos
2.1 Extracción del ADN.
El ADN se extrajo del hígado de un pollo de “Pollo de Broiler” cuyo lavado se
realizó con el uso de una solución de NaCl al 0,9%. Una vez lavado se le retiró el
exceso de líquido usando papel filtro y se peso en una balanza analitica (OHAUS
ADVENTURER). Posteriormente para la homogeneización del tejido, se empezó con la
maceración del hígado en un mortero cortándolo previamente en trozos finos. Luego de
macerarlo se le agregó 10 mL de buffer TES y se colocó por porciones en un
homogeneizador de tejidos realizando 8 pases con el émbolo de teflón.
El homogenato obtenido se filtró con el uso de gasa y se le agregó de nuevo TES
hasta completar un volumen de 50 mL tomando de esta solución 9 mL que se
adicionaron en un tubo de centrífuga con 3 mL de sacarosa 0,2 M de manera que
quedara una interfase para la formación del gradiente de densidad, una vez hecho esto
se procedió a centrifugarlo en un centrifugadora (DIGISYSTEM DSC100SD) a 3000
rpm por 10 minutos descartando el sobrenadante y conservando el precipitado. El
mismo se resuspendió en 4 mL de buffer TES y se le agregó 1 mL de SDS al 10% antes
de agregarle 7 mL de mezcla de cloroformo-fenol, para luego agitarlo en un vortex
(THERMO SLV-G) y posteriormente centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm.
Pasado el tiempo centrifugación mencionado, se extrajo la fase acuosa resultante, se
repitió el proceso de extracción con cloroformo-fenol centrifugando de la misma forma
y se volvió a extraer el sobrenadante, al cual se le agregó 2 ½ volúmenes de etanol frío.
Después de eso el material de fibroso de ADN se retiró con una pipeta pasteur y se
disolvió en 6 mL de NaCl 0,9% con la ayuda del vortex. A esta solución se le
denominó “ADN concentrado”.
2.2 Hipercromicidad del ADN.
A partir de la solución concentrada de ADN, se realizó una dilución ⅙ al adicionar
1,0 mL de esta sobre 5,0 mL de una solución de cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% m/V
presente en un tubo de ensayo, seguidamente se trasvasó 1 mL de la solución diluida a
un celda para así determinar la absorbancia de la muestra de ADN bajo 260 nm como
280 nm mediante un espectrofotómetro (FISHER SCIENTIFIC GENESYS 10UV).
Posteriormente, se trasvasaron 3 mL de la solución preparada de ADN (⅙) a un tubo de
ensayo, el cual fue cubierto con parafilm, seguidamente se sometió a la muestra diluida
a un baño térmico hirviente durante 15 minutos mediante una plancha calefactora
(CORNING PC-400D), al enfriar la muestra de ADN, se determinó nuevamente la
absorbancia bajo 260 nm como 280 nm a través del espectrofotómetro inicialmente
empleado.
2.3 Determinación colorimétrica de fosfatos en el ADN.
Bajo un tubo de ensayo, se adicionaron tanto 0,5 mL de la solución diluida de ADN
(⅙) como 1,0 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) al 30% v/v para posteriormente calentar
el tubo en un mechero de Bunsen, al oscurecerse la muestra se adicionaron 5 gotas de
perhidrol y se mantuvo el tratamiento térmico hasta que la solución se tornó incolora,
bajo este punto, se añadió 1,0 mL de una solución de molibdato de amonio al 2,5%
m/v, finalmente, se observó la coloración característica de la prueba cualitativa.
2.4 Determinación cualitativa de desoxirribosa en el ADN.
Se determinó la presencia de desoxirribosa utilizando la reacción de Bial, a partir de
un tubo de ensayo donde se trasvasaron 0,5 mL de la solución concentrada previamente
extraída de ADN para posteriormente adicionar 2,5 mL del reactivo de Bial, el cual fue
seguidamente sometido a un baño de agua hirviente con el uso de una plancha
calefactora (CORNING PC-400D) durante 10 minutos para observar la presencia de la
coloración correspondiente a la prueba.
3. Resultados
3.1 Cuantificación del ADN presente en el hígado.
El hígado utilizado tuvo un peso de 23,1124 g de los cuales se utilizó 19,8000 g y
una vez se homogeneizó con el homogeneizador de tejidos el volumen de homogenato
obtenido después de filtrar fue de 16 mL. Luego del procedimiento para la extracción, el
material fibroso de ADN se observó como una hebra fina e incolora cuyo valor de
absorbancia a 260 nm después de diluir el ADN concentrado resultó de 1,001. A partir
de este valor de absorbancia se determinó el contenido de ADN por gramo de hígado, el
número de células por gramo de hígado y peso de una célula hepática del pollo utilizado
obteniendo los resultados expresados en la tabla I a continuación.
Tabla I. Contenido de ADN, número de células máximo por g y peso aproximado de una célula
hepática del hígado de pollo.
 Número de células por
Contenido de Peso de una célula
Parámetros gramo de hígado
ADN (mg/g) hepática (g)
(cel/g)

Hígado de pollo 0,084 91,456x106 1,093x10-8

3.2 Evaluación del carácter hipercrómico del ADN.

A partir de la muestra diluida de ADN (⅙), se midió la absorbancia en longitudes de
onda de tanto 260 nm como 280 nm, cuyos resultados fueron de 1,001 como 0,560
respectivamente, por lo que el índice de pureza del ADN en la muestra es de 1,79 (Tabla
II), de igual manera, se midió nuevamente la absorbancia de la muestra después de
haber sido esta calentada durante 15 minutos, donde se obtuvo un valor de 0,787 a 260
nm, mientras que la magnitud obtenido a 280 nm fue de 0,452.
Tabla II. Absorbancias medidas sobre la muestra diluida de ADN antes y después de calentar.

Longitud de onda Después de

Antes de calentar
(nm) calentar

260 1,001 0,787

280 0,560 0,452

3.3 Prueba colorimétrica para la determinación de fosfatos.

Bajo la adición de la solución de ácido sulfúrico sobre la muestra diluida de ADN,
se observó una transitoria coloración grisácea al calentar la muestra hasta la adición de
cinco gotas de perhidrol, donde la solución se tornó incolora, posteriormente al
adicionar la solución de molibdato de amonio, rápidamente se observó un precipitado
amarillo en la muestra (Figura 1), producto de la reacción entre los grupos fosfato del
esqueleto del ADN y la sal de amonio, tal como se describe en la siguiente ecuación:
 Figura 1. Coloración observada en la muestra diluida de ADN bajo la prueba de fosfato.

3.4 Determinación cualitativa de desoxirribosa en el ADN.

Bajo el tubo de ensayo con una muestra concentrada de ADN, al adicionar el reactivo de
Bial, no se observó ningún cambio en la coloración, no obstante, una vez se colocada la
muestra en el baño de agua hirviente, en el transcurso de los 10 minutos, se evidenció
un cambio de coloración en la solución a un marrón oscuro (Figura 2). Esta coloración
resulta de tanto la deshidratación de la desoxirribosa del esqueleto del ADN como la
reacción de su producto con el orcinol, tal como se describe en las siguientes
ecuaciones:
 Figura 2. Coloración observada en la muestra concentrada de ADN bajo la prueba de Bial.

4. Discusión
4.1 Cuantificación de ADN
La homogeneización de los tejidos es necesaria para rotura de las uniones entre las
células de modo que se facilite la interacción con las soluciones de lisis, las cuales
destruyen estructuras formadas por lípidos y proteínas de forma que se facilite la
liberación de los ácidos nucleicos del núcleo celular, mientras tanto la lisis se puede
llevar a cabo mediante una solución salina o detergentes (Alejos et al, 2015).
Por su parte las proteínas, los lípidos, los carbohidratos y los residuos celulares se
separan del ADN con el uso de solventes orgánicos como una mezcla de cloroformo-
fenol y centrifugación debido a que al agregar esta mezcla se forman dos fases que
permiten dicha separación; la capa inferior constituye la fase orgánica en donde
permanecen los componentes celulares mientras la capa superior constituye la fase
acuosa con ADN (Tan et al, 2013). Asimismo, el etanol y una alta concentración de sal
como NaCl son agregados para precipitar el ADN del sobrenadante, ya que el sodio de
la neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos causando la disminución de la
solubilidad del ADN (Buckingham, 2011).
Con respecto a la cuantificación, tomando en cuenta que 50 µg de ADN por mL
equivalen a 1 unidad de absorbancia a 260 nm se pudo obtener un contenido de 0,084
mg/g de ADN por gramo de hígado de pollo, comparativamente, en el trabajo de
Medidi et al (2015) se encontró que el contenido de ADN en el hígado de pollo es de
300 ng/µL una cantidad que contrasta con los 33,366 ng/µL de ADN al expresar la
cantidad obtenida en las mismas unidades. Una de las posibles razones por la cual se
observó tal diferencia puede estar dada al hecho de que el método de extracción
utilizado por Medidi et al (2015) tuvo un mayor proceso de purificación que incluyó el
uso de enzimas, además para la cuantificación fue utilizado Picogreen, un colorante
fluorescente que es 10,000 veces más sensible que los métodos de absorbancia UV e
incluso es altamente selectivo para dsDNA sobre DNA y RNA (Brescia et al, 2015).
4.2 Pureza y carácter hipercrómico del ADN extraído.
 Todas las moléculas tienen la capacidad de absorber y dispersar luz en un mayor o
menor grado de acuerdo a su estructura y la longitud de onda de la radiación (Shukla et
al, 2017) el ADN no es una excepción a esto, el cual presenta un pico de absorbancia a
los 260 nm a de acuerdo a su estructura primaria y secundaria (Pachchigar et al, 2016),
no obstante, al eliminarse la regular conformación helicoidal de esta macromolécula (su
estructura secundaria), esta absorbe luz ultravioleta con una mayor intensidad, por lo
que el ADN presenta un carácter hipercrómico, esto es, absorbe un mayor grado de luz
UV cuando es desnaturalizada que cuando se encuentra en dúplex. Gran parte de la
naturaleza de este proceso es desconocida (D’Abramo et al, 2013), no obstante, resulta
evidente ante los innumerables experimentos realizados que la hipercromicidad se debe
a la existencia de los enlaces de hidrógeno presentes bajo bases complementarias, los
cuales limitan la resonancia electrónica de tales anillos aromáticos (Ackerman et al,
2016), que en última instancia, disminuye la absorbancia de luz ultravioleta en el
dúplex.
A pesar de esto, al evaluar la hipercromicidad del ADN extraído, no se observó el
esperado aumento en la absorbancia al desnaturalizar térmicamente la muestra diluida,
más aún, esta presentó un fuerte carácter hipocrómico (Nwokeoji et al, 2017) de
acuerdo a las considerables disminuciones en las absorbancias medidas en 260 nm y
280 nm, después del calentamiento (Tabla II). Los resultados obtenidos son indicativos
de una significativa disminución en la concentración de ADN presente en la muestra
antes y después del tratamiento térmico, por lo que esta diferencia con respecto a lo
esperado teóricamente es atribuida a algún error experimental en la ejecución de la
experiencia.
Por otra parte, a través de la espectrofotometría, es posible obtener un índice de la
pureza del ADN extraído a partir de la medición de la absorbancia tanto a 260 nm como
a 280 nm (Solano-Flórez et al, 2009), de acuerdo a que el ADN tal como se mencionó
anteriormente, presenta un pico de absorbancia a 260 nm, mientras que las proteínas en
general presentan un pico de absorbancia a los 280 nm (Porterfield et al, 2010), por lo
que el cociente entre ambos valores medidos permite determinar la pureza de la muestra
de ADN con respecto a los proteínas nucleares, cuyo valor calculado de 1,79 es
indicativo de que la muestra extraída de ADN presentaba una alta pureza frente a la
posible presencia de proteínas nucleares en solución (Olson et al, 2012).
Por otro lado, entre las numerosas pruebas colorimétricas que permiten determinar
la presencia de grupos fosfato en solución (Pradhan et al, 2013), una variante del
método de PHB (fosfomolibdeno azul) constituye la vía más empleada para esta
determinación, de acuerdo a su rápido y relativamente económico uso (Talarico et al,
2015), la cual se fundamenta en la reacción de oxidación entre el molibdato de amonio y
los grupos fosfatos de la sustancia en estudio, dando lugar al ácido fosfomolibdico
(Zaruba et al, 2015), el cual se disocia rápidamente en fosfomolibdato de amonio, un
precipitado amarillo, el cual se observó al someter una muestra diluida de ADN a la
prueba descrita (Figura 2).
Lo anterior, se debe al propio esqueleto covalente de esta macromolécula, el cual es
tan extenso que son necesarias proteínas especiales que empaqueten tal estructura
(Harrison et al, 2013), compuesta por unidades alternantes de tanto desoxirribosa como
de fosfato, unidas covalentemente a través de enlaces fosfodiéster (Travers et al, 2015),
ante esto, la coloración observada es indicativa de la presencia del ADN en la muestra,
esto puede ser constatado aún más, debido a que la intensidad de coloración amarilla de
la prueba depende de la concentración de fosfato presente (Adelowo et al, 2016), por lo
que abundantes proporciones de esta molécula inorgánica ocasionarán coloraciones
intensas bajo la muestra, tal como la observada, de acuerdo con la abundante presencia
de grupos fosforilo bajo el ácido nucleico extraído.
A pesar de que existen varias alternativas para determinar la presencia de pentosas
en solución (Le et al, 2016), generalmente solo se emplea uno de ellas de acuerdo a
cuán fácil es de aplicar, esta es la prueba de Bial, la cual se fundamenta en la reacción
de deshidratación entre las pentosas y un ácido fuerte como el HCl, cuyo producto es el
furfural o en su defecto, alguno de sus derivados, el cual rápidamente reacciona ante el
otro componente del reactivo de Bial, el orcinol, bajo nuevamente una reacción de
deshidratación para dar lugar a un complejo aromático verde-azul (Hu et al, 2017). La
reacción de Bial solo tiene lugar ante pentosas libres en solución por lo que la estructura
primaria del ADN debe ser hidrolizada antes de que las unidades de desoxirribosa sean
deshidratadas, esto es posible de acuerdo a la composición del reactivo de Bial, la cual
permite la despurinación de las bases nitrogenadas tanto como la hidrólisis de los
enlaces fosfodiéster de la estructura primaria (Patterson et al, 2013), esta última
mediada a través del ácido clorhídrico, lo que habilita el desarrollo de la reacción de
Bial cuyo resultado es la formación de un complejo verde-azul.
De acuerdo a numerosos ensayos empíricos (Makwana et al, 2013);(Kasthuri et al,
2019), esta coloración debe observarse al someter la muestra concentrada de ADN al
ensayo de Bial, de acuerdo a la extensa alternancia de unidades de tanto desoxirribosa
como de los grupos fosfato que las unifican (Frank-Kamenetskii et al, 2014), no
obstante, esta no se observó bajo la muestra evaluada ante la coloración marrón
presentada (Figura 2), lo cual puede atribuirse a la contaminación del reactivo de Bial
empleado, debido a la posibilidad de que cambios en la composición química,
resultantes de la reacción de cualquier otra especie con los componentes del reactivo de
Bial (Abatenh et al, 2018), hayan imposibilitado la reacción de deshidratación y con
esto, la formación del complejo aromático verde.

5. Conclusiones
Bajo el método de extracción y cuantificación del ADN presente en el hígado de un
“Pollo de Broiler” empleado, se obtuvo que por cada gramo de los 23,1124 gramos
totales del hígado, se encuentran 0,084 mg de ADN presentes en sus células hepáticas,
una cantidad menor a la promedio encontrada en el hígado de un pollo, donde se estima
que, entre los múltiples factores que contribuyeron a tal desviación, el método de
cuantificación empleado, en contraste con los utilizados actualmente no presenta las
condiciones necesarias para determinar el contenido de ADN presente en el hígado. De
igual manera, a partir de método empleado, se obtuvo tanto el número de células como
su masa bajo el hígado evaluado.
 A través de la espectrofotometría, se evaluó la hipercromicidad del ADN extraído,
sin embargo los resultados no reflejan un carácter hipocrómico, por lo que se destaca la
sensibilidad del estudio del efecto hipercrómico ante factores como la renaturalización o
el posible choque térmico en la muestra. Por otro lado, se confirmó la presencia de tanto
la desoxirribosa como los grupos fosfatos presentes en el esqueleto covalente del ADN
a través de un método alterno al fosfomolibdeno azul (PHB) y el ensayo cualitativo de
Bial, respectivamente.
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 Apéndice
Contenido de ADN por gramo de hígado:
50µ𝑔 1,001 6 𝑚𝐿 50 𝑚𝐿
× × × = 1668,33µ𝑔/𝑚𝐿
1𝑚𝐿 1 1 𝑚𝐿 9 𝑚𝐿

1 𝑚𝑔 1 𝑚𝑔
1668,33µ𝑔/𝑚𝐿 × × = 0,0842 𝑚𝑔/𝑔
1000 µ𝑔 19,800 𝑔

Número máximo de células por gramos de hígado:

1 𝑝𝑔
× 9,016 × 108 = 0,9218 𝑝𝑔
9,78 × 108

1000000 𝑝𝑔 1 𝑐𝑒𝑙 1 𝑐𝑒𝑙

1668,33µ𝑔/𝑚𝐿 × × × = 91,456x106 cel/g
1µ𝑔 0,9218 𝑝𝑔 19,800 𝑔

Peso de una célula hepática:

1 𝑐𝑒𝑙
19,800 𝑔 × = 1,093x10−8 g
1,811 × 109 𝑐𝑒𝑙