Manual de Practicas de Genetica Humana PDF

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
MANUAL DE PRÁCTICAS
GENÉTICA HUMANA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE GENETICA HUMANA
COMPILADORES:
Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez
Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez
Revisado por: Academia de Biologia 2011
Ciudad Juárez, Chihuahua

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez
2009
p. 68
M. en C. Emilio Clarke Crespo
Coordinador de la Academia de Biología
D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias

Coordinador del Programa de Biología
Dr. Alejandro Martínez Martínez

Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas
M.C. Hugo Staines Orozco

Director del Instituto de Ciencias Biomédicas
Aprobados por la Academia de Biología, 2011

CONTENIDO
Practica 1: Extraccion de DNA…………………………………………………………..3
Practica 2: Corrimiento de Acidos Nucleicos…………………………………………..9
Practica 3: El cariotioi humano…………………………………………………………11
Practica 4: Simulacion de errores durante el proceso de replicacion...……………14
Practica 5: Digestion del DNA con endonucleasas de restriccion………………….19
Practica 6: Southern blotting……………………………………………………………23
Practica 7: Transformacion de celulas bacterianas…………………….……………28
Practica 8: Fundamentos de la clonacion……………………………………………..32
Practica 9: Regulacion genica en procariotes………………………………………...37
Practica 10: Factores involicrados en la regulacion de la transcripcion genica en

eucariotas y sus funciones……………………………………………………………...43
Practica 11: Biologia genomica………………………………………………………...48
Practica 12: Estudio genealogico en el genoma humano…………………………...50
Practica 13: Estudio de la herencia poligenica………………………………………56
Practica 14: Estudio de los polimorfismos del grupo sangineo……………………..63
Pracitca 15: Tecnica del aplastamiento para el estudio de los cromosomas……..66
2

Pracitca 1
EXTRACCION DE DNA
Objetivo:
Que el alumno aprenderá sobre la extracción de DNA y la electroforesis.
Introducción
Extracción de DNA
El concepto básico de la extracción de DNA se puede dividir en 5 pasos:
1) Ruptura de las células.- es casi virtualmente posible obtener DNA de todas las
células que se conocen, únicamente tendrá que adaptarse a las necesidades y
facilidades para escoger los métodos de lisis celular. Entre los mas utilizados
están:
a) Los detergentes.- El uso de detergentes es útil para extraer DNA
especialmente de parásitos, células en cultivo y tejido.
b) Enzimas.- cuando se trata de extracción de DNA en bacterias, se utiliza la
lisosima que es una enzima que se encuentra en varias secreciones del
cuerpo humano como lagrimas y moco, y en la clara de huevo. Actúa
desestabilizando la pared celular bacteriana cuando rompe las uniones
glucosidicas entre los polisacáridos.
2) Eliminación de proteínas.- para eliminar las proteínas se utilizan enzimas
proteolíticas, como la pronasa, la cual es activa contra un amplio espectro de
proteínas naturales.
3) Eliminación de ARN.- Una vez concluida la digestión con las proteasas, se
realiza la digestión con una RNasa para eliminar en su totalidad la presencia
de ARN. La RNasa se utiliza a una concentración de 100mg/ml.
4) Extracción de proteínas.-la eliminación de las proteínas de la muestra se
termina utilizando solventes organicos como el fenol que es utilizado en la
extracción de las proteínas debe ser biodestilado o ultrapuro.
5) Precipitación del DNA.- para poder concentrar el DNA después de la
eliminación de las proteínas, se utilizan una serie de sales entre las que se
encuentran el acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio y cloruro
de litio. Una vez que el DNA ha estado en contacto con los cationes
seleccionados se precipitan con volúmenes de etanol absoluto.
3

Extracción del DNA
A partir de células sanguíneas o de espermatozoides (Nature, Vol 318, 12 dic,

1985)
1.- Tomar 300 µl de glóbulos blancos principalmente.
2.- La solución grinding contiene las siguientes soluciones stock:
Para 1 10
muestra muestras
Agua 290 µl 2.9 ml
0.5 M EDTA 100 µl 1.0 ml
0.1 M tris (pH 50 µl 0.5 ml
8.0)
10% SDS 50 µl 0.5 ml
Proteinasa 10 µl 0.1 ml
Total 500 µl 5.0 ml
3.- Homogenizar con un pistón de teflón
4.- Incubar el homogenizado a 55°C toda la noche (o por 3 horas)
5.- Agregar 20 µl de NaCl 5 M por cada tubo de muestra.
6.- Agregar un volumen igual de fenol equilibrado a la muestra.
7.- Dar vortex por 1 minuto. Microcentrifuga de 3 a 5 minutos a máxima velocidad.
8.- Tomar el sobrenadante (el cual contiene el DNA), y ponerlo en un tubo nuevo.
Descartar el tubo con el pellet.
9.- Repite los pasos 6 y 8 de 2 a 3 veces, o hasta que el sobrenadante este claro y
no turbio.
10.- Agregar un volumen igual de cloroformo a la muestra.
11.- Dar vortex por 1 min. Microcentrifuga de 3 a 5 minutos a máxima velocidad.
12.- Toma el sobrenadante (el cual contiene el DNA) y colócalo en un nuevo tubo.
Repite los pasos 10 al 12.
13.- Agregar 2 volúmenes de etanol 100% frio al sobrenadante y mantenerlo por 5

min a -20°C (puede ser durante toda la noche).
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14.- Microcentrifuga por 5 minutos hasta hacer un pellet de DNA y
cuidadosamente descarta el sobrenadante lentamente por la decantación.
15.- Adicional 2 volúmenes de etanol al 70% y dejar a temperatura de cuarto por 5

minutos.
16.- Centrifugar 5 minutos descartar sobrenadante dejando solamente el pellet,

repetir los pasos 11 y 12.
17.- Secar el pellet a temperatura ambiente.
18.- Resuspender el pellet de DNA seco en 50 µl de H2O uv para cuantificar en el

espectrofotómetro.
19.- Colocar las muestras en refrigeración a -20°C para almacenar el DNA.
Procedente de células epiteliales
1.- Raspar cuidadosamente dentro de la mejilla 4 veces con la punta de una pipeta
P200 µl; raspar con la punta con un ángulo hacia la mejilla de manera que las
células sean colectadas alrededor y dentro de la punta.
2.- Pon la punta de la pipeta dentro del tubo para microcentrifuga que contenga
500 µl de NaCl. Con un pipetor para la pipeta P200 suba y baje 3 a 5 veces para
resuspender las células.
3.- Centrifugar el tubo a alta velocidad por 2 minutos.
4.- Remueve el sobrenadante con P1000 y pon el tubo conteniendo el pellet en

hielo.
5.- Poner 200 µl de chelex al 5% sobre pellet y resuspender.
6.- Poner el tubo en baño de arena a 100°C por 8 minutos.
7.- Dar vortex por 10 a 15 segundos, después pasarlo al hielo por 1 minuto.
8.- centrifuga a alta velocidad por 2 min.
9.- Remover el sobrenadante a otro tuvo y dejarlo en el hielo hasta que vaya a ser
utilizado.
10.- Adicionar 2.5 µl de solución de células bucales a cada 50 ul de tubos de

reacción.
5

CUANTIFICACION DE DNA
Cuantificación en espectrofotómetro.
El espectrofotómetro mide la cantidad de luz ultravioleta a 260nm absorbida por

las bases. Usar una cubeta de cuarzo de 1 ml con el agua como blanco. Se ajusta
a cero el espectrofotómetro con H2O. Después de ajustar agregar 1µl de DNA y
99 µl de H2O.
Absorbancia de 1 a 260 nm es igual a 50 µg/ml de DNA de doble hebra.
Nota: La contaminación de soluciones de acidos nucleicos hace la cuantificación

espestrofotometrica inexacta. Calcular la proporción de OD260/OD280 para
indicación de pureza del acido nucleico. El DNA puro tiene una proporción de
cerca de 1.8. una proporción baja puede ser causada por la contaminación de
proteínas o fenol.
Double-Stranded DNA (dsDNA):
A260 = OD 260= 1 for a 50 µg/ml solution
Single-stranded RNA (ssRNA):
A260= OD260= 1 for a 40 µg/ml solution
Single-stranded DNA (ssDNA):
A260= OD260= 1 for a 33 µg/ml solution
Absorbance=
Molar Extinction coefficient X concentration X pathlength (usually cuvette width)
GEL DE AGAROSA
1. Hacer 1.8 % agarosa en 1 X TBE: 0.9 g agarosa en 50ml 1 X TBE.

2. Hervir hasta que se aclare, usar microondas (1-2 min; examinar para
asegurar que todo se solubilice)
3. Dejar enfriar hasta aprox 60°C.
4. Agregar 12µl de una solución de 5 mg/ml bromuro de etidio; mezclar.
5. Sellar ambos lados del aparato con agarosa utilizando cinta masking tape.
6. Colocar los peines en la cámara
7. Poner agarosa en la cámara, dejar solidificar -30 min.
8. Llenar con 1 XTBE hasta que la solución apenas alcance el borde del gel
(sin cubrirlo).
9. Sacar los peines lentamente.
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10. Mezclar cada muestra de ADN (50µl) con 10 X loading buffer (5µl). cargar la
poza lentamente con una pipeta de 200 µl, utilizando los “gel loading tips”.
(con un peine de 17 pozas se puede cargar hasta 25 µl/poza). Cargar una
poza con marcadores con 10µl.
11. Correr a 100 V hasta que el colorante azul llegue al borde del gel.
Agarosa: sirve como matriz para la separación de fragmentos de DNA por su

tamaño. La agarosa de bajo punto de fusión sirve como matriz inerte, facilitando la
recuperación del DNA de la agarosa, evitando la perdida de la muestra.
Recommended Agarose Gel Percentages for Resolution of DNA
Gel DNA size

percentage range
0.5% 1,000-30,000
bp
0.7% 800-12,000
bp
1.0% 500-10,000bp
1.2% 400-7,000bp
1.5% 200-3,000bp
2.0% 50-2,000bp
Bromuro de etidio: colorante que fluoresce de una color rojo anaranjado (560nm)
cuando se excita con luz ultravioleta (260 a 360 nm). Esto permite detectar 10ng
de DNA. Tiene carga negativa y corre en dirección opuesta al DNA. El colorante
se intercala entre los pares de bases que se encuentran en las moléculas lineares
y circulares del DNA, haciéndolas mas rigidas.
Inactivación:
1. Diluir la solución de EtBr a menos que 0.1mg/ml con agua.

2. Agregar un volumen igual al volumen de solución de EtBr o del volumen de
los geles de 0.1 M de KMnO4 y mezclar con cuidado para evitar cualquier
salpicado.
3. Agregar un volumen de 0.5 M de HCl y mezcla cuidadosamente.
4. Dejar que reaccione de 2 a 4 horas (o toda la noche). Agregar un volumen
de 0.5 M de NaOH y mezclar con cuidado. La solución puede ser tirada en
el lavabo.
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Referencias:
Zavala Castro Jorge Eduardo, Manual de Técnicas Básicas de Biología Molecular,

Mexico D.F., Pag 31-33
Berk, A., Harvey, L. 2005. Biologia celular y molecular
8

Practica 2
CORRIMIENTO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS.
Objetivo.
Que el alumno reconozca las características de los ácidos nucléicos y el principio

de la electroforesis.
Introducción.
La electoforesis es una técnica de separación de moléculas en una mezcla por

aplicación de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran
en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga: masa.
Por ejemplo, si dos moléculas tienen más masa y formas iguales, la de mayor
carga neta se desplazara más rápido hacia un electrodo.
Los ácidos nucleicos son separados mediante esta tenica utilizando una matriz o
gel. El gel puede estar compuesto de agarosa o de poliacrilamida. El gel es
sumergido en un buffer de electroforesis el cual provee iones que lleva una
corriente.
Los geles de agarosa tienen un rango grande de separación, pero su resolución es

baja. En un gel agarosa se pueden separar fragmentos de DNA de entre 100 y
50,000 pares de bases. Por otra parte los geles hechos de poliacrilamida pueden
separarse de fragmentos de DNA de menos de 500 pares de bases, y
dependiente de la concentración del gel pueden observar diferencias de tamaño
hasta 5 pares de bases.
Materiales y Métodos
El Bromuro de etidio debe ser manejado siempre con guantes y bajo la supervisión
del maestro. (Los geles con Bromuro de etidio deben ser desechados
apropiadamente).
Tubos eppendorf para microcentrifuga de 1.5

Puntas para micropipetas estériles.
Marcador de peso molecular
Guantes
Material Biológico (proporcionado por el maestro):

DNA genómico de Drosophila melanogaster.
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Equipo
Camara de electroforesis
Horno de microondas o mechero
Transiluminador
Metodología
1. Preparación de un gel agarosa al 1%. Pesar agarosa suficiente para 50 ml.
De TAE 1X. fundir la agarosa hirviendo en un mechero o en un horno de
microondas, estar pendientes de que no se derrame. Dejar enfriar en la
mesa por 5 min. agitándola suavemente con movimientos circulares. Añadir
Bromuro de etidio a una concentración final de 30µg por cada 100 ml.
Vaciar la agarosa a una charola para electroforesis horizontal con un peine
de al menos 10 pozos.
2. Una vez que gelifique el gel, se retira el peine y se coloca la charola en la
cámara de electroforesis horizontal, se agrega TAE 1X hasta un cubre gel.
3. Preparar las muestras, añadiendo el buffer de cargado hacer los cálculos
necesarios para cargar las siguientes cantidades de DNA genómico por
pozo: colocar 10,50, 100, 300, 500, 800 ng, 1 y 2 µd de DNA genómico y en
el ultimo pozo cargar un marcador de un peso molecular.
4. Correr el gel a 80 V constante del polo negativo al polo positivo, durante 2
horas.
5. Visualizar en un transiluminador.
6. Tomar una foto si es posible o bien dibujar y describir lo que se observo. Si
el DNA genómico fue aislado correctamente debe aparecer como una
banda de alto peso molecular y con un ligero barrido por debajo de ella. Si
aparecen barridos más extensos o de bajo peso molecular quiere decir que
el DNA se degrado en algún paso del aislamiento, este DNA degradado es
un DNA de mala calidad el cual no podrá ser utilizado en experimentos
subsecuentes en el laboratorio.
Referencias.
Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T.1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor
Laboratory Press
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Practica 3
EL CARIOTIPO HUMANO
Objetivo
El objetivo de esta práctica es el estudio del cariotipo humano. Se pretende

que el alumno aprenda a elaborar cariogramas y a distinguir el cariotipo normal de
cariotipos que reflejan alteraciones cromosómicas, obtenidos de individuos que
presenten diferentes síndromes.
Introducción
El cariotipo es el complemento cromosómico particular de un individuo y viene

definido por el número y morfología de los cromosomas en la metafase mitótica.
En la especie humana la dotación cromosómica es de 2n = 46 (22 pares de
autosomas y un par de cromosomas sexuales). Utilizando técnicas de tinción
estándar los cromosomas aparecen uniformemente teñidos en metafase y se
clasifican en 7 grupos de la A a la G atendiendo a su longitud relativa y a la
posición del centrómero que define su morfología. Los autosomas se numeran del
1 al 22 ordenados por tamaños decrecientes y por la posición del centrómero. Los
cromosomas sexuales X e Y constituyen un par aparte, independientemente del
resto (por su tamaño, el cromosoma X se incluiría en el grupo C, y el Y, en el
grupo G). De esta forma el cariotipo humano queda constituido así:
Grupo Pares cromosómicos Características

A 1, 2 y 3 Cr. muy grandes casi metacéntricos (1 y 3
metacéntricos, pero 2 submetacéntrico)
B 4y5 Cr. grandes y submetacéntricos, con
dos brazos muy diferentes en tamaño
C 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 Cr. medianos submetacéntricos
D 13, 14 y 15 Cr. medianos acrocéntricos con satélites
E 16, 17 y 18 Cr. pequeños, metacéntrico el 16 y
submetacéntricos 17, 18
F 19 y 20 Cr. pequeños y metacéntricos
G 21 y 22 Cr. pequeños y acrocéntricos, con
satélites.
X, Y El cr. X es parecido al 6. El Y, al grupo
G, pero sin satélites.
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(Todos los cromosomas autosómicos están ordenados en orden decreciente de
tamaño, excepto el cromosoma 21 que ahora se sabe que es más pequeño que el
22)
Clasificación de los cromosomas
A B
1 2 3 4 5
C
6 7 8 9 10 11 12
D E
13 14 15 16 17 18
Crs.
19 20 21 22

sexuales
X Y
F G
12

Materiales:
Computadora
Acceso a internet
Cariotipos de individuo sano y enfermo
Metodologia:
Seleccionar un cariotipo por medio de una imagen de la computadora en el que se

muestran los cromosomas metafásicos teñidos pertenecientes a diversos
individuos. El alumno deberá ordenar el cariograma y determinar si existen
anomalías cromosómicas en cada individuo.
Referencias:
Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T.1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor
Laboratory Press
Cuestionario:
1.- ¿Qué características permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de

otros?
2.- ¿Qué células del organismo llevan el cariotipo diploide completo?
3.- ¿Qué mecanismos cromosómicos producen anomalías del cariotipo humano?
4.- ¿Se manifiestan siempre las alteraciones cromosómicas en el fenotipo del
individuo que las transmite? Explica tu respuesta.

13

Practica 4
SIMULACIÓN DE ERRORES DURANTE LA REPLICACIÓN.
Objetivo
Que el alumno entienda la Identificación de los distintos errores que pueden ocurrir
durante la replicación del DNA.
Introducción
La replicación del DNA es un proceso complicado y altamente regulado que ocurre

en diferentes etapas:
1.La iniciación requiere el reconocimiento de un origen se producen varios

sucesos. Antes de la comience la síntesis de ADN, las cadenas parentales han de
ser separadas y estabilizadas en forma de cadena simple. Entonces puede
inciarse la síntesis de las cadenas hijas en la horquilla de replicación; E.coli ello se
consigue por medio de un complejo proteico llamada primosoma.
2.La elongación es obra de otro complejo de proteínas. El replisoma no es una

entidad independiente tan obvia como otras, ya que sus componentes solo se
ensamblan al comienzo de la replicación. A medida que replisoma se mueve a lo
largo del ADN, las cadenas parentales se desenrollan y se sintetizan las cadenas
hijas.
3. Terminación al término de la replicación, se requiere de reacciones de unión y

de terminación. Después de la terminación, los cromosomas duplicados se
separan.
La enzima que sintetiza una nueva hebra de DNA se denomina DNA polimerasa,
existen3 tipos de DNA polimerasa: la I está involucrada en la reparación del DNA
dañado y en un tipo de replicación llamada semiconservativa; la II también está
involucrada en reparación y la III, una proteína con múltiples sub-unidades, es la
responsable de la síntesis de novo de hebras de DNA añadiendo nucleotidosa un
extremo 3´-OH.
Durante la replicación pueden existir errores, estimaciones matemáticas indican

que hay aproximadamente 1 error por 1000 ciclos de replicación. Los errores que
produce la DNA polimerasa durante la replicación pueden dividirse en dos clases:
sustituciones, que ocurre cuando el nucleótido incorrecto es incorporado, debido a
un deficiente eficiencia de la lectura de prueba y, cambios de marco de lectura que
ocurre cuando un nucleótido extra es insertado o cuando uno es omitido.
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Cuestionario
(Ejercicios modificados de Averes, 1984)
1. ¿Cuál es la importancia de que se mantenga la fidelidad de la replicación

del DNA?
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2. Se ha demostrado que la secuencia de los aminoácidos del segmento de

una enzima es:-Met-Lys-Ser-Leu-Asp-Ala-Tyr-His- en una cepa silvestre.
Después de la inducción de una mutacion, se encuentra que el mismo
segmento se ha modificado de la siguiente forma: -Met-Lys-Ser-His-His-
Leu-Met-Leu-Thr-lle
a) Si la secuencia original del DNA que codifica esta polipeptido es 5´-TAC

TTT TCA GCT AGT GAA CTA CGA ATG GTA G 3´- ¿Cuál fue la
naturaleza de la mutacion que condujo al cambio en la secuencia de
aminoácidos?
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b) ¿Qué cambio particular en el DNA mutante podría restaurar todos los

codones originales excepto para el codón que especifica el aminoácido
numero nuatro (His)?
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3. Un análisis de una proteína muestra que dos mutantes diferentes contienen
una substitución de aminoácidos en el sitio normalmente ocupado por la
leucina. El origen de estos mutantes es :
Leu→Val→Met-1
a) Asignar los codones respectivos de RNA a cada mutante y a la cepa

silvestre
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__________________________________________________________________
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4. Un análisis de una proteína muestra que dos mutantes diferentes contienen

una subritutcion de aminoácidos en el sitio normalmente ocuparo por la
glicina. El origen de estos mutantes es:
Gly→Arg→Met-2
a) Asignar los codones respectivos de RNA a cada mutantes y a la cepa

silvestre
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__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
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5. Un RNAm que codifica una pequeña hormona peptidica de tan solo once
aminoácidos tiene la siguiente construcción:
5ÁUG UGU AAU UUG UGG CAU UGC UAU UUU UAG AAAAAAAA-3´
a) ¿ Que aminoácidos conforman esta proteína?
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b) ¿Cuáles de los siete codones que especifican aminoácidos podrían ser
cambiado a un codón de terminación por una sola sustitución de una base?
De el codón de terminación en cada paso que cite.
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6. Los plásmidos que portan los genes pen-r y test-r fueron expuestos a
enzimas de restricción que cortan la región que porta prn-r pero dejan
intacta a tet-r. El plásmido digerido se mezclo con fragmentos genómicos
de restricción de una biblioteca genómica clonada de ratón para producir
DNA recombinante, el cual fue utilizado para transformar bacterias
sensibles a drogas. Las bacterias transformadas fueron paqueadas
(puestas a crecer en un medio de cultivo solido) en medio selectivo para
identificar aquellas colonias de bacterias portando DNA recombinante, con
los siguientes resultados.

Medio nutritivo + tetraciclina Medio nutritivo + penicilina
a) ¿Qué colonias portan DNA recombinante? Explique.
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b) ¿Qué colonias podrían crecer en medio que contuviera penicilina y tetraciclina? Explique.
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Referencias bibliográficas
Lewin, B., Aguilar, A., Genes Benjamin Lewin. Tercera edición
Avers, Ch. J. 1984. Genetica. Segunda edición. Willard Gran Prees, Boston E.U.
Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. 1989 Molecular cloning. Cold Spring
Harbor Laboratory Press.

18

Practica 5
DIGESTION DEL ADN CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
OBJETIVO
Conocer, aprender y realizar la técnica de digestión del ADN utilizando dos

enzimas de restricción.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Digerir el ADN del bacteriófago lambda con dos enzimas de restricción

diferentes.
2. Separar por electroforesis los fragmentos de restricción
3. Visualizar los fragmentos de restricción y analizar.
INTRODUCCION
Las endonucleasas de restricción y mapas de restricción
Las endonucleasas de restricción permiten la hidrólisis selectiva del DNA para

obtener mapas de restricción. La naturaleza posee un conjunto variado de
herramientas, las endonucleasas de restricción, capaces de diseccionar
selectivamente moléculas de DNA de muchos tamanos y orígenes en fragmentos
mas pequenos. Estas enzimas protegen a las bacterias de los virus invasores, los
bacteriófagos. Las secuencias de DNA bacteriano, normalmente reconocidas por
la endonucleasa de restricción, están protegudas contra el corte por la metilación
de las bases situadas dentro del palíndromo, mientras que el DNA vírico metilado
es reconocido como extraño y es hidrolizado. Se han identificado y purificado
numerosas endonucleasas de restricción de tipo II con diferente especificidad de
secuencia; en la actualidad, muchas están disponibles comercialmente. Las
endonucleasas de restricción permiten la construcción de nuevo tipo de mapa
genético, el mapra de restricción, en el que se identifica el sitio de corte enzimático
dentro del DNA. Especies de DNA purificadas que contienen secuencias para una
endonucleasa de restricción son cortadas por esta. Variando el tiempo de
digestión de las moléculas de DNA purificadas por la endonucleasa de restricción,
se puede generar una población de fragmentos de DNA de diferentes tamanos
total o parcialemtne hidrolizados. La separación de estos fragmentos generados
enzimanticamente mediante electroforesis en gel de agarosa permite la obtención
de mapas de restricción. El análisis de un DNA completamente hidrolizado por una
endonucleasa de restricción establece el numero de sitios reconocidos por la
19

endonucleasa dentro de la molecula, asi como el tamaño de los fragmentos
generados.
METODOLOGIA
(Adaptado de la traducción de Villalobos-Arambula, Moreno-Salcedo).
REACTIVOS MATERIALES
ADN del bacteriófago lambda Baño maría a 37°C
Amortiguador de reacción (2x) Micropipetas 0.5-10 µl
Enzima EcoRI Equipo electroforético
Enzima hindIII Microcentrifuga
H2O Regla y papel semi-logaritmico
Digestión del ADN
1. Ubicar los microtubos proporcionados por el profesor que contienen

las enzimas (“Es”para “Stock de EcoRI y “Hs”para “Stock de HindIII),
en el ADN del fago lambda ”λ”, el amortiguador de restricción 2x
“Am”y el amortiguador de carga “C”. Mantener las soluciones en
hielo.
2. Rotular tres microtubos nuevos de la siguiente manera:
Tubo uno L= ADN de λ(control sin
digestión)
Tubo dos E= Digestión con EcoRI
Tubo tres H= Digestion con Hind III
Agregar ademas una marca que distinga su grupo de los de sus companeros.
3. Dar un pulso de centrifuga y pipetear con extrema precisión

(micropipeta de 0.5-10 µl) los reactivos en los microtubos rotulados:
Tubo ADN λ Amortiguador EcoRI Hind III H2 O Volumen

2x MilliQ Final
L 2µl 5 µl -- -- 3 µl 10 µl
E 4 µl 5 µl 1 µl -- -- 10 µl
H 4 µl 5 µl -- 1 µl -- 10 µl
4. Tapar los tubos y mezclar los componentes suavemente al agitar los

tubos con el dedo. Utilizar una microcentrifuga para recolectar los
liquidos en el fondo (pulso de centrifugación rápida). Verificar que el
volumen total de cada tubo sea de 10 µl. utilizar una punta diferente
para cada muestra y colocar las tres gotas en puntos diferentes del
microtubo.
20

5. Colocar los tubos en la gradilla flotante e incubarlos durante 1 hora a
37°C.
6. Mientras, preparar el gel de agarosa al 1.5% (ver practica uno).
7. Después de la incubación, retirar los tubos del baño maría,
centrifugar rápidamente (pulso) con el propósito de recolectar el
líquido en el fondo del tubo.
8. Anadir 2 µl del amortiguador de carga azul (tubo “C”) en cada tubo.
Tapar los tubos y mezclar suavemente, aguitando los tubos con el
dedo. Dar un pulso de centrifugación rápida.
9. Llenar la cámara de electroforesis hasta cubrir el gel de agarosa con
el amortiguador TBE 1X.
10. Asegurarse de que los pozos de gel agarosa estén cerca del
electrodo (-) de color negro y que la base del gel este cerca del
electrodo (+) color rojo.
11. Cargar la muestra dentro de los pozos del gel, utilizando una punta
diferente para cada muestra, siguiendo el orden indicado, de
izquierda a derecha:
• LINEA 1: tubo L (control sin digestión)

• LINEA 2: tubo E, digestión con EcoRI.
• LINEA 3: tubo H, digestión con Hind III
• LINEA 4: marcador de ADN (lambda-Hindi III, proporcionado
por el profesor)
12. Colocar la tapa de la cámara de electroforesis. Los cables rojo y

negro de la tapa concordaran con los cables rojos y negro de la
base. Conectar los electrodos con la fuente de poder.
13. Encender la fuente de poder y someter las muestras a 80V por 120
minutos.
14. Apagar la fuente de poder una vez terminado el proceso de
electroforesis y retirar cuidadosamente el gel y la bandeja de la caja.
Remover el gel de la bandeja tener cuidado ya que ¡el gel es muy
resbaloso!, colocar el gel en la bandeja de tinción.
15. *Añadir 60 ml de colorante ADN bio-seguro en la charola de
tinción. Cubrir la bandeja con papel aluminio. Dejar el gel tiñendo
toda la noche.
16. * Colocar el sobrenadante de la solución bio-segura, una botella, ya
que se puede volver a utilizar. Agregar 60 ml de agua destilada al
gel. Dejar que se destina de 10 a 15 minutos, y vacias
posteriormente el agua utilizada en un contenerdor de desechos.
21

17. * Para obtener un registro permanente, ponerlo sobre el acetato.
(*) Alternativamente el profesor realizara la tinción con bromuro de etidio (ver

practica uno) y entregara al alumno la fotografía instantánea o digitalizada del
resultado de la electroforesis.
BIBLIOGRAFIA
Devlin T.; Bioquimica: libro de texto con aplicaciones clínicas, 2006, 4ta edición,
editorital Reverte, S.A., Barcelona, España.
Sambrook J.; Fristsch E.F.; Maniatis, 1989, molecular cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edicion.
22

Practica 6
SOUTHERN ¨BLOTTING¨
OBJETIVO
Que el alumno conozca la de transferencia tipo Southern.
INTRODUCCION
Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis

como primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro
de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para
la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la
transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior
revelado.
Esta técnica consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean
secuencias
específicas (sondas) complementarias a la molécula de ácido nucleico a
identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la
detección de las moléculas buscadas. Los principios generales son los mismos,
pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se
degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas
más precauciones.
Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética
hasta lograr que las moléculas se separen por tamaños de manera tal que se
puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los ácidos nucleicos del gel a
la membrana. De esta manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a
ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia
dedeterminadas secuencias.
El Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se
usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma.
La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producir
fragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño
molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de
etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los fragmentos son luego transferidos a una
membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumerge en una solución
salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel
secante que las recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los
fragmentos se fijan (por UV) al filtro membranoso y pueden ser hibridados con una
sonda que se marque radioactivamente y que tenga una secuencia
complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava
el filtro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia
(en caso de marcaje no-radioctivo).
23

El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias
específicas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación
utilizando sondas especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosomal
ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando sonicación ó
enzimas de restricción. Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor
tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la
electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de
nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.
A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la
secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido
nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a la secuencia de DNA inmovilizada en
el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos
nucleicos.
El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el
reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en
el gel es muy ineficiente.Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot
deriva en parte del apellido Southern del investigador que la desarrolló y de la
palabra en inglés Blot que significa traspasar.
24

METODOLOGIA
Reactivos Materia, equipo y accesorios

Microcentrifuga
Gel agarosa Equipo electrpfpretico
ADN genomico Micropipetas y puntas
ADN digerido Termociclador
Amortiguador TBE 1X Equipo electroforetico
Papel filtro grueso y delgado
Amortiguador de desnaturalizacion (Whatman)
Amortiguador de neutralizacion Selección del papel filtro largo
Amortiguador SSC* (20 X) Charola de vidrio y puente plastico
Amortiguador SSC* (6 X) Peso (1 kg)
Amortiguador SSC* (2X) Agitador rotatorio
Membrana de nitrocelulosa o nylon (recordata al tamaño
del gel) Papel plastico
Electroforesis de las muestras ADN a transferir:
1. Cargar (por duplicado: en geles idénticos) las muestras de ADN (ADN del
bacteriófago lambda con o sin digestión que proporcionara el profesor
2. Llevar a cavo la electroforesis, 2 horas, 80 volts.
3. Teñir un solo gel (con bromuro de etidio o colorante Biosafe), tomar
fotografía y guardar gel a 4°C, en oscuridad.
Transferencia del ADN a membrana de nylon: se trabaja únicamente con el

gel NO teñido:
1. Sumergir el gel en 500 ml de solución de desnaturalización ** por 45 minuto

con agitación leve sobre agitador rotacional
2. Enjuagar el gel en agua bidestilada 5 minutos ¡Cuidado el gel es muy
resbaloso!
3. Neutralizar en 500 ml de solución de neutralización** 15 minutos, dos
veces.
4. Cortar una pequeña sección de la esquina derecha superior del gel para su
futura orientación.
Formación de la pirámide de transferencia por capilaridad:
1. Usar guantes para cortar la membrana de transferencia (proporcionada

entre dos hojas de papel protector), 2 hojas de papel filtro grueso y una
altura de 10 cm de papel filtro delgado al mismo tamaño que el gel. Cortar
25

la esquina derecha superior de la membrana de la misma manera que lo
hizo para el gel.
2. Para formar la pirámide colocar en orden
a) La charola de vidrio
b) Transversalmente, el puente (tabla de vidrio o plástico)
c) El papel filtro largo que cubra la tabla y toque al interior de la charola.
d) El gel (con los puntos de carga hacia abajo)
e) La membrana humedecida en agua bidestilada colocada
exactamente encima del gel (con las esquinas recortadas en misma
ubicación). Una vez ubicada no moverla.
f) El plástico hermético alrededor del gel y membrana para evitar el
contacto directo entre el puente y las siguientes capas.
g) 2 hojas de papel whatman grueso, humedecidas en SSC 2x.
h) 10 cm de papel Whatman delgado y seco.
i) Suficiente solución SSC 20x para que humedezca el papel filtro
grande.
j) Película de plástico alimenticio que cubra toda la charola (evita
evaporación y polvo).
k) Por último un peso (1kg aprox)
3. Dejar el proceso de transferencia de 8 a 24 horas.

4. Al dia siguiente, eliminar la pirámide en orden inverso al del montaje. Anotar
el aspecto (color) de cada capa. Antes de quitar la membrana, marca con
lápiz la ubicación de los pozos de carga del gel. Separar con cuidado (y
guantes) la membrana del gel.
5. Enjuagar brevemente (5min) la membrana con SSC 6x, escurrir la
membrana hasta secar por 30 minutos.
6. Fijar el ADN de cadena sencilla covalentemente a la membrana:
a) Horneado (cuidado de no quemarse) de 30 a 120 minutos (>80°C).
b) O irradiando con la luz UV 5 minutos (sobre la superficie limpia del
transiluminador, ubicando la membrana con marca de lápiz por
arriba)
¡CUIDADO CON LOS OJOS Y LA PIEL, TOME PRECAUCIONES ADECUADAS!
7. Las membrana se puede conservar por varias semanas a -20°C hasta su

hibridación posterior con sonda marcada (esta parte sin embargo no se
efectuara)
26

Verificación del éxito de la transferencia:
1.- Para cerciorarse del éxito de la transferencia del ADN a la membrana se suele
teñir el gel después de la transferencia y comprarlo con el gel que se tiño pero no
se transfirió.
BIBLIOGRAFIA
Lunque J.; Herraez A.; Biologia Molecular e ingeniería genética, 2001, primera
edición, editorial harcourt, Madrid, España.
Sambrook J.; Fristsch E.F., Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edicion.
SOLUCIONES PROPORCIONADAS PARA LA PRACTICA:
Solucion SSC 20x:
Disolver 175.3 g de NaCl y 88.2 g de citrato de sodio en 800 ml de agua

bidestilada. Ajustar a pH 7 con NaOH, ajustar el volumen a 1 litro, esteriliza en
autoclave.
Solución SSC 6x: al momento de su uso, diluir 3.3 veces el amortiguador SSC
20x.
Solución SSC 2x: al momento de su unos, diluir 10 veces el amortiguador SSC

20x.
Solución amortiguadora de desnaturalización
NaOH---------- 0.5 M
NaCl------------ 1.5 M
Solucion de neutralización
Tris pH 7.4---------- 1M
NaCl------------------ 1.5 M
27

Practica 7
TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS BACTERIANAS.
Objetivo
Que el alumno aprenda una de las técnicas más utilizadas en la biología molecular
para le analisis genetico.
Introducción
Esta técnica es básica en un laboratorio de biología molecular. La finalidad de esta

técnica es introducir un plásmido a una bacteria, y utilizar esta para amplificar el
plásmido y así obtener grandes cantidades del mismo.
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN de doble cadena que se

encuentran naturalmente en varias especies de bacterias. Estos elementos
genéticos son extracromosomales, se replican de manera independiente del
cromosoma bacteriano y codifican para una gran variedad de enzimas que
confieren resistencias a antibióticos y metales pesados, degradan complejos
orgánicos o producen toxinas, etc. Dadas estas características, los plásmidos han
sido empleados como vectores o vehículos de clonación de moléculas de ADN
foráneas que permiten el transporte y manipulación del mismo. Es así como, hoy
en día, se dispone de una gran variedad de plásmidos sintéticos de naturaleza
modular con características diversas para lograr ya sea la clonación de un
fragmento de ADN genómico, de cADN o de PCR, o para la expresión de los
mismos y obtención del respectivo producto proteico.
Entre las prioridades de los plásmidos que favorecen su utilización como vector de
clonación se incluyen: (1) su pequeño tamaño que hace que el ADN sea fácil de
aislar y de manipular; (2) su naturaleza circular que hace que el ADN se mas
estable durante la extracción; (3) su origen de replicación independientemente del
control directo de la replicación del cromosoma bacteriano; (4) su múltiple numero
de copias, de manera que se aumenta la eficiencia de la extracción del ADN
plasmidico; y (5) la presencia de marcadores seleccionables, tales como genes de
resistencia a antibióticos, haciendo así mas fácil la detección y la selección de las
bacterias que contienen plásmidos.
La estructura modular de todo plásmidos comprende básicamente: (1) un origen

de replicación autónomo que permita un alto número de copias por bacterias
(replicación autónomo que permita un alto número de copias por bacteria
(replicación relajada), (2) genes de resistencia a antibióticos, (3) marcadores de
selección, y (4) un sitio múltiple de clonación, caracterizado por la presencia de
28

sitios únicos para enzimas de restricción, no encatrados en ninguna región del
plásmido.
Materiales y Métodos
El maestro elaborara con anterioridad los siguientes reactivos:

Medio de cultivo LB
Cajas de agar-LB con ampicilina
X-gal 20 mg/ml (no filtrar)
IPTG 100mM (estéril a través de filtración por un filtro de 0.22 mM)
Cloruro de Calcio 100 Mm estéril
Materiales
Puntas para micropipetas estériles
Espátulas para sembrar bacterias
Mechero
Marcador indeleble punta negra
Tubos 10 ml estériles
Tubos para microcentrífuga de 1.5 ml.
Matraz de 100 ml. estéril
Material biológico
Cepas DH5α
Equipo
Incubadora a 37°C
Baño María 42°C
Microcentrífuga
Metodología
1. Poner, de una caja fresca de células de la cepa DH5α, un cultivo de 5 ml
estéril, dejarlo toda la noche a 37° C con agitación.
2. Agregar al día siguiente 100 ml de medio luria, 3ml del cultivo de células de
la cepa DH5α, incubar con agitación a 37°C hasta que alcance una
densidad óptica entre 0.4 a 0.6 (O.D. 600).
3. Centrifugar las células a 3000 rpm por 10 min. Se desecha el medio
sobrenadante y las células se resuspenden delicadamente en 20 ml. De
una solución 100 mM de CaCl₂ fría. (Es muy importante que la solución
este muy fría por que la pared de las células es muy delicada en este
momento y la temperatura ayuda a mantener la viabilidad de las células).
29

4. Centrifugar de nuevo a 3000 rpm por 10 min. Resuspender en 1 ml de la
solución de CaCl₂ fría. Dividir el volumen en 10 tubos para microcentrífuga
de 1.5 ml estéril y conservar en hielo.
5. Marcar cinco tubos como contro a, 1 ng a, 10 ng a, 100 ng, 300 ng a. Los
cincos restantes marcarlos igual pero con al letra b.
6. A los tubos con la letra ä¨ añadir la cantidad indicada del plásmido
pBluescript y a los tubos marcados con la letra ¨b¨ añadir la cantidad indica
del plásmido pBluescript-ATRAX, el cual lleva clonado del DNA de un gen.
A los tubos control no se les añadirá nada. Esto se hace para comprobar
que las baterías componentes recién preparados no estén contaminados
con otro plásmido.
7. Incubar el DNA con las bacterias durante 1 hora en el hielo. Durante este
tiempo de incubación se preparan 10 tubos de 5 ml con 1 ml de medio luria
líquido, y se marcan como los tubos del inciso 5.
8. Terminado el tiempo de incubación rápidamente se pasan los tubos a un
baño de 42°C (choque térmico) durante 1 min. al término de este minuto se
vuelven a pasar los tubos al hielo durante otro minuto, se les agrega 1 ml
de medio a cada tubo y se transfiere el medio a los tubos de 5 ml que se
prepararon.
9. Se incuban los tubos en agitación a 37°C durante una hora para permitir
que las bacterias se recuperen. Durante este tiempo de incubación a las
cajas con medio solido agar-luria, se les agrega 25µ de X-Gal y se extiende
con una espátula en un ambiente estéril (mechero).
10. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se centrifugan los tubos a
3000 rpm durante 10 min., se decanta el medio y con el medio restante se
toma la totalidad de las bacterias y se siembran en las cajas en ambiente
estéril y se espátulan para extenderlas. Las cajas se dejan incubar en una
estufa a 37°C.
11. Al día siguiente se cuenta el número de colonias, y se calcula la
competencia de las células dividiendo el número de colonias obtenidas en
cada caja por la cantidad de DNA (en microgramos) que se agrego.
Unas células muy bien preparadas deben de dar una competencia entre
10⁵ y 10⁶. Unas células muy componentes pueden estar en el orden de
hasta 10⁸.
30

Consepcion, J., Puerta, B., Cludia, P., Ureña, P., Practicas de biología
molecular. Pontifica Universidad Javeriana.
Bolivar, f et al., 1977. Construction and characterization of new cloning vehicles. I.

Ampicillin-resistant derivatives of plasmid pMB9. Gene 2,75.
Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. 1989 Molecular cloning. Cold Dpring
Harbor Laboratory Press.
31

Practica 8
FUNDAMENTOS DE LA CLONACIÓN.
Objetivo
El alumno aprenderá la utilidad de la clonación para investigación actual.
Introducción
El desarrollo de métodos para la introducción de DNA en células de mamíferos, ha
hecho posible expresar genes clonados en una gran variedad de tipos de células
de diferentes estructurales, y para identificar elementos involucrados en el control
de la expresión genética. En este tipo de estudios se inserta la secuencia de
interés en un vector de expresión apropiado, se clona en una bacteria, se amplifica
por replicación y posteriormente se utiliza para transfectar células de mamífero, de
insecto o bien para hacer organismos transgénicos.
Estas construcciones también pueden utilizarse para sobre-expresar
proteínas o fragmentos de proteínas las cuales son posteriormente purificadas
para hacer anticuerpos específicos contras esas proteínas.
La clonación tiene por lo tanto múltiples aplicaciones y últimamente con
ayuda de la ingeniera genética se han podido introducir mutaciones en genes que
codifican para proteínas de interés, para producir proteínas mutantes en grandes
cantidades en bacterias o en células de insecto o mamíferos. El introducir este
mutación en el gen, en sitios específicos, ha llevado muchas veces a encontrar
funciones para proteínas desconocidas, o a estudiar en células de mamífero cómo
se comportan estas proteínas mutadas y analizar a nivel celular su contribución a
una enfermedad determinada.
Las principales herramientas que un biólogo molecular tiene para poder
manipular el DNA son enzimas de restricción y otras enzimas modificadoras del
DNA. Las enzimas de restricción se unen específicamente y cortan el DNA de
doble cadena en sitios específicos en secuencias llamadas sitios clasificadas en 3
grupos: el grupo I y III cortan el DNA en su secuencia blanco y después se disocia
del sustrato. El grupo II consiste de un sistema binario, el cual lleva una
endonucleasa que corta una secuencia específica de nucleótidos y una metil-
transferasa por separado que modifica la misma secuencia blanco. Este tipo de
enzimas son las que han sido ampliamente utilizadas en biología molecular. La
mayoría de las enzimas reconocen 4,5 o 6 nucleótidos específicos los cuales
generalmente son palindromes. Existen también enzimas que reconocen 6
nucleótidos específicos los cuales generalmente son palindromes. Existen también
enzimas que reconocen 6 nucleotidos o mas, pero las secuencias no son exactos
o están degeneradas. Hay enzimas que cortan justo en el eje de simetría creando
fragmentos de DNA cohesivos.
32

El DNA restringido con una cierta enzima posteriormente puede ser ¨ligado¨
a un vector que haya sido cortado con la misma enzima ya que tendrán extremos
complementarios. Muchas veces al diferir con dos enzimas diferentes. Ya ligar
estos fragmentos a veces se puede formar un nuevo sitio de reconocimiento para
una tercera enzima de restricción.
El conocer toras estas combinaciones, ha hecho que los biólogos
moleculares cuenten con muchas herramientas para poder manipulas los genes o
el gen que codifican para una proteína particular a su conveniencia.
Cuestionario
1. ¿Cuáles son las propiedades de las endonucleasas del grupo II que las hacen
útiles para la clonación?
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_____________________________________________________
2. A continuación se muestra el mapa de restricción del plásmido YIP5 de 5,541
33

Figura: Mapa de restricción del plásmido YIP5 de 5,541 pb. Los números indicados
después de cada enzima de restricción indican las posiciones de los sitios de corte.
Indicar los tamaños de los fragmentos que se obtendrían tras la digestión de los
plásmidos YIP5 con las siguientes enzimas de restricción:
Enzimas Tamaño del fragmento obtenido
EcoRI
EcoRI y Eagl,
Hindilll y Apal
Hindilll y Smal
Pvull y Eagl
Apal y Pvull
3. Un fragmento de DNA de ratón con extremos cohesivos EcoRI contiene el gen

CyP1A1. Este fragmento de DNA, de 2 kb de largo, se inserta en el sitio EcoRI del
plásmido bacteriano Pbr322. El plásmido recombinante se corta con tres enzimas
de restricción distintas. La distribución de bandas tras la electroforesis en gel de
agarosa, visualizadas con bromuro de etidio, se muestra en la figura siguiente:
(i) EcoRI (ii) BamHI (iii) BamHI + EcoRI
Se transfiere el ADN del gel (iii) mediante la técnica de Soutjern blot. ¿Qué
fragmentos hibridaran con una sonda de DNA del vector pBR322, marcada con
P32?
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
34

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
A continuación se muestra una cadena sencilla de DNA:
5ÁTGGGGTAGAATTCGAATTCAAGCTTGGCCCTGCAGGGATCC3´
Indicar las secuencias potenciales de reconocimiento de las enzimas de
restricción, si las hay, en la forma de doble hélice de DNA.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
4. ¿Qué método se usa para crear extremos cohesivos?

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
5. A continuación se muestran los sitios internos de corte del gen humano Cyp1A en
el plásmido PCMvSport6.
Enzima Corte
1 2
BamH I 1,773
Sph I 1,577 2,444
EcoRI 1,515 1,071
HInC II 732 1,345
Suponga que ha digerido este inserto con las encimas indicadas en la tabla
anterior cada una por separado, y con BamH I- EcoRI. Lleve a cabo el análisis de
los productos de digestión después de haber realizado una electroforesis de un gel
35

teñido con bromuro de etidio. En el esquema del gel mostrado a continuación
indicar en cada carril las bandas que se espera obtener para cada muestra.
Gel de electroforesis teñido
BamH I -
kb Marcador BamH I Sph I EcoRI HLnC II EcoRI
23,000
9,000
6,000
4,000
2,322
2,027
565
125
Bolivar, F. et al., 1977 a. Construction and characterization of new cloning

vehicles. I. Ampicillin-resistant derivatives of plasmid Pmb9. Gene 2, 75.
Bolivar, F. et al., 1977b. Construction and characterization of new cloning

vehicles. II. Ampicillin-resistant derivatives of plasmid Pmb9. Gene 2, 95.
Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular cloning. Cold spring Harbor
Laboratory Press.
36

Practica 9
REGULACIÓN GÉNICA EN PROCARIONTES.
Objetivo
El alumno entenderá el proceso de regulación génica en procariontes.
Introducción
Jacob, Monod y colaboradores analizaron el sistema de la lactosa en E. coli, de

manera que los resultados de sus estudios permitieron establecer el modelo
genético del Operón que permite comprender como tiene lugar la regulación de la
expresión génica en bacterias. Jacob y Monod recibieron en 1965 el Premio Nobel
pos estas investigaciones.
Un Operón es grupo de genes estructurales cuya expresión está regulada por los
mismos elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores.
Los principales elementos que constituyen un operón son los siguientes:
Los genes estructurales: llevan información para polipéptidos. Se trata de los

genes cuya expresión está regulada. Los operones bacterianos suelen contener
varios genes estructurales, son poligénicos o policistrónicos. Hay algunos
operones bacterianos que tienen un solo gene estructural. Los operones
eucarióticos suelen contener un sólo gen estructural siendo monocistrónicos.
El promotor (P): se trata de un elemento de control que es una región del ADN con
una secuencia que es reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la
transcripción. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales.
Abreviadamente se le designa por la letra P.
El operador (O): se trata de otro elemento de control que es una región del ADN
con una secuencia que es reconocida por la proteína reguladora. El operador se
sitúa entre la región promotora y los genes estructurales. Abreviadamente se le
designa por la letra O.
El gen regulador (i): secuencia de ADN que codifica para la proteína reguladora
que reconoce la secuencia de la región del operador. El gen regulador está cerca
de los genes estructurales del operón pero no está inmediatamente al lado.
Abreviadamente se le denomina gen i.
Proteína reguladora: proteína codificada por el gen regulador. Está proteína se

une a la región del operador.
Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresión de los genes.

37

El operón lactosa: control negativo
El Operón lactosa, que abreviadamente se denomina Operón lac, es un sistema

inducible que está bajo control negativo, de manera que la proteína reguladora,
producto del gen regulador i, es un represor que impide la expresión de los genes
estructurales en ausencia del inductor. El inductor del sistema es la lactosa. Como
veremos más adelante, el operón lac también está bajo control positivo, ya que
existe otra proteína que estimula la transcripción de los genes estructurales.
Los genes estructurales del operón lactosa son los siguientes:
El gen z+: codifica para la b-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de la lactosa

en glucosa más galactosa.
El gen y+: codifica para la galactósido permeasa que transporta b-galactósidos al

interior de la célula bacteriana.
El gen a+: codifica para la tiogalactósido transacetilasa que cataliza la

transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un aceptor
tiogalatósido. Este gen no está relacionado con el metabolismo de la lactosa.
El verdadero inductor del sistema es la Alolactosa y no la lactosa de manera que

la β-galactosidasa transforma la lactosa en Alolactosa. En los estudios del operón
lactosa se utiliza como inductor un análogo sintético de la lactosa que es el
Isopropil tiogalactósido (IPTG). El IPTG no necesita ser transportado por la
galactósido permeasa para entrar en la bacteria.
Las cepas normales de E. coli son inducibles, de manera que en ausencia del
inductor (la lactosa), la proteína represora producto del gen i se encuentra unida a
la región operadora e impide la unión de la ARN-polimerasa a la región promotora
y, como consecuencia, no se transcriben los genes estructurales.
Operón lactosa: control positivo
El operón lactosa también está sujeto a un control de tipo positivo, de manera que
existe una proteína que estimula la transcripción de los genes estructurales. En los
sistemas de control negativo existe una proteína que que impide la transcripción
de los genes estructurales, en los sistemas de control positivo existe una prteína
activadora que estimula la transcripción de los genes. En principio existen cuatro
tipos de sistemas posibles de regulación de la expresión génica:
Tipo 1: Inducible, control negativo (operón lactosa y operón galactosa)
Tipo 2: Inducible, control positivo (operón arabinosa y operón maltosa)
38

Tipo 3: Represible, control negativo (operón triptófano y operón histidina)
Tipo 4: Represible, control positivo (no se han descrito)
Por supuesto, un operón pude estar sujeto a más de un tipo de control, como
sucede en el caso del operón lactosa que esta bajo control negativo ejercido por la
proteína represora y bajo control positivo ejecutado por una proteína activadora
por catabolitos (CAP) también llamada proteína activadora del AMP cíclico (CRP).
El control positivo del operón lactosaa como veremos está estrechamente
relacionado con la Represión catabólica.
Figura: Operón de la lactosa.
39

Cuestionario
1. Explicar con un ejemplo las diferencias fundamentales entre control

negativo y positivo.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
2. Los mutantes lac Y puede sintetizar β-galactosidasa. Sin embargo,

aunque el gen lac I está intacto, no se puede inducir β-galactosidasa
añadiendo lactosa al medio. ¿Explique por qué?
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
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3. Explicar porque las mutaciones I del operón lac son recesivas frente al
alelo silvestre I+ y por qué I+ es recesivo frente a las mutaciones I5.
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4. ¿Qué significa que las mutaciones Oc del operón lac sean dominantes
en cis?
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40

5. Completar el siguiente cuadro.
Genotipo β-galactosidasa Permeasa

sin lactosa con lactosa sin lactosa con lactosa
I+ P+ O+ Z+ Y+ / I+ P+
a) O+ Z+ Y+
I- P+ OC Z+ Y- / I+ P+
b) O+ Z- Y+
I+ P- OC Z- Y+ / I- P+
c) OC Z+ Y-
IS P+ O+ Z+ Y- / I+ P+
d) O+ Z- Y+
IS P+ O+ Z+ Y+ / I- P+
e) O+ Z+ Y+
I- P+ OC Z+ Y- / I- P+ O+
f) Z- Y+
I- P- O+ Z+ Y- / I- P+ OC
g) Z+ Y+
6. Como podría determinar experimentalmente si un gen se expresa de

forma constitutiva.
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7. Comparar las características de los genes que se expresan de forma

constitutiva con los que se expresan de forma regulada.
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8. Describir y explicar, con ayuda de esquemas como funcionan el cAMP y
CAP en el operón de la lactosa.
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__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Jacob, F y J. Monod 1961. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of

prteins. Journal of Molecular Biology 3:318-356
Klug W.S y Cummings M.R. 2002. Essentials of Genetics. 4Th ed. Prentice Hall.
Upper Sadle River N.J. 508 pp.
Lewin B. 2001. Genes VII. Oxford Press. New York. 990 pp.
Lewis M., Chang G., Horton N.C., Kercher M.A., Pace H.C., Schumacher M.A.,
Brennan R.G y Lu P. 1996. Crystal structure of the lactose operon repressor and
its complexes with DNA and inducer. Science 271: 1247-1254.
Matthews K.S. 1996. The whole lactose repressor. Science 271:1245-1246.
Niu W, Kim Y., Tau G., Heyduk T y Ebright R.H. 1996. Transcription activation ar
class II CAP-dependent promoters: two interactios betwwn CAP and RNA
polymerase. Cell 87: 1123-1134.
Rodriguez Arnaiz R, Catañeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004.

Conceptos básicos de genética. Las prensas de Ciencias. 262 pp.
Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2nd ed. Addison-Wesley Longman.

San Francisco, CA. 527 pp.
42

Practica 10
FACTORES INVOLUCRADOS EN LA REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN

GÉNICA EN EUCARIONTES Y SUS FUNCIONES.
Objetivo
El alumno reconocerá las características de los elementos involucrados en la

regulación de la transcripción génica en los eucariontes.
Introducción
En los ecuariontes superiores la regulación de la expresión génica se encuentra

íntimamente asociado con la estructura de la cromatina. Los promotores de los
genes eucariotas se encuentran cromatinizados, y cuando un gen debe
expresarse, el promotor debe adoptar una estructura abierta que permita la unión
de la maquinaria basal de transcripción a sus secuencias blanco. Los promotores
se definen como secuencias que van de -40 a 40 pares de bases a partir del sitio
de inicio de la transcripción, muchos de los promotores tienen una caja TATA a
donde se une la proteína TBP (proteína de unión a la caja TATA, TATA Binding
Protein); aunque recientemente se ha demostrado la existencia de promotores que
carecen de cajas TATA y que utilizan otras secuencias a donde también se une la
maquinaria basal de transcripción. Los promotores también tienen una región
llamada promotor proximal que va desde -40 hasta -200 pares de bases a la cual
se unen otros factores transcripcionales.
La apertura de la cromatina y la activación de la expresión de un gen son eventos

controlados que deben de ocurrir en un tiempo, espacio y tejidos determinados.
Para que esto ocurra, además de un promotor, los genes cuentan con regiones
de control a distancia, como son los acrecentadores de la transcripción, los
silenciadores y los islotes.
Los acrecentadores son elementos que tiene una organización modular, es decir,
tienen sitios de unión para diversos factores transcripcionales, son tejidos
específicos y todos aumentan la tasa de transcripción.
Los silenciadores también tienen una organización modular pero al contrario en los
enhanceres, estos tienen un efecto negativo sobre la transcripción. Una
característica compartida tanto por los acrecentadores como por los silenciadores
en que se pueden actuar sobre un promotor independientemente de su posición,
es decir, pueden encontrarse rio arriba o rio abajo del promotor y potenciar o
reprimir su trascripción. A los acrecentadores y silenciadores se unen factores
transcripcionales que pueden atraer actividades remodeladoras de la cromatina
43

como acetiltransferasas de hisotonas para favorecer una estructura äbierta¨ o
bien desacetilasas de hisotonas para favorecer una estructura ¨cerrada¨.
Debido a que estos elementos actúan a grandes distancias sobre un promotor

determinado, se hace evidente que deben de existir regiones de la cromatina que
ayuden a organizar a los genes y a sus promotores en dominios bien definidos
para evitar la promiscuidad entre los elementos de regulación de un promotor
determinado y los promotores de otro genes.
Los islotes son elementos que tienen una actividad neutra, es decir no tienen
efecto sobre la transcripción, no son promotores, ni silenciadores. Son elementos
contitutivos, es decir que se mantienen a lo largo de la diferenciación celular y que
no son tejidos específicos. Estos islotes se han encontrado en algunos casos
enmarcando a un gen o a un grupo de genes y se ha propuesto que correspondan
a los limites físicos de los dominios transcripcionalmente activos. Se ha propuesto
que estos elementos son capaces de ayudar a la formación de un dominio
transcripcionalmente activo protegiéndolo del silenciamiento por
heterocromatizacion y de la acción de elementos de regulación adyacentes al
dominio. Funcionalmente los islotes se definen porque con capaces de bloquear la
acción de un acrecentador sobre su promotor únicamente cuando esta
posicionados entre el acrecentador y el promotor, es decir, su actividad depende
de su posición, al contrario de los silenciadores y de lo acrecentadores.
Cuestionario
1. Se esta trantando de determinar cual es la región promotora de un gen.

Se ha clonado 3 fragmentos de DNA genómico que se encuentran rio
arriba y rio abajo del posible inicio de la transcripción del gen (A, B, C).
Los fragmentos clonados se sobrelepan de la siguiente manera:
Las flechas indican el posible sitio de inicio de la transcripción del gen.

44

Se diseña un ensayo utilizando un plásmido que lleva como gen reportero al de la
luciferasa, es decide clonar los fragmentos rio arriba del gen reportero y hacer
transfecciones transitorias en células eucariontes, medir la actividad del gen
reportero 24 horas después de la transfección haciendo un lisado de las células
cuantificando la actividad de la luciferasa en un luminometro.
Se obtienen los siguientes resultados:
Plásmido control (solo lleva al gen de la luciferasa): 0.000

Plásmido con el fragmento A: 250
Plásmido con el fragmento B: 2000
Plásmido con el fragmento C: 1000
(a) ¿Qué región contiene el promotor?
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__________________________________________________________________
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(b) ¿Por qué la actividad del gen reportero disminuye con el fragmento C?
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(c) Al analizar otras de las clonas del fragmento B que se obtuvieron, hay una
en particular que tiene mutada la caja TATA (sitio de unión TBP). De
acuerdo a los valores obtenidos para los distintos fragmentos (A, B y C),
¿cuál será la actividad hipotética del gen reportero si se ensaya este
fragmento?
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45

2. Se está tratando de determinar la función de un fragmento de DNA
genómico que tiene varios posibles sitios de unión a factores de
transcripción. Se quiere determinar si se trata de un silenciador, o de un
islote. El alumno todavía no lo sabe pero esa región es un islote. Se
tiene el siguiente vactor y se decide seguir la estrategia de
transfecciones transitorias en el problema No.1:
a) Dibujar en qué posición o posiciones clonar el fragmento para demostrar

que se trata de un silenciador.
b) Dibujar en qué posición o posiciones clonar el fragmento para demostrar

que se trata de un islote.
c) La actividad del gen reportero del plásmido control es de 20,000 unidades,

de acuerdo a las construcciones de las respuestas para a y b. escribir para
cada casi cual es la actividad teórica del gen reportero. Recordar que el
fragmento clonado tiene una actividad de islote.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
46

Lewin, B et. al. 2002. Genes VII Oxford University Press.
Valdez-Graham V, y Recillas-Targa Félix 2001. Características y formación de

un dominio transcripcionalmente activo. Revista de Educacion Bioquimica 21, 21-
40.



47

Practica 11
BIOLOGÍA GENÓMICA
Objetivo
El alumno aprenderá una de las metodologías empleada en la construcción de un

gen de diferentes especies de un género.
Introducción
El término “Genómica” fue acuñado hace aproximadamente 17 años y hace

referencia al estudio no sólo de los genes, sino sus funciones, relaciones entre sí y
con el medio ambiente. Esta disciplina surge, como la farmacogenética y la
medicina proteómica, con la consolidación, a fines de la década de los ’80 del
Proyecto Genoma Humano y nos introduce en un periodo de transición de la
medicina donde el conocimiento genético específico se torna crítico para brindar
un cuidado efectivo de la salud para cada individuo.
A diferencia de la genética clásica que a partir de un fenotipo, generalmente
mutante, busca el o los genes responsables de dicho fenotipo, la genómica tiene
como objetivo predecir la función de los genes a partir de su secuencia o de sus
interacciones con otros genes. Así, la genómica tienen un enfoque distinto para
responder preguntas biológicas cuando se compara a otras ramas de la biología
más tradicionales. En lugar de un enfoque reduccionista más comúnmente usado
en otras ramas como lo son la biología molecular o la bioquímica la genómica trata
estos problemas de manera global. En el caso del estudio puro de genomas, la
secuenciación de un genoma genera información sobre todos los genes presentes
en un genoma. Distintas características de los genes como posición en el genoma,
conservación de los genes observada entre distintas especies y predicciones de la
estructura de las proteínas o el ARN ahí codificados permiten inferir la función de
algunos de los genes estudiados. En la genómica aplicada a estudios de
transcriptómica se estudian los patrones de expresión de distintos genes a una
escala global (véase Chip de ADN, PCR en tiempo real). De esta forma es posible
sugerir posibles funciones e interacciones de genes observadas en un punto en el
tiempo.
Los estudios genómicos se caracterizan por su interdisciplinaridad debido a que el
gran número de datos generados en un estudio de este tipo requiere combinar
tanto conocimientos biológicos como estadísticos e informáticos.
Por otra parte, los estudios en genómica utilizan una estrategia Top-down para
analizar preguntas en biología. Con este enfoque primero se observa el
comportamiento global de muchos genes o biomoléculas en un organismo (ARN
mensajero, proteínas, metabolitos, etc.) y eventualmente se llega a conclusiones
más particulares que conciernen solo algunas biomoléculas. Así la aplicación de
las ciencias genómicas permite abordar preguntas de gran significancia en
biología que requieren de una comprensión global del problema. Por ejemplo, para
48

el estudio de distintas enfermedades genéticas complejas es necesario disponer
de una lista completa de los genes participantes y luego estudiar sus
interacciones. Para entender la evolución de los genomas también es necesario
disponer de secuencias completas para poder inferir distintos eventos que
pudieron dar lugar al estado actual del genoma.
Para abordar distintos problemas biológicos las ciencias genómicas se subidividen
en distintas áreas de conocimiento, por ejemplo la Genómica funcional, la
Genómica estructural y la Genómica comparativa.
Materiales y métodos
Material
Diskettes o discos compactos (CD) nuevos.
Equipo
Computadora con conexión a internet
Programa de alineamiento
Programa para análisis filogenético
Métodos
1. Investigar la biología de las especies que conforman al genero Canis y de
Lycaon pictus.
2. Entrar a la dirección electrónica del Gene Bank: http://ncbi.nlm.nih.gov/
3. Seleccionar las secuencias nucleotidicas del citocromo b de las especies
que se agrupan en el género Canis.
4. Guardar la información en un disco
5. Alinear las secuencias con el programa de alineamientos que hayas
seleccionado.
6. Utilizar el programa para análisis genéticos y generan el o los arboles
filogenéticos, utilizando a L. pictus como grupo externo
7. Analizar los resultados e inferir la historia filogenética del genero Canis.
Beckoff. M.1977. Canis Latarans. Mammalian Species, 79, 1-9.
Gotelli, D., Sillero-Zubiri, G.D, M.S. Roy, D.J Giramn, J. Garcia-Moreno, E.A.
Ostrander y R.K. Wayne 1994. Molecular genetics of the most endangered canid:
the etiopian wolf Canis simensis. Mol . Ecol. 3, 301-312.
Martin, L.D. 1989. Fossil history of the terrestrial carnivore. En : Gittleman, J.l.
(Ed) Carnivore behavior, ecology and evolution. Pp 536-568 Cornell University
Press. New York.
49

Practica 12
ESTUDIO GENEALOGICO EN GENETICA HUMANA
Objetivo:
El objetivo de esta práctica es que el alumno aprenda a confeccionar y

esquematizar árboles genealógicos; a determinar, en la medida de los posible, el
genotipo de los individuos que lo componen, y a conocer la transmisión de algunos
caracteres sencillos y de fácil observación.
Introduccion:
El hombre presenta ciertas características especiales que lo califican como un

material difícil para el estudio genético. De hecho, estas características son:
1. Hay una gran diversidad genética de individuos, y también la estructura
genética de las poblaciones humanas varía continuamente debido a las
migraciones, la mezcla de razas, etc.
2. Por motivos éticos y morales no se practican cruzamientos
experimentales, de los que por otra parte no se obtendría gran información, ya
que:
a) de cada parto suele nacer un solo individuo
b) las gestaciones son largas
c) entre una generación y la siguiente transcurre mucho tiempo
d) el tamaño de las familias es pequeño.
En cambio, otros organismos que se utilizan frecuentemente en la investigación

genética presentan características mucho más ventajosas. Por ejemplo en los
ratones, ocurre una generación cada dos meses y los descendientes de cada
pareja pueden contarse por decenas. En Drosophila, la generación dura 20 días y
se cuentan los descendientes por centenares.
Así, en estos organismos y otros de características similares, los cruzamientos
experimentales constituyen uno de los mejores métodos para el conocimiento de
los caracteres hereditarios.
Por lo tanto, la genética humana tiene que recurrir para su desarrollo a métodos
indirectos tales como el uso de pedigrís o árboles genealógicos, análisis de
poblaciones, etc.
A pesar de todas estas dificultades, desde principios de siglo y mediante el uso de
técnicas genealógicas, se ha ido acumulando el conocimiento de nuevos
caracteres determinados genéticamente y de los genes que los controlan, hasta
llegar a varios millares. Posteriormente, las técnicas citogenéticas y moleculares
han permitido identificar nuevos genes y determinar su localización cromosómica.
50

Material:
El material biológico de esta práctica serán los propios alumnos y sus familiares
para la observación de algunos caracteres genéticos. Con sus datos se elaborarán
las genealogías.
Procedimiento:
La práctica en sí consiste, en primer lugar, en el reconocimiento de las variaciones
fenotípicas para cada uno de los caracteres monogénicos que se describen a
continuación, de donde el alumno deducirá su genotipo en cada caso. Los datos
se tomarán en una hoja como la que se indica al final de esta práctica. Se usará
una hoja de datos para cada persona.
Descripción de los caracteres
1) Disposición del lóbulo de la oreja. Lóbulo separado de la mejilla o pegado

lateralmente a la mejilla.
2) Línea frontal del pelo. Puede ser continua o tener un saliente frontal en el centro
denominado "pico de viuda". Obviamente las personas calvas no se pueden
contabilizar.
3) Capacidad de enrollar la lengua. Ser o no capaces de enrollar la lengua en

forma de U fuera de la boca.
4) Pigmentación del iris. Ojos azules frente a ojos más oscuros, sean éstos
verdes o marrones. Lo que se compara es la ausencia total o no de pigmentación
en la superficie del ojo. En ausencia de ésta, se observa la lámina interna azul del
iris, y los ojos serán totalmente azules. La presencia de pigmento en las capas
superiores del iris enmascara en mayor o menor grado el color azul del fondo.
Otros genes determinan el color exacto y su intensidad para ojos verdes,
marrones, etc., pero en esto no nos fijaremos.
5) Hiperextensibilidad del dedo pulgar. Capacidad o incapacidad de doblar hacia

atrás la última falange del pulgar en un ángulo de casi 90º respecto a la anterior
("dedo del autoestopista"). Esta capacidad puede manifestarse sólo en una de las
manos, y la expresividad del rasgo es variable.
6) Dedo meñique doblado. El meñique puede estar recto, o bien con la última
falange doblada hacia el dedo anular. Se colocan ambas manos relajadas sobre
una mesa y se observa si los dedos están paralelos o si los meñiques se doblan
hacia dentro.
7) Longitud relativa del dedo índice. Dedo índice más o menos largo que el anular.
Se realiza la observación como en el caso anterior. Se trata de un carácter de
expresión influenciada por el sexo.
51

8) Hoyuelos faciales a ambos lados de la boca. Presencia o ausencia de hoyuelos
en las mejillas.
9) Presencia de pelo en las segundas falanges de los dedos. Aunque sólo haya
algo de pelo en alguna de las diez falanges, se considera como fenotipo positivo.
10) Dedo gordo del pie corto. El dedo gordo del pie puede ser más corto o más
largo que el índice adyacente.
11) Capacidad de detectar la feniltiocarbamida (PTC). Hay individuos que detectan

un sabor amargo y otras que no notan nada. Introducir primero en la boca el papel
control, ensalivar, y sacar de la boca. Introducir a continuación el papel
impregnado en PTC y ensalivar.
Una vez realizada la observación, proceder de la siguiente manera:
1. Tomar los datos del fenotipo propio

2. Anotar todos los fenotipos en el lugar correspondiente de la hoja de datos.
3. Tomar los datos de tantos parientes (padres, hermanos, abuelos, tíos) como
sea posible.
4. Anotar los datos de cada persona en una hoja de datos diferente.
5. Confeccionar el árbol genealógico indicando el fenotipo de cada persona para,
al menos, dos de los caracteres analizados.
6. Determinar si es posible el tipo de herencia de los caracteres analizados.
7. En base al tipo de herencia, nombrar los alelos adjudicados a cada carácter en
la hoja de datos, usando una letra distinta para cada carácter, en
mayúsculas/minúsculas para dominante/recesivo.
8. Por último, indicar cuando sea posible los genotipos de todos los miembros para
cada carácter.
Como ejemplo de árbol genealógico se seguirá un esquema como el que se indica

a continuación:
52

I
1 2 3 4
II
1 2 3 4 5 6 7 8 9
III
1 2 3 4 5
En la genealogía se indica el orden de las generaciones con número romano. La

primera generación (I) corresponde a la primera persona de la que se posean
datos, por ejemplo la de los abuelos del alumno; la segunda (II) correspondería a
la de los padres y tíos, y la tercera (III), a la generación del alumno.
Los varones se representan con cuadrados, las mujeres con círculos, y por
rombos los individuos de los que no se conocen los datos (II.9). Las parejas se
unen por una línea horizontal. Los descendientes se disponen bajo una línea
horizontal desde la que parte una línea vertical por individuo, excepto en el caso
de mellizos (III.4 y 5) o gemelos fraternos (II.4 y 5), que se indican por líneas
convergentes (ver figura). Los individuos que muestran el fenotipo en estudio se
indican rellenando el símbolo.
53

Referencias:


54

HOJA DE DATOS 1
Parentesco:
Fenotipo Fenotipo
Lóbulo de la oreja ..... separado ..... unido Dedo autoestopista ..... presente..... ausente
Pico de viuda .... presente .... ausente Longitud del índice ..... corto ..... largo
Lengua en U ..... capaz ..... incapaz Dedo meñique ..... curvado ..... recto
Pigmentación del iris .... presente ..... ausente Hoyuelos faciales .... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges .... presente .... ausente Dedo gordo del pie ..... corto ..... largo
Detección PTC: …. SI .… NO
HOJA DE DATOS 2
Parentesco:
Fenotipo Fenotipo
Lóbulo de la oreja ..... separado..... unido Dedo autoestopista ..... presente..... ausente
Pico de viuda .... presente .... ausente Longitud del índice ..... corto ..... largo
Lengua en U ..... capaz ..... incapaz Dedo meñique .... curvado ..... recto
Pigmentación del iris ... presente ..... ausente Hoyuelos faciales.... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges ... presente ..... ausente Dedo gordo del pie ..... corto ..... largo
HOJA DE DATOS 3
Parentesco:
Fenotipo Fenotipo
Lóbulo de la oreja ..... separado..... unido Dedo autoestopista ..... presente..... ausente
Pico de viuda ..... presente .... ausente Longitud del índice ..... corto ..... largo
Lengua en U.... capaz ..... incapaz Dedo meñique.... curvado ..... recto
Pigmentación del iris.... presente..... ausente Hoyuelos faciales .... presentes... ausentes
Pelo en 2ª falanges.... presente..... ausente Dedo gordo del pie ..... corto ..... largo
55

Practica 13
ESTUDIO DE LA HERENCIA POLIGENICA
RECUENTO DE LAS LÍNEAS DE LAS HUELLAS DACTILARES
Objetivo:
Que el alumno comprenda la importancia del estudio de la herencia poligenica. Y
comprenda el estudio que será totalmente de las líneas de la huella (en inglés:
total ridge count o TRC)
Introducción:
La herencia poligénica no se puede analizar empleando pedigríes ni estudiando

los cromosomas (de no ser que se estudie una aberración cromosómica en
concreto). Un rasgo poligénico es el fenotipo resultante de la acción de dos o más
genes.
Estos tienen unas características comunes:

1.- los rasgos se cuantifican midiéndose,
2.-los rasgos son controlados por 2 o más genes resultando en un efecto aditivo,
3.- los rasgos son controlados por efecto de alelos múltiples,
4.- los fenotipos de los rasgos poligénicos y multifactoriales varían de expresión
por efecto de los factores ambientales.
Existen numerosos ejemplos de este tipo de herencia por ejemplo la estatura, el

peso, la inteligencia, el color de la piel, etc.
Demostrar y estudiar la herencia de los rasgos poligénicos no es fácil. El
ejemplo que a continuación te proponemos estudiar explorará cómo los rasgos de
la herencia de las huellas dactilares son modelos de herencia poligénicas.
Recogeréis las huellas dactilares vuestras y prepararéis un perfil de las mismas.
En 1890, Francis Galton sugirió que las huellas dactilares serían una buena
manera de identificación para humanos. Durante los últimos años de hecho, tanto
los dibujos de las huellas dactilares (de las manos y pies) y de las huellas de las
palmas de las manos y pies han sido de gran interés para numerosos estudios
especializados. Un ejemplo de su utilidad es el estudio de la huella del recién
nacido para el diagnóstico precoz de anormalidades cromosómicas.
La herencia de las huellas dactilares, al igual que los demás caracteres de
herencia poligénica, también se ve influída por factores ambientales aunque,
debido a la precocidad y rapidez del desarrollo de éstas, el fenotipo no cambiará
tras el nacimiento. Las huellas dactilares se pueden detectar a partir de la 6ª
semana de desarrollo fetal, llegando a su mayor desarrollo hacia la semana 12-13.
Posteriormente regresarán hasta adquirir la morfología final que ya no se verá
alterada durante el restante desarrollo prenatal y postnatal.
56

ARCOS LAZOS ESPIRALES
Clasificación de las huellas
Los patrones de los dibujos de las huellas se pueden clasificas en tres grupos
principalmente: arcos, lazos y espirales. El arco es el patrón más simple y menos
frecuente. En las huellas donde aparecen lazos, las líneas aparecen en tres
direcciones, encontrándose en un punto intermedio (el trirradio) con ángulos de
unos 120 grados. En el centro del punto de encuentro se forma un triángulo. Los
lazos pueden denominarse radiales o cubitales, dependiendo de hacia dónde
estén inclinados; por ejemplo, un dedo meñique presentará un lazo radial si su
trirradio se abre hacia el pulgar de su misma mano. Un lazo cubital será aquel que
del pulgar se abra hacia el meñique de la misma mano. El patrón espiral presenta
dos trirradios (formándose dos triángulos). Las frecuencias de estros tres patrones
en la población son de 5,0% para el arco, 5,4% para el lazo radial, 63,5% para el
lazo cubital, y 26,1% para el espiral.
Características de algunos síndromes comunes:
- Trisomía 21: dedos con lazos cubitales generalmente, lazos radiales en dedos 4
y 5.
- Trisomía 18: líneas poco desarrolladas, gran frecuencia de arcos (media de 7-8
con al menos un arco). En los pulgares sin arcos, con lazos radiales, recuentos
TRC bajos.
- Síndrome de Turner (45,X): alto recuento TRC sin aumento de espirales.
Relación entre la media de TRC y el número de cromosomas X e Y
45, X 165 47, XYY 103

46, XY 145 48, XXYY 88
46, XX 126 48, XYYY 83
47, XXY 114 49, XXXXX 17
57

Materiales:
Cinta tape transparente.
Regla
Metodologia:
1.- Recogida de un juego completo de huellas dactilares propias.
2.- Clasificar las huellas de acuerdo a su morfología.
3.- Determinar el recuento total de líneas (TRC) de un juego completo de huellas.
4.- Construír un histograma de la distribución de frecuencias con los datos
obtenidos del grupo de prácticas.
5.- Discutir las características de la herencia poligénica y el por qué de su difícil
análisis.
Bibliografia:
Beckoff. M.1977. Canis Latarans. Mammalian Species, 79, 1-9.
Martin, L.D. 1989. Fossil history of the terrestrial carnivore. En : Gittleman, J.l.
(Ed) Carnivore behavior, ecology and evolution. Pp 536-568 Cornell University
Press. New York.
58

Resultados:
Recogida de datos individuales
(pegar aquí la cinta adhesiva con las huellas en cada casilla)
pulgar derecho (I) índice derecho (II) corazón dcho (III) anular derecho meñique
(VI) dcho(V)
pulgar izquierdo (I) índice izquierdo (II) corazón izdo (III) anular izdo (IV) meñique izdo
(V)
59

mano derecha
pulgar índice corazón anular meñique
patrón
obtenido:
_________ _________ _________ _________ _________
recuento
parcial: _________ _________ _________ _________ _________
recuento _________
total =
mano dcha
mano izquierda
pulgar índice corazón anular meñique
patrón
obtenido:
_________ _________ _________ _________ _________
recuento
parcial: _________ _________ _________ _________ _________
recuento _________
total =
mano izda
Recuento total dos manos: TRC= ___________
60

Recogida de datos del grupo de prácticas
sexo
estudiante V/M TRC lazos* espirales* arcos*
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
61

22
23
24
% del total: ______ ______ ______
media del TRC: ________
media TRC
mujeres:
________
media TRC
varones:
________
(*) poner el número de dedos
Realizar un histograma de frecuencias.
Preguntas de la práctica:
1.- ¿Cuál es la media TRC para la clase? ¿Existen diferencias en las TRC medias
para los varones y mujeres?
2.- ¿Cuál puede ser la causa de esta diferencia? Razona tu respuesta.
3.- Compara tu TRC con la media total y con la de tu sexo.
4.- Resume y razona los resultados obtenidos en el histograma.
5.- De haber recogido datos de una población mucho mayor ¿crees que el gráfico
presentaría otro aspecto? Razona tu respuesta.
62

Practica 14
ESTUDIO DE POLIMORFISMOS
ANÁLISIS DEL GRUPO SANGUÍNEO
Objetivo:
El objetivo del analisis del gurpo sangineo es analizar un polimorfismo evidente
fenotípicamente, como es el de los grupos sanguíneos. Se pretende dar a conocer
la base genética de los grupos sanguíneos más importantes. Se determinarán los
grupos sanguíneos de cada alumno mediante la extracción de unas gotas de
sangre por punción del cuarto dedo de una mano con una lanceta estéril.
Introducción:
Los polimorfismos son el reflejo de la diversidad genética de la especie. Se dice
que existe un polimorfismo en un determinado locus cuando hay más de un alelo
presente en la población con una frecuencia superior al 1%. Aunque un individuo
sólo puede presentar como máximo dos alelos distintos para un locus, un estudio
poblacional puede revelar la presencia de múltiples alelos para ese locus,
especialmente en ciertos loci que son altamente polimórficos.
Una pequeña proporción de los polimorfismos en el ADN dará lugar a diferencias a
nivel de los aminoácidos codificados, produciendo por tanto un polimorfismo de
proteínas. Pero la mayoría de los polimorfismos en las secuencias de ADN
ocurren en ADN no codificante, y no tienen por tanto efecto fenotípico (se
denominan silenciosos). La causa de que la mayor parte de polimorfismos sean
silenciosos es, por una parte, que la gran mayoría del genoma humano consiste
en ADN no codificante; y por otra, que este ADN está sometido a menores
presiones selectivas.
En esta práctica abordaremos el estudio de polimorfismos humanos de dos
maneras muy distintas. En primer lugar se estudiará el polimorfismo del locus AB0
que determina el grupo sanguíneo. Puesto que es éste un polimorfismo fenotípico,
y además la penetrancia es del 100%, el análisis se hará directamente sobre el
producto génico.
Materiales:
Sangre de los indviduos.
Metodologia:
Sistema AB0
La determinación de grupos del sistema AB0 se efectúa enfrentando los
hematíes problema con antisueros de especificidad conocida: anti-A, anti-B y anti
A,B (grupo 0). La aglutinación o no aglutinación de los hematíes ensayados frente
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a cada uno de los antisueros es indicativa de la presencia o ausencia de los
correspondientes antígenos en los mismos.
1.- Dividir un porta en cuadrados. Rotular las divisiones: anti-A, anti-B y anti-AB.
2.- Con una lanceta estéril realizar una punción en el cuarto dedo de una mano.
3.- Depositar en cada cuadrado una gota muy pequeña de la sangre a ensayar.
4.- Añadir 1 gota de cada antisuero en su respectivo cuadrado.
5.- Mezclar bien la sangre con el reactivo empleando palillos distintos para cada
ensayo.
6.- Mover la placa lentamente por rotación a temperatura ambiente. Examinar
macroscópicamente la aparición de aglutinación a los 2 minutos.
Sistema Rh (anti-D)
La presencia del antígeno D se determina enfrentando los hematíes problema, en
un medio proteico alto, con suero anti-D. La aglutinación o no aglutinación de los
hematíes ensayados es indicativa de la presencia o ausencia del correspondiente
antígeno en los mismos.
1.- Depositar una gota de suero anti-D sobre un porta rotulado.
2.- Sobre otro porta depositar una gota de Autocontrol Rh-hr CROMATEST.
3.- Añadir a cada porta 2 gotas de sangre de un tamaño aproximado a la gota de
suero en él depositada.
4.- Con palillos distintos mezclar reactivo y sangre de forma que cubran una
extensión de unos 2 cm cuadrados.
5.- Colocar los portas sobre la lámpara visualizadora precalentada (45º).
6.- Mover la lámpara lentamente con movimientos pendulares durante 2 minutos,
observando macroscópicamente la aparición de cualquier signo de aglutinación .
Lectura
Reacción negativa: ausencia de aglutinación al cabo de los 2 minutos.
Reacción positiva: aglutinación visible a los dos minutos y ausencia de aglutinación
con el autocontrol. La reacción positiva indicará cuál es el antígeno presente en los
eritrocitos (por ej. si sale aglutinación en la casilla “A” el grupo sanguíneo será A).
Si los hematíes presentasen aglutinación en el Autocontrol, dar el resultado como no
válido.
Cuestionario:
1.- Anotar los resultados obtenidos y deducir el genotipo ó genotipos posibles.

2.- ¿Por qué se tiene en cuenta el grupo sanguíneo de las series AB0 y Rh en las
transfusiones y no la serie MN?
3.- ¿Por qué el antígeno D define básicamente al grupo Rh?
4.- ¿Por qué el análisis de los grupos sanguíneos sólo sirve en algunos casos
para excluír la paternidad y no para asignarla?
5.- ¿En qué casos la eritroblastosis fetal puede manifestarse en el primer
embarazo asumiendo incompatibilidad Rh?
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Referencias:


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Practica 15
TECNICA DE APLASTAMIENTO PARA EL ESTUDIO DE CROMOSOMAS
OBJETIVO
Que el alumno comprenda la importancia del estudio de los cromosomas como

portadores de la informacion genetica.
INTRODUCCION
Los cromosomas son las estructuras en que se organiza la cromatina nuclear y

que tienen una expresión dinámica en las distintas fases del ciclo celular. En la
mitosis estas estructuras comienzan un proceso de compactación que alcanza su
máximo nivel en la metafase. Los cromosomas se tiñen fácilmente cuando están
condensados y pueden ser individualizados con el microscopio óptico. Cada
cromosoma contiene una molécula de ADN lineal asociado a distintas proteínas y
el contenido de genes es variable aunque está en relación con su tamaño. Por
eso, cualquier alteración en el número o la estructura de los cromosomas puede
ser causa de enfermedades. Para la detección de estas alteraciones se
desarrollaron numerosas técnicas y todas ellas requieren de un observador
entrenado que las interprete. Los humanos tenemos un número total de 46
cromosomas y este número varía según las especies. Los 46 cromosomas están
constituidos por 23 pares de homólogos y cada miembro del par proviene de un
progenitor. El cariotipo es la constitución cromosómica de un individuo y es un
estudio de rutina en genética médica. Los cariotipos se pueden informar
presentando todos los pares cromosómicos ordenados de acuerdo a su tamaño,
que en un principio eran recortados de la fotografía de una metafase, y ahora se
pueden hacer con analizadores automáticos. De los 23 pares, el par de
cromosomas sexuales se señala por separado para indicar el sexo del individuo.
Para citar el cariotipo de un individuo se indica primero el número total de
cromosomas y seguidamente los componentes del par sexual precedido de una
coma. Así, el cariotipo normal de un varón se escribe 46,XY y el de una mujer
46,XX. Las anomalías cromosómicas son una causa más importante de abortos
espontáneos, retardo mental y malformaciones.
METODOLOGIA
1. Utilizando una navaja corte las puntas radiculares que han crecido en la
base de la cebolla colocada en agua; descarte las raíces mayores a 2 cm.
Coloque la mitad de las puntas radiculares en colchicina y la otra
proporción en solución de Carnoy. Mantenga las muestras siempre frescas
y no deje que se sequen en ningún momento. Sea precavido con la
66

colchicina ya que es venenosa (lave inmediatamente cualquier area de
contacto)
2. Después de unas horas en la solución de Carnoy, remueca cuatro puntas
radiculares y coloque las puntas en la solución de maceración (1:1 de
alcohol: HCl). Cronometre bien el tiempo en estos pasos, a intervalos de
dos minutos remueva las puntas radiculares a viales con 45% de acido
acético marcado con 2, 4,6 y 8 minutos. Las puntas radiculares deberán
permanecer por lo menos durante 15 minutos en acido acético al 45%.
3. Agregue una gota de acetocarmin a un portaobjeto y tranfiera la punta
radicular macerada por dos minutos en el carmín. Utilice agujas con puntas
finas (entomológicas) para remover la punta de 1mm. Descarte la opción
restante de la raíz, adicione acetocarmin a la punta si es necesario.
Detenga la punta de la raíz con una aguja de diseccion (de preferencia con
punta de dicromo) y rasge la punta; durante este procedimiento la
acetocarmina se tornara ligeramente morado, esto es ventajoso ya que
acelera la reacción de la tinción de la cromatina. Si se expone mucho a la
punta de acero la tinción formara un precipitado oscuro que puede arruinar
la preparación.
4. Ponga un cubreobjetos limpio y adicione acetocarmin para rellenar los
espacios bajo el cubreobjetos. Invierta cuidadosamente la preparación y
coloque en los bordes de papel secante; presione con cuidado, pero no
fuerte para aplastar las células. No deje que se resbale a los lados la
preparación.
5. Caliente en un mechero de alcohol la preparación con la muestra arriba
para diferenciar la tinción (los cromosomas se tiñen mas y el citoplasma se
aclara), cuide que no hierva la preparación de acetocarmina.
6. Con la punta del borrador de un lápiz presione ligeramente la preparación
para aplanar mas las células.
7. Puede en este paso sellar los lados del cubreobjetos con barniz de uñas.
8. Examine la preparación del microscopio utilizando un filtro verde para
mejor claridez. Si las células están conglomeradas y no aplanadas,
descarte la preparación y utilice las puntas radiculares que se encuentran
maceradas a 4 minutos y si aun no hay éxito utilice las de mayor tiempo.
Aunque la maceración prolongada resulta en fallas en la captación de
tinción del núcleo y cromosomas.
9. No haga las preparaciones de forma mecánica, hágalas de una en una y no
apresuradamente. Guarde mejor la preparación para posteriores estudios.
Si las mantiene por más de 2 o 3 días es mejor colocarlas en una caja de
petri con un poco de papel secante húmedo y mantenerlas en el
67

refrigerador. Normalmente las mejores preparaciones se encuentran
durante los primeros días después de preparadas.
10. Las puntas colocadas en la colchicina deben removerse después de 6
horas, colocarse en solución de carnoy par fijarse. Después de la fijación se
aplastan y tiñen en acetocarmin.
11. El numero de cromosomas de la cebolla común allium cepa es e 2n=16
Referencias:


68

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

Ciudad Juárez, Chihuahua

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias

Dr. Alejandro Martínez Martínez

M.C. Hugo Staines Orozco

Aprobados por la Academia de Biología, 2011

Practica 1: Extraccion de DNA…………………………………………………………..3

Practica 2: Corrimiento de Acidos Nucleicos…………………………………………..9

Practica 3: El cariotioi humano…………………………………………………………11

Practica 4: Simulacion de errores durante el proceso de replicacion...……………14

Practica 5: Digestion del DNA con endonucleasas de restriccion………………….19

Practica 6: Southern blotting……………………………………………………………23

Practica 7: Transformacion de celulas bacterianas…………………….……………28

Practica 8: Fundamentos de la clonacion……………………………………………..32

Practica 9: Regulacion genica en procariotes………………………………………...37

Practica 10: Factores involicrados en la regulacion de la transcripcion genica en

Practica 11: Biologia genomica………………………………………………………...48

Practica 12: Estudio genealogico en el genoma humano…………………………...50

Practica 13: Estudio de la herencia poligenica………………………………………56

Practica 14: Estudio de los polimorfismos del grupo sangineo……………………..63

Pracitca 15: Tecnica del aplastamiento para el estudio de los cromosomas……..66

Que el alumno aprenderá sobre la extracción de DNA y la electroforesis.

El concepto básico de la extracción de DNA se puede dividir en 5 pasos:

A partir de células sanguíneas o de espermatozoides (Nature, Vol 318, 12 dic,

1.- Tomar 300 µl de glóbulos blancos principalmente.

2.- La solución grinding contiene las siguientes soluciones stock:

3.- Homogenizar con un pistón de teflón

4.- Incubar el homogenizado a 55°C toda la noche (o por 3 horas)

5.- Agregar 20 µl de NaCl 5 M por cada tubo de muestra.

6.- Agregar un volumen igual de fenol equilibrado a la muestra.

7.- Dar vortex por 1 minuto. Microcentrifuga de 3 a 5 minutos a máxima velocidad.

10.- Agregar un volumen igual de cloroformo a la muestra.

11.- Dar vortex por 1 min. Microcentrifuga de 3 a 5 minutos a máxima velocidad.

13.- Agregar 2 volúmenes de etanol 100% frio al sobrenadante y mantenerlo por 5

15.- Adicional 2 volúmenes de etanol al 70% y dejar a temperatura de cuarto por 5

16.- Centrifugar 5 minutos descartar sobrenadante dejando solamente el pellet,

17.- Secar el pellet a temperatura ambiente.

18.- Resuspender el pellet de DNA seco en 50 µl de H2O uv para cuantificar en el

19.- Colocar las muestras en refrigeración a -20°C para almacenar el DNA.

Procedente de células epiteliales

3.- Centrifugar el tubo a alta velocidad por 2 minutos.

4.- Remueve el sobrenadante con P1000 y pon el tubo conteniendo el pellet en

5.- Poner 200 µl de chelex al 5% sobre pellet y resuspender.

6.- Poner el tubo en baño de arena a 100°C por 8 minutos.

8.- centrifuga a alta velocidad por 2 min.

10.- Adicionar 2.5 µl de solución de células bucales a cada 50 ul de tubos de

El espectrofotómetro mide la cantidad de luz ultravioleta a 260nm absorbida por

Absorbancia de 1 a 260 nm es igual a 50 µg/ml de DNA de doble hebra.

Nota: La contaminación de soluciones de acidos nucleicos hace la cuantificación

Double-Stranded DNA (dsDNA):

A260 = OD 260= 1 for a 50 µg/ml solution

Single-stranded RNA (ssRNA):

A260= OD260= 1 for a 40 µg/ml solution

Single-stranded DNA (ssDNA):

A260= OD260= 1 for a 33 µg/ml solution

Molar Extinction coefficient X concentration X pathlength (usually cuvette width)

1. Hacer 1.8 % agarosa en 1 X TBE: 0.9 g agarosa en 50ml 1 X TBE.

Agarosa: sirve como matriz para la separación de fragmentos de DNA por su

Recommended Agarose Gel Percentages for Resolution of DNA

Gel DNA size

1. Diluir la solución de EtBr a menos que 0.1mg/ml con agua.

Zavala Castro Jorge Eduardo, Manual de Técnicas Básicas de Biología Molecular,