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Determinaciones Analticas

en Leche
1. Introduccin.
2. Determinacin de la Acidez
3. Determinacin del pH
4. Determinacin de la Materia
Grasa
5. Prueba de Estabilidad
6. Prueba de la Fosfatasa
7. Deteccin de Inhibidores
Determinaciones analticas en leche. / [Lpez, A.L.; Barriga, D.; Jara, J.; Ruz, J.M.]].
Crdoba. Consejera de Agricultura y Pesca, Instituto de Investigacin y Formacin Agraria y
Pesquera, 2015. 1-26 p. Formato digital (e-book) - (Tecnologa, Postcosecha e Industria
Agroalimentaria)

Leche - Quesos - Calidad Acidez - pH Materia grasa Estabilidad Inhibidores Fosfatasa


- Sistema de Autocontrol Anlisis leche

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Determinaciones analticas en leche.


Edita JUNTA DE ANDALUCA. Instituto de Investigacin y Formacin Agraria y Pesquera.
Consejera de Agricultura y Pesca.
Crdoba, Noviembre de 2015.

Autora:
ngel Luis Lpez Ruiz1
Diego Barriga Velo1
Jess Jara Muoz1
Jos Mara Ruz Luque1

1
IFAPA, Centro de Hinojosa del Duque
El presente documento constituye el material didctico para la realizacin de las
Determinaciones prcticas de laboratorio del Mdulo 1: Recepcin y almacenamiento de la leche,
analticas en leche. correspondiente al Programa Formativo de Especialista en Quesera. En estas
prcticas se realiza in situ, el control de calidad de la materia prima principal para la
1. Introduccin elaboracin de productos lcteos.

La leche es considerada como uno de los alimentos ms completos en la nutricin


humana. Debido a su variada composicin (protenas, grasas, hidratos de carbono,
vitaminas y sales minerales), de su alta digestibilidad y su capacidad de
aprovechamiento por el organismo humano, de su sabor y de sus posibilidades de
empleo en la elaboracin de otros productos alimenticios, la leche lquida y los
productos lcteos son alimentos indispensables para atender a las necesidades
biolgicas del ser humano en todas sus edades.

Con este documento se pretende dar una visin global en cuanto a la necesidad de
partir de una calidad de leche excelente, independientemente de la especie animal
Figura 1. El transporte de la leche se de origen. La calidad de la leche abarca aspectos tales como las condiciones
realiza mediante cisternas homologadas
higinico-sanitarias, composicin fsico-qumica, as como las caractersticas
organolpticas del producto. Analizar la calidad de la leche permite obtener la
informacin necesaria para interpretar la evolucin de cada uno de los parmetros,
que posteriormente se precisan controlar.

Las determinaciones analticas que se desarrollan a continuacin vienen establecidas


en los controles obligatorios en el centro lcteo del Real Decreto 1728/2007, para
leche de vaca y el Real Decreto 752/2011, para leche de oveja y cabra y en el
Reglamento 853/2004 relativo a higiene de los alimentos de origen animal. Adems,
se incluyen otras determinaciones de gran utilidad para el desarrollo del proceso
Figura 2. Toma de muestras en el centro
tecnolgico.
lcteo

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2.1. Fundamento
Determinaciones
Se entiende por acidez en la leche natural, certificada, higienizada, pasterizada,
analticas en leche.
esterilizada y uperizada, al contenido aparente de cido, expresado en gramos de
cido lctico por 100 ml de leche (porcentaje %), grados SOXHLET-HENKEL (S-H) y
2. Determinacin de en Grados Dornic.
la Acidez La acidez total de una leche se determina por volumetra o titulacin. Lo que se
pretende es la saturacin de las funciones cidas de la leche mediante un producto
alcalino que, en presencia de un reactivo indicador (solucin alcohlica al 2 % de
fenolftalena) descubre mediante un cambio de color, la neutralizacin del cido de la
leche por el lcali al final de la reaccin.

La solucin alcalina ms empleada en la valoracin de la acidez de la leche es el


hidrxido sdico (NaOH) 0,111 N (N/9).

2.2. Material y reactivos utilizados

Acidmetro Dornic, que consta:

- Base de plstico y frasco de plstico

- Bureta graduada de enrase automtico y tubo de goma

Frasco cuentagotas para el indicador

Pipeta graduada de 10 ml

Vaso de precipitados de 100 ml


Figura 3. Acidmetro Dornic
Sosa Dornic N/9

Solucin de fenolftalena al 2%

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2.3. Procedimiento
Determinaciones
1) Homogeneizar la leche utilizando una varilla agitadora antes de tomar la
analticas en leche.
muestra.

2. Determinacin de 2) Depositar en un vaso de precipitado 10 ml de la leche problema.


la Acidez
3) Aadir 4-5 gotas de fenolftalena.

4) Enrasar la bureta con sosa N/9, presionando el frasco de plstico.

5) Dejar caer gota a gota la sosa N/9 sobre la leche, agitando el vaso de
precipitado al mismo tiempo.

6) La valoracin concluye cuando aparece una coloracin rosa dbil, que debe
persistir al menos durante unos segundos.

7) Lectura en la bureta de los ml de sosa N/9 gastados.

2.4. Resultados
Los resultados los expresamos en grados Dornic o en gramos de cido lctico por
100 ml de leche.

1 Dornic = 0,1 ml de Sosa N/9 = 0,1 g de cido lctico


Figura 4. La prueba de la acidez nos
permite conocer el estado de la leche

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Figura 5. Esquema de la determinacin de acidez

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Supongamos que para determinar la acidez de una leche necesitamos 1,6 ml de sosa

Determinaciones Dornic; esa leche tiene entonces una acidez de 16 Dornic o 1,6 g de cido lctico /

analticas en leche. 100 ml de leche.

La leche tiene una acidez natural como consecuencia de la presencia de cido ctrico,
2. Determinacin de anhdrido carbnico, casena, lactoalbmina, fosfatos y cloruros.
la Acidez Esta acidez natural est en la leche de vaca en torno a los 14-18 Dornic, siendo
muy similar en la leche de cabra. En la leche de oveja, la acidez normal alcanza los
18-25 Dornic.

Una acidez en cabra y vaca inferior a 14 Dornic puede indicar procedencia de


animales enfermos (mamitis), leches calostrales o alteradas (aguadas). La acidez por
encima de 18 Dornic, nos indican leche procedente de ordeos poco higinicos o
que han pasado ms de 10 horas sin refrigeracin.

Segn el Real Decreto 1728/2007 (para leche de vaca) y el Real Decreto 752/2011
(para leche de cabra y oveja), en los que se establece la normativa bsica de control
que deben cumplir los operadores del sector lcteo, se debe determinar la acidez o la
estabilidad al alcohol de la leche en el centro lcteo.

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3.1. Fundamento
Determinaciones
analticas en leche. El pH es una medida de la concentracin de protones o iones hidrgeno, es decir, de
la acidez o basicidad de un medio.

3. Determinacin En numerosos alimentos el pH es un factor importante para su estabilidad, ya que es


del pH determinante en el crecimiento de grupos de microorganismos especficos.

El valor de un pH neutro es de 7; por debajo de este valor, el pH se considera cido


y por encima del mismo el pH es bsico. Los resultados se expresan en unidades de
pH a 20C.

La determinacin del pH de una leche se realiza directamente sobre la misma con


ayuda de un pH-metro. La precisin entre los resultados de dos determinaciones
consecutivas debe ser de 0,10 pH.

El pH de una leche es inversamente proporcional a la acidez Dornic; es decir, a


mayor acidez menor pH.

El pH normal de la leche se encuentra entre 6,6 y 6,8.

3.2. Material y reactivos utilizados

pH-metro con electrodo de vidrio (sensibilidad 0,05 pH)

Vasos de precipitado

Varilla agitadora de vidrio

Soluciones tampn de referencia, pH 7 y pH 4,01

Agua destilada
Figura 6. Escala de pH

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3.3. Procedimiento
Determinaciones
1) Calibrar el pH-metro con las soluciones tampn de referencia, empezando
analticas en leche.
siempre por la de pH 7.

3. Determinacin Entre mediciones lavar siempre el electrodo con agua destilada.


del pH
2) Llevar la muestra hasta los 20C, y agitar hasta conseguir una perfecta
homogeneizacin.

3) Sumergir el electrodo del pH-metro en la muestra de leche y leer el valor en el


visor.

3.4. Resultados
Las mediciones se expresan en unidades de pH a 20C, con dos cifras decimales.
Figura 7. pH-metro con sonda para
lquido Si el valor de pH es diferente, puede deberse a:

Un deficiente estado sanitario de la glndula mamaria incrementa el pH de la


leche.

El desarrollo de microorganismos que degradan la lactosa en cido lctico


hace disminuir el pH de la leche.

Desarrollo de microorganismos alcalinizantes que hacen aumentar el pH de la


leche
Figura 8. Soluciones tampn para la
calibracin del pH-metro

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Figura 9. Esquema de la determinacin del pH

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4.1. Fundamento
Determinaciones
analticas en leche. Para la determinacin de la materia grasa de la leche debemos medir la grasa una
vez separada del resto de componentes de la leche, despus de destruir su estado
globular o bien extraerla mediante un disolvente.
4. Determinacin
de la materia grasa La grasa al formar una emulsin muy frgil, puede destruirse mediante la utilizacin
de cidos concentrados y calientes, que adems destruyen la membrana globular y
disuelven totalmente la casena, por lo que hay una excelente separacin en dos
fases.

Para la determinacin de la materia grasa liberada se utiliza el Mtodo de Gerber


(volumtrico).

El MTODO GERBER es una tcnica volumtrico de rutina, rpida y precisa que se


basa en medir el volumen de la fase grasa, separada de la acuosa por centrifugacin
en aparatos especialmente graduados.

Consiste en la liberacin total de la grasa de la leche por disolucin de las sustancias


proteicas, separacin de la grasa por centrifugacin y posterior medida volumtrica
de esta.

La leche se deposita en un butirmetro y se aade cido sulfrico, el cual disuelve


las protenas y alcohol isoamlico que facilita la separacin de la grasa.

Mediante centrifugacin, conseguimos la separacin total de la grasa procediendo a


su lectura gracias a la escala graduada del butirmetro.

Figura 10. Glbulos de grasa de leche de Se expresa el contenido de grasa de la leche en porcentaje por 100 ml. de leche.
vaca al microscopio

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4.2. Material y reactivos utilizados
Determinaciones
analticas en leche. Pipetas aforadas de 11 ml.

Butirmetro original Gerber, que pueden ser:


4. Determinacin
de la materia grasa - Escala de 0-5%, con divisiones de 0,1 ml, para leche de vaca.

- Escala de 0-9%, con divisiones de 0,1 ml, para leche de cabra.

- Escala de 0-14%, con divisiones de 0,1 ml, para leche de oveja.

Tapones cnicos de butirmetros y vstago para tapones.

Centrfuga Gerber con calefaccin (1000-1200 rpm)

Pipeta Kipp (medidor automtico) para cido sulfrico, de 10 ml.

Pipeta Kipp para alcohol isoamlico de 1 ml.

Gradilla

Bao Mara con termostato regulable, en caso de que la centrfuga no disponga


de calefaccin.

Figura 11. Butirmetro Gerber (con


escala 0 - 9 %)

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4.3. Procedimiento
Determinaciones
analticas en leche. 1) Homogenizar la leche evitando la formacin de espuma. Depositar en el
butirmetro 10 ml de cido sulfrico 90-91 % segn Gerber, con cuidado de
no manchar el cuello del butirmetro.
4. Determinacin
de la materia grasa 2) Tomar 11 ml de la leche problema y depositarlos en el butirmetro, dejndola
caer por las paredes del mismo. La posicin correcta de la pipeta y el cuello del
butirmetro sera formando un ngulo de 45.

3) Aadir 1 ml de alcohol isoamlico, procurando no manchar el cuello del


butirmetro.

4) Cerrar el butirmetro ayudndonos con el empujador.

5) Agitar con cuidado el butirmetro hasta conseguir la total disolucin de las


fases. Colocar los butirmetros en la centrfuga en posiciones opuestas y con los
tapones hacia abajo. Centrifugar durante 5-7 minutos entre 1000-1200 rpm y
60-65 C.

6) La lectura debe realizarse a una temperatura de 60-65 C, y siempre


manteniendo el butirmetro en posicin vertical. Si la centrfuga no tiene
calefaccin, debemos mantener los butirmetros antes y despus de la
centrifugacin, durante 5 minutos en el bao mara programado a 65 C.

La lectura se lleva a cabo, haciendo coincidir uno de los extremos de la columna


de grasa con una unidad entera de la escala del butirmetro, y posteriormente
contando el nmero de grados.
Figura 12. El mtodo Gerber es un
mtodo rpido de determinacin de la
grasa

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Figura 13. Esquema de la determinacin de la materia grasa

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4.4. Resultados
Determinaciones
analticas en leche. La lectura obtenida en el butirmetro Gerber, expresa el contenido en materia grasa
de la leche en porcentaje en volumen, es decir, % de materia grasa en 100 ml de

4. Determinacin leche.

de la materia grasa La cantidad de materia grasa presente en cualquier leche vara en funcin de:

- La alimentacin del animal.

- La estacin del ao.

- El estado de lactacin del animal y el nmero de partos.

- La raza y la gentica.

- Manejo y estado sanitario del animal.

No obstante, a continuacin se exponen valores porcentuales medios de la materia


grasa de la leche de vaca, cabra y oveja.

TIPO DE LECHE

Vaca Cabra Oveja

3,6 % 3,8 % 7,9 %

Figura 14. La grasa de la leche queda en


la parte superior del butirmetro

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Antes de someter una leche cruda a un tratamiento trmico es preciso asegurarse de

Determinaciones su estabilidad al calentamiento que va a sufrir.

analticas en leche. Los componentes de la leche se encuentran en estado de equilibrio, existiendo


numerosas causas o factores que pueden alterar este estado de equilibrio, haciendo
que la leche no sea estable y por tanto no resista los tratamientos trmicos. Estas
5. Prueba de
causas o factores pueden ser:
estabilidad al
alcohol - Exceso de cido lctico (la ms frecuente). Una leche cida ser inestable.

- Presencia de conservantes (agua oxigenada) y sustancias extraas.

- Larga conservacin de la leche. Las llamadas leches viejas, que han sido
conservadas en fro durante 4-5 das.

- Estado de los animales. Leches mamticas o calostrales.

- Largo tiempo de transporte y excesiva agitacin de la leche

Existen diversas pruebas que permiten determinar la estabilidad de la leche cruda y


seleccionarla para un determinado tratamiento trmico: Prueba del Alcohol,
Prueba de la Ebullicin y Prueba del Fosfato

5.1. Fundamento
Al aadir una cierta cantidad de alcohol etlico a la leche se produce una parcial o
total deshidratacin de ciertos coloides hidrfilos, lo que puede conducir a su
desnaturalizacin y a la prdida del estado de equilibrio seguida de floculacin.

Dicha desnaturalizacin slo ocurre cuando se llega a un cierto grado de alcohol en la


Figura 15. Preparacin de la graduacin mezcla final, por debajo del cual las leches estables no floculan.
necesaria con alcoholmetro

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5.2. Material y reactivos utilizados
Determinaciones
Tubos de ensayo
analticas en leche.
Pipetas de 5 ml

5. Prueba de Agua destilada


estabilidad al Alcohol etlico o etanol de diferente graduacin
alcohol
a) segn el tratamiento trmico al que se vaya a someter la leche:

- Pasteurizacin: alcohol de 67-68 %

- Esterilizacin: Alcohol de 72-74%

- Uperizacin: Alcohol de 76%

b) segn la especie de la que proviene la leche a analizar, as:

- vaca y oveja: alcohol de 67-68%

- cabra: alcohol de 56-57%

Figura 16. La estabilidad es una prueba


sencilla para ver el estado de la leche

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5.3. Procedimiento
Determinaciones
1) Homogeneizar la leche agitndola con una varilla agitadora.
analticas en leche.
2) En un tubo de ensayo, depositar 5 ml de la leche problema.

5. Prueba de 3) Aadir 5 ml de etanol con la gradacin correspondiente.


estabilidad al
alcohol 4) Mezclar invirtiendo el tubo varias veces

5) examinar la mezcla.

5.4. Resultados
Si no se observan cogulos en las paredes del tubo de ensayo, se considera que la
leche es estable a la temperatura de tratamiento trmico ensayado, que corresponde
con la graduacin del alcohol utilizado.

Si se percibe la formacin de cogulos en las paredes del tubo, indica que la leche no
es estable para ese tratamiento trmico en concreto.

Segn el Real Decreto 1728/2007 (para leche de vaca) y el Real Decreto 752/2011
(para leche de cabra y oveja), en los que se establece la normativa bsica de control
que deben cumplir los operadores del sector lcteo, se debe determinar la estabilidad
al alcohol o la acidez de la leche en el centro lcteo.

Figura 17. Leche inestable (izquierda) y


estable (derecha)

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5. Prueba de
estabilidad al
alcohol

Figura 18. Esquema de la determinacin de la materia grasa

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6.1. Fundamento
Determinaciones
analticas en leche. La determinacin de la fosfatasa es una prueba que permite comprobar la correcta
pasteurizacin de una leche; es decir, comprobar que el tiempo y la temperatura de
tratamiento trmico de pasteurizacin se ha realizado correctamente.
6. Prueba de la
fosfatasa La fosfatasa es una enzima que se encuentra en la leche cruda y se desnaturaliza por
el calor, por lo cual al pasteurizar la leche se destruye.

Para comprobar la existencia (mala pasteurizacin) de fosfatasa se usa un mtodo


colorimtrico. La fosfatasa tiene la propiedad de desdoblar el fenilfosfato disdico en
fenol y fosfato de sodio. Tambin existen tiras indicadoras para esta prueba.

Este mtodo pone de manifiesto la existencia de fenol mediante un indicador de color


que reacciona con l formando un compuesto de color azul (existe fenol y por tanto
fosfatasa por lo que no se ha pasterizado correctamente). Si no existe fosfatasa
(leche bien pasterizada), no existe fenol y se forma un compuesto de color marrn.
Figura 19. Leche cruda (izquierda) y
pasteurizada (derecha)
6.2. Material y reactivos utilizados
Tubos de ensayo con tapn de rosca

Pipetas graduadas de 10 y 1 ml

Varillas agitadoras de vidrio

Estufa de incubacin a 37C o Bao Mara

Pinzas y gradilla y agua destilada para anlisis


Figura 20. Tiras indicadoras para
fosfatasa (mtodo alternativo al Reactivo I, II y III
descrito)

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6.3. Procedimiento
Determinaciones
analticas en leche.
1) En 2 tubos de ensayo se depositan 10 ml de agua destilada para anlisis y se
llevan a la estufa para que se pongan tibios o se atemperan con la mano.

6. Prueba de la 2) Aadir a cada tubo una tableta de Reactivo I y disolver con ayuda de una varilla.

fosfatasa 3) Cuando est bien disuelta, aadir una tableta de Reactivo II y disolver.

4) Depositar en cada tubo 1 ml de la leche problema. Mezclar.

5) Llevar los tubos de ensayo a la estufa de incubacin a 37C durante 1 hora.

6) Tras la incubacin, aadir a cada tubo una cucharadita de Reactivo III.

7) Mezclar y llevar a incubacin durante 10-15 minutos.

6.4. Resultados

Observar el color de los tubos de ensayo:

Color marrn indica que no hay fosfatasa: Leche bien pasterizada.

Color verdoso, indica que hay una pequea cantidad de fosfatasa: Leche sin
pasterizar correctamente.

Color azul fuerte, indica que hay fosfatasa: Leche cruda.

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Figura 21. Esquema de la determinacin de la materia grasa

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7.1. Fundamento
Determinaciones
analticas en leche. La deteccin de inhibidores es una prueba que nos permite conocer la presencia en la
leche de antibiticos tales como los -lactmicos y las tetraciclinas, y por tanto su
inutilizacin para el consumo humano.
7. Deteccin de
inhibidores Se trata de un test competitivo que utiliza dos receptores en una misma reaccin.
Cuando se mezcla el reactivo contenido en el microtubo con la muestra de leche,
ambos receptores pueden unirse a sus correspondientes analitos durante la primera
incubacin. Cuando la muestra de leche no tiene antibiticos, se produce la
coloracin de las lneas de captura presentes en la tira reactiva, indicando la
ausencia de molculas de antibitico en la muestra.

La presencia de antibiticos en la muestra se determina por la dbil coloracin de las


lneas de captura existentes en la tira reactiva.

Figura 22. Se debe respetar el Periodo 7.2. Material y reactivos utilizados


de Supresin de cada antibitico
La deteccin de inhibidores es una prueba que nos permite conocer la presencia en la
leche de antibiticos

Microtubos

Tiras reactivas

Gradilla
Figura 23. No se puede ordear un
animal durante un tratamiento con
Estufa de incubacin
antibiticos

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7.3. Material y reactivos utilizados
Determinaciones
analticas en leche.
1) Sacar del test de inhibidores un microtubo.

2) Colocar una punta en la pipeta minipet y aadir 200 l de la muestra de leche


7. Deteccin de al microtubo. Disolver el producto mezclndolo con ayuda de la punta de la

inhibidores pipeta hasta obtener un color rosa homogneo.

3) Colocar en la estufa a 40C durante 3 minutos.

4) Finalizada la incubacin, colocar una tira reactiva en el interior del microtubo


sumergiendo la parte de debajo de la tira (parte ms gruesa) y realizar una
segunda incubacin de otros 3 minutos.

5) Al terminar la segunda incubacin, se extrae la tira reactiva, en la cual


aparecer una, dos o tres lneas impresas.

7.4. Resultados
La interpretacin visual se realiza a travs de una comparacin entre la intensidad de
color de la lnea TEST y la Control. Las lneas TEST se corresponden con la inferior
relativa a -lactmicos y con la superior correspondiente a tetraciclinas.

Si las lneas TEST son ms visibles que la de control, la muestra se considera


NEGATIVA.

Figura 24. Test rpido de deteccin de


Si las lneas TEST son igual de visibles que la control o menos visibles que sta, la
inhibidores con necesidad de incubacin muestra se considera POSITIVA.

En caso de duda, la muestra se considera POSITIVA.

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Figura 25. Interpretacin de test de inhibidores

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Determinaciones Analticas
en Leche

Instituto de Investigacin y Formacin Agraria y Pesquera

Edificio BLUENET. Avenida de Grecia s/n,


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