25 de marzo del 2020

PRACTICA 3
AISLAMIENTO Y CONSERVACION DE BACTERIAS Y HONGOS
PARTE IA Y PARTE II
MORFOLOGIA COLONIAL Y CRECIMIENTO EN MEDIO LIQUIDO
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS
DANIELA IBARRA MALDONADO, MISAEL MONDRAGON HERNANDEZ, MARIA FERNANDA RODRIGUEZ BRAVO
E-mails: m.mondragonhernandez@ugto.mx mf.rodriguezbravo@ugto.mx d.ibarramaldonado@ugto.mx

RESUMEN
En esta practica primero el profesor dio una introducción al tema, explicando lo que se realizaría.
Comenzamos Inoculando colonias de bacterias y actinomicetos aislados de la practica anterior en distintos tipos
de medios de cultivo, liquido, agar nutritivo y en agar inclinado. También se hicieron descripciones detalladas
de la morfología colonial de cada una.
Posteriormente para el aislamiento de bacterias anaerobias se realizaron 3 diluciones en agua destilada de las
cuales se realizo simbra en agar tioglicolato y agar sangre en la mitad de la caja Petri. Después del tubo con la
dilución 10-1 se calentó en baño maría y una vez que pasaron 10 minutos se sembró de este tubo en la otra mitad
de la caja Petri. Un equipo fue el encargado de sembrar Clostridium en los mimos medios. Después de dos días
se realizó una tinción Gram y se observó al microscopio en objetivo de 40x.
Se realizaron una serie de diluciones decimales hasta 10-3 y se sembraron cada una de ellas en tubos de 10 ml
de leche-fierro con sello aceite mineral y se dejaron incubadas durante 24 h después de este periodo se
observaron y fueron determinados los cálculos necesarios.

INTRODUCCION PARTE IA

Al desarrollarse las colonias bacterianas sobre los medios sólidos las células en división no se dispersan, por lo que la
población está en forma compacta o densa. Los nutrientes en el centro de la colonia pronto escasearan, de esta forma
los microorganismos dejaran de reproducirse, pero en la periferia de la colonia las células continúan desarrollándose.
La colonia bacteriana no se extiende en forma indefinida sobre la superficie del medio de cultivo, sino que representa un
borde, el cual por su forma es característico para ciertas especies de bacterias.
Las bacterias aisladas y bien definidas se desarrollan a partir de una célula bacteriana individual por lo que puede
considerarse que todas las bacterias en la colonia son idénticas desde el punto de vista genético.

Las características de la morfología colonial bacteriana que nos ayudan a seleccionar e identificar a estos
microorganismos son:

 tamaño en mm
 color
 forma: puntiforme, circular, filamentosa, ameboide, alargada o fusiforme.
 Elevación: plana, elevada, convexa, pulvinada y umbonada.
 Borde o margen: entero, ondulado, lobulado, filamentosa, enrollado o festoneado.
 Superficie: lisa o rugosa.
 Aspecto: húmeda o seca.

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 Transmisión de la luz: traslucida, opaca o transparente.

 Reflexión de la luz: brillante o mate.
 Consistencia: butirosa o blanda, dura o friable.

MORFOLOGÍA COLONIAL

INTRODUCCION PARTE II
Un factor que influye de manera importante en el crecimiento microbiano es el oxigeno y aunque es un gas muy reactivo,
muchos microorganismos dependen de la disponibilidad de este como nutriente. Los microorganismos se pueden
clasificar de acuerdo con sus necesidades y tolerancia al oxigeno como: aerobios estrictos, microaerófilos, anaerobios
facultativos, aerobios estrictos y anaerobios aerotolerantes.
Mientras que la aeración se emplea para incrementar el crecimiento de los microorganismos aerobios, el oxigeno debe
ser excluido del medio para permitir el crecimiento de los anaerobios estrictos. Esto se puede hacer agregando sustancias
reductoras al medio de cultivo que reaccionan con el oxigeno molecular disuelto, eliminándolo. Por ejemplo,
frecuentemente se añade tioglicolato de sodio, cisteína.
En los medios líquidos se suele burbujear nitrógeno, hidrogeno o bióxido de carbono para desplazar al oxigeno y
posteriormente se sella el recipiente para evitar que entre de nuevo oxígeno. Además, hay muchos modelos de cámaras
de cultivo para aerobios que se emplean para eliminar el oxígeno.

RESULTADOS

Crecimiento en medio liquido

Conservación de cultivo puros
Aislamiento de bacterias anaerobias de material fecal
Cultivo en la jarra de anaerobiosis (sistema Gas Pak)

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Estimación de Clostridium sp en una muestra de material fecal por NMP

En los tubos número 1 todos cuajaron

1 1 1
En los tubos número 2 solo 1 cuajaron

2 2 2
En los tubos numero 3 ninguno cuajo

3 3 3

𝟏
𝑵𝑴𝑷 𝑿
𝑵𝑼𝑴𝑼𝑬𝑹𝑶 𝑴𝑨𝑺 𝑨𝑳𝑻𝑶 𝑫𝑬 𝑪𝑶𝑵𝑪𝑬𝑵𝑻𝑹𝑨𝑪𝑰𝑶𝑵 𝑴𝑨𝑺 𝑫𝑰𝑳𝑼𝑰𝑫𝑨 𝑸𝑼𝑬 𝑺𝑬 𝑼𝑻𝑰𝑳𝑰𝒁𝑶

𝟏
NMP = 𝟒𝟑 𝑿 = 𝟒𝟑𝟎𝟎𝟎
𝟏𝑿𝟏𝟎−𝟑

Comparación del crecimiento en medios líquidos de diferente potencial redox de Clostridium sp, Escherichia coli y
Bactcillus subtilis.

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En esta imagen podemos observar 3 tubos de ensaye los cuales

tienen como medio liquido BHI (infusión de cerebro y corazón) que
cuenta con un pH de 7.4. En el tubo que contiene la muestra de
Escherichia coli (1), podemos decir que estas son anaerobias
facultativas ya que en la imagen se observa más cantidad de
bacterias en la parte superior, pero también se puede observar que
todo el medio se encuentra turbio.
En el tubo numero 2 el cual contiene la muestra de Bactcillus subtilis,
podemos observar que la mayoría de las bacterias se concentran en
la parte superior y con esto podemos concluir que son bacterias
aeróbicas.
En el tubo numero 3 el cual contiene la muestra de Clostridium sp,
se puede decir que estas son bacterias anaerobias estrictas ya que
podemos observar en la imagen como la mayor parte de las bacterias

Imagen 1 se concentran en la parte inferior.

En esta imagen podemos observar 3 tubos de ensaye los cuales tienen

como medio liquido caldo nutritivo que cuenta con un pH de 6.9.
En el tubo número 1 y 2 el cual contiene la muestra de Escherichia coli
y de Bactcillus subtilis no se puede observar con gran detalle las
bacterias, pero en la parte superior se observa un poco mas turbio y
con esto podemos concluir que son microaerófilos.
En el tubo numero 3 el cual contiene la muestra de Clostridium sp,
podemos observar como la mayoría de las bacterias se concentran en
la parte inferior y con esto podemos decir que estas son anaerobias
estrictas.

Imagen 2

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En la imagen numero 3 podemos observar 3 tubos de ensaye

los cuales contienen como medio liquido tioglicolato, el cual
cuenta con un pH de 7.1.
En el tubo numero 1 el cual contiene la muestra de Escherichia
Coli se puede observar que las bacterias se encuentran
dispersas en todo el medio, con esto podemos concluir que son
bacterias anaerobio-aerotolerantes.
En tubo numero 2 el cual contiene la muestra de Bactcillus
subtilis se puede observar que las bacterias se encuentran
concentradas en la parte superior del medio, teniendo como
conclusión que estas son bacterias aerobias.
En el tubo numero 3 el cual contiene la muestra de Clostridium
se observa que las bacterias se encuentras distribuidas en todo
el medio líquido, esto quiere decir que son bacterias anaerobio-
tolerantes.

Imagen 3

Por último, se realizaron varias tinciones Gram y se observaron al microscopio

Tinción Gram E. Coli

En esta imagen podemos observar una muestra de E. Coli la cual se observó
con un objetivo de 40x. Se observa una coloración morada, esto se refiere a
que es una bacteria Gram positiva.

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Tinción Gram Bactcillus subtilis

En esta imagen podemos observar una muestra de Bactcillus subtilis la cual
se observó con un objetivo de 40x. Se observa una coloración morada, lo
que quiere decir que esta bacteria es Gram positiva.

Tinción Gram Clostridium

En esta imagen observamos una muestra de Clostridium la cual se
observo con un objetivo de 40x. Podemos distinguir una coloración
morada, lo que indica que esta bacteria es Gram negativa.

Tinción Gram gelosa sangre

En esta imagen podemos observar una muestra de Eses sin ser llevada
aun a calentamiento. Se observo con el objetivo 40x. Podemos
observar en la imagen una coloración rojiza, lo cual quiere decir que en
una bacteria Gram negativa

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Tinción Gram tioglicolato

En esta imagen podemos observar una muestra de heces en un
medio de tioglicolato. Se observo con el objetivo 40x dando como
resultado una bacteria Gram positiva.

OBSERVACIONES
 En el agar de tioglicolato la siembra fue mejor y se observo de mejor manera
 En la tinción Gram todas las muestras dieron mayormente Gram positiva, pero buscando bibliográficamente es
gran positiva, esto puede deberse a una mala tinción.
 Al momento de determinar si eran anaerobias o anaerobias facultativas notamos que nos costaba determinar
cada una de ella, ya que no se habían separado completamente.
 Se requirió dejar más de 24hrs, los tubos de agar nutritivo inclinado y el agar nutritivo en caja, ya que aun no se
notaba un gran crecimiento.
 La mayoría de los tubos de leche-fierro no fueron positivos (no hubo una fermentación “tormentosa” presente),
esto pudo ser debido a la dilución decimal que se hizo.
 Tuvimos problemas al elegir nuestros actinomicetos ya que no teníamos una gran variedad y los pocos que
teníamos se encontraban en muy pequeñas cantidades.

PARTE ll

DISCUSION DE RESULTADOS
Al realizar la parte I de esta práctica se resaltó la importancia de la descripción de todas las características morfologías
de las colonias y la descripción del crecimiento en diferentes medios de cultivo como el agar inclinado o en medio líquido.
Además de observaron más a fondo las colonias obtenidas de las muestras de tierra y del agua del inodoro, que se
trabajaron en la práctica pasada además se realizaron algunas siembras de estos resultados previos de diferentes colonias
y actinomicetos (3 de cada uno) en diferentes medios de cultivo ya mencionados, así como observar su morfología y sus
principales características.
Por otra parte, la parte II nos ayudó a identificar algunas características más específicas de bacterias anaerobias. Se
observó su comportamiento en agar Tioglicolato y agar sangre en una jarra de anaerobiosis con el uso de Gas Pak, aunque
hubo crecimiento en estos medios después del calentamiento en agua, estos resultados se puedes comparar o validar
por medio de la investigación bibliográfica. También logramos la cuantificación del número más probable de bacterias en

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una muestra de materia fecal (de conejo), como un método para la cuantificación de estos organismos anaerobios. Y
como parte final se observó y comparó el crecimiento de organismos aerobios, facultativos y anaerobios según su
naturaleza y su comportamiento en presencia de oxígeno.
Algo muy importante fue que aprendimos de forma más clara a identificar la morfología de las diferentes colonias, desde
su aspecto, color, borde, la lux transmitida y reflejada, entre otras.

CONCLUSION

En esta práctica aprendimos a identificar la morfología de las colonias en las cajas de Petri describiendo cada una de sus
características, esto nos ayuda a poder diferenciar una colonia de bacterias de otra ya que por lo general suelen ser
parecidas pero analizándolas a detalle se logran apreciar las distintas características que cada una de ellas tienen como
son el color, tamaño, forma, etc. Pero no solo aprendimos todo esto de bacterias sino que también aplicamos todo esto
con actinomicetos que gracias a las diferencias que tienen hacia las bacterias pudimos llevar a cabo esta parte de la
práctica; lo interesante es que no solo resembramos sino que también inoculamos en distintos medios que fueron en
medio líquido, inclinado y en caja.
Por otra parte también aprendimos a identificar los potenciales de óxido reducción en microorganismos aerobios,
anaerobios estrictos y anaerobios facultativos. Esto se logró utilizando materia fecal (conejo) en distintos medios como
fue el tioglicolato, para así identificar el crecimiento de los microorganismos.
El medio de leche-fierro nos ayudó a estimar el NMP/g y así tener una mayor idea más certera de cuantos
microorganismos se encuentran.
Gracias a esto aprendimos nuevas técnicas, medios de cultivo y a identificar las características que diferencian a una
bacteria de otra y a estimar la población de microorganismos que podemos obtener.

CUESTIONARIO IA
1. Describe en la tabla siguiente las características morfológicas de tres colonias de bacterias aerobias o
anaerobias facultativas aisladas en gelosa nutritiva o en gelosa cuenta estándar

CARACTERISTICA COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 3

Tamaño 0.5 x 1 cm 0.5 x1 cm 0.5 x1 cm

Color Amarilla Amarilla Blanca

Forma Circular Circular Circular

Elevación Plana Plana Plana

Superficie Plana Plana Plana

Aspecto Húmedo Húmedo Húmedo

Borde Liso Liso Liso

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Luz transmitida Si No No

Luz reflejada Si Si Si

Consistencia Cremosa Cremosa Cremosa

Pigmento no No No

1. Describe el tipo de crecimiento en medio líquido, en gelatina y en agar inclinado que presenta cada una de
las colonias.

Colonia Crecimiento en gelatina Crecimiento en agar inclinado Crecimiento en agar líquido

1 Uniforme color beige. Filiforme color beige. Sin crecimiento.

2 Difuso color tornasol. Esquinado color blanco. Sin crecimiento.

3 Difuso color transparente Difuso color tornasol. Sin crecimiento.

Posteriormente se sembraron dichas colonias en medio de gelatina, de agar nutritivo inclinado y en medio
líquido caldo nutritivo. Se dejaron en incubación a 28°C por 24 horas y al observarse mostraron la
morfología mostrada en la tabla e imágenes. En el agar inclinado dos colonias fueron algo abundantes,
mientras que una mostró muy poco crecimiento. En la parte superior del agar inclinado puede apreciarse
un crecimiento más pobre que en la parte inferior, lo cual es atribuible a la disminución de los nutrientes
disponibles. En el medio liquido no se presentó ningún crecimiento para ninguna de las colonias.

2. Describa la morfología colonial de tres colonias de actinomicetos

CARACTERISTICAS COLONIA 1 COLONIA 2 COLONIA 3

Tamaño (mm) 2x 2.5 9.5 x 2.5 3 x 0.5

Color Blanco con Amarillo Blanco Blanco

Forma Filamentosa Ameboide Ameboide

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Elevación Plana Plana Plana

Superficie lisa lisa Lisa

Aspecto Húmedo Húmedo Húmedo

Borde Fimbriado Lobulado Lobulado

Luz transmitida si no No

Luz reflejada no no No

Consistencia cremosa Cremosa Cremosa

Pigmento Sin pigmento Sin pigmento Sin pigmento

3. Haga esquemas a colores de sus colonias aisladas y de las diferentes formas de crecimiento tanto en medio
solido como líquido. (ver imágenes)

4. En las ultimas estrías de un puro se observan colonias que tienen las mismas características de la morfología
colonias pero que difieren de tamaño ¿Cómo explica este hecho? Puede deberse a que son diferentes tipos
de bacterias o cualquier microorganismo, siendo de la misma familia, pero de diferente especie

5. ¿Qué relación existen la forma de crecimiento de las bacterias en medio liquido y sus requerimientos de
oxígeno, así como el efecto del medio de cultivo? El crecimiento se observa de acuerdo con el gradiente de
O2 mientras más cercano este a la superficie, mayor (O2) habrá. La tensión superficial puede impedir el
crecimiento uniforme de los microorganismos en el medio líquido.

CUESTIONARIO II
1. Describa en la siguiente tabla, la morfología colonial de dos colonias aisladas de material fecal incubada en
la jarra de anaerobiosis y de la cepa de referencia (Clostridium sp.)
Característica Colonia en agar sangre. Colonia en agar tioglicolato.
Forma Redonda Redonda
Tamaño (mm) 3 2
Color Blanca Blanca
Borde Regular Regular
Superficie Lisa Lisa
Luz reflejada Brillante Brillante
Luz transmitida Opaco Opaco
Aspecto Húmedo Húmedo
Consistencia Cremosa Cremosa
Acción sobre el medio Hemólisis α Ninguno

2. Describa en la siguiente tabla la morfología microscópica de dos colonias aisladas de la muestra fecal
incubada en la jarra de anaerobiosis

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Características Colonia 1 Colonia 2 Clostridium

Forma
Agrupación
Tinción Gram
Presencia de endosporas

3. Haga un esquema de las observaciones anteriores.

Ver imágenes.
4. Calcule el NMP de anaerobios en la muestra a partir del numero de tubos obtenidos en medio leche-fiero
utilizando la tabla adjunta

Dilución Numero de tubos positivos NMO/g

10-1 3 43000
10-2 1
10-3 0

5. Dibuje esquemas del crecimiento de las tres cepas en los tres medios de cultivo.
Ver imágenes.

BICLIOGRAFIA
[1] Rivas, C. Mora, M. (sf). “Bacterias anaerobias” en TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA. [PDF].
Recuperado el 23 de febrero de 2020. Fig. 4. Tubos con caldos nutritivo (N), BHI (B) y tioglicolato (T), cultivados con
E. coli (izquierda), B. subtillis (centro) y Clostridium sp (derecha). N B T N B T T N B
[3] Marielsa Gil. (sf). Caldo tioglicolato: fundamento, preparación y usos. 23 de febrero de 2020, de Lifeder Sitio web:
https://www.lifeder.com/caldo-tioglicolato/
[2] Marielsa Gil. (sf). Agar sangre: fundamento, usos y preparación. 23 de febrero de 2020, de Lifeder Sitio web:
https://www.lifeder.com/agar-sangre/

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