Reacción en cadena de la polimerasa

La PCR es un procedimiento eficaz para generar grandes cantidades de un

determinado Secuencia de ADN in vitro. Esta amplificación, que puede ser más de
un millón de veces, se logra mediante un proceso de ciclo de tres pasos. Los
componentes esenciales para la amplificación por PCR son (1) dos cebadores de
oligonucleótidos sintéticos (~20 nucleótidos cada uno) que son complementarios a
regiones en lados opuestos hebras que flanquean la secuencia de ADN diana y que,
después de hibridarse con la el ADN de origen, tienen sus extremos hidroxilo 3'
orientados uno hacia el otro; (2) un secuencia de plantilla en una muestra de ADN
que se encuentra entre la unión del cebador sitios y que pueden tener una longitud de
100 a ~35.000 pb; (3) un termoestable ADN polimerasa que puede resistir el
calentamiento a 95°C o más y que copia la plantilla de ADN con alta fidelidad; y (4)
los cuatro desoxirribonucleótidos.
Un proceso de PCR típico implica una serie de ciclos para amplificar una secuencia
de ADN específica. Cada ciclo tiene tres pasos sucesivos.
1. Desnaturalización. El primer paso en el sistema de amplificación por PCR es la
desnaturalización térmica de la muestra de ADN elevando la temperatura dentro de
un tubo de reacción a 95°C. Además del ADN molde de origen, este tubo de
reacción contiene un gran exceso molar del dos cebadores de oligonucleótidos, una
ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, ADN polimerasa Taq, aislada de la
bacteria Thermus aquaticus), y cuatro desoxirribonucleótidos. La temperatura es
mantenido durante aproximadamente 1 minuto.
2. Renaturalización. Para el segundo paso, la temperatura de la mezcla se baja
lentamente a ~55°C. Durante este paso, el par de bases de los cebadores con sus
secuencias complementarias en la muestra de ADN.
3. Síntesis. En el tercer paso, la temperatura se eleva a ~75°C, que es óptimo para el
funcionamiento catalítico de la ADN polimerasa Taq. La síntesis de ADN se inicia
en el extremo hidroxilo 3' de cada cebador y utiliza el ADN de origen como molde
(fig. 4.14). Todos los pasos de un ciclo de PCR se llevan a cabo en un calentador de
bloques automatizado que está programado para cambiar la temperatura después de
un período específico de tiempo. Un ciclo generalmente dura de 3 a 5 minutos.
Para entender cómo el protocolo PCR logra amplificar un discreto segmento de
ADN, es importante tener en cuenta la ubicación de cada sitio de hibridación del
cebador y su secuencia complementaria dentro de las hebras que se sintetizan
durante cada ciclo. Durante la fase de síntesis del primer ciclo, el ADN recién
sintetizado de cada cebador se extiende más allá del punto final de la secuencia que
es complementaria a la segunda cebador. Estos nuevos hilos forman "plantillas
largas" que se utilizan en el segundo ciclo (Fig. 4.14).
Durante el segundo ciclo, las hebras de ADN originales y las nuevas hebras
sintetizados en el primer ciclo (plantillas largas) se desnaturalizan y luego hibridó
con los cebadores. El gran exceso molar de cebadores en la mezcla de reacción
asegura que se hibridarán con el ADN molde antes las hebras de plantilla
complementarias tienen la oportunidad de reasociarse entre sí.
Una segunda ronda de síntesis produce plantillas largas a partir del original.
hebras, así como algunas hebras de ADN que tienen una secuencia de cebador en
una terminan y terminan con una secuencia complementaria al otro cebador en
el otro extremo (“plantillas cortas”) que se generaron a partir de las plantillas largas
(Fig. 4.15).
Durante el tercer ciclo, plantillas cortas, plantillas largas y originales. todas las
hebras se hibridan con los cebadores y se replican (Fig. 4.16). En ciclos posteriores,
las plantillas cortas se acumulan preferentemente, y por la ciclo 30, estas hebras son
alrededor de un millón de veces más abundantes que ya sea la hebra plantilla
original o larga (Fig. 4.17). PCR se ha convertido en un técnica generalizada que se
utiliza para innumerables propósitos, algunos de los cuales se describen aquí y
muchos otros en los capítulos siguientes.

Amplificación por PCR de ADNc de longitud completa

Un método basado en PCR que enriquece moléculas de ADNc de longitud completa
implica añadiendo un oligonucleótido que consta de una secuencia de oligo(dT)
seguida por una secuencia de cebador de PCR en el extremo 5' a una preparación de
ARNm de poli(A) purificado (fig. 4.18). La primera cadena de ADNc se sintetiza
con la enzima transcriptasa inversa, que cataliza la síntesis de una hebra de ADN
usando El ARN como molde. Cuando la transcriptasa inversa alcanza el extremo 5′
de un Plantilla de ARN, su actividad de transferasa terminal, que no requiere un
plantilla, agrega nucleótidos adicionales que consisten predominantemente en
citosinas. Un segundo oligonucleótido en la mezcla de reacción que tiene un
poli(dG) secuencia en su extremo 3 'y una secuencia de cebador de PCR en los pares
de bases del extremo 5' con el tracto poli(dC) al final de cada primera hebra de
ADNc de longitud completa. La transcriptasa inversa utiliza la secuencia del
segundo oligonucleótido, incluyendo la secuencia del cebador, como plantilla para
extender primero el cDNA hebra en el extremo 3′. Las condiciones de reacción
evitan que se produzcan repeticiones en tándem. formándose en los extremos 5' de
las primeras cadenas de ADNc de longitud completa. A continuación, invertir y los
cebadores de PCR directa se agregan a la mezcla de reacción, y las moléculas de
cDNA de doble cadena de longitud completa se generan mediante PCR. Incompleto
Las moléculas de ADNc no tienen tramos de oligo(dC) en sus extremos 5'. Como
consecuencia, carecen de la secuencia complementaria necesaria para el cebador
directo, y como resultado, no se amplifican. Además, las secuencias de restricción
Los sitios de endonucleasas que facilitan la clonación en un vector pueden incluirse
como parte de las secuencias de oligonucleótidos oligo(dT)-cebador y cebador-
oligo(dG) originales. Esta estrategia de amplificación por PCR se ha denominado
SMART (que significa mecanismo de cambio en el extremo 5 'de la transcripción de
ARN) ADNc síntesis por parte de sus desarrolladores.

Síntesis de genes por PCR

El ensamblaje de un gen por PCR es más rápido y económico que el llenado
en oligonucleótidos superpuestos usando ADN polimerasa y luego sellando
las mellas con ADN ligasa T4. Un protocolo basado en PCR para el gen total
la construcción comienza con dos oligonucleótidos superpuestos (A y B) que
representan secuencias del centro del gen (Fig. 4.19). Después de ser
recocidos, estos oligonucleótidos tienen grupos hidroxilo 3' empotrados que
proporcionar un punto de partida para la síntesis de ADN durante la fase de
elongación de un ciclo de PCR. Una molécula de ADN de doble cadena está
formada por un relleno reacción. Este ciclo de 4 minutos se repite 20 veces para
maximizar la cantidad del producto que se forma. A continuación, dos
oligonucleótidos adicionales (C y D) se añaden a la mezcla. El oligonucleótido C se
superpone en su extremo 3 ' con el extremo 5' del oligonucleótido A y representa el
nucleótido secuencia del gen inmediatamente aguas arriba del oligonucleótido A
secuencia. El oligonucleótido D se superpone en su extremo 3' con el extremo 5' del
oligonucleótido B y representa la secuencia de nucleótidos del gen inmediatamente
aguas abajo de la secuencia del oligonucleótido B. después de 20 ciclos de
desnaturalización, renaturalización y síntesis, un ADN de doble cadena con un orden
de secuencia específico (CABD). A partir de entonces, se agregan pares de
oligonucleótidos, uno de los cuales se superpone a la secuencia aguas arriba de la
molécula de ADN formada en el anterior. redondo y el otro superpuesto a la
secuencia aguas abajo, y sometido a 20 ciclos de PCR por cada par agregado hasta
que se forme el gen completo. Generalmente, los oligonucleótidos tienen una
longitud de aproximadamente 50 nucleótidos. Así, los 10 rondas de 20 ciclos de
PCR de 4 minutos que se requieren para sintetizar un gen con 1.000 pb se puede
realizar en 1 día. Además, al igual que con otros métodos para ensamblar genes, el
último par de oligonucleótidos (es decir, los extremos 5' y 3' del gen) se pueden
hacer con secuencias suplementarias fuera del región codificante que facilita la
clonación del gen en un vector y, al mismo tiempo, extremo 5′, con secuencias que
permiten que el gen se exprese en una célula huésped.

Técnicas de secuenciación de ADN

En términos moleculares, la comprensión definitiva
de una molécula de ADN viene
de determinar su secuencia de nucleótidos. La
función de un gen a menudo puede
deducirse de su secuencia de nucleótidos. Por
ejemplo, un presunto
La secuencia de aminoácidos, determinada a partir
de la secuencia de nucleótidos, puede ser
en comparación con secuencias de proteínas de
genes conocidos, y una similitud de secuencia
significativa generalmente indica una proteína con
una función equivalente. También,
regiones de codificación distintivas, como sitios de
unión al ADN, reconocimiento de receptores
pueden determinarse sitios y dominios
transmembrana. el nucleótido
secuencias en regiones no codificantes (regiones
que no codifican una proteína o
molécula de ARN) puede proporcionar información
sobre la regulación de un gen. En
Además, la información de la secuencia de
nucleótidos es esencial para los estudios de
clonación molecular y para caracterizar la actividad
génica.
Durante más de 3 décadas, el procedimiento
didesoxinucleótido desarrollado
por Fred Sanger se ha utilizado para la
secuenciación de ADN. Esto incluye
secuenciación de fragmentos de ADN que contienen
de uno a unos pocos genes y también
muchos genomas completos, incluido el genoma
humano. Sin embargo, el interés
en la secuenciación de grandes cantidades de
moléculas de ADN en menos tiempo y a menor
El costo ha impulsado el desarrollo reciente de
nuevas tecnologías de secuenciación.
que puede procesar de miles a millones de
secuencias al mismo tiempo (un término
usado a menudo para describir esto es paralelización
masiva). Muchos diferentes
actualmente se están explorando tecnologías de
secuenciación; sin embargo, aquellos que
han llegado a la etapa de comercialización se basan
en gran medida en los principios de secuenciación
por síntesis, que incluye pirosecuenciación y
secuenciación usando terminadores de cadena
reversibles, y secuenciación por ligación. En
general, estos nuevos métodos de segunda
generación implican la repetición
ciclos de (1) adición enzimática de nucleótidos a un
cebador basado en la complementariedad con un
fragmento de ADN molde y (2) detección e
identificación de los nucleótidos agregados. Las
técnicas difieren en el método por
que los nucleótidos se extienden, empleando ADN
polimerasa para
catalizar la adición de un solo nucleótido o ligasa
para agregar un oligonucleótido complementario
corto, y en el método por el cual se realiza la
adición
detectado. A pesar del desarrollo de estas nuevas y
prometedoras tecnologías, el procedimiento
didesoxinucleótido de Sanger sigue siendo el
método más utilizado en la actualidad y es muy
adecuado para la secuenciación a pequeña escala.
proyectos (en el rango de kilobase a megabase).
Procedimiento didesoxinucleótido para la
secuenciación del ADN
Un didesoxinucleótido es una molécula hecha por el
hombre que carece de un hidroxilo
grupo en los carbonos 2' y 3' del resto azúcar (Fig.
4.20A). Por el contrario, un desoxirribonucleótido
natural tiene un grupo hidroxilo 3 'en el azúcar
unidad (Fig. 4.20B). Normalmente, durante la
replicación del ADN, un elemento natural entrante
El nucleósido trifosfato está unido por su grupo 5′
α-fosfato al 3′
grupo hidroxilo del último nucleótido de la cadena
en crecimiento (Fig. 4.21).
Sin embargo, si se incorpora un didesoxinucleótido
al final del crecimiento
cadena, la síntesis de ADN se detiene porque un
enlace fosfodiéster no puede ser
formado con el siguiente nucleótido entrante (Fig.
4.22). La terminación de
La síntesis de ADN es la característica por
excelencia del método de secuenciación de ADN de
didesoxinucleótidos, aunque se deben cumplir otras
condiciones experimentales.
antes de que se pueda determinar una secuencia de
ADN.
En principio, el primer paso en el procedimiento
estándar de laboratorio para
La secuenciación del ADN de didesoxinucleótidos
implica hibridar un oligonucleótido sintético (17- a
24-mer; cebador) a un segmento predeterminado de
una hebra
del ADN a secuenciar, por ejemplo, a un segmento
de un vector de clonación
cerca del sitio de inserción del ADN clonado. El
oligonucleótido actúa como un
cebador al proporcionar un grupo hidroxilo 3 'para
el inicio de la síntesis de ADN. En el método
original, la muestra de ADN preparada se divide en
uatro tubos de reacción separados. Cada tubo
contiene cuatro desoxirribonucleótidos.
(dATP, dCTP, dGTP y dTTP), uno de los cuales
está radiomarcado y otro
los cuatro didesoxinucleótidos (trifosfato de
didesoxiadenosina [ddATP],
trifosfato de didesoxicitidina [ddCTP], trifosfato de
didesoxiguanosina
[ddGTP] o trifosfato de didesoxitimidina [ddTTP]).
La concentración
de cada didesoxinucleótido en cada tubo de reacción
se ajusta cuidadosamente para
asegúrese de que se incorpore a la mezcla de
cadenas en crecimiento en cada
sitio posible. Recuerde que el crecimiento de la
cadena se detiene tan pronto como un
didesoxinucleótido
se incorpora, por lo que cada cadena en crecimiento
eventualmente contendrá un didesoxinucleótido en
su terminal 3 '. Esta condición experimental se
cumple en cada uno de
los cuatro tubos de reacción. En consecuencia,
después de la síntesis enzimática de ADN con
ADN polimerasa, cada tubo de reacción contendrá
un conjunto único de moléculas de ADN
monocatenario de todas las longitudes posibles,
cada una de las cuales incluye el
secuencia del cebador en su extremo 5' (fig. 4.23).
Las reacciones de síntesis se detienen mediante la
adición de formamida,
que evita que las hebras de ADN se apareen y las
moléculas de ADN,
incluidas las moléculas de ADN recién sintetizadas,
se separan mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida. Este procedimiento de separación
resuelve piezas
de ADN que difieren en tamaño en tan solo un
nucleótido. Una autorradiografía del gel muestra
sólo los fragmentos de ADN radiomarcados que
fueron
producido durante el paso de síntesis de ADN
enzimático. Cada uno de los cuatro carriles
en el gel y la autorradiografía corresponde a un tubo
de reacción que contenía uno de los cuatro
didesoxinucleótidos.
La secuencia de un segmento de ADN se determina
observando el orden
de las bandas, con la mayor precisión posible, desde
la parte inferior hasta la parte superior de la
autorradiografía. En el ejemplo que se muestra en la
Fig. 4.24, las primeras 6 bases de la
El ADN secuenciado es AGCTGC. En este caso, la
banda de migración más rápida (la
fragmento radiomarcado más cercano al fondo), que
corresponde al
fragmento de ADN más pequeño, está en el carril
ddATP, la siguiente banda está en el
carril ddGTP, el siguiente está en el carril ddCTP, el
siguiente está en el carril ddTTP,
y así. Se pueden resolver hasta 500 bandas de
manera confiable en la mayoría de las
autorradiografías. Por lo general, la secuencia del
cebador se coloca entre 10 y 20 nucleótidos del
ADN objetivo para que el investigador pueda
reconocer el
secuencia conocida al comienzo de la
autorradiografía y así identificar
precisamente el primer nucleótido del ADN diana.
Aunque el procedimiento descrito anteriormente
todavía se usa para algunas aplicaciones
especializadas, en la práctica, todo el procedimiento
ha sido automatizado y
generalmente usa nucleótidos marcados con
colorantes fluorescentes que se detectan
utilizando un láser, en lugar de nucleótidos
radiomarcados que se visualizan en
una autorradiografía. La secuenciación
automatizada de ADN minimiza el manual
manipulaciones y aumenta la tasa de adquisición de
datos de secuencia, que es
esencial para ensamblar grandes cantidades de datos
de secuencias de nucleótidos de
genomas procarióticos y eucarióticos completos.
Análisis de secuencias automatizado
puede llevarse a cabo con cuatro colorantes
fluorescentes diferentes, uno para cada reacción de
didesoxinucleótido, o con el mismo colorante
fluorescente para cada didesoxinucleótido en cada
mezcla de reacción. En algunos casos, la
imprimación, en lugar de
un didesoxinucleótido, se marca con un colorante
fluorescente. Con un sistema de cuatro colorantes
fluorescentes, las muestras al finalizar cada reacción
se agrupan, y los fragmentos se separan en un solo
carril de un gel de poliacrilamida o
tubo capilar lleno de polímero. Este tipo de análisis
se denomina “cuatro colores,
detección de un carril”. Alternativamente, con un
marcador de colorante fluorescente, cada
la muestra se ejecuta en un carril separado; esta es la
detección de “un color, cuatro carriles”.
Cada tinte fluorescente emite un espectro estrecho
de luz con un pico distintivo cuando es golpeado
por un rayo láser de iones de argón. El haz escanea
un
ubicación fija cerca de la parte inferior de la matriz
electroforética. A medida que cada fragmento
etiquetado sucesivo pasa a través del haz, la
excitación por el láser
provoca una emisión con características espectrales
específicas que es detectada por un tubo
fotomultiplicador. Los datos de emisión se registran
y almacenan en un ordenador.
Una vez completada una serie, la sucesión de
señales fluorescentes se convierte
a la información de la secuencia de nucleótidos.
Para un sistema de un carril de cuatro colores, cada
tinte fluorescente emite una longitud de onda
diferente, y el orden de espectral
respuestas en un solo carril corresponde a la
secuencia de nucleótidos (Fig.
4.25 y 4.26A a C). En otras palabras, cada tinte
representa un nucleótido particular. Con un sistema
de un solo color y cuatro carriles, las señales
fluorescentes del
los fragmentos terminados en dideoxinucleótido se
registran en sucesión a lo largo
los cuatro carriles. En este caso, el orden general de
las señales fluorescentes como
la función de cada carril corresponde a una
secuencia de nucleótidos. Entre paréntesis,
La secuenciación de ADN con marcador radiactivo
es equivalente al formato de cuatro carriles de un
color (fig. 4.26D).