Preparación de medios de cultivo

Informe de Laboratorio Nº 1-Cultivo de tejidos vegetales

Guacalés, D. , Moreno, K. , Torres, V.
Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología
dguacales6371@uta.edu.ec ; kmoreno4648@uta.edu.ec ; ktorres1240@uta.edu.ec

RESUMEN
La preparación de medios de cultivos es el primer paso para realizar cultivos vegetales, este se
debe realizar con asepsia para evitar desde este punto la contaminación en los cultivos. En este
trabajo se desarrollaron tres medios diferentes teniendo como base la preparación del medio
Murashige y Skoog (MS), enriquecido con BAP y 2,4-D en el primer medio, para el segundo se
enriqueció con BAP y ANA y para el último medio se enriqueció con BAP y AIA. Se preparo
500 ml de cada medio colocando los componentes en el siguiente orden: macronutrientes,
micronutrientes, vitaminas, hormonas fitorreguladores, sacarosa, ajustar pH y agregar gelificante
para realizar posteriormente el autoclavado por un día para uso en las practicas a realizar.
ABSTRACT
The preparation of culture media is the first step to carry out vegetable crops, it must be done with
asepsis to avoid from this point the contamination in the crops. In this work, three different media
were developed based on the preparation of the Murashige and Skoog (MS) media, enriched with
BAP and 2,4-D in the first medium, for the second it was enriched with BAP and ANA and for
the last medium it was enriched with BAP and AIA. 500 ml of each medium was prepared by
placing the components in the following order: macronutrients micronutrients, vitamins,
phytoregulatory hormones, sucrose, adjust pH and add gelling agent to subsequently perform
autoclaving for one day for use in practices to be performed.

I. INTRODUCCIÓN
En los primeros experimentos que utilizaron
medios de cultivar tejidos vegetales se
suministraba los elementos necesarios por
medio de tres sales KH2PO4, Ca(NO3)2 Y
MgSO4 (Roca & Mroginski, 1991). En la
actualidad los medios de cultivos se
presentan en forma de solución acuosa que
sirve como fuente de sacarosa debido a la
escasa actividad fotosintética de los cultivos
in vitro. Para enriquecer el medio se añade
vitaminas, hormonas y sales minerales las
cuales son elementos importantes para los
macronutrientes y micronutrientes. Para la
preparación del medio se debe utilizar agua
desionizada y las sustancias a utilizar para su
preparación deben tener gran alto de pureza,
el almacenamiento prolongado de los
medios de cultivo acumula contaminantes
(Roca & Mroginski, 1991).
Uno de los factores más importantes para el
cultivo vegetal in vitro es la preparación del
medio. Un aspecto importante que
considerar es preparar soluciones madre para
así facilitar el trabajo en prácticas
posteriores. Las soluciones madres deben ser
preparadas en altas cantidades, en el caso de
que la solución madre contenga precipitados
se debe decantar para tener un balance
adecuado en la solución (Abdelnour &
Vincent, 1994)
Dependiendo la especie a cultivar se deberá
preparar el medio, debido a que no todos
tienes los mismos requerimientos como por
ejemplo la edad de la planta.
Uno de los medios más utilizados y base
para cualquier otro medio es el medio de
Murashige y Skoog este medio
experimentado en el desarrollo de plantas de
tabaco. Este medio tiene alto contenido de
potasio y nitrógeno. Para plantas leñosas se
utiliza el medio Lloyd y McCow (UnADM,
2017).
II. MATERIALES Y MÉTODOS 𝑚𝑔
0.5 ⁄𝐿 ∗ 0.5 𝐿
𝑉1 = 𝑚𝑔
Antes de realizar la práctica, se debe realizar 1 ⁄𝑚𝐿
la desinfección a todo el material a utilizar
como son: balón de 500ml, pipetas y puntas 𝑽𝟏 = 𝟎. 𝟐𝟓 𝒎𝑳
de micropipeta. En la Tabla #1 se detalla los
C1: 1 mg/mL V1: 1 mL
reactivos, concentraciones y cantidad a usar
para el volumen de medio de cultivo vegetal C2: 2mg/L V2: 0.5 L
a elaborar. Sin embargo, es indispensable la
verificación de la funcionalidad y 𝐶2 ∗ 𝑉2
𝑉1 =
calibración de: pH-metro, microondas, 𝐶1
agitador magnético con placa calefactora y 𝑚𝑔
autoclave con el fin de optimizar tiempo. 2 ⁄𝐿 ∗ 0.5 𝐿
𝑉1 = 𝑚𝑔
1 ⁄𝑚𝐿
Tabla #1.
Reactivos: Concentración y Volumen 𝑽𝟏 = 𝟏 𝒎𝑳
2,4-D (Ácido 2,4 - diclorofenoxiacético)

Concentración Concentración Relación C1: 1mg/ mL V1: 1.5 mL

Reactivo
Madre Requerida 500ml
Macronutrientes Stock - 50 mL
C2: 3mg/L V2: 0.5 L

Micronutrientes Stock - 50 mL
𝐶2 ∗ 𝑉2
𝑉1 =
𝐶1
Vitaminas 10x - 5 mL
𝑚𝑔
3 ⁄𝐿 ∗ 0.5 𝐿
0.5 mg/L 0.25 mL 𝑉1 = 𝑚𝑔
BAP (6-Bencilamino
1 ⁄𝑚𝐿
1 mg/mL 20 uM 50 uL
purina)

2mg/L 1 mL
𝑽𝟏 = 𝟏. 𝟓 𝒎𝑳

2,4-D (Ácido 2,4 -

1mg/ mL 3mg/L 1.5 mL AIA (Ácido indol-3-acetico)
diclorofenoxiacético)

C1:1mg/ mL V1: 0.25 mL

ANA (Ácido 1-
1mg/mL 0.54 uM 2,25 mL
naftalenacético) C2: 0.5 mg/L V2: 0.5 L
AIA (Ácido indol-3-
1mg/mL 0.5 mg/L 0.25 mL 𝐶2 ∗ 𝑉2
acetico) 𝑉1 =
𝐶1
Sacarosa 30 g/L - 15 g 𝑚𝑔
0.5 ⁄𝐿 ∗ 0.5 𝐿
Agar 7 g/L - 3.5 gr 𝑉1 = 𝑚𝑔
1 ⁄𝑚𝐿

𝑽𝟏 = 𝟎. 𝟐𝟓 𝒎𝑳
Las cantidades por utilizar se deberán
calcular para la elaboración de un medio de A. Elaboración del medio de cultivo
cultivo de 500ml en volumen. vegetal.

Cálculos Demostrativos Una vez realizados los cálculos de la

cantidad requerida para cada reactivo, se
BAP (6-Bencilamino purina) procede a la adición de los reactivos en un
orden especifico. Para la preparación de 500
C1: 1 mg/mL V1: 0.25 mL
mL de medio de cultivo vegetal se agrega:
C2: 0.5 mg/L V2: 0.5 L 50 mL de solución stock de macronutrientes,
50 mL de solución de micronutrientes y 10
𝐶2 ∗ 𝑉2 mL de solución stock de vitaminas.
𝑉1 =
𝐶1
La diferenciación de los medios de cultivo es
por los fitorreguladores adicionados
posteriormente, en este caso se realizó tres
tipos de medios de cultivos vegetales. Para
el primer medio se adiciona 0.25 mL de BAP
de 1 mg/mL y 1.5 mL de 2,4-D de 1 mg/ mL.
En el segundo medio se agrega 50 uL de
BAP de 1mg/ mL y 2.25mL de ANA de
1mg/ mL y en el último medio se
complementa con un 1 ml de BAP Y0.25 mL
de AIA al 1mg/ mL.
A continuación, en los tres medios diferentes
adicionar 15 gr de sacarosa previamente
diluida y agitar los balones, luego ajustar el
pH en un rango de 5.7-5.8 y agregar 3.5 g de
agar. En el microondas se calentará hasta
que empiece un burbujeo lento y se lo llevará
inmediatamente al agitador magnético con
una velocidad y temperatura media, este
paso se lo debe realizar tres veces hasta que
el agar se haya disuelto por completo.
Finalmente trasvasar y tapar los frascos de
vidrio con un volumen de 30mL y colocarlos
en a la autoclave por 20 minutos a 121°C y
15 lb de presión.
III. DISCUSIÓN
El buen manejo del cultivo de tejidos de
plantas depende en su mayoría de la
preparación del medio de cultivo, siendo
esencial para que el nuevo tejido se forme de
una manera adecuada, el medio Murashine-
Skoog conglomera varios nutrientes
adecuados para un amplio número de tejidos
vegetales y es el más usado en este tipo de
técnica vegetal. (Molina, 2013)
Para que se pueda desarrollar un tejido
vegetal, necesita de varios nutrientes
orgánicos, como inorgánicos que vendrían a
considerarse como macronutrientes que
denotarían la composición mineral en dónde
se puede encontrar con el nitrógeno que
puede ser introducido en el medio en forma
de nitrato o de iones de amonio se incorpora
el sulfato de magnesio otorgando al medio
los requerimientos de magnesio y azufre ,
potasio, calcio, fósforo son otros nutrientes
que otorgan las sales en dichos medios
(Vilchez , 2014).
Los micronutrientes como el hierro, níquel,
carbono, oxígeno conjunto con otros 17
elementos esenciales son introducidos en el
medio para una adecuada actividad
metabólica de las células vegetales, además
de otras funciones como síntesis de clorofila,
función de cloroplastos, formación de
precursores de la formación de citocromos,
ferredoxina y lego-hemoglobina
indispensable en la fijación de nitrógeno,
además que sirven para actúan en la síntesis
de triptófano precursor del ácido
indolacético (Widholm, 1972).
La nutrición que es desarrollada en las
condiciones in vitro a partir en los diferentes
órganos y tejidos son considerablemente
heterótrofos en relación al carbono por la
ausencia de asimilación de clorofila por lo
que es importante complementar un fuente
de energía y regulador osmótico que por lo
general es sacarosa, además la incorporación
de vitaminas es indispensable ya que ayudan
a generar una cascada de reacciones
catalíticas en el metabolismo con ayuda de
antioxidantes como el ácido ascórbico y el
ácido cítrico ( Navarro, 1979).
La suplementación del medio con
reguladores de crecimiento como las
auxinas, citoquinas, giberelinas etc.
permiten la adecuada modulación de los
procesos de crecimiento y correcto
desarrollo de las plantas, este tipo de
agregado actúa de una manera eficaz en
bajas concentraciones (Murashine, T; Skoog
F, 1962).
IV. CONCLUSIÓN
La preparación de los diferentes medios de
cultivos vegetales es indispensable para el
correcto crecimiento y desarrollo de los
explantes. Sin embargo, la asepsia es un
factor primordial al momento de realizar el
medio. Los diferentes nutrientes, vitaminas,
fitorreguladores, sacarosa y agar y la adición
de cada uno de ellos en un orden
determinaran la correcta siembra del
explante con los requerimientos necesarios
asegurando un crecimiento vegetal
satisfactorio.
V. BIBLIOGRAFÍA