PRACTICA N°5

PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS

➢ OBJETIVOS

OBJETIVOS GENERALES:

• Estudiar las principales reacciones químicas de identificación de los aminoácidos

• Comprender la importancia de estas reacciones para distinguir proteínas

OBJETIVOS ESPECIFÍCOS:

• Identificar la presencia de aminoácidos en un hidrolizado proteico a traves de

diferentes reacciones

• Comprobar las propiedades químicas de polipeptidos y proteínas

INTRODUCCIÓN

Un aminoácido es una molécula orgánica que en su estructura contiene un grupo amino (NH2)
y un grupo carboxilo (COOH). Los aminoácidos son los monómeros a partir de los cuales se
forman las proteínas, en cuyo caso pasan a denominarse residuos de aminoácidos debido a la
perdida de los elementos del agua al unirse dos aminoácidos. En la naturaleza existen más de
300 aminoácidos diferentes, pero solo 20 de ellos se encuentran codificados en el DNA y por
tanto son los constituyentes de las proteínas en donde se encuentran contenidos en distintas
proporciones.

Las proteínas deben sus propiedades físicas, químicas, fisicoquímicas y biológicas, al tipo de
aminoácidos que las forman. Debido a la presencia de diferentes aminoácidos en las uniones
peptídicas las proteínas reaccionan con una variedad de compuestos formando
productos coloreados. Existen reacciones de coloración que son específicas para
aminoácidos de esas proteínas y son importantes tanto para la detección como para el dopaje
de aminoácidos y proteínas. Existen también reacciones generales porque sirven
para caracterizar grupos comunes a todas las proteínas como grupos amino o uniones
peptídicas como lo son las reacciones de la Ninhidrina y Sakaguchi.

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIALES

• Tubos de ensayo

• Pipetas

• Gradillas
• Baño maría

• Baño de hielo

REACTIVOS

EXPERIMENTO 1. REACCIÓN CON NINHIDRINA

• Solución de aminoácidos 0.1 M / Caseína 1% / Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo

5%) /

• Solución desconocida

• Ninhidrina 0.2% en etanol de 95%

EXPERIMENTO 2. REACCIÓN XANTOPROTEICA

• Solución de aminoácidos 0.1 M / Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)/Caseína 1%

/

• Solución desconocida

• Ácido nítrico concentrado

• NaOH 40%

EXPERIMENTO 3. REACCIÓN DE PAULY

• Solución de aminoácidos 0.1 M / Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo 5%) /Caseína

1% /

• Solución desconocida

• Ácido sulfanílico al 1% en HCl al 10%

• Nitrito de sodio al 5%

• Carbonato de sodio al 10%

EXPERIMENTO 4. REACCIÓN DE MILLON

• Solución de aminoácidos 0.1 M / Caseína 1% / Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo

5%) /

• Solución desconocida

• Reactivo de Millon

• Ácido nítrico

EXPERIMENTO 5. PRUEBA DE HISTIDINA

• Solución de aminoácidos 0.1 M / Caseína 1% / Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo

5%) /

• Solución desconocida

• Bromo al 5% en ácido acético al 33%

• Carbonato de amonio al 5%
EXPERIMENTO 6. REACCIÓN DE HOPKINS-COLE

• Solución de aminoácidos 0.1 M / Caseína 1% / Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo

5%) /

• Solución desconocida

• Ácido sulfúrico concentrado

• Reactivo de Hopkins-Cole

EXPERIMENTO 7. REACCIÓN DE SAKAGUCHI

• Solución de aminoácidos 0.1 M / Caseína 1% / Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo

5%) /

• Solución desconocida

• Hidróxido de sodio 40%

• Reactivo α naftol 1% en alcohol etílico

• Solución de hipobromito (para preparar en el momento de uso: Trasvasar 100 ml de

NaOH

• al 5% a una botella de reactivo de vidrio y agregar 1 ml de bromo líquido previamente

• enfriado, usando una propipeta. Agitar el contenido hasta que se disuelva el bromo)

• Urea al 5%

EXPERIMENTO 8. REACCIÓN CON ACETATO DE PLOMO

• Solución de aminoácidos 0.1 M / Caseína 1% / Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo

5%) /

• solución desconocida

• NaOH 40%

• Acetato de Plomo 0.5 M

EXPERIMENTO 9. REACCIÓN MCCARTHY-SULLIVAN

• Solución de aminoácidos 0.1 M / Caseína 1% / Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de Huevo

5%) /

• Solución desconocida

• NaOH 5 N

• Nitroprusiato de sodio 10% (prepárese al momento).

• HCl 6N

METODOLOGÍA:

Para observar las distintas reacciones que ocurren en presencia de aminoácidos, se utilizó el
siguiente enlace: https://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=63&sim=1094&cnt=2142
RESULTADOS:

EXPERIMENTO 1. REACCIÓN CON NINHIDRINA

Figura 1: Reacción de la Ninhidrina

Luego de calentar la solución, se observó la formación de una coloración azul-violeta.

Indicando la presencia de aminoácidos en la solución.

Figura 2: Coloración azul-violeta en la solución.

EXPERIMENTO 2. REACCIÓN XANTOPROTEICA

Figura 3: Reacción Xantoproteica

Luego de añadir NaOH, se observó la aparición de un color naranja en la interfase. Indicando la

presencia de aminoácidos aromáticos en la solución.

Figura 4: Coloración amarilla y naranja en la interfase.

EXPERIMENTO 3. REACCIÓN DE PAULY

Figura 5: Reacción de Pauly

Al adicionar Na2CO2, se observó la formación de un color rojo intenso. Indicando la presencia

de Tirosina o Histidina en la solución.

Figura 6: Formación de color rojo intenso en la solución.

EXPERIMENTO 4. REACCIÓN DE MILLON

Figura 7: Reacción de Millon

Al adicionar HNO3, se observó la formación de un color rojo. Indicando la presencia de Tirosina

en la solución.

Figura 8: Formación de color rojo.

EXPERIMENTO 5. PRUEBA DE HISTIDINA

Luego de calentar la solución, se observó la formación de un color violáceo. Indicando la

presencia de Histidina.
Figura 10: Formación de color violeta.

EXPERIMENTO 6. REACCIÓN DE HOPKINS-COLE

Figura 11: Reacción de Hopkins-Cole

Al agregar Ácido Sulfúrico Concentrado, se observó la formación de un anillo de color violeta

en la interfase de la solución. Indicando la presencia de Triptófano.

Figura 12: Formación de anillo.

EXPERIMENTO 7. REACCIÓN DE SAKAGUCHI

Figura 13: Reacción de Sakaguchi

Al agregar Hipobromito a la solución, se observó la formación de un complejo rojo

característico. Indicando la presencia de Arginina.
Figura 14: Formación de color rojo-naranja.

EXPERIMENTO 8. REACCIÓN CON ACETATO DE PLOMO

Figura 15: Reacción con Acetato de Plomo

Al agregar Acetato de Plomo a la solución, se observó la formación de un color pardo grisáceo.

Indicando la presencia de Cisteína.

Figura 16: Formación de color grisáceo.

EXPERIMENTO 9. REACCIÓN MCCARTHY-SULLIVAN

Figura 15: Reacción MCCARTHY-SULLIVAN

Al agregar Nitroprusiato de Sodio (Na2NOFe (CN)5) a la solución, se observó la formación de

color rojo. Indicando la presencia de Metionina.

Figura 18: Formación de color plomo.

DISCUSIÓN:

EXPERIMENTO 1. REACCIÓN CON NINHIDRINA

La coloración purpura se debe a la formación de un complejo “Purpura de Ruhemann” por la
presencia del grupo alfa-amino.

La ninhidrina es un agente oxidante poderoso y por cada mol de aminoácido con el que
reacciona, lleva a cabo la determinación oxidativa de los grupos alfa-amino, liberando
amoniaco, CO2 y el correspondiente aldehído, así como la forma reducida de la ninhidrina. El
amoniaco liberado entonces reacciona con un mol adicional de ninhidrina oxidada y un mol de
ninhidrina reducida para dar una sustancia de color azul violeta, que presenta un máximo de
absorción a 570 nm (Véjar,2005).

La reacción de Ninhidrina es positiva para aminoácidos y proteínas con un grupo NH2 libre, sin
embargo, para la prolina es negativa, ya que da un producto color amarillo.

EXPERIMENTO 2. REACCIÓN XANTOPROTEICA

La coloración amarilla que se forma al comienzo de la reacción es producto de la nitración de

los anillos aromáticos del aminoácido, posteriormente la formación de una sal se da por la
adición de NaOH, tornando la solución de color naranja.

Según Quesada (2007) “Los compuestos que presentan bencenos sustituidos (con grupos
unidos al anillo bencénico) como el aminoácido tirosina, al reaccionar con el acido nítrico
forman compuestos nitrados de color amarillo”. Estos, se tornan de color anaranjado al añadir
álcali, debido a la formación de sales (Véjar,2005).

EXPERIMENTO 3. REACCIÓN DE PAULY

La formación del color rojo intenso se debe a que esta prueba es específica para detectar
grupos imidazoles, fenoles y aminas de ciertos aminoácidos. Y la histidina es un aminoácido
que posee un grupo imidazol en su estructura.

En esta prueba el ácido sulfanilico disuelto en ácido clorhídrico se mezcla con el nitrito de
sodio y se produce Acido Nitroso, el cual reacciona con la sal produciendo sal de diazonio. En la
segunda etapa de esta prueba se le incorpora un compuesto fenólico, imidazol o amina y un
ácido o base débil para que la sal de diazonio se asocie con el compuesto generando un
compuesto azo de color rojo. (Teijon, 2006).

EXPERIMENTO 4. REACCIÓN DE MILLON

Esta reacción determina los grupos hidroxifenilos que pueden nitrarse fácilmente. La aparición
del complejo color rojo se debe a que el anillo hidroxibenceno de la tirosina está reaccionando
al reactivo de Millon. Véjar (2005) menciona que el reactivo de Millon al ser una solución de
nitrato mercúrico con ácido nítrico, el color rosa rojo que se forma al reaccionar la tirosina con
el reactivo, se debe a un complejo mercúrico con los derivados nitrofenol.

Por otro lado, las proteínas se precipitan por acción de los ácidos inorgánicos fuertes del
reactivo, forman primero un precipitado blanco que se vuelve gradualmente rojo al calentar
(Benitez y Garcia, 2013).

EXPERIMENTO 5. PRUEBA DE HISTIDINA

Esta reacción implica la bromación de histidina en solución ácida, seguida de la neutralización

del ácido con exceso de amoníaco. El calentamiento de la solución alcalina desarrolla una
coloración azul.
EXPERIMENTO 6. REACCIÓN DE HOPKINS-COLE

La formación del anillo violeta, se debe probablemente a una reacción de deshidratación, y

esos compuestos de deshidratación reaccionan con el alfa-naftol del aminoácido.

Los derivados indol dan productos de condensación cuando se tratan con aldehídos
aromáticos en presencia de ácido sulfúrico o clorhídrico (Véjar,2005). El aminoácido triptófano
contiene un grupo indol, por ello la reacción es específica para este.

EXPERIMENTO 7. REACCIÓN DE SAKAGUCHI

Mediante esta reacción se detecta la presencia de grupos guanidinos en la muestra. En un

medio alcalino, el grupo guanidino de la arginina reacciona con el alfa naftol y el hipoclorito de
sodio y produce un compuesto de color rojo (Quesada, 2007) intenso.

EXPERIMENTO 8. REACCIÓN CON ACETATO DE PLOMO

Para la detección de aminoácidos que contienen azufre en su estructura como lo son

metionina, cisteina, homocisteína y taurina, se libera el azufre del aminoácido en medio básico
generando un sulfuro. Posteriormente dicho sulfuro reacciona con acetato de plomo para
generar un precipitado de sulfuro de plomo, fácilmente identificable por su color negro.

EXPERIMENTO 9. REACCIÓN MCCARTHY-SULLIVAN

Se forma un complejo de color rojo. Esto debido a que la presencia de aminoácidos sulfurados
como la homocisteína y cistina son evidenciados con la técnica colorimétrica de nitroprusiato
de sodio. Utilizando esta técnica los sulfhídrilos oxidados, son reducidos inicialmente con
cianuro de sodio, para luego reaccionar con el nitroprusiato de sodio (con grupos sulfhídrilos
libres), produciendo una coloración de rosa púrpura (Bermúdez y Carrillo, 2005).

CONCLUSIONES:

• La formación del “Purpura de Ruheeman” en la reacción con Ninhidrina indica

positividad para aminoácidos y proteínas, a excepción de la prolina.

• La formación de color amarillo en la reacción Xantoproteíca, indica que es positiva para

aminoácidos aromáticos.

• La formación de color rojo intenso en la reacción de Pauly, indica la presencia de

Tirosina o Histidina.

• La formación de color rojo en la reacción de Millon, indica la presencia de Tirosina.

• En la prueba de Histidina, la formación de un color violáceo indica la presencia de este

aminoácido.

• La formación de un anillo violeta en la reacción de Hopkins-Cole, indica la presencia de

Triptófano.

• La formación de un complejo color rojo en la reacción de Sakaguchi, indica la presencia

de Arginina.

• La formación de color grisáceo en la reacción con Acetato de Plomo, indica la presencia

de Cisteína.
• La formación de color rojo, en la reacción Mccarthy-Sullivan, indica la presencia de
Metionina.

CUESTIONARIO:

1. Calcular el punto isoeléctrico de los siguientes aminoácidos: a) glicina, b) ácido

glutámico y c) lisina. Desarrolle las reacciones de disociación

a) Glicina:

La glicina tiene 2 grupos disociables:

pK1=2.34 y pK2=9.6

b) Acido glutámico:

El ácido glutámico tiene tres grupos disociables, cuyos pK son: pK1=2.19; pK2=9.67 y pK3=4.25

c) Lisina:

La lisina tiene 3 grupos disociables, cuyos pK son: pK1=2.18; pK2=8.95 y pK3=10.52

2. Cuáles son las movilidades electroforéticas relativas a pH 5.68 de alanina, arginina, ácido
glutámico, serina y triptófano.
3. Una solución que contiene ácido aspártico (pI=2.98), glicina (pI=5.97), leucina (pI=5.98) y
lisina (pI=9.74) en tampón citrato pH=3 es aplicada a una columna cambiadora de cationes
equilibrada con el mismo tampón. ¿En qué orden eluirán los aminoácidos de la columna?

Orden: Lisina / Leucina / Glicina / Ácido aspártico

4. Un determinado péptido fue tratado con el reactivo de Sanger y al realizar la hidrólisis se

observó que el 1-fluoro, 2,4-dinitrobenceno (DNFB) no reaccionó con ningún aminoácido,
¿Cómo explica?

El reactivo de Sanger o 1-fluoro, 2,4-dinitrobenceno es una sustancia química que reacciona

con los aminoácidos N-terminal de los péptidos, al reaccionar producen dinitrofenil-
aminoácidos, estos DNP-aminoácidos son estables en condiciones de hidrolisis ácida. La razón
por la cual no reacciona con ningún aminoácido es porque la hidrolisis por la cual se ocasiona
la reacción era un ácido débil-base que ocasionó que no se rompan los enlaces peptídicos.

5. Calcular las concentraciones de las especies iónicas de una solución de histidina 0, 25 M a

pH 2. (pK1= 1.82, pK2= 6, pK3= 9.17)

Como el pH de la solución esta mucho más cerca del pK1 que pK2 y pK3, se usa el pK1 para los
cálculos: