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09 y 10 de septiembre de 2013

PRCTICO N2 AMINOCIDOS 1. INTRODUCCIN Las protenas son las biomolculas ms abundantes de la materia viva. Sus propiedades fisico-qumicas pueden diferir drsticamente, y as una queratina del pelo se parece poco a una protena plasmtica o a la insulina. Sin embargo, todas tienen en comn su composicin, basada en -aminocidos unidos por enlaces peptdicos dando lugar a cadenas lineales. Para que las protenas cumplan su funcin biolgica tiene que adoptar una estructura espacial determinada, denominada nativa. La prdida de esta estructura tridimensional conlleva la prdida de su actividad biolgica, y el proceso se denomina desnaturalizacin. Las propiedades fisico-qumicas cambian drsticamente, y en el caso de las protenas globulares solubles, generalmente se produce una insolubilizacin. Agentes desnaturalizantes tpicos son el calor, valores extremos de pH, disolventes orgnicos y agentes caotrpicos. Las protenas pueden determinarse por una gran cantidad de mtodos, entre los que se encuentran: Ensayo de Biuret: Compuestos con enlaces peptdicos producen un cambio de color del azul al prpura cuando reaccionan con Cu(II) en medio alcalino. El compuesto ms sencillo que da la reaccin es el biuret, un dmero de la urea que da el nombre al ensayo, de estructura CONH2-NH-CONH2. El ensayo es bastante especfico para protenas pero poco sensible, requiriendo de 1 a 10 mg de protena. Ensayo de Lowry: Es ms sensible que el Biuret, pero mas tedioso de realizar. Puede detectar cantidades del orden de 0,1 mg de protena. Se basa en la reaccin de protenas con el Cu(II) en medio alcalino y tambin de la reaccin de grupos fenlicos (mayoritariamente tirosina en protenas) con un reactivo denominado de Folin-Ciocalteau que contiene fosfomolibdato y fosfowolframato.

Los aminocidos pueden detectarse con reactivos que reaccionen con sus grupos caractersticos, el carboxilo, el amino u otros de la cadena lateral. Aunque el nmero de ensayos es muy grande, con caractersticas particulares en cada caso, uno de los ms utilizados es la deteccin con ninhidrina, que produce un color prpura que en algunos casos puede ser rosa o rojizo, y en el caso de los iminocidos amarillo. Actividad N1: Reaccin de la Ninhidrina. 1.1. Fundamento La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno), un agente oxidante poderoso, reacciona con todos los -aminocidos a un pH entre 4 y 8 para dar un compuesto de color prpura. Esta reaccin se efecta tambin con aminas primarias y amonaco pero sin desprendimiento de CO2. Los iminocidos prolina e hidroxiprolina tambin reaccionan con la ninhidrina, pero en este caso se obtiene un color amarillo en vez del prpura. La reaccin es muy sensible y es la ideal para la deteccin de aminocidos en cromatogramas y su determinacin cuantitativa en fracciones de columnas.

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1.2. Materiales Aminocidos (glicina, tirosina y triptfano, 1 g/L) Ninhidrina (2 g/L) 1.3 Mtodo Coloque 1 mL de solucin de aminocido en un tubo de ensayo y ajuste el pH cerca de la neutralidad. Agregue cinco gotas de solucin de ninhidrina y deje hervir por dos minutos. Determine los lmites de sensibilidad de la reaccin haciendo el ensayo en diluciones seriadas hasta que se obtengan resultados negativos. Actividad N2: Reaccin de Millon. 1.1. Fundamento Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el reactivo Millon formando compuestos rojos. Los nicos aminocidos fenlicos son la tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reaccin positiva. El reactivo original de Millon consista en una solucin de nitrato mercrico en cido ntrico 50% v/v, pero actualmente se usan modificaciones menos suceptibles a la interferencia de las sales inorgnicas. 1.2. Materiales Aminocidos (glicina, tirosina y fenilalanina, 1 g/L) Reactivo de Millon (solucin de sulfato mercrico 150 g/L en cido sulfrico 15% v/v) Fenol (1 g/L) Nitrito de sodio (10 g/L) Baos de agua hirviendo 1.3. Mtodo A 1 mL de la muestra aada cinco gotas del reactivo de Millon y caliente en un bao de agua hirviendo por 10 minutos. Deje enfriar a temperatura ambiente y agregue cinco gotas de nitrito de sodio, la aparicin de un color rojo ladrillo indica un resultado positivo.

Actividad N3: Prueba de Pauly. 1.1. Fundamento El cido sulfanlico diazotizado se une con las aminas, fenoles e imidozales para dar compuestos azo fuertemente coloreados. Los compuestos de diazono se forman nicamente en el fro, as que las soluciones deben enfriarse en hielo antes de la diazotizacin. 1.2. Materiales Aminocidos (glicina, tirosina, histidina y triptfano, 1 g/L) cido sulfanlico (10 g/L en solucin de cido clorhdrico 1 mol/L) Nitrito de sodio (50 g/L) Carbonato de sodio (10 g/L) 1.3. Mtodo Mezcle 1 mL de cido sulfanlico con 2 mL de la muestra. Enfre en hielo. Agregue 1 mL de solucin de NaNO2 y djela al fro durante 3 minutos. Lab. Bioqumica Enfermera Pgina 2

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Alcalinice la solucin aadiendo 2 mL de solucin de Na 2CO3 y registre los colores que se han formado.

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