ÍNDICE

1. OBJETIVO

2. ALCANCE

3. NIVEL DE ACCESO

4. RESPONSABILIDADES

5. INFORMACIÓN DEL PRODUCTO

6. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

7. MÉTODOLOGÍA

8. DISEÑO EXPERIMENTAL Y ESTADISTICO

9. CRITERIO DE ACEPTACIÓN

10. REVALIDACION Y VERIFICACIÓN DEL MÉTODO

11. BIBLIOGRAFÍA

12. ANEXO

13. CONTROL DE CAMBIOS

1. OBJETIVO
Describir el procedimiento a seguir para desarrollar la validació n de los métodos
microbioló gicos para el aná lisis del Agua Purificada.

2. ALCANCE
Esta validació n aplica al método de filtració n por membrana y vertido en placa que se
llevará a cabo en el agua purificada de Laboratorios Lira.

3. NIVEL DE ACCESO
Se le otorga acceso de SOLO LECTURA a todo el personal de la Empresa que lo requiera
para su consulta. Tendrá ACCESO TOTAL el Jefe de Aseguramiento de Calidad, quién lleva el
control de la documentació n.

4. RESPONSABILIDADES:

Gerente General:

 Garantizar los medios necesarios para el desarrollo de la actividad.

Jefe de Calidad

 Aprobar el presente protocolo para la realizació n de la validació n microbioló gica para el

Agua Purificada.
 Aprobar los informes emitidos de la validació n microbioló gica del agua purificada.

Jefe de Validaciones

 Revisar y notificar en el menor tiempo posible las correcciones debidas a este protocolo
para su posterior aprobació n.
 Vigilar el cumplimiento de este protocolo para la realizació n de la validació n
microbioló gica.

Analista de Microbiología

 Elaborar el presente protocolo conjuntamente con los informes finales de la validació n.

 Realizar la validació n del método microbioló gico para el agua purificada.

5. INFORMACIÓN DEL PRODUCTO

Producto Agua Purificada

Forma Farmacéutica Liquido
 Cantidad de muestra 100 mL
Cantidad de producto a evaluar 1mL

Técnica de recuperación Vertido en placa, Filtració n

por membrana
Muestra del inóculo ≤ 100 UFC

6. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

6.1. EQUIPOS
 Autoclave
 Incubadora
 Bañ o María
 Balanza
 Agitador Vortex
 Cámara de Flujo Laminar
 Micropipeta de 0.5-10µL
 Micropipeta de 100-1000µL
6.2. MATERIALES
 Cajas Petri
 Hisopos
 Matraces
 Tubos de ensayo
 Pipetas 10mL
 Pera de succió n
 Puntas
 Gradilla
 Probetas
 Envases de vidrio
6.3. REACTIVOS
 Agar MacConkey
 Agar Mannitol
 Agar Cetrimide
 Agar Plate Count 
 Caldo Tripticasa Soya
 Fosfato monobá sico de potasio
  Fosfato dibá sico de Sodio Dihidratado
 Cloruro de Sodio
 Peptona

6.4. MICROORGANIMOS ATCC PARA LA VALIDACIÓN MICROBIOLÓGICA

 Escherichia coli ATCC 8739
 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
 Staphylococcus aureus ATCC 6538

7. METODOLOGÍA
7.1. MUESTREO DEL AGUA PURIFCADA
 Realizar el muestreo de los puntos establecidos del agua purificada dentro de la planta.
Tanto los puntos como la frecuencia de muestreo se establecen en el “Procedimiento de
Muestreo del Agua PG. 039”
 Las muestras de agua purificada deben tomarse por duplicado, en envases de polietileno
estéril, con capacidad de 100 mL. Se debe codificar cada frasco de forma clara con el
nombre del punto de muestreo, la fecha, hora y nú mero de muestra.

VERTIDO EN PLACA

7.2. DETERMINACIÓN DEL INÓCULO

 Prepara una suspensió n de una concentració n de 0.5 McFarland con los 5
microorganismos ATCC a trabajar, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus con la solució n
tampó n.
 Leer las absorbancias de las soluciones microbianas preparadas a 625nm, estas se deben
encontrar entre 0.08 a 0.085 A.
 Realizar 6 diluciones seriadas (1:10), tomar un mililitro de la solució n madre y pasar a 9
ml de TSB (solució n de dilució n) para los microorganismos E. coli y S. aureus y realizar 5
diluciones (1:10) seriadas para P. aeruginosa.
 Tomar la sexta dilució n (≥100 ufc) para el caso de E. coli y S. aureus, mientras que para
P. aeruginosa tomar la quinta dilució n y sembrar en el medio específico de Agar
McConkey, Agar Manitol y Agar Cetrimide respectivamente para cada microrganismo.
 Realizar un pull con las bacterias E. coli y P. aeruginosa llevar a una concentració n de 0.5
McFarland, realizar 6 diluciones seriadas (1:10) y tomar la sexta dilució n ((≥100 ufc) y
sembrar un mililitro en el medio de cultivo Agar Plate Count.
 Incubar a 35°C por 48 horas y dar lectura.
 7.3. TÉCNICA DE RECUPERACIÓN
 Tomar 9 mL de la muestra de agua purificada en un tubo de ensayo.
 Agregar 1mL del inoculo bacteriano (≥100 ufc) y con ayuda del Vortex mezclar
vigorosamente la muestra.
 Tomar un mililitro de la muestra y colocarlo en una caja petri previamente etiquetada y
verter aproximadamente 20mL del medio de cultivo (Agar MacConkey, Agar Mannitol,
Agar Cetrimide y Agar Plate Count para E. coli, P. aeruginosa, S. aureus y Aerobios totales
respectivamente).
 Mezclar adecuadamente realizando movimientos circulares, arriba hacia abajo y de
izquierda a derecha para homogenizar la muestra en el medio de cultivo.
 Incubar a 35°C por 72 horas y posteriormente dar lectura a los resultados y anotar los
mismos en el Registro de Datos Experimentales.
 Para calcular la recuperació n también se sembrará un mililitro del inoculo bacteriano en
los medios descritos anteriormente.
 Se realizará repeticiones de tres determinaciones por tres días para la realizació n de la
validació n.

FILTRACION POR MEMBRANA

8. METODOLOGÍA
8.1. DETERMINACIÓN DEL INÓCULO
 Prepara una suspensió n de una concentració n de 0.5 McFarland con los 3
microorganismos ATCC a trabajar, E. coli, P. aeruginosa, , con la solució n tampó n.
 Leer las absorbancias de las soluciones microbianas preparadas a 625nm, estas se deben
encontrar entre 0.08 a 0.09 A.
 Realizar 5 diluciones seriadas (1:10), tomar un mililitro de la solució n madre y pasar a 9
ml de la solució n Tampó n con cada uno de los microorganismos a trabajar. (solució n de
dilució n).
 Tomar un mL de la quinta dilució n (≥100 UFC) y colocarlo en los 100mL de la muestra
de agua purificada.

8.2. TÉCNICA DE RECUPERACIÓN

 Tomar un filtro de membrana estéril, colocarla sobre el soporte de filtració n con ayuda
de unas pinzas estériles.
 Colocar el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la membrana y que
esta quede bien centrada.
 Encender la bomba al vacío.
  Agitar la muestra, verter los 100mL del agua purificada a través del embudo y filtrar el
agua purificada con el sistema de vacío.
 Filtrada la muestra retirar el embudo y con ayuda de unas pinzas estériles transferir el
filtro de membrana al medio de cultivo.
 Incubar el medio de cultivo a 35°C por tres días.
 Se realizará cuatro repeticiones durante cuatro días con cuatro determinaciones para la
realizació n de la validació n.

9. DISEÑO EXPERIMENTAL

Se ejecutará n tres tratamientos cada uno con tres determinaciones, se realizará un

tratamiento por día y los datos obtenidos de las unidades formadoras y colonias, UFC, se
transformará n a sus valores logarítmicos para ser analizados estadísticamente con un
aná lisis de ANOVA.

TRATAMIENTO TRATAMIENTO
TRATAMIENTO1
2 3
DETERMINACIÓN 1 60 cajas petri
Se llevará a cabo en Se evaluará n los
el medio específico siguientes
para cada microorganismos:
microorganismo Escherichia coli
(Se realizará n 3 Pseudomonas
determinaciones por aeruginosa
microorganismo y Staphylococcus aureus
por medio en tres Aerobios totales
días)
DETERMINACIÓN 2

DETERMINACIÓN 3

NOTA: Se utilizará un blanco por cada medio de cultivo utilizado para verificar que no existe
ninguna contaminació n.

9.1. ESTADÍSTICA

Los siguientes pará metros será n evaluados para la validació n del método microbioló gico:
a) Especificidad: Para la evaluació n de este pará metro se valorará el diluyente con un
inoculo (≤100 ufc) de cada microrganismo a evaluar.
b) Exactitud y Precisión: Pará metros que permiten visualizar la similitud de los datos
obtenidos de los 4 tratamientos y 4 determinaciones empleados en cuatro días. Estos
pará metros se relacionan con la desviació n está ndar relativa. Dentro de este pará metro
se evaluará también la Repetibilidad y Reproducibilidad.
o Repetibilidad: Este pará metro se evaluará durante los cuatro días que durará la
validació n del método microbioló gico sin variar las condiciones de trabajo.
o Reproducibilidad: Este pará metro se evaluará durante la validació n el método
microbioló gico tomando en cuenta que se debe variar una de las condiciones de
trabajo, en nuestro caso se realizará el cambio de analista en uno de los cuatro
días de la validació n.
c) Límite de detección: Se evaluará por medio de la inoculació n de un nú mero bajo de
microrganismo de desafío (≤ 5ufc) y midiendo el porcentaje de recuperació n del inó culo.
d) Límite de cuantificación: Se evaluará por medio de la inoculació n de un nú mero bajo
de microrganismo de desafío (≤ 5ufc), durante los cuatro días de validació n con cada
microrganismo y con el medio especifico y el medio general.
e) Linealidad: Este pará metro se evaluará mediante cuatro repeticiones de tres
concentraciones diferentes con cada uno de los tres microorganismos: una
concentració n baja, una concentració n media y una concentració n alta durante cuatro
días.
f) Intervalo de Trabajo: Se determinará con la concentració n má s baja y alta de cada uno
del microorganismo a ensayar.
g) Robustez: Se evaluará este pará metro mediante la lectura de las cajas en diferentes
tiempos. (T1: 18 horas, T2: 24 horas y T3: 48 horas).

10. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

PARÁMETRO DE
MEDIDA/ VARIABLE CRITERIO DE ACEPTACIÓN
VALIDACIÓN
Cumple (No existen
ESPECIFICIDAD Blanco/Matriz
interferencias)
Coeficiente de
LINEALIDAD DEL MÉTODO ≥ 0,99
correlació n (r)
%Recuperació n 80 - 110,0%
EXACTITUD
CV ≤ 32,0%
PRECISIÓN

REPETIBILIDAD DEL
%CVr ≤ 32,0%
MÉTODO
PRECISIÓN INTERMEDIA
%CV ≤ 32,0%
DEL MÉTODO
REPRODUCIBILIDAD DEL
%CVR ≤ 32,0%
MÉTODO
ROBUSTEZ DEL MÉTODO
%Recuperació n 80.0 - 110,0%
(ESTABILIDAD DE LAS
CV ≤ 32,0%
SOLUCIONES ANALÍTICAS)

PRECISIÓN DE SISTEMA % CV ≤ 32%

11. BIBLIOGRAFÍA
 Magnusson, B. (2014). The fitness for purpose of analytical methods: a laboratory guide to
method validation and related topics (2014). Eurachem.
Pharmacopeia, U. S. (2014). United States Pharmacopeia and National Formulary (USP
37–NF 32). Rockville, MD: US Pharmacopeia.
 Camaró -Sala, M. L., Martínez-García, R., Olmos-Martínez, P., Catalá-Cuenca, V., Ocete-
Mochó n, M. D., & Gimeno-Cardona, C. (2015). Validació n y verificació n analítica de los
métodos microbioló gicos. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, 33(7), e31-
e36.
 OAA (2013). Guía para la Validación de Métodos Microbiológicos. Organismo Argentino
de Acreditació n. Argentina, 1-17.
 Sala, M. L. C., Cuenca, V. C., Cardona, C. G., García, R. M., & Martínez, P. O. (2013)
Procedimientos en Microbiología Clínica. Validació n y verificació n analítica de los
métodos microbioló gicos.

12. VIGENCIA

13. ANEXOS

Anexo A: Informe de Desviaciones y Discrepancias

Anexo B: Informe de Validació n Microbioló gica para el Agua Purificada
Anexo C: Tabla de resultados estadísticos