Toma, transporte y procesamiento de muestras biolgicas.

Objetivo
Establecer los lineamientos para la toma, transporte y procesamiento de muestras biolgicas que permitan asegurar sus condiciones de calidad para los anlisis correspondientes.

Etapa pre-analtica

Los antecedentes del paciente y los factores epidemiolgicos son tiles para orientar el diagnstico etiolgico.

Etapa analtica

La validez de los resultados del diagnstico microbiolgico depende entre otros factores, de que se sigan correctamente las normas de obtencin, transporte y procesamiento de la muestra.

Toda la informacin diagnstica que el laboratorio de microbiologa puede proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida.

Una toma mal realizada, o transportada determinar un fallo en la recuperacin de los agentes patgenos, que puede inducir a errores diagnsticos y tratamiento.

Lo ms importante es diferenciar entre flora normal y patgena. El aislamiento de un patgeno o posible patgeno no indica necesariamente que est implicado en el desarrollo de la enfermedad. Ej.: S.pneumoniae.

Medios de transporte
Los medios para el transporte de muestras ms utilizados y que permiten la viabilidad de la mayora de los patgenos son: el medio de Stuart, Cary-Blair y el de Amies. Estos medios semislidos tienen un ph regulado y son esencialmente una mezcla de sustancias tamponadas que carecen de factores de crecimiento.

Eleccin correcta de los antibiticos a probar.

1. Microorganismo aislado.

2. Mecanismo de accin del antibitico.

3. Espectro de accin del antibitico.

Fuentes de error ms comunes en la realizacin de un antibiograma

1. Falta del control de calidad de los medios de cultivo a utilizar, patrn de McFarland y los discos de antibiticos. 2. Trabajar con cepas bacterianas que no estn puras. 3. Inadecuada estandarizacin de la concentracin del inculo.

Procedimiento
1. Cepa : cultivo fresco y puro. 2. Inculo: pasar 1 o 2 colonias a un tubo de caldo Mueller Hinton. El crecimiento bacteriano se ajustar a la turbidez del patrn 0.5 del estndar de McFarland. 3. Introducir un hisopo e inocular en forma masiva una placa con agar Mueller Hinton.

Procedimiento
4. Colocar hasta un mximo de 6 discos de antibiticos en forma equidistante. 5. Incubar a 35 oC por 18 h. 6. Medir el halo de inhibicin con una regla. Comparar con tablas de interpretacin internacional. S, I o R. 7. Reportar.

Mueller Hinton

MH + 5% sangre cordero

Control de calidad
Implementar en su rutina diaria de laboratorio el proceso de control de calidad. Usar y conservar correctamente cepas ATCC a mediano y corto plazo.

Sistema Vitek :
Realizar control de calidad a toda nueva tarjeta de identificacin o de sensibilidad, una vez que se ha recibido. No se requiere otro control de calidad si todos los resultados estn dentro de los lmites. Los informes de control de calidad y reporte de desviaciones, son mantenidos en el Libro de control de calidad del Vitek.

Incubadora
a) Controlar diariamente la temperatura de las incubadoras, antes de sacar las placas y anotar en una hoja control el resultado. b) Observar el termorregulador por cualquiera alteracin en su posicin preestablecida. c) Todas las incubadoras deben ser limpiadas mensualmente y llevar un rcord de mantenimiento preventivo.

Refrigerador
a) Control diario de la temperatura en hoja de formato mensual. b) Mantenga la temperatura entre 4 8 C. c) Lleve un registro de problemas de funcionamiento, causa y solucin.

Microscopios :
1. Limpieza del aceite de objetivos, condensador, etc. 2. Apagar la fuente de luz. 3. Colocar cobertor contra el polvo. 4. Limpieza de Ocular, condensador y diafragma. 5. Limpieza y ajuste del sistema lumnico.

Tincin de Hansel

Fijar la lmina con metanol absoluto por 3 min. Cubrir la lmina con eosina durante 1 min. Lavar con agua destilada. Teir con azul de metileno por 1 min. Lavar y decolorar ligeramente con metanol (dos a tres gotas). Dejar secar y examinar el extendido con objetivos de 10X y 40X.

Tincin de Hansel

Realizar un recuento diferencial con objetivo de 40X, se cuentan 50 clulas por campo, si se observan 10 eosinfilos se considera la prueba positiva.

Ilustracin de Keppler, S XVIII

Cultivo farngeo

Se utiliza para el diagnstico de faringitis estreptocccica. Excepcionalmente se puede requerir bsqueda de otros patgenos (por ejemplo: Neisseria gonorrhoeae).

Cultivo farngeo
Se investigar rutinariamente la presencia de Streptococcus betahemoltico del grupo A (S. pyogenes) y otros grupos beta hemolticos como C y G.

Condiciones previas del paciente

El paciente no debe haber recibido antibiticos en los ltimos 8 das, previos a la obtencin de la muestra. Debe acudir en ayunas al laboratorio. Debe cepillarse los dientes y no practicar gargarismo. El hisopado de garganta est contraindicado en pacientes con epiglotitis.

Cultivo farngeo
Utilizar hisopos de dacrn o de alginato de calcio para recolectar las muestras para el cultivo. El estreptococo sobrevive en hisopos secos por cerca de 2 horas y en medio de transporte (Stuart, Amies) a 4C por 24 a 48h.

Procedimiento
1. Inspeccin de la faringe. 2. Indicar al paciente que abra la boca y que pronuncie un largo ah. 3. Introducir el hisopo y frotar enrgicamente ambas amgdalas/criptas y la pared posterior de la faringe con movimientos de barrido y sembrar AS.

Cultivo farngeo

Con frecuencia, el dolor de garganta se debe a un virus, pero el cultivo permite determinar si se debe a una bacteria.

Angina de Vincent

Angina de Vincent

Haemophilus

Neisseria

Investigacin de otros patgenos

Bsqueda de Arcanobacterium haemolyticum: Se recomienda el uso de AS humana o de caballo para el aislamiento primario. Se puede utilizar el AS de carnero convencional con incubacin hasta por 72h para lograr evidenciar la beta-hemlisis.

A. haemolyticum

Borrelia/campo oscuro

Azul de metileno de Leffler

Investigacin de otros patgenos

Cuando la clnica oriente hacia una faringitis por N. gonorrhoeae, debe seleccionarse el medio Thayer-Martin o el GC. Otras especies de Neisseria tambin pueden estar presentes en cultivos de garganta y deben diferenciarse bioqumicamente.

Prueba de la bacitracina

Esta tcnica tiene un 5% de falsos negativos y entre 10 y 20% de falsos positivos ya que otros Streptococcus (grupos C y G) tambin pueden dar sensibles.

Prueba de PYR

Se fundamenta en la actividad de la enzima pirrolidonil aminopeptidasa producida por S. pyogenes, sobre un sustrato el L-pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR), con formacin de beta-naftilamida libre, que se combina con el reativo cinamaldehdo formando un producto final de color rojo.

Los laboratorios que utilizan las pruebas bacitracina o PYR deben informar: Hubo desarrollo presuntivo de Streptococcus pyogenes.

La identificacin definitiva se lleva a cabo mediante la deteccin del antgeno especfico de grupo, tambin llamado carbohidrato de Lancefield; sta se realiza a travs de mtodos de aglutinacin con partculas de ltex o coaglutinacin, directamente sobre la colonia aislada. Solo los estreptococos beta-hemolticos, A , B , C , F , G y los alfa o no hemolticos del grupo D pueden clasificarse con esta prueba.

Deteccin directa de Streptococcus del grupo A en hisopado de garganta

Aglutinacin con ltex y ELISA. Sondas quimioluminiscentes.

Desventajas: Solo detectan Streptococcus grupo A. Bajo valor predictivo positivo. El elevado costo.

1. Pruebas bioqumicas: evalan la capacidad metablica de un microorganismo relacionada con:

Los sustratos que puede utilizar la bacteria para crecer. Las enzimas que posee la bacteria . Los productos metablicos producidos por las bacterias.

2. Pruebas de tolerancia:

Se refiere a la capacidad que pueda tener la bacteria para crecer a distintos tipos de temperaturas, atmsfera, pH, sales presentes en el medio, antibiticos, entre otras.

Mtodos rpidos

Sistema API: Posee un gran nmero de pruebas bioqumicas, las cuales se presentan como sustratos liofilizados en una galera de pozos y se requiere slo de un inculo estandarizado a partir de cultivos puros y frescos, y un tiempo de incubacin posterior que depende de la galera de pruebas que se haya escogido.

Mtodos rpidos

El sistema VITEK consta de un mdulo de vaco-sellador, un incubador-lector, una computadora, el monitor y la impresora. Permite identificar bacterias hasta en 3 horas.

Inmunodiagnstico.

Tambin conocido como serologa diagnstica. Se utilizan pruebas que permiten la interaccin antgeno anticuerpo para diagnosticar enfermedades infecciosas, as como para identificar microorganismos.

Mtodos moleculares de diagnstico en enfermedades infecciosas.

El uso de la biologa molecular para el diagnstico y seguimiento de las enfermedades infecciosas se basa en las caractersticas de los cidos nucleicos como cdigos nicos de identificacin de todo ser viviente.

Etapa post-analtica

El informe al mdico tratante debe incluir la identificacin del paciente, tipo de muestra recolectada, estudio microbiolgico realizado, fecha de recepcin de la muestra, emisin de los resultados y cualquier otro dato necesario.

Toma de muestra

La recoleccin se realizar en un envase desechable que debe ser de boca ancha con tapa de rosca, con capacidad para 30 50 mL, transparente porque permite ver la cantidad y la calidad de la muestra.

Baciloscopa

Baciloscopa
(-): No se encuentran BAAR en 100 campos observados. (+): Menos de 1 BAAR por campo en 100 campos observados. (++): 1 a 10 BAAR por campo en 50 campos observados (+++): Ms de 10 BAAR por campo en 20 campos observados.

En caso de encontrar slo uno a cuatro bacilos en cien campos observados debe ampliarse la lectura a otros 100 campos utilizando una nueva lnea.

Sntomas: Neumona, fiebre, dolor torcico.

Procedimiento
En el caso de conjuntivitis, la muestra se obtendr del ngulo interno del ojo. Obtener raspado conjuntival del borde interno del prpado superior e inferior para la investigacin de C. trachomatis

Agentes productores de ITU

En el 85%, Escherichia coli , Proteus sp., Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp., Enterobacter sp. En pacientes hospitalizados, Pseudomonas sp., Serratia y Acinetobacter. En mujeres en edad reproductiva, levaduras, Staphylococcus saprophyticus.

Agar CLED (cistina-lactosa-electrolito-deficiente)

Examen en fresco
5 o ms leucocitos por campo, es signo de piuria e infeccin. Cilindros leucocitarios + un germen con recuento significativo, sugiere pielonefritis. En infecciones vesicales agudas, adems de piuria, puede comprobarse hematuria.

Frotis

Una o ms bacterias por campo de inmersin se presenta en muestras con cuentas mayores de 100.000 colonias/mL de orina, y al menos un leucocito cuando existe piuria.

Mtodo del asa calibrada

Sembrar la orina sin centrifugar con un asa calibrada a 0.001 ml (3mm de dimetro). Contar el nmero de colonias y multiplicar por el factor 1000, para determinar las unidades formadoras de colonia por mililitro de orina (UFC/ml).

Diarrea: definiciones operativas

Diarrea aguda: incremento en el nmero o volumen de las heces de 72 horas o menos de duracin. Diarrea crnica o persistente: incremento en el nmero o volumen de las heces de ms de 14 das de duracin.

Disentera: historia de moco o sangre en las heces con tenesmo o dolor al defecar y temperatura axilar de 38.5 C.
Gastroenteritis: diarrea lquida de color amarillo verdosa o no, acompaada con vmito y fiebre en algunas ocasiones. Fiebre entrica: fiebre, cefalea, dolor abdominal, bradicardia relativa, esplenomegalia y leucopenia. Ej: Fiebre tifoidea.

Deteccin de leucocitos fecales

1. Colocar una pequea cantidad de moco o de heces en una lmina y mezclar con 23 gotas de azul de metileno al 1%. 2. Cubrir con una laminilla y esperar 2 a 3 minutos con la finalidad de obtener una buena coloracin nuclear. 3. Observar al microscopio con los objetivos secos (10X y 40X).

Interpretacin

La presencia de 5 o ms leucocitos por campo microscpico sugiere la presencia de un agente enteroinvasor. La ausencia de clulas inflamatorias sugiere la presencia de un agente toxignico.

Preston mod.

Shigella

XLD

Yersinia

V. cholerae

CONTROL DE CALIDAD INTERNO

Agar TCBS con cepas de V. cholerae O1, V.

Agar sangre control esterilidad y cepa de V. cholerae O1. Reactivo oxidasa con cepas de P. aeruginosa, E.

parahaemolyticus, Escherichia coli.

coli.

Agar TSI con cepa de E. coli, P. vulgaris, S.

flexneri, P. aeruginosa. Agar LIA con cepa de E. coli, P. vulgaris, S. flexneri. Agar MIO con cepa de E. coli, K. pneumoniae.

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO

El laboratorio debe estar adscrito a un programa externo de calidad.

Pruebas de sensibilidad antimicrobiana

Fiebre tifoidea Sndrome disentrico Diarrea crnica Clera

SS

Infecciones del aparato circulatorio. Hemocultivo

Bacteremia: Presencia de bacterias en la sangre. Bacteremia primaria: Ausencia de foco primario de infeccin. Bacteremia secundaria: Existe una asociacin clnica, temporal y bacteriolgica con un sitio reconocido de infeccin en el paciente.

Infecciones del aparato circulatorio. Hemocultivo

Septicemia: Conjunto de alteraciones fisiolgicas por presencia de los microorganismos en torrente sanguneo o en tejidos. Actualmente se considera como una respuesta sistmica a una infeccin, se manifiesta por dos o ms de los siguientes parmetros: temperatura mayor de 38 C o menor de 36C, ritmo cardaco mayor de 90 latidos por minuto, recuento leucocitario mayor de 12.000/mL o mayor del 10% de bandas.

Infecciones del aparato circulatorio. Hemocultivo

Choque sptico: Sepsis con hipotensin, a pesar de una reanimacin adecuada con lquidos el paciente no responde, alteracin de la perfusin orgnica, que puede incluir disminucin del gasto urinario, cambios del estado mental, acidosis sistmica e hipoxemia.

Infecciones del aparato circulatorio. Hemocultivo

Infecciones endovasculares: Consisten en infecciones localizadas en el torrente intravascular, as como sitios de acceso intravenoso perifrico, central y para hemodilisis.

Infecciones del aparato circulatorio. Hemocultivo

En el caso de las bacteremias y septicemias es necesario el cultivo de sangre, as como en las infecciones endovasculares el cultivo de la punta de catter para el diagnstico microbiolgico de los mismos.

Toma de muestra de sangre

El momento ideal es durante el ascenso de la curva febril.
1.

2.
3.

4.

Seleccionar el sitio. Preparacin del sitio. Desinfectar las tapas de las botellas para el hemocultivo con isodine. Proceder a la venopuncin en una proporcin de 1:10.

Mtodo de Maki, cultivo de catteres

1.

Realizar una antisepsia cuidadosa del sitio de insercin y retirar el catter.

2. Cortar con tcnica estril a 4 5 cm del extremo del catter. 3. Colocar la punta en un tubo estril para ser enviada al laboratorio. 4. Una vez en el laboratorio se procede a inocular mediante rodamiento en una placa de agar sangre la punta del catter. 5. La placa de agar sangre debe ser incubada en microaerofilia a una temperatura de 36C durante un mximo de 72 horas con lecturas intermedias cada 24 horas. 6. Despus de la incubacin, realizar contaje del nmero de colonias bacterianas y si el nmero de colonias en la placa es igual o mayor de 15, la posibilidad de septicemia con este punto de origen es alta.

Diagnstico microbiolgico de las infecciones del sistema nervioso central.

Meningitis: Inflamacin de las meninges. Encefalitis: Inflamacin o infeccin del tejido cerebral o ambos fenmenos. Meningoencefalitis: Inflamacin o infeccin del cerebro o ambas alteraciones con afeccin de las meninges. Meningitis bacteriana: Inflamacin menngea causada por una bacteria patgena presente en LCR.

Meningitis asptica: Inflamacin menngea de causa diversa, sin evidencia de un microorganismo patgeno detectable en LCR.

Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto genital

Vaginitis: es la inflamacin de la vagina que se acompaa comnmente con secrecin vaginal o leucorrea. Vaginosis bacteriana: es la causa ms frecuente de infeccin vaginal entre las mujeres en edad frtil.

Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto genital

Cervicitis: es una ITS generalmente asintomtica pero con importantes complicaciones y secuelas a largo plazo. Agentes importantes productores de cervicitis: C. trachomatis, N. gonorrhoeae, virus del herpes simple (VHS) y el virus del papiloma humano (VPH).

Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto genital

Uretritis: consiste en la inflamacin de la uretra, que ocasiona sntomas como: disuria, dispareunia, secrecin uretral mucopurulenta y eritema del meato.

Vaginosis bacteriana

A) score=0; B) score=2; C) score=4; D) score=6.

E) score=8; F) score=10.

Atopobium vaginae

Biofilm

Tx metronidazol, 3 y 35 das.

Hifas y clamidoconidios

Tubo germinativo

CRITERIOS PARA EL DIAGNSTICO DE VAGINOSIS CITOLTICA

Sntomas y signos: Prurito y/o ardor vaginal. Examen ginecolgico: Descarga abundante de flujo de aspecto de leucorrea e irritacin de la mucosa vaginal. Cultivo vaginal: Desarrollo de flora comensal (lactobacilos). Estudio de gram: Compatible con identificacin de lactobacilos abundantes. Medicin del pH vaginal: Anormalmente cido, entre 3,5 y 4,5. Estudio por microscopa: Demostracin en biopsia o extendido citolgico, de lisis en las clulas epiteliales. Caractersticas frecuentes de los lactobacilos: Se observan cambios morfolgicos.

Diagnstico microbiolgico de las infecciones por bacterias anaerobias

Las bacterias anaerobias son patgenos importantes de infecciones en el hombre. Pueden estar involucradas en cualquier tipo de infeccin, de piel y tejidos blandos, osteomielitis, infecciones pleuropulmonares, intra-abdominales y del tracto genital femenino

Cultivo

Si se sospecha la participacin de flora bacteriana mixta, tanto anaerobia como facultativa, se recomienda el uso de medios de cultivo no selectivos y selectivos. Como agar base se emplea agar Schaedler, agar Brucella, agar Wilkins Chalgren, agar CDC.

Aislamiento primario e identificacin

Mtodo convencional: Galera de medios diferenciales que ponen en evidencia la capacidad de microorganismos para utilizar carbohidratos, licuar la gelatina, producir indol y ureasa, reducir los nitratos, hidrolizar la esculina, crecer en bilis al 20%, producir lecitinasa o lipasa, entre otras, son las ms utilizadas.

Aislamiento primario e identificacin

Mtodos bioqumicos rpidos miniaturizados: API 20: 15 carbohidratos, urea, gelatina, esculina, medio para detectar indol. Mtodos enzimticos: RAPID ID32 detecta enzimas preformadas en unas pocas horas despus de la inoculacin, se incuba aerbicamente. Identificacin por mtodos moleculares: Se han utilizado sondas y PCR.

Interpretacin de la prueba de aerotolerancia:

Considerar como bacterias anaerobias aquellos morfotipos que: Crecieron nicamente en atmsfera anaerobia. Sin embargo, algunas especies de Actinomyces, Propionibacterium y Bifidobacterium crecen en atmsfera de CO2 aumentada y en anaerobiosis, no crecen en aerobiosis.

GRACIAS!!!