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la Polimerasa (PCR)
Eva Mas, Julio Poza, Jesús Ciriza, Pilar Zaragoza, Rosario Osta y Clementina
Rodellar.
Laboratorio de Genética, Bioquímica y Grupos Sanguíneos.
Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza (España)
La PCR es una técnica para la síntesis "in vitro" de secuencias específicas de ADN. Es una
forma simple y muy rápida de multiplicar el ADN presente en diferentes muestras biológica,
obteniéndose millones de copias de una determinada secuencia de ADN. En poco tiempo esta
técnica ha conseguido ser ampliamente utilizada no sólo en el campo de la genética
molecular, sino en otras muchas ciencias. Las siglas PCR significan "Polimerase Chain
Reaction", Reacción en Cadena de la Polimerasa.
El inventor de esta interesante técnica fue Kary Mullis por la cual se le adjudicó el Premio
Nobel de Química en 1993. Utilizó la PCR para la amplificación del gen de la b-globina
humana (Mullis y cols., 1986; Mullis y Faloona., 1987) y el diagnóstico prenatal de la anemia
falciforme (Saiki y cols., 1985; Saiki y cols., 1986; Embury y cols., 1987), desde entonces la
PCR ha revolucionado todos los campos que estudian y manipula los ácidos nucleicos.
Mullis se basó en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA
polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el
sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble
cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados cebadores (primers).
Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada
uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar.
Como se muestra en las figuras 3a y 3b, observamos que una vez completado el
primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo
tenemos 4, al final del tercero 8...Si los ciclos se producen un número "n" de veces y
suponiendo que el número de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una
cantidad de ADN de 2n, por lo que la amplificación se realiza en forma de progresión
geométrica.
Figura 3a: Amplificación exponencial del PCR (de Andy Vierstracte 2001)
Figura 3b: Amplificación exponencial del PCR (de M.E. Gilles-González 1997)
Es importante recalcar que los productos obtenidos tras la tercera etapa son de dos
tipos: "producto corto" y "producto largo". El producto corto tiene una longitud
perfectamente definida por los extremos 5´de los cebadores y contiene exactamente la
secuencia que se desea amplificar. Es el fragmento que se almacena de manera
exponencial durante la reacción. El producto largo es el que incorpora las cadenas de
ADN originales de la muestra y cuyos extremos 3´no están definidos. Sin embargo, es
importante aclarar que al final de la PCR, la cantidad de producto corto sintetizado es
muy superior en comparación con el producto largo, por lo que generalmente para
posteriores estudios a partir del producto de la PCR, se desestima. (Fig.4)
Figura 4: Detalle de los cuatro primeros pasos de la PCR (de Andy Vierstracte 2001)
Para la elección de los primers, existen una serie de normas que nos pueden
ayudar, aunque hay que indicar también que existen programas de ordenador
que nos facilitan esta tarea (DNAsis, Primer3, etc.).
DNA Polimerasa
Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicación
del ADN, siguiendo el mismo método de síntesis. Se pueden clasificar en:
Tampón de la reacción
Por lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente), 50
mM ClK, 0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2.
Sales
1. Desnaturalización
Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el ADN
molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera
adecuada se recomiendan temperaturas de 94ºC durante 30´´-1´. Si la
muestra tiene alto contenido de G+C se puede aumentar el tiempo o la
temperatura.
Sin embargo hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima
decrece de manera muy rápida a partir de los 95ºC, por lo que a estas
temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de
incubación.
En la práctica se suele añadir un período de desnaturalización antes de
comenzar los ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la
muestra de ADN. Esta etapa suele ser de 5´a 94ºC.
2. Hibridación
En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores
relacionados con los oligonucleótidos: la composición de bases, el
tamaño y la concentración.
En la práctica, la temperatura de hibridación puede oscilar entre 45ºC y
65ºC, durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un
aumento de temperatura o del tiempo favorece la especificidad ya que
disminuye las uniones incorrectas de los cebadores con la hebra molde.
3. Elongación
En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72ºC.
Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72ºC. El tiempo de
extensión depende del tamaño de la amplificación. Se puede estimar un
tiempo de 1min. para elongar 1 Kb.
En la práctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una
última elongación de 5´a 72ºC.
Número de ciclos
También adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR el número
de ciclos que se utilizan. Este número depende de la cantidad de ADN que
existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados
(normalmente de manera empírica).
Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que puede dar lugar a la
amplificación de productos no deseados originados por hibridaciones no
específicas.
Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una enzima que
sufre el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de la acumulación
del producto. Después de un número determinado de ciclos la amplificación
deja producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria.
Generalmente cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN
sintetizado es suficiente para su posterior utilización.
Contaminación en la PCR
La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo
que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el
ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se
amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus
mayores ventajas de la técnica, se convierte a la vez en el principal
inconveniente (Kwok y Higuchi, 1989).
Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el
caso de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al
máximo:
Bibliografía
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