TÉCNICAS DE

CUANTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS
TOTALES
 Microbiología experimental 2020-1
 Elaboró: Micro Exp.
 https://www.facebook.com/profile.php?id=100010129183459
 Dudas y sugerencias en Inbox Micro Exp
 Versión 3.0.
 
¿Por qué cuantificar?

 Expresar numéricamente una magnitud

(RAE,2015)

 Uso de microorganismos como indicadores

de calidad

 Usos de microorganismos en procesos

biotecnológicos= seguir un proceso
 CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS DE
CUANTIFICACIÓN

 
Métodos directos
 Determinación del número de microorganismos en
una muestra de manera directa (microscopía).
 Métodos indirectos
 Determinación de la actividad metabólica, biomasa
y proteínas asociada al crecimiento microbiano
 Métodos para microorganismos totales
 Determinan microorganismos vivos y muertos en
una muestra
 Métodos para microorganismos viables
 Determina microorganismos vivos, capaces de
replicarse
 Métodos para microorganismos viables pero no
cultivables
 Determina los microorganismos presentes en la
muestra que son imposibles de cultivar en
condiciones de laboratorio
 Métodos indirectos:
Métodos espectrofotométricos
Turbidimetría
Es la medición de la luz transmitida a
través de una suspensión
Señal (unidades):D.O – densidad óptica
( Absorbancia/Transmitancia)
NTU (Unidades de Turbidez Nefelométrica, por
Nefelometría
Es la medición de la luz dispersada
en dirección distinta a la emitida
(15-90º).Uso de filtro verde (540
nm)
Señal (unidades): Unidades Klett,
sus siglas en ingles

Longitudes de onda para

microorganismos:
Bacterias 540 nm
Protozoarios 580 nm
Levaduras 600 nm
Factor de conversión de nefelometría (UK) a DO
U.K (nefelometría)= DO/0.002
 Tabla para la preparación de la curva de Mc Farland
CURVA ESTANDAR
DE MC FARLAND
mL 1% de mL de Solución
BaCl2 1% H2SO4

10

*Modificación de la tabla 2 NOM-181-SSA1-1998

 ACONDICIONAMIENTO DEL EQUIPO

1. En ambos equipos se recomienda

encender la fuente de luz con anticipación
10-15 min para asegurar una emisión
constante de energía luminosa

Nefelómetro:

2. Ajustar el blanco del método, coloca agua desionizada

suficiente en la celda,

3.Introduce la celda y ajusta con el botón de autocero

Espectrofotómetro:

2. Ajusta la longitud de onda a la que se realizará la

medición, usualmente 600 nm para bacterias.

3. Ajustar el blanco del método, coloca agua desionizada

suficiente en la celda,

3.Introduce la celda y ajusta con el botón de autocero

 TRAZANDO LA CURVA ESTANDAR DE MC FARLAND
1. Leer cada uno de los tubos de la escala en el
nefelómetro/ espectrofotómetro (600nm).
Valores
 *¡Cuidado! Recuerda lavar la celda de lectura entre
anómalos
muestras, no tocar la parte inferior con los dedos y
limpiar la parte exterior antes de realizar la lectura.

 *Agita los tubos vigorosamente para homogeneizar

la suspensión antes de vaciar a la celda y realiza la
lectura rápidamente para evitar la sedimentación del
BaSO4

2. Asociar la concentración (nunca número de tubo de

escala) con la señal del equipo (unidades
Klett/absorbancia)

 E.g. x=300X106 , y=110 U.K –Caso del tubo 1

 3. Ajustar a un modelo lineal (quitar valores anómalos-

volver a evaluar). Buscar un valor de R2>0.98

 -Los valores anómalos pueden presentarse

especialmente en altas concentraciones, ya que las
partículas no se mantiene en suspensión fácilmente y
colapsan rápidamente, disminuyendo su aportación a la
densidad óptica del medio
TRAZANDO LA CURVA ESTANDAR DE MC FARLAND
 EJEMPLO DE CÁLCULO PARA EL LÍMITE DE
DETECCIÓN
DETERMINACIÓN DE DETERMINACIÓN DE
LÍMITE DE DETECCIÓN LÍMITE DE DETECCIÓN
MEDIANTE EL USO DE DE REGRESIÓN LINEAL
BLANCOS
Este método se basa en el análisis de la
 Blanco 1= 1 UK regresión lineal asociada a la curva, no
 Blanco 2= 0 UK requiere lectura de blancos, sin embargo, su
valor puede estar sobreestimado
 Blanco 3= 5 UK
Promedio=2 , D.E.=2.65
LD (U.K)= 2+3(2.65)= 9.93
Traduciendo a concentración (microorganismo/mL)
LD (microorg./mL)=(9.93.+5.7653)/4X10-7 )=40X107
 Por tanto, cualquier concentración calculada que de una concentración por debajo
de este valor debe reportarse como <LD
Toma en cuenta que el valor estimado con la
regresión lineal es 4 veces mayor que el
calculado con los blancos, sin embargo,
puede ser una aproximación adecuada.
 CALCULANDO LA CONCENTRACIÓN DE
MICROORGANISMO EN UNA MUESTRA

 
Nefelómetría:
 2. Ajustar el blanco del método, introduce el tubo del
matraz nefelométrico con medio estéril, sin inocular en la
ranura del nefelómetro
 3. En equipos digitales, pulsa la tecla de “Lectura” /”Read.
En equipos analógicos, girar la perilla hasta nivelar el
señalamiento del lector.
 4. Registra el resultado en bitácora en U.K..
 5. Repite para cada tiempo de incubación/muestreo
 6. Traduce con ayuda de la curva de McFarland de U.K. a
concentración UFC/mL.
 -eg. Si la muestra tuvo una señal de 450 UK, la
concentración de microorganismos/mL será :
(microorg./mL)= ((450+5.7653)/4X10-7))=
12X109microorg./mL
El informe debe realizarse con 2 cifras significativas,
expresado en notación científica
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS
VENTAJAS

 Método rápido de evaluación del

crecimiento microbiano.
 Permite realizar un seguimiento rápido
de las cinéticas de crecimiento.

DESVENTAJAS
 No diferencia entre
microorganismos vivos y muertos
(método totales)
 Microorganismos capsulados
pueden presentar dificultades al ser
evaluados (no homogéneo).
 Metabolitos secundarios que
aportan turbidez pueden interferir.
PERMITE EVALUAR CINÉTICAS DE
CRECIMIENTO MICROBIANO
 EJERCICIO: IDENTIFICA LAS FASE DE
CRECIMIENTO

Fase estacionaria (M Fas

((Equilibrio dinámico vivos-muertos) ue e
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(S

Fase lag o
latencia
 DETERMINA LOS PARÁMETROS
DE CINÉTICOS DE
CRECIMIENTO

* El log2 X, resulta de la resolución de la ecuación diferencial yde del hecho de considerar el fenómeno de reproducción bacteriana es por fisión binaria
 CÁLCULO DE PARÁMETROS CINÉTICOS-
MÉTODO GRÁFICO.
 m = v= 1/g=n/t incubación, por tanto:

 La velocidad de división (v) será:

 v= 0.2332 h-1

 La velocidad específica de crecimiento (µ) será:

 µ= 0.0702 h-1

 El tiempo de generación (g), será:

 g= 1/0.2332= 4.3 h

 El número de generación para un tiempo de

incubación de 4.3 h, será:

 m= n/t incubación, por tanto n=m t incubación,

 Asi que, n=(0.2332)(4.3)=1, aproximadamente

n=1, es decir, en 4.3 h recién se esta formando
una nueva generación (Como se esperaba)

¡Cuidado! Aunque existen valores reportados para cada género y especies, los valores de la velocidad específica de
crecimiento (µ) depende del medio de cultivo utilizado (composición) y condiciones de incubación, si alguno de los
ingredientes o condiciones se modifica, los valores pueden ser totalmente diferentes, de ahí la necesidad de
determinarlos cada vez que se modifique alguna condición del cultivo
 Si lo deseas también puedes
utilizar log10

* Esto lo podrás consultar en la edición 14 de Biología de los microorganismos (Cuidado porque ediciones anteriores contienen algunas imprecisiones)
 CÁLCULO DE PARÁMETROS CINÉTICOS-
MÉTODO GRÁFICO.
 m = µ = log10 2/g=n log10 2 /t incubación tanto:

 La velocidad específica de crecimiento (µ) será:

 µ = 0.0702 h-1

 La velocidad de división (v) será: v= µ / log 10 2

 v= 0.2332 h-1

 El tiempo de generación (g), será:

 g= log102/0.0702= 4.3 h

 El número de generación para un tiempo de

incubación de 4.3 h, será:

 m= n log10 2 /t incubación, por tanto n=m t incubación,

 Asi que, n=(0.0702) log10 2 (4.3)=1, por tanto, n=1,

es decir, en 4.3 h recién se esta formando una
nueva generación (como se esperaba)

En general este modelo primario de evaluación cinética es el más sencillo y no considera la influencia de la variación
de sustrato con respecto al tiempo en el crecimiento, para eso hay otros modelos matemáticos que tratan de modelar
este fenómeno
 Determinación de carga microbiana en leche
REDUCTASA
(reducción del azul de metileno)
PROCEDIMIENTO
REACCIÓN

CUANTIFICACIÓN
 EVALUACIÓN POR DECOLORACIÓN DE

RESAZURINA

En este caso incubamos por una hora y realizamos la

evaluación, aunque también podríamos hacer seguimiento
por triplicado por 3 h, registramos el color y realizamos la
evaluación
¡Cuidado! La presencia de sustancias reductoras en la muestra provocarán una sobreestimación.
 MÉTODOS DIRECTOS:
RECUENTO MICROSCÓPICO
Cámara de Neubauer/
Cuenta de Breed
Cámara de Petroff- Hausser
(Samuel C. Prescott y Robert S.
Breed,1910. Leche)

Área de
Área de
Extensión
campo Ac
Am (µm2) VENTAJAS
(µm2)
Permite evaluar morfologías distintas.
Permite evaluar movilidad
Tinción Para ciertos microorganismos (moviles) puede ser un
método de cuantificación de viables.
Observación a DESVENTAJAS
100x 10 campos Presenta un sesgo por la presencia de asociaciones
(Promedio Ẋ) microbianas en muestras reales.
En muestras con altas concentraciones el conteo no es
confiable
 PROBLEMA
CUENTA DE BREED
 Como parte de tu ejercicio profesional en
un laboratorio de análisis clínicos, se te
pide que de manera urgente determines la
concentración de BAAR y no BAAR en una
muestra de esputo procedente de un
paciente con tuberculosis, para adecuar la
dosis de antibiótico necesaria que debe
administrarse. Para lo cual, decides
realizar su cuantificación por cuenta directa
usando el método de Breed
 Para realizar la cuantificación, utilizas el
objetivo de 100x, que al calibrarlo da una
longitud de 18 líneas de diámetro. La
longitud de cada línea es de 10 µm. Tomas
la muestra con un asa calibrada de 10 µL
(0.01 mL), la esparces en un área de 10
mm X 15 mm, después de lo cual procedes
a realizar una tinción BAAR y finalmente
observas al microscopio, encontrando las
siguientes observaciones por campo
1. Conteo
de BAAR
3 2 3 3 2
2. Promedio de bacterias por campo=2.6 BAAR/campo
3. No de campos de observación sobre los que se realizó la
extensión
r campo=90 µm=0.09 mm, por tanto,
Acampo=3.1416X 0.092mm=0.025 mm2
A inoculación=10 mmX 15 mm=150 mm2
No de campos=150/0.025=6000 campos
3. Concentración bacteriana relacionando conteo de campos
observados, campos sobre los que se realizó la extensión y volumen de
extendido en mL
4. Reportar con 2 cifras significativas y en notación científica.
Método de cuantificación por cámara de Neubauer
(Hematocitómetro)
CONTEO DE
MICROORGANISMOS
POR CÁMARA DE

NEUBAUER

Lo que se observo en el microscopio

a 40x fue un cuadro de la sección 3
 Problema

 A partir de las siguientes

imágenes que representan
cuadros (3), donde cada
cuadro pequeño tiene una
profundidad de p=0.100 y
un área de 0.0025 mm2.
 El microorganismos fue
identificado como
Chlorella sp.
 MATERIAL DE APOYO

 La escala de McFarland
https://www.youtube.com/watch?v=chDt1fCJm3k&fbclid=IwAR2CQCm_9yvd06owVN29d-
41oJqKJaai2mOFae9fzqLMHWZ2cDhcpEAcI8Y
 Uso de la turbidimetría/densidad óptima para cuantificar
https://www.youtube.com/watch?v=bia_5GFKV3E&fbclid=IwAR1UYUx_zgo5Dapbgulxjjso3-
SQTWWntM-yho3_S8c_qM6OS1OqYKODWEc
 Recuento de microalgas por cámara de Neubauer
https://www.youtube.com/watch?
v=29W913Mn2ec&fbclid=IwAR07i1mICPsu3610lHEl1QafOX9ia5N5KYvSxxOgbPuux0Y
kklOGnnjB528
 Método tiempo de decoloración azul de metileno-Reductasas
https://www.youtube.com/watch?
v=E9w1IHRw9RY&fbclid=IwAR01DvN5hj_cZNpLEZwQ7DnvD75fHXelQ_8LmOoR4U8G
BS84i-zYfVHG8m8