UT 10 (continuacion) PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

Los microorganismos no presentan una variedad de aspectos anatómicos definidos, y por tanto
los procedimientos para la identificación de los microorganismos se realizan estudiando:
- Sus características morfológicas macroscópicas y microscópicas.
- Sus características tintoriales.
- Su comportamiento bioquímico.

Teniendo siempre presente que para realizar todas estas pruebas de identificación, previamente
hemos aislado el microorganismo y hemos obtenido un cultivo puro del mismo. Se han de usar cultivos
puros, jóvenes y en fase exponencial de crecimiento.

1. MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA: Consiste en el estudio de las colonias en

distintos medios de cultivo. Es un dato orientativo, pero en ocasiones el aspecto de las
colonias es importante para la identificación de un microorganismo. Se estudia la forma,
borde, color, elevación, superficie, etc.. (ver dibujo de colonias)

2. MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA: Consiste en la observación del microorganismo

en el microscopio, en fresco o mediante tinción. Se estudia la forma celular individual y
la disposición o agrupación celular de la bacteria.

La morfología bacteriana celular es diferente de unas especies a otras, pero es poco variada. Se
diferencian las siguientes formas:
Formas esféricas o COCOS.
Formas cilíndricas rectas alargadas. BACILOS
Formas cilíndricas largas onduladas. ESPIRILOS
Formas cilíndricas cortas y curvas. VIBRIOS.
Formas alargadas en espiral. ESPIROQUETAS.

Cuando la célula bacteriana se divide, las nuevas células pueden agruparse o bien quedar células aisladas.
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 Los Cocos se agrupan en:
Parejas: Diplococos.
Cadenas: Streptococos.
Racimos: Stafilococos.
Masas cúbicas: Sarcinas.

Los Bacilos que habitualmente se presentan aislados, pueden formar cadenas, colonias móviles o
estructuras pedunculadas. (Ver dibujo anterior).

3. CARACTERÍSTICAS TINTORIALES: Consiste en teñir el microorganismo

mediante tinción simple (empleo de un solo colorante), o tinciones diferenciales que
emplean más de un colorante. Mediante las tinciones se pone de manifiesto algún
carácter propio del microorganismo, como la morfología y agrupación celular, cápsulas,
endosporas, flagelos…

Una de las tinciones más importantes es la tinción diferencial de Gram, que divide a las bacterias
en dos grandes grupos basándose en el distinto comportamiento de los colorantes frente al espesor de la
pared celular las bacterias: bacterias Gram+ y bacterias Gram-.

Las Gram+: poseen una pared gruesa y uniforme, y en la tinción de Gram impiden la salida del
primer colorante (cristal violeta) al decolorar con alcohol-acetona y dan coloración azul-violeta.

Las Gram- : poseen una pared más delgada y heterogénea- Pierden el primer colorante (cristal
violeta) al decolorar con alcohol-acetona y conservan el segundo colorante (safranina) dando coloración
rosa.

4. TIPACIÓN BIOQUÍMICA: Investigación del metabolismo de un microorganismo.

Para la investigación bioquímica es imprescindible partir de un cultivo puro joven en fase de

crecimiento exponencial (18-24 horas), se realizan una serie de pruebas bioquímicas que en general nos
van a poner de manifiesto la capacidad que poseen dichas bacterias para producir enzimas, utilizar o
transformar ciertas sustancias, produciendo cambios y compuestos característicos que pueden ser
detectados de una forma fácil.
Los resultados de estas pruebas se comparan con el resultado tipo obtenido en el estudio de un grupo de
microorganismos conocidos (patrones) procedentes de colecciones de cultivo, estas bacterias serán
utilizadas como controles y facilitaran la investigación e identificación de la “bacteria problema”.

El número y tipo de pruebas bioquímicas a realizar a cada microorganismo en estudio, depende

de los primeros datos del examen microbiológico, como morfología, aspecto de las colonias,
características tintoriales, medios de cultivo donde crecen… Ej. Si en el estudio microscópico observamos
que el microorganismo en estudio presenta una morfología bacilar Gram- le haremos las pruebas IMVIC y
Kligler que son características para identificar Enterobacterias (bacilos Gram-).

Para la identificación correcta de los microorganismos debemos consultar los resultados obtenidos
durante las pruebas de identificación con un manual de identificación adecuado al sistema utilizado:
Manual Bergey de taxonomía, Tabla codificada, programa informático, Índice de perfiles API…
La clasificación de las pruebas bioquímicas es muy diversa vamos a establecer una en base a sus
funciones bioquímicas.

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 CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

DETERMINACIÓN DEL Prueba óxido-fermentativa de Hugo-Leifson

METABOLISMO
HIDROCARBONADO Producción de ácido y gas (fermentación de azúcares)

DETERMINACIÓN DEL
METABOLISMO PROTEICO Hidrólisis de la Gelatina

Oxidasa

Catalasa

PRUEBAS ENZIMÁTICAS Amilasa (hidrólisis del almidón)

Ureasa

Reducción de nitratos

Indol

PRUEBAS PARA Rojo de Metilo

ENTEROBACTERIAS
(IMVIC) Voges-Proskauer

Citrato de Simons

Agar-Hierro-Kligler (AHK)
MACROTÉCNICAS
Agar-Sulfuro-Indol-Motilidad (ASIM)

SISTEMAS MULTIPRUEBAS

Sistemas en tira (API 20E)

MICROTÉCNICAS
Sistemas en Tubo

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 A. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO HIDROCARBONADO.

Estas pruebas se basan en la utilización de los hidratos de carbono por los microorganismos
mediante metabolismo oxidativo (aerobio) ó fermentativo (anaerobio).

A.1 Prueba de oxidación fermentación de azúcares O/F de Hugo-Leifson: Pone de manifiesto

la propiedad de determinados microorganismos de actuar sobre los hidratos de carbono por via oxidativa o
fermentativa, las bacterias que no presentan esta actividad sobre los glúcidos dan esta prueba negativa.
Esta prueba diferencia géneros Gram- de las Enterobacterias (fermentadoras de glucosa). Pseudomonas
oxidan la glucosa.

El medio de cultivo que se emplea es el de Hug y Leifson que contiene entre otros componentes el
azúcar a estudiar y un indicador de ph (azul de bromotimol).
Se inoculan dos tubos en picadura, uno de ellos “abierto” vía oxidativa (proceso aerobio) y otro
cubierto con parafina para aislarlo del oxigeno, vía fermentativa (proceso anaerobio). Después del periodo
de incubación, si se produce viraje del color azulado a amarillo, indica que el microorganismo ha
producido acidez a partir del azúcar.
 Si el color amarillo se manifiesta ligeramente en la parte superior del tubo sin
parafina y sin producción de gas, el microorganismo actúa sobre el azúcar
oxidativamente.
 Si el viraje a amarillo se manifiesta intensamente desde la parte inferior a superior
en ambos tubos con ó sin producción de gases diremos que el microorganismo es
fermentador.

fermentativo oxídativo

negativo
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 A.2 Prueba de producción de ácido y gas: Se determina la capacidad del microorganismo de
fermentar azúcares produciendo ácidos (vira el indicador) y/o ácidos y gases. El gas se detecta
introduciendo una campana Durhan invertida en el tubo inoculado.

 Viraje a amarillo, indica la presencia de ácidos.

 Presencia de burbujas dentro de las campanas, indica producción de gas.

Prueba de fermentación de lactosa: PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Y GAS.

CALDO BILIS VERDE BRILLANTE

FUNDAMENTO: Evidenciar la fermentación de la lactosa y la producción de gas. El medio inhibe Gram (+),
debido a que contiene verde brillante y bilis. Sirve para la detección de coliformes totales

Se muestra la prueba positiva en los tres
tubos, debido a que se observa
crecimiento (turbidez) y formación de
burbuja en la campana de Durham.
Es decir presencia de coliformes.
Se observa la prueba negativa en los tres tubos, debido a que no
hay crecimiento, pero eventualmente puede haber turbidez, pero si
no hay producción de gas la prueba es negativa

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 B. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO PROTEICO

Son pruebas para detectar enzimas necesarias para el metabolismo de las proteínas.

B.1 Prueba de hidrólisis de la gelatina: Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un
microorganismo para producir enzimas proteolíticas que licúan la gelatina (gelatinasas).

MEDIO FRAZIER
Preparar 1 litro de agar nutritivo. Disolver 40 g de gelatina en una pequeña cantidad de agua hirviendo
(tomarla del agua utilizada para la preparación del agar nutritivo). Mezclar ambas soluciones. Esterilizar
durante 20 minutos a 120 ºC.

CLORURO MERCÚRICO ÁCIDO. Reactivo de FRAZIER

Cloruro mercúrico 15,0 g

Acido clorhídrico concentrado 20,0 mL
Agua destilada 100,0 mL

PROCEDIMIENTO
Inocule con filamento haciendo una estría en la superficie del medio (agar gelatina). Incube a 37°C por 2 a
7 días.

RESULTADOS
Cubra la placa con el reactivo precipitante de proteínas (Cloruro mercúrico ácido). Un precipitado blanco
indica presencia de gelatina no hidrolizada; la ausencia del precipitado en la región de crecimiento
bacteriano indica hidrólisis de la gelatina.

Crecimiento en Medio Frazier antes de añadir el reactivo

Resultado negativo Resultado positivo

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 C. PRUEBAS ENZIMÁTICAS: Son pruebas que determinan la presencia de enzimas en el
microorganismo.
C.1 Prueba de la oxidasa: Esta prueba pone de manifiesto la presencia de la enzima oxidasa
(citocromo c oxidasa) en ciertos microorganismos, (bacterias aerobias, facultativas y microaerofilas). La
citocromo c oxidasa es una enzima que cede electrones de un sustrato al oxígeno en la cadena de
transporte electrónico.
La identificación de esta enzima se basa en la capacidad del colorante tetrametil-para-
fenilendiamino de oxidarse al ceder electrones al citocromo c. Este colorante es incoloro en estado
reducido y puede oxidarse rápidamente en presencia del citocromo c, dando una coloración azul. Esta
prueba permite diferenciar entre otras el grupo Enterobacteriacea (negativo) del género Pseudomonas
(positivo).

 Reactivo.
El reactivo empleado es el cloruro de tetrametil-p-fenilendiamina, cuyo cambio oxidativo, al ceder
los electrones a la citocromo oxidasa, revela la prueba. Este reactivo debe ser de preparación momentánea.
Actualmente, esta reacción se puede realizar directamente empleando unas tiras reactivas que ya
llevan incorporado el reactivo.

 Técnica.
Si la técnica emplea el reactivo recién preparado, se debe tomar un trozo de papel de filtro y
colocar una gota de reactivo y con ayuda del asa o pipeta Pasteur, se toma un pequeño inoculo del cultivo
y se pone en contacto con el reactivo.
Si por el contrario se emplean las tiras reactivas, la operación es más rápida, simplemente se debe
poner en contacto el asa o pinchar con el hilo en la zona de la tira que contiene el reactivo.

 Lectura de la reacción de identificación.

Esta reacción es muy rápida, en aprox 10 segundos se pueden observar los resultados que son:

La Prueba (+) se observa de color AZUL en tiras que poseen compuestos que son oxidados por la enzima.
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La prueba (-) se observa de color amarillo.

C.2 PRUEBA DE LA CATALASA (CAT).

Se investiga la presencia de la enzima catalasa en el microorganismo por la capacidad de

descomponer el peroxido de hidrógeno en agua y oxigeno que aparece como burbujas de oxígeno en el
medio (portaobjetos). La catalasa es una enzima propia de la mayoría de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas.

 Técnica  Tomar con el asa una colonia y depositarla sobre el porta. Añadir con una pipeta una
gota de agua oxigenada al 3%.

 Resultado  Si la prueba es positiva se producirán burbujas de oxígeno.

Esta prueba se usa para determinar la presencia de la enzima catalasa. La prueba POSITIVA se
observa producción bubujas. De lo contrario la prueba es NEGATIVA.

C.3 PRUEBA DE LA UREASA (URE).

Esta prueba determina la presencia, en algunas bacterias, de la enzima ureasa que es capaz de
hidrolizar la urea a carbonato amonico, que se detecta por la alcalinización del medio.

 Medio  Bactourea agar base de Christensen. Se le añade urea al 20% esterilizada por filtración.

 Normas para preparación del medio.

 Agua de peptona .................................................. 1 g
 Glucosa ................................................................ 1 g
( NaCl ..................................................................... 5 g
( Fosfato monobásico potásico ............................... 2 g
( Rojo fenol .......................................................... 0,012 g
( Agar-agar .............................................................. 15 g
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 ( Urea ...................................................................... 20 g

Se pesan todas las cantidades de los componentes señalados (tener en cuenta el contenido de NaCl
del agua de peptona y ajustar con la cantidad que hay que añadirle), excepto los gramos de urea. Se
mezclan todos (excepto la urea), se enrasa hasta 900 ml con agua destilada y se lleva a esterilizar al
autoclave.
Paralelamente se prepara la urea, se pesan los 20 gr y se disuelven en agua destilada hasta 100 ml;
se trata de una sustancia termolábil por lo que para su esterilización no puede realizarse en autoclave sino
que se realiza por filtración a vacío. Se recoge en el kitasato estéril y se mezcla con el medio base, que
debe estar sobrefundido 50-55ºC. Hay que tener mucho cuidado de que no se encuentre demasiado
caliente para evitar que la urea se descomponga.

 Técnica  Una vez preparado el medio se siembra el microorganismo masivamente en la

superficie de un tubo con el agar Christensen en inclinado. Finalizada la siembra se llevan a incubar los
tuboss durante 48 horas a 37ºC.

 Lectura de la reacción de identificación.

Pasado el tiempo de incubación, se retiran los tubos de la estufa y se procede a su lectura:

 Prueba positiva  Aquellos tubos, cuyo color amarillo inicial haya virado a rosa, están
indicando alcalinización del medio.

Urea - Urea +

Hay que tener precaución por que también puede ocurrir que no se produzca cambio de coloración, en este caso
es negativo. el medio posee un color rosáceo (mucho menos intenso que los verdaderos positivos) lo que puede
llevarnos a error (falsos positivos)

C.4 PRUEBA DE LA AMILASA (hidrólisis del almidón)

 Fundamento.

Esta prueba trata de poner de manifiesto, la capacidad de aquellos microorganismos que son
capaces de hidrolizar el almidón. Como consecuencia de esa hidrólisis, se produce zonas de aclaramiento
alrededor de las colonias bacterianas.
La detección se hace más visible por la adición de lugol que forma un complejo azul con el
almidón no hidrolizado.
 Medio  Agar almidón

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  Normas para preparación del medio: Agar nutritivo al que se le añaden 2g/l de almidón
 Reactivo  Lugol

 Técnica  Preparado el medio se tiende en placa pequeñas, luego con un asa se toma el inoculo
y se siembra tocando con el asa en varios puntos (no hay que volver a tomar el inoculo). Se lleva a incubar
a 37º C durante 48 horas.

 Lectura de la reacción de identificación.

Pasado el tiempo de incubación se retiran las placas de la estufa y para observar la prueba hay que
agregarle lugol.

 Prueba positiva  La aparición de unas zonas de aclaramiento alrededor del crecimiento o de un

halo transparente al adicionar el lugol indica que las bacterias pueden hidrolizar el almidón del medio. El
resto de la placa aparece cubierta de azul.

Después de que ha crecido la bacteria en el medio de cultivo, se adiciona lugol sobre el medio y se
esperan unos minutos. En la parte izquierda de la placa se observa la prueba Negativa de
color azul oscuro, es decir que no se degradó el almidón. En la parte derecha se observa la
prueba Positiva debido a que no se unió el iodo-ioduro del lugol y el medio no toma ningún color.

C.5.- PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS.

 Fundamento.

Esta prueba investiga la presencia de una enzima bacteriana encargada de la reducción de nitratos a
nitritos o a N2, es la enzima nitrato reductasa (nitrasa)..

 Medio  Indol-nitrito, aunque puede ser sustituido por agar nutritivo + KNO3 (1g/l).

 Reactivo  Ácido sulfanilico y alfa-naftalamina

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  Normas para preparación de estos reactivos.

 Solución de ácido sulfanílico.

 Ácido sulfanilico .................................. 0,8 g

 Ácido acético 5N ................................. 100 ml

 Solución de alfa-naftilamina.

 Alfa-naftilamina .................................... 0,5 g

 Ácido acético 5N ................................. 100 ml

 Técnica.

Se prepara el medio y se tiende en tubo inclinado, después con ayuda de un asa de siembra se toma
un inoculo y se en superficie. El tubo con el medio sembrado se lleva a incubar, a 37º C durante 48 horas.

 Lectura de la reacción de identificación.

Pasado el tiempo de incubación se retira el tubo de la estufa y se le agrega 0,5 ml de cada reactivo,
1º el 1-naftilamina y 2º el ac. sulfanílico y se observa al cabo de unos minutos la coloración que presente:

 Coloración rosa o roja  Presencia de nitritos.

 Sin coloración  La falta de coloración no permite diferenciar si los nitritos se han

reducido a N2 o si no ha habido reducción de los nitratos; por lo tanto y para poder determinar esa
condición, se añade una pequeña cantidad de polvo de zinc y se observa la reacción:

 Coloración roja  Los nitratos han sido reducidos a nitritos por el zinc, lo que
confirma que la bacteria no ha sido capaz de reducir los nitratos.
 Sin coloración  Indica que la bacteria ha reducido los nitratos a N2.

positivo presunto negativo

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 D. PRUEBAS PARA ENTEROBACTERIAS.

Son cuatro pruebas para identificación de bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae,

con géneros tan representativos como Escherichia, Salmonella, Serratea, Klebsiellla, etc.

D.1 PRUEBA DEL INDOL (IND).

Esta prueba se emplea para detectar la presencia del enzima triptofanasa en las bacterias. Las
bacterias cultivadas en agua de peptona, sin indol o glúcidos, y que poseen el enzima triptofanasa son
capaces de desintegrar el aminoácido triptófano presente formando así indol.
La detección del indol se hace con el reactivo de Kovacs donde el indol se extrae con el alcohol
amílico formando un complejo de color rojo con el paradimetilaminobenzaldehído.

 Medio  Se puede emplear indol-nitrito, aunque también se puede sustituir por un medio
liquido, constituido por agua de triptona, NaCl y agua destilada, ajustándolo a un pH = 7,2.

 Reactivo  Reactivo de Kovacs

 Técnica.
Se siembra la bacteria en un tubo con el medio liquido, empleando un asa de siembra y se incuba a
37º C durante 48 horas.

 Lectura de la reacción de identificación.

Finalizado el tiempo de incubación, se retira el tubo de la estufa, se añade 5 gotas del reactivo de
Kovacs se agita y se deja reposar unos minutos.

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  Prueba positiva (presencia de enzima triptofanasa)  Aparición de anillo rojo en la
parte superior del tubo.

D.2. PRUEBA DEL ROJO DE METILO (R-M).

Las bacterias fermentadores de azucares pueden hacerlo mediante rutas diferentes, así algunas
pueden seguir una ruta fermentativa ácido-mixta.
El crecimiento de algunas bacterias (anaerobias, anaerobias facultativas) en medio glucosado,
transforma la glucosa en ácidos orgánicos, que van a disminuir el pH a menos de 5 al cabo de 48 horas de
incubación. Esta característica se detecta con el viraje al rojo del indicador rojo de metilo.

 Medio  Caldo rojo metilo – Voges-Proskauer.

 Reactivo  Rojo de metilo
 Técnica  Se tiende el medio liquido en tubo, se siembra la bacteria (con asa de siembra) y se
incuba 48 horas a 37°C.

 Lectura de la reacción de identificación.

Pasado el tiempo de incubación se retiran los tubos de la estufa y se le añaden 5 gotas del reactivo,
la observación será:

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  Prueba positiva (fermentación ácido-mixta)  Viraje a rojo del medio (RM(+)).
 Prueba negativa  Presencia de coloración amarilla (RM(-)).

Al adicionar el reactivo Rojo de metilo sobre el medio MR/VP se evalúa la prueba. A la izquierda se
observa la prueba POSITIVA en donde hay producción de ácidos mixtos estables a partir de la
glucosa. La prueba NEGATIVA se observa a la derecha en donde no hay producción de ácidos mixtos
estables.

D.3.- PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER (V-P).

 Fundamento.

Existen algunas bacterias que pueden fermentar la glucosa por otra vía alternativa, llamada ruta
fermentativa butilen-glicolica.
En esta ruta, la fermentación de la glucosa puede conducir a la formación de acetil-metil-
carbinol o acetoína (precursor del 2,3 butanodiol necesario para la síntesis de lípidos), que con el reactivo
de Voges-Proskauer (alfa-naftol en disolución alcalina) se forma un complejo de color rosa .

 Medio  Caldo rojo metilo – Voges-Proskauer

 Reactivos  Alfa-naftol y KOH

 Normas para preparación de estos reactivos.

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  Solución de KOH.

 KOH ................................................. 40 g
 Agua destilada ................................. 100 ml

 Solución de alfa-naftol.

 Alfa-naftol ............................................ 7,5 g

( Agua destilada ....................................... 5 ml
( Alcohol 96º ........................................... 120ml

 Técnica  Se tiende el medio liquido en tubo, se siembra la bacteria (con asa de siembra) y se
incuba 48 horas a 37°C.

 Lectura de la reacción de identificación.

Pasado el tiempo de incubación se retiran los tubos de la estufa, se le añaden 0,5 ml de cada
reactivo y se agita. Se de debe añadir 1º el 1-naftol y 2º el KOH, agitar suavemente el tubo y mantenerlo
inclinado para favorecer la oxidación de la acetoina por el oxígeno atmosférico. El resultado de la prueba
se observara en menos de una hora y se interpretara:

 Prueba positiva  Coloración rosa del medio (VP (+)).

 Prueba negativa  Ausencia de coloración rosa del medio (VP(-)).

VOGES PROSKAUER VP

Al adicionar reactivo de Barrit y de KOH, se evidencia la producción de acetoína con la formación de

un anillo rojo (prueba +) como se observa en el tubo de la derecha. Caso contrario es el del tubo de
la izquierda (prueba negativa) en donde no hay producción de acetoína. Es decir que se espera que
la prueba de Rojo de Metilo para el tubo de la derecha sea negativa y para el tubo de la derecha
positiva.

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D.4.- PRUEBA DE CITRATOS (CIT).

 Fundamento.

Esta prueba indica la capacidad de las bacterias para metabolizar el citrato, empleándolo así como
única fuente de carbono.
El medio empleado (medio Simmons) contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de
amonio como única fuente de nitrógeno y azul de bromotimol como indicador. Únicamente las bacterias
capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y al hacerlo utilizaran los fosfatos
liberando iones amonio, que generara una basificación del medio, que virara a color azul.

 Medio  Agar Simmons

 Reactivos  No hay reactivos

 Técnica  Se prepara el medio y se tiende en tubo inclinado, con el asa se siembra y se lleva a
incubar durante 48 horas a 37º C.

 Lectura de la reacción de identificación.

Pasado el tiempo de incubación se observa la coloración del tubo, si es azul (se ha producido el
viraje del indicador), la prueba es positiva, las bacterias allí sembradas son capaces de emplear el citrato
como única fuente de carbono. También se considera positiva la prueba por el crecimiento del
microorganismo.

Citrato de Simmons

Prueba de citratos (+) izquierda, (-) derecha. Utilización de Citrato como única fuente de carbono.
Indicador de pH: azul de bromotimol.

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 E. MACROTÉCNICAS.

Son técnicas que utilizan medios que permiten realizar varias pruebas bioquímicas a la vez.

E.1 PRUEBA DE KLIGLER (KIA).

 Fundamento.

El medio empleado en esta prueba es el, agar hierro de Kligler, se trata de un medio diferencial
muy útil, ya que demuestra varias características enzimáticas de la bacteria. Su principal aplicación es la
identificación de Enterobacterias, las cuales se dividen en dos grandes grupos, según su capacidad de
metabolizar o no la lactosa.
Está compuesto por dos azúcares en distinta proporción (glucosa 0,1% y lactosa 1%) tiosulfato
sódico, citrato ferrico y rojo fenol como indicador de pH. Esta composición permite determinar diferentes
características enzimáticas, para lo cual es necesario realizar una siembra tanto en superficie como en
profundidad.
 Características enzimáticas analizadas.

Fermentación de la glucosa  Se pone de manifiesto mediante el viraje de rojo a amarillo, en el

fondo del tubo.
Fermentación de la lactosa  Se pone de manifiesto mediante el viraje de color a amarillo en la
superficie inclinada del tubo.
No fermentación de los azucares  Si la bacteria es aerobia estricta como el genero
Pseudomonas, el medio permanecerá de color rojo.

Producción de gas en la fermentación Se produce la aparición de burbujas, rotura o elevación

del agar del fondo del tubo.

Producción de ácido sulfhídrico Se produce la aparición de un precipitado de color negro en el

fondo del tubo. Algunas bacterias son capaces de emplear el tiosulfato sódico como aceptor final de
electrones en la cadena transportadora, como consecuencia este se reduce a ácido sulfhídrico, que a su vez
reacciona con el hierro presente en el medio, formando un precipitado negro de sulfuro de hierro

Técnica.

Se preparan tubos ligeramente inclinados (en pico de flauta) con el agar y ayudados con el hilo de
siembra con el que tomamos el inoculo, se siembra por estrías en la superficie inclinada y seguidamente
en picadura (sin necesidad de tomar de nuevo inoculo).

Lectura de la reacción de identificación.

La lectura se realiza después de 16 – 24 horas de incubación a 37º C. Los resultados se interpretan:

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  Precipitado negro: SH2 (+).
 Viraje a amarillo en la parte inferior: ( Glu (+)
 Viraje a amarillo en la superficie inclinada: ( Lac (+)
 Burbujas o ruptura del medio ( Gases (+)

Posibles resultados de la prueba de Kligler. De izquierda a derecha se observa primero un tubo sin
inocular; luego un tubo Lactosa (+), Glucosa (+), H2S (-), Gas (+); en seguida un tubo Lactosa (-),
Glucosa (+), H2S (+), Gas (-).

E.2 PRUEBA DEL AGAR SULFURO-INDOL- MOTILIDAD. (ASIM)

Es un medio semisólido, y se detecta: Indol (anillo rojo), producción de ácido sulfhídrico (pp negro), y la
movilidad de la bacteria.
Medio: Agar ASIM.

Técnica.
Se siembra en picadura y se incuba a 37ºC durante 18-24 horas.

Lectura de la reacción de identificación.

La interpretación de resultados y las aplicaciones son las correspondientes a las pruebas que lo
componen.

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 Se observa la producción de sulfuros, que se precipitan con iones férricos, a partir del tiosulfato de sodio
presente en el medio. La prueba positiva (tubos del centro e izquierda) se observa un precipitado
negro en el medio de cultivo donde creció la bacteria.

Adicionalmente se observa la motilidad de la bacteria que ha sido sembrada por punción en este medio
semi-sólido. Se observa el movimiento de las bacterias que crecen a manera de sombrila al rededor del
eje de siembra.(Motilidad+ tubos del centro e izquierda).

Se observa la capacidad de la bacteria para desdoblar el triptófano por medio de la enzima triptofanasa y
producir INDOL. Al adicionar Kovacs sobre el medio cuando hay produccion de Indol se forma un
anillo rojo (tubo de la derecha INDOL+). De lo contrario se forma un anillo amarillo (tubo del centro
y la izquierda INDOL-).

F. MICROTÉCNICAS.

Son sistemas miniaturizados que permiten realizar varias pruebas bioquímicas simultáneamente, y
actualmente son muy utilizados por su rapidez y eficacia.
Existen varios tipos: en tubo y en tira.

Vamos a describir el sistema en tira API 20E . El sistema en tubo es similar y existen para
Enterobacterias y otros géneros como Staphloccoccus.

SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN MULTIPRUEBAS API 20E

El sistema de ensayo API-20E, es un método rápido para la identificación de bacterias de la

familia Enterobacteriaceae.
Consiste en un dispositivo plástico con 20 mini-tubos que contienen diferentes medios de cultivo
deshidratados que permitirán la identificación del microorganismo, de acuerdo con su actividad
metabólica, como por ejemplo fermentación de carbohidratos, producción de H2S, hidrólisis de gelatina,
etc..
Cada mini-tubo se inocula con una suspensión salina de un cultivo puro del microorganismo a ser
identificado (deben seguirse las instrucciones del fabricante de este sistema). Algunos mini-tubos se
llenan completamente con la suspensión, mientras que en otros hay que añadir además parafina, para dar
las condiciones anaeróbicas necesarias.
Luego se incuba el sistema por 18-24 horas a 37ºC.
La prueba número 21, la oxidasa, se hace de forma independiente a la tira.
Las coloraciones que se desarrollan, algunas con el añadido de reactivos, se comparan con una carta
de colores y las reacciones se convierten en un código de 7 dígitos, el cual corresponderá a un
determinado género o especie, en un texto de la base de datos.

Las pruebas de que consta la galeria son las siguientes:

Prueba Reacción / Enzimas

ONPG Beta-galactosidasa
ADH Arginina deshidrolasa
LDC Lisina descarboxilasa
ODC Ornitina descarboxilasa
CIT Utilización del citrato

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 H2S Producción de H 2 S
URE Ureasa
TDA Triptófano desaminasa
IND Producción de indol
VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer)
GEL Gelatinasa
GLU Fermentación/oxidación de glucosa
MAN Fermentación/oxidación de manitol
INO Fermentación/oxidación de inositol
SOR Fermentación/oxidación de sorbitol
RHA Fermentación/oxidación de ramnosa
SAC Fermentación/oxidación de sacarosa
MEL Fermentación/oxidación de melobiosa
AMY Fermentación/oxidación de amigdalina
ARA Fermentación/oxidación de arabinosa
OX Citocromo oxidasa

SISTEMA DE UTILIZACIÓN DE LA GALERIA API 20E

A patir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una suspensión en 5 mL de solución
salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril.

Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada pocillo tiene un tubo y una cúpula,
parte aerobia), de todos los pocillos.

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Llenar la cúpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensión de bacterias.

Cubrir con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis.

Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Previamente poner agua en los alvéolos de
la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.

21
Incubar a 37 °C durante 18-24 h.

Tras la incubación se anotan los resultados inmediatos, es decir, los que no requieren ser revelados.

Determinadas pruebas requieren ser reveladas, para el revelado se tienen que tener en cuenta dos
criterios:

 Si el compartimento de glucosa GLU da negativo (AZUL o azul verdoso) y los tests positivos son dos
o menos de dos, no hay que añadir reactivos ya que el microorganismo no se trata de una
Enterobacteria. Cuando ésto ocurre se hacen otros tipos de API como el API 20NE, API OF, el API M
o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales.

 Si la glucosa es positiva y/o tres o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos:

TDA

Añadir una gota de FeCl3 10 %.

22
VP

Añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2 H5 OH).

IND

Añadir una gota de reactivo de Kovacs o de Dimetilamino-cinamaldehido.

Oxidasa

Añadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recién preparado.

INTERPRETACIÓN

La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de
las tablas de lectura, y anotando el resultado como positivo o negativo (más adelante se explicará
con detalle).

Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo

ONPG Beta-galactosidasa sin color amarillo
ADH Arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja
LDC Lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
ODC Ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
CIT Utilización del citrato verde azul oscuro o turquesa
H2S Producción de H 2 S sin precipitado negro precipitado negro
URE Ureasa amarillo rojo o naranja
TDA Triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo
IND Producción de indol amarillo color rosa o anillo rosa-rojo
VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer) sin color rosa-rojo
GEL Gelatinasa sin difusión difusión de pigmento
GLU Fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo
MAN Fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo
23
INO Fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo
SOR Fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo
RHA Fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo
SAC Fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo
MEL Fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo
AMY Fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo
ARA Fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo
OX Citocromo oxidasa

Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Los pocillos están
separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test número 21
corresponde al test de la oxidasa).

Para obtener el perfil númerico de 7 cifras, a cada pocillo se le dará el valor 0, 1, 2 ó 4, de

acuerdo a los siguientes criterios:

 Si la reacción es negativa se pone 0.

 Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4 si

es el tercero.

 Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se obtiene un código de
7 cifras.

24
Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata, para realizar esta
operación hay programas informáticos.

PERFILES NUMÉRICOS.

0104140 Shigella flexneri

0104452 Salmonella paratyphi A
0104504 Pasteurella multocida
0104521 Yersinia enterocolitica
0140004 Pasteurella multocida
0144042 Shigella boydii
0206042 Acinetobacter calcoaceticus
0210004 Achromobacter sp.
0210004 Alcaligenes faecalis
0210004 Alcaligenes sp.
0314000 Proteus mirabilis
0504512 Salmonella paratyphi A
0676001 Proteus vulgaris
0776000 Proteus mirabilis
1000004 Pasteurella sp.
1014743 Klebsiella ozaenae
1104112 Shigella sonnei
1214012 Yersinia pseudotuberculosis
1214773 Klebsiella pneumoniae
2206004 Pseudomonas aeruginosa
2504752 Salmonella spp.
3005573 Enterobacter cloacae
3246527 Aeromonas hydrophilia
4004550 Salmonella cholerasuis
4004550 Salmonella typhi
4104100 Salmonella gallinarun
4357106 Vibrio parahemolyticus
4404112 Salmonella gallinarum
4404510 Salmonella cholerasuis
4404540 Salmonella tiphy
4504010 Salmonella pullorum
25
 4604552 Salmonella spp.
4704500 Salmonella cholerasuis
5004024 Pseudomonas cepacea
5044124 Vibrio cholerae
5046753 Serratia odorifera
5100100 Yersinia ruckeri
5104111 Hafnia alvei
5104542 Salmonella arizonae
5144572 Escherichia coli
5207323 Serratia rubidae
5255573 Klebsiella oxytoca
5346761 Serratia marcescens
5314173 Enterobacter gergoviae
5317761 Serratia marcescens
5704412 Salmonella arizonae
5704552 Salmonella arizonae
6004540 Salmonella typhi
6144204 Plesiomonas shigelloides
6404112 Salmonella spp.
6504750 Salmonella spp.
6604512 Salmonella spp.
6704342 Salmonella spp.
6704532 Salmonella spp
6704752 Salmonella gallinarum
7244126 Aeromonas hydrophila
7305773 Enterobacter cloacae
7704752 Salmonella arizonae
7704752 Salmonella spp.

ANEXO I.

ESQUEMA GENERAL DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

Prueba Medio Reactivo Tª y tiempo Soporte Resultado +

medio

Oxidasa (OXI) — Tiras 10 sg — Color azul

reactivas
Pp negro: SH2
Amarillo abajo:gluc.+
Kligler (KIA) Agar Kligler 16 – 24 horas Tubo en pico Amarillo arriba:lact.+
— 37º C de flauta Burbujas o ruptura del
medio: gas +

α-naftilamina
Reducción A.N. + KNO3 Ac. Sulfanilico 48 horas, 37º C Tubo inclinado Color rojo cereza
NO3-

26
 Triptona+NaCl
Indol (IND) + Agua Kovacs “ Tubo Anillo rojo

Rojo-Metilo Caldo RM-VP Rojo metilo “ Tubo Color rojo

(RM)

Voges- Caldo RM-VP α-naftol+ “ Tubo Color rosa

Proskauer KOH
(VP)

Citratos (CIT) Agar Simmons — “ Tubo inclinado Color azul

Bactourea agar
Ureasa (URE) base — “ Tubo inclinado Color rojo-rosado
No se forma color
Almidón Agar almidón Lugol “ Placa azul con lugol

Catalasa H2O2 — Portaobjetos Burbujas de oxígeno

(CAT)
Agar Hug y 1 tubo abierto Amarillo: oxidante
Óxido- Leifson + el
fermentativa 10% de disoluc — 48-72 horas 1 tubo cubierto Amarillo: fermentador
O/F del azúcar a 37º C con parafina.
ensayar al 10%
Halo transparente
Hidrólisis de la Agar gelatina Frazier 2 a 7 días Placa alrededor del
gelatina AN + 40g/l de 37º C crecimiento
gelatina bacteriano

27