GUIA DE PRÁCTICA PARA EL ESTUDIANTE

CURSO: Fundamentos de Bioseguridad

COORDINAD Genny Marulanda
OR:
AMBIENTE
PRÁCTICO Laboratorio de Microbiología
DE
APRENDIZAJ
E:
FECHA: Abril de 2024
TIEMPO HTP 2 horas / 6 horas de trabajo independiente
ESTIMADO:

TEMA DE LA PRACTICA

Prueba de sensibilidad o susceptibilidad de Microorganismos a diferentes

desinfectantes.

JUSTIFICACI Este curso es importante en la formación del estudiante de

ON: odontología porque le permite reconocer y aplicar las guías de
manejo clínico en bioseguridad y desarrollar las competencias
necesarias antes, durante y después de la realización de un
tratamiento al paciente.

Este curso le ofrece al estudiante realizar una práctica odontológica

responsable y eficiente, mediante el conocimiento, aplicación de las
normas y protocolos del programa de Seguridad del Paciente, para
evitar la presencia de infecciones cruzadas, enfermedades
transmisibles y lograr un ambiente de trabajo SEGURO, tanto para
los pacientes, personal de la clínica, estudiantes y el odontólogo.
ELEMENTO  Aplicar conocimientos de bioseguridad.
DE  Evaluar la actividad antimicrobiana de los desinfectantes más
COMPETENCI
usados en los procesos de desinfección del consultorio, frente a
AA
DESARROLL cepas bacterianas.
AR:  Determinar la efectividad de algunos desinfectantes empleados en
ambientes hospitalarios utilizando el método de difusión en agar.
 Determinar la sensibilidad de una cepa bacteriana frente a un
desinfectante comercialmente usado.
 Interpretar y correlacionar los resultados obtenidos por el método
kirby-bauer en las cepas evaluadas.
PROBLEMA
 Irresponsabilidad en la práctica profesional
QUE
 Falta de integralidad en los procesos de bioseguridad en el
 RESUELVE: consultorio.
 Contaminación cruzada
 Infecciones asociadas al cuidado en salud.
DESCRIPCIO PREPARACION:
N DEL FUNDAMENTO
ESCENARIO
El método más común empleado en las pruebas de sensibilidad es la
difusión en agar, y la variante más utilizada es la de Kirby Bauer.
Este es un método estándar para evaluar la eficacia de los
antimicrobianos contra microorganismos patógenos, y hace referencia
a la difusión que experimenta un agente antimicrobiano desde un
disco de papel que contiene una concentración determinada del
agente hacia un medio de cultivo sólido en el que se ha inoculado un
cultivo puro.

Para esta prueba, se realiza una siembra en superficie de la cepa a

evaluar sobre el agar Mueller-Hinton, se colocan discos de papel de
filtro impregnados con el agente antimicrobiano y se incuba a 37°C
por 16-20 h. Durante la incubación, el agente antimicrobiano se
difunde radialmente desde el disco a través del agar, por lo que su
concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco. Si la
cepa es susceptible al agente antimicrobiano, aparecerá una zona
clara alrededor del disco que indica inhibición de crecimiento. El
resultado de la difusión en agar se determina midiendo el diámetro
del halo de inhibición que aparece alrededor del disco, de tal manera
que el diámetro del halo es proporcional a la sensibilidad de la cepa
frente al agente antimicrobiano presente en el disco.

OBJETIVOS

1. Evaluar la acción de desinfectantes de uso en odontología sobre

diferentes cepas bacterianas.

2. Determinar con base en los resultados obtenidos del método de

Kirby Bauer, la sensibilidad o resistencia bacteriana frente a
distintos agentes desinfectantes.

Materiales:
 Agar Mueller-Hinton (MH)

 Caldo BHI (Infusión cerebro corazón)

 Cepas bacterianas:

 Escherichia coli (Cepa Gram Negativa)

 Staphylococcus aureus (Cepa Gram Positiva)

 Bacillus cereus (Cepa Gram Positiva)

 Agentes desinfectantes:

 Hipoclorito de sodio a 5000 ppm

 Alcohol al 70%

 Amonio Cuaternario

 Glutaraldehído al 2%

 Solución Salina al 0.9 % (Control Negativo)

 Turbidímetro

 Vortex

 Incubadora

 Tubos de ensayo

 Discos de papel filtro estériles

 Pinzas metálicas

 Hisopos de algodón estériles

 Etanol al 70%

 Mecheros

 Pie de rey digital o regla

 Cinta de enmascarar
 Marcador Sharpie
 Candela
PROCEDIMIENTO:

1. Antes de realizar el ensayo rotule la caja de Petri con el

nombre de la cepa y el desinfectante empleado, nombre del
estudiante y día y hora del laboratorio.

2. A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, realice una

suspensión bacteriana estándar, para esto, inocule colonias
en caldo BHI y ajuste el inóculo en un turbidímetro a 90 ± 5
NTU (Unidad Nefelométrica de Turbidez), el cual equivale a
0,5 de la escala de MacFarland. Esta turbidez corresponde
a una concentración bacteriana de 1,5 x 108 UFC/mL
(Unidad Formadora de Colonia por mililitro) (Figura 1).

3. Agite en vortex durante 30 segundos.

4. Junto al mechero encendido tome un hisopo de algodón

estéril e introdúzcalo dentro de la suspensión bacteriana, al
retirarlo rótelo varias veces contra la pared del tubo por
encima del nivel del líquido para eliminar el exceso de
inóculo.

5. Haga una siembra en superficie por agotamiento (en

césped) sobre el agar MH, inoculando completamente sin
dejar ningún espacio libre. Esto se consigue deslizando el
hisopo por la superficie del agar tres veces, rotando la placa
unos 60º cada vez y pasándola por último por la periferia del
agar para conseguir una siembra uniforme. Deje secar de 3
a 5 minutos antes de depositar los discos de filtro (Figura 2).
Figura 1. Preparación de del inóculo bacteriano. La
concentración celular de cada una de suspensiones
corresponde a 1,5 x 108 UFC/mL.

6. ESTUDIANTE
Con una pinza estéril, tome un disco de papel filtro estéril y
humedézcalo con la primera solución desinfectante,
evitando que los discos queden muy saturados de solución.
Coloque los discos cuidadosamente sobre el agar
previamente inoculado. Debe asegurase que contacten
perfectamente con la superficie del agar, por lo que deben
presionarse ligeramente con las pinzas. No deben situarse a
menos de 15 mm del borde de la placa, y han de estar
distribuidos de forma equidistante para que no se produzca
superposición de los halos de inhibición (Figura 3).

Figura 2. Inoculación de la cepa bacteriana sobre la superficie

del agar Mueller-Hinton. Los cultivos se deben dejar secar de 3
a 5 minutos antes de colocar los discos de filtro que contienen
los desinfectantes.

7. Incube las placas invertidas a 37°C en atmósfera aeróbica

antes de que transcurran 15 minutos, esto evita la
predifusión que podría producir halos de mayor tamaño. Las
placas se incubarán durante 16-18 horas.

8. Después del periodo de incubación mida el diámetro de las

zonas o halos de inhibición. La medición se hace
preferentemente en el exterior de la placa, sin quitar la tapa,
esto puede hacerse con un pie de rey calibrado o una regla.

Figura 3. Colocación de los discos de filtro impregnados con

los agentes desinfectantes sobre el agar previamente
inoculado. Después del periodo de incubación se pueden
evidenciar algunas zonas translucidas alrededor de los discos
de filtro, zonas denominadas halos de inhibición.
 LECTURA

Mida el diámetro de la zona de inhibición de crecimiento

alrededor de los discos, estos deben ser medidos por el revés
de la caja de Petri sobre una superficie oscura. Los diámetros
de la zona de inhibición son reportados en milímetros (mm)
incluyendo el disco de papel de filtro. Luego de determinar los
diámetros de los halos de inhibición consigne los resultados y
clasifique las cepas evaluadas como sensible (S) o resistentes
(R). Entregue el informe con los resultados obtenidos en el
formato de reporte entregado por el docente.
Realice un cuadro comparativo con las diferentes reacciones,
establezca si hay resistencia o sensibilidad y realice una
conclusión final.

ALGORITMO
PARA USO Prueba in vitro sistematizada.
DEL
PROCEDIMIE
NTO
INDICADOR Interpreta los procesos y procedimientos de limpieza, desinfección y
esterilización en el consultorio odontológico.
EVIDENCIA Informe escrito de la actividad de manera grupal
BIBLIOGRAFÍA

 CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 29th ed. CLSI supplement M100. Wayne:
Clinical and Laboratory Standards Institute; 2019
 Varghese N., Joy P.P. Microbiology Laboratory Manual; 2014. Disponible en
[https://www.researchgate.net/publication/306018042_Microbiology_Laboratory_Manual/citation/download].
Consultado el 18 de enero 2023.
 Cappuccino J., Sherman N. Microbiology: a Laboratory Manual. 6 ED. San Francisco: Benjamin Cummings; 2002