INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

PRÁCTICA No. 1
“DETERMINACIÒN DE AMINOÀCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALAFA AMINO
LIBRE (METODO DE SANGER)”

Ortiz Sánchez Marcos Jhoan, Jiménez Galván José Angel Sección 4 Gpo: 3FM1

INTRODUCCÓN  Comprender el metodo de Sanger para la

secuenciacion de proteinas
Frederick Sanger comenzo a trabajar en la  Realizar una cromatografia en papel para la
secuenciacion de proteinas en 1943, originalmente separacion-identificacion de los aminoacidos
sus experimentos no estaban dirigidos a secuenciar
una proteina; sus primeros experimentos se dirigian RESULTADOS
a diseñar un metodo major para cuantificar los
grupos amino libres como los correspondientes al Compuesto Frente de Frente RF
segment N-terminal de un polipeptido. Esta técnica la mancha del
de secuenciamiento utiliza el compuesto, 2,4- (compuest disolven
dinitrofluorobenzeno (DNF) que reacciona con el . o) te
residuo del N-terminal bajo condiciones alcalinas DNP-Val 21.8 41.4 0.69
formando un derivado (DNP) amarillo con los grupo DNP- Phe 24.8 40.9 0.58
amino terminal si cortar ningun enlace peptidico. DNP-Ala 23.9 40.7 0.6063
DNP- 27.6 40 0.5265
DNFB
Problema 1 17.5 41.1 0.4257
Problema 2 27.5 41.1 0.6690
Tabla 1 Resultados de cromatografía

1.- Valina

Ilustración 1 Ilustración 1 2.- Fenilalanina

3.- Alanina
Posteriormente la proteina se hidroliza para cortar los
enlaces peptidicos, el aminoacido N-terminal 4.- DNFB
conserva su marca DNP y puede identificarse 5.- Problema 1
separando los productos de la hidrolisis mediante una
cromatografia. 6.- Problema 2

OBJETIVOS
 Identificar el amino N-terminal de la
hemoglobina bovina siguendo el metodo de Ilustración 3 Cromatograma

Sanger
DISCUCION
Mediante el metodo de Sanger identificamos el
residuo N-terminal de las cadenas de la hemoglobina
bovina, para esto diluimos nuestra hemoglobina en
un medio alcalino(NaHCO3) para desprotonar a la
misma, de modo que al momento de adicionar el 1-
fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB) para que asi se
facilite la reaccion del mismo con la hemoglobina y
se lleve acabo la dinitrofelilacion proceso donde el
DNFB desprotona a la hemoglobina para la
formacion de un derivado dinitrofenilado, dicho
proceso se deja reaccionar durante un intervalo
establecido de tiempo y posteriormente se detiene el
proceso volviendo acido al medio.
Para eliminar al DNFB que no reacciono de nuestro
medio realizamos extracciones con eter en una
solucion acuosa de FeSO4 *El eter al ser un
disolvente no polar disuelve al DNFB y la solucion
en la que se encuentra el eter es para reducir la
volatilidad del mismo y hacerlo mas manejable. Una
vez extraido eliminamos los residuos de eter
mediante una evaporacion del mismo en un baño
maria.
Una vez eliminamos las trazas de eter realizamos una
centrifugacion de nuestra sustancia problema y
eliminamos el sobrenadante.
posteriormente se realizo una hidrolisis para romper
los enlaces peptidicos en la muestra problema, para
realizar la hidrolisis en condiciones acidas y
sometido a condiciones extremas de temperatura y
presion para esto añadimos 5 ml de HCl 6N y lo
llevamos a la autoclave durante 3 horas a 15 lb/in2 .
Terminada nuestra hidrolisis al contenido del tubo
añadimos 2.5 ml de agua, y pasamos a realizar
extracciones con eter, donde se forman 2 fases una
eterea y una acuosa, donde la fase que se encuentran
nuestros productos deseados es la eterea mientras
que la acuosa sirve para eliminar trazas de elementos
polares no deseados.
Con las extracciones de eter realizadas se toma la
fase eterea que contiene nuestra sustancia problema
y se pasa a secar el eter en una parrilla quedando solo
nuestra sustancia problema que contiene nuestro
aminoacido buscado.
Por ultimo el product seco se diluyo en 0.5 ml de
alcohol absolute y se utilizo esta solucion para
realizar la cromatografia tomando la solucion como
nuestra muestra problema para la comprobacion de
la correcta identificacion del grupo amino N-
terminal.
Se realizo un cromatograma con aminoacidos como
lo fueron , la valina, fenilalanina, alinina, el DNFB y
la solucion problema, posteriormento se llevo a eluir
en una camara cromatografica la cual contenia como
eluyento o disolvente acido citrico , se dejo que el
cromatograma eluyera aproximadamente 5 horas,
posteriormente se dejo que se secara el disolvente al
aire.
CONCLUSION
Se logro identificar y concluir lo reportado en la
literatura la cual nos indica que la valina es el amino
N-Terminal de la hemoglobina bovina , con base a
esto la cromatografia concuerda debido a que nutra
muestral problema eluyo en el cromatograma a la
misma altura que la valina , la muestra problema
posiblemente se encontraba contaminada con DNFB
debido a que aluyo a la misma altura que el DNFB ,
esto se debe que al realizar la dinitrofenilacion no
reacciono todo el DNFB y apesar de que se
realizaron extracciones con eter en este paso como
en la hidrolisis no se elimino todo el DNFB.
REFERENCIAS
1. Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, John L.
Tymoczko. (2008). Bioquimica . Mexico :
Reverete.
2. Donald Voet, Judith G. Voet. (2016).
Fundamentos de bioquimica. Mexcio :
Panamericana.
3. Nelson, M., & Cox, D. (2009. Lehninger
principios de bioquímica. Barelona:
Ediciones Omega