Residual eDNA Detection Sensitivity Assessed by Quantitative Real Time PCR in A River Ecosystem - En.es

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Fecha de recepción: 17 de abril de 2016

Fecha de revisión: 22 de julio de 2016 Fecha
de aceptación: 05 de agosto de 2016 Tipo de
artículo: Artículo de recurso
Artículo aceptado
Sensibilidad de detección de eDNA residual evaluada por
PCR cuantitativa en tiempo real en un ecosistema fluvial
Katherine D. Balasingham1
ryan p walter1,2,3
daniel d heath1
1Departamento de Biología, Instituto de Investigación Ambiental de los Grandes Lagos, Universidad

de Windsor, 2990 Riverside Drive West, Windsor, ON, N9C 1A2, Canadá
2La dirección actual:Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad Estatal de California, 800 N State
College Blvd, Fullerton, CA 92831, Estados Unidos
3Laboratorio de Pesca y Ciencias Acuáticas de los Grandes Lagos, Fisheries and Oceans Canada,
Burlington, ON L7R 4A5, Canadá
Título consecutivo:Análisis qRT-PCR de eDNA residual
Palabras clave: ADN ambiental, qRT-PCR, río, persistencia de ADN, residual
Correspondencia:
Katherine D. Balasingham
Departamento de Biología
Instituto de los Grandes Lagos para la Investigación Ambiental
Universidad de Windsor
2990 Riverside Drive West
Windsor, ON, N9C 1A2, Canadá
contacto: 1-647-588-5799;
Correo electrónico: katherine_balasingham@hotmail.com
Este artículo ha sido aceptado para su publicación y se sometió a una revisión completa por pares, pero no ha
pasado por el proceso de edición, composición tipográfica, paginación y corrección de pruebas, lo que puede
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10.1111/1755-0998.12598
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Resumen
Varios estudios han demostrado que el ADN ambiental (eDNA) se puede utilizar para
detectar la presencia de especies acuáticas, días o semanas después de que la especie objetivo haya sido
Artículo aceptado
remoto. Sin embargo, la mayoría de los estudios utilizaron análisis de eDNA en sistemas lénticos (estanques o lagos), o en
experimentos de laboratorio controlados. Si bien el eDNA se degrada rápidamente en todos los sistemas acuáticos,
también sufre efectos de dilución y destrucción física en los sistemas de flujo, lo que complica
Detección en ríos. Sin embargo, algo de eDNA (es decir, eDNA residual) puede retenerse en organismos acuáticos.
incluso aquellos sujetos a regímenes de alto flujo. Nuestro objetivo era determinar el eDNA residual
sensibilidad de detección utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), en un
río que fluye sin control después de que la fuente de eDNA se eliminó del sistema; nosotros
repitió el experimento durante dos años. El eDNA residual tuvo la señal más fuerte en
el sitio de origen original y fue detectable allí hasta 11,5 horas después de la fuente de eDNA
eliminación. La intensidad de la señal de eDNA residual disminuyó a medida que la distancia de muestreo aguas abajo de
el sitio de origen del eDNA aumentó y ya no era detectable en el sitio de origen 48 horas
después de que se agotó el agua de la fuente de eDNA en ambos experimentos. Este experimento muestra
que el eDNA residual muestreado en aguas superficiales se puede mapear cuantitativamente usando qRT-PCR,
lo que permite una identificación espacial más precisa de la ubicación de la especie objetivo en lótico
sistemas, y la fuerza de la señal de eDNA residual relativa puede permitir la determinación de la
el momento de la presencia de las especies objetivo.
Introducción
Detección de especies acuáticas sin utilizar métodos de captura convencionales como
redes o pesca eléctrica (que a menudo son perjudiciales para el individuo objetivo y su
ecosistema), es de particular importancia cuando se monitorea la distribución de especies raras
(Jones 1992; Baldwin et al. 1996; Port et al. 2006). En los hábitats acuáticos, los organismos liberan
Moléculas de ADN de varias fuentes (por ejemplo, células de la piel, orina, heces, esperma, óvulos, moco)
que pueden persistir en el hábitat circundante. Este ADN ambiental (eDNA) ofrece una
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enfoque alternativo para estudiar la presencia de especies de interés a través de su genética
información a la que se accede tomando muestras de su ADN en el agua, en lugar de capturar físicamente
(Ficetola et al. 2008; Goldberg et al. 2011; Taberlet et al. 2012; Wilson & Wright
2013). La integración de técnicas de genética molecular y ecología acuática (análisis eDNA)
ha resultado en una mayor sensibilidad de detección para especies raras y detección temprana de especies acuáticas
especies invasoras (Goldberg et al. 2013; Thomsen et al. 2012; Jerde et al. 2012). como ADN electrónico
el análisis utiliza secuencias de ADN de las especies objetivo para la detección, ha reducido los errores
asociado con la identificación taxonómica por lo que es ideal para las especies que son taxonómicamente
críptico, presente en baja abundancia o habita en áreas difíciles de muestrear (Jerde et al. 2011;
Dejean et al. 2012; Pillod et al. 2013). Es importante tener en cuenta que debido a una mayor detección
sensibilidad, la contaminación cruzada entre los sitios de estudio o dentro del laboratorio puede resultar en
falsos positivos, donde el ADN de la especie objetivo está presente en la muestra pero la especie no
ocurren en el sitio de estudio. El protocolo de muestreo adecuado y el uso de controles pueden minimizar el riesgo
de falsos positivos (Rees et al. 2014). Además, la facilidad para obtener muestras de agua
en relación con la obtención de especímenes vivos, disminuye en gran medida el tiempo de campo y los costos y reduce la
riesgo de dañar a las personas o a su entorno.
Varios estudios recientes han ilustrado el análisis de eDNA como una herramienta poderosa en el
detección de especies acuáticas raras, incluidas especies en riesgo e invasoras. Por ejemplo,
Los estudios han detectado con éxito especies invasoras en ambientes acuáticos. Exitosamente
especies detectadas incluyen la rana toro americana (Lithobates catesbeianus) en el suroeste
Humedales de Francia (Ficetola et al. 2008), carpas asiáticas (Hipoftalmitisspp.) en el Gran
cuenca de los lagos (Jerde et al. 2011; Jerde et al. 2012), cangrejo rojo de pantano (procambarus clarkii) en
estanques en el noroeste de Francia (Tréguier et al. 2014), pitón birmana (Pitón bivittatus) en
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estanques de Florida (Piaggio et al. 2014), carpa cabezona (Hypophthalmichthys nobilis) en el
Cuenca del río Muskingum en Ohio (Simmons et al. 2015) y caracol de barro de Nueva Zelanda
(Potamopyrgus antípodarum) invadiendo los sistemas de agua dulce a nivel mundial (Goldberg et al. 2013).
Los estudios también han tenido éxito en la detección de especies en riesgo, como el salmón chinook en el
Upper Columbia River (Laramie et al. 2015) y el loach meteorológico europeo en Dinamarca
(Sigsgaard et al. 2015). Estos estudios emplean la reacción en cadena de la polimerasa específica de especie
cebadores (PCR) que pueden diseñarse para atacar mitocondrial o nuclear altamente conservados
regiones para la detección de las especies objetivo. A continuación, los productos de la PCR se visualizan en
geles de agarosa para identificar la presencia de la banda objetivo, infiriendo la presencia de una especie
para una muestra particular de eDNA. Los productos de PCR positivos deben secuenciarse para su confirmación.
de la detección de especies objetivo (Ficetola et al. 2008; Jerde et al. 2011; Thomsen & Willerslev
2014).
Sin embargo, la PCR de punto final tradicional no es cuantitativa y aunque se puede utilizar para
inferir la presencia/ausencia de especies, no proporciona información sobre la intensidad de la señal, ni
estimación cuantitativa de la sensibilidad de detección. Cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real
reacción (qRT-PCR) puede proporcionar una estimación de la abundancia relativa, dadas algunas suposiciones
(Thomsen et al. 2012; Goldberg et al. 2013; Pilliod et al. 2013; Klymus et al. 2015).
Además, qRT-PCR es más sensible para detectar bajas concentraciones de ADN molde,
que a menudo es un factor limitante para el eDNA acuático (Wilcox et al. 2013). Plantilla de cuantificación
Las concentraciones de eDNA se han identificado como un componente importante del análisis de eDNA, ya que
una mejora sobre la simple presencia/ausencia, y más estudios que incorporan qRT-qPCR
para la detección de eDNA se están publicando análisis (Takahara et al. 2012; Pilliod et al. 2013;
Wilcox et al. 2013; Uchii et al. 2016). Por ejemplo, Uchii et al. (2016) utilizaron qRT-PCR para
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cuantificar las detecciones de eDNA de genotipos no nativos de carpa común (Cyprinus carpio) en un
sistema controlado, y encontró una correlación positiva entre la plantilla calculada eDNA
concentración y la biomasa conocida de la especie objetivo. Del mismo modo, Thomsen et al. (2012)
midió la concentración de eDNA de la plantilla a través del análisis qRT-PCR e informó un resultado positivo
correlación entre la concentración de eDNA y la abundancia de anfibios. plantilla de ADN electrónico
las concentraciones están influenciadas por la abundancia y la biomasa de la especie objetivo junto con la
tasa de degradación del ADN influenciada por la temperatura, el metabolismo microbiano y
descomposición química/física (Barnes & Turner 2016). La relación entre el
concentración de eDNA y la abundancia de especies de destino se vuelve más compleja en el flujo
ambientes, donde el flujo del río mueve físicamente las moléculas de eDNA más lejos de
individuos o poblaciones de origen (Deiner y Altermatt 2014), lo que también contribuye a aumentar
dilución y descomposición física/química (Jane et al. 2015). No obstante, qRT-PCR
Las aplicaciones para el análisis de eDNA pueden ser adecuadas para mapear las concentraciones de eDNA en flujo
sistemas para identificar las ubicaciones de las especies objetivo en función de la plantilla de ADN cuantificada
gradientes de concentracion
En situaciones donde las especies de interés están siendo eliminadas del sistema o ciertas
hábitats (es decir, sobreexplotados o extirpaciones potenciales), número de especies objetivo y
la abundancia disminuye y es probable que se aísle en unos pocos hábitats discretos. Junto con
aumento del movimiento y descomposición de las moléculas de eDNA en sistemas lóticos, raro y aislado
individuos daría como resultado una disminución del eDNA disponible en el sistema. Por lo tanto, el uso de
eDNA residual que definimos como las moléculas de eDNA que persisten en el medio ambiente después
la remoción de la fuente puede usarse para identificar áreas que ya no pueden contener la especie
de interés, o ayudar a identificar áreas que puedan albergar poblaciones de origen o algunos individuos
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usando fuertes señales residuales de eDNA.
Si bien se ha observado que el eDNA se degrada exponencialmente con el tiempo (Barnes et al.
2014), experimentos de laboratorio controlados han demostrado que algunas moléculas de eDNA pueden
persistir más de lo esperado. Varios estudios informaron tiempos de retención de eDNA que oscilaron entre 7
a 25 días después de la eliminación de las especies de agua dulce objetivo (Dejean et al. 2011; Thomsen
et al. 2012; Goldberg et al. 2013; Barnes et al. 2014; Pillod et al. 2014; Piaggio et al. 2014;
Merkes et al. 2014; Strickler et al. 2015), sin embargo, estos estudios utilizaron
ambientes controlados. Un pequeño número de estudios han utilizado el análisis de eDNA en lótica
sistemas para comparar la sensibilidad de detección de eDNA con los métodos tradicionales basados en captura
(Goldberg et al. 2011; Pilliod et al. 2013). Sin embargo, no existen estudios que cuantifiquen
la dinámica del eDNA residual de baja concentración en sistemas de flujo no controlados.
El objetivo de este proyecto es cuantificar la detectabilidad del eDNA residual utilizando superficie
muestras de agua en un ecosistema de flujo natural dos horas después de la extracción del eDNA
fuente. Agua que contenía juveniles de salmón del Atlántico (salmo salar) se utilizó como fuente de eDNA
para que este estudio determine: (1) qué tan lejos río abajo puede ser el eDNA residual del salmón del Atlántico
detectado desde un sitio de fuente de eDNA fijo dentro de un corto período de tiempo después de que se
agotado y, (2) la intensidad de la señal del eDNA residual en relación con la distancia desde el
fuente. Para lograr esto, tomamos muestras de nuestro río de estudio a distancias uniformes río abajo.
de la fuente de eDNA después de detener la entrada de agua de ADN de origen, y eDNA medido
intensidades de la señal de detección usando qRT-PCR. Si bien algunos estudios han cuantificado la
persistencia de eDNA después de la eliminación de una especie objetivo en ambientes controlados, a nuestro
conocimiento ninguno ha examinado aún las interacciones entre el movimiento y la retención
de moléculas de eDNA en ecosistemas de flujo natural, después de que la fuente de eDNA (es decir, la especie) sea
remoto. Además, nuestro uso de qRT-PCR para la detección de eDNA permite una
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análisis del gradiente espacial de la concentración de eDNA residual. Predijimos que el Atlántico
las concentraciones de eDNA de salmón disminuirían aguas abajo como un factor de distancia como dilución
y la degradación asociada con el flujo de moléculas de eDNA reduce la retención. tal
relación funcional entre la distancia espacial y las señales residuales de eDNA permitiría la
determinación de fuentes puntuales de eDNA, y posiblemente una estimación relativa de las especies objetivo
abundancia.
Materiales y Métodos
Área de estudio y especies de estudio
El sitio de estudio, Little River, está ubicado en el suroeste de Ontario y tiene aproximadamente
65 kilometros2de superficie, 12 km de longitud, y desemboca en el lago St. Clair (Fig. 1). Aproximadamente
El 46% de la cuenca está urbanizada con un bajo caudal base, bajos niveles de oxígeno y mala
comunidades de invertebrados (Hayman et al. 2005; ERSPA 2011). Little River fue elegido como
no contiene la especie objetivo experimental, salmón del Atlántico, y la accesibilidad para
muestreo. El salmón del Atlántico fue elegido como la especie objetivo como agua de cría del salmón del Atlántico
estaba fácilmente disponible para su uso como fuente de eDNA y esta especie no se encuentra en Little
Río. Aproximadamente 400 L de agua de un tanque de retención de salmón del Atlántico en la Universidad
del Centro de Ecología de Restauración de Agua Dulce de Windsor (FREC, LaSalle, ON, Canadá) fue
recogido y almacenado en dos barricas. El agua procedía de un depósito de recirculación que alimentaba
tanques de cría con 102 juveniles de salmón del Atlántico, con un peso aproximado de 40 g cada uno. los
El experimento se repitió dos veces, una en 2014 y otra en 2015.
Muestreo de agua
Experimento de 2014: dos barriles que contienen agua de salmón del Atlántico, cada uno con
aproximadamente 200L, se instalaron en un terreno al lado de Little River (42o16'56.1” N, 82o54'45,6” O;

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en lo sucesivo, el sitio de origen; Figura 1). Este sitio fue elegido debido a su fácil acceso y
instalación de los barriles en un área elevada, necesaria para el flujo por gravedad. Se ha observado que
los peces introducidos en nuevos hábitats liberarán mayores cantidades de eDNA inicialmente antes que eDNA
los niveles de producción se estabilizan (Takahara et al. 2012; Maruyama et al. 2014). Desde que obtuvimos
agua de salmón del Atlántico de un tanque de retención donde los juveniles ya estaban aclimatados,
liberó el agua de eDNA a un ritmo constante. El agua se vertió en el río por gravedad.
caudal a una tasa de descarga de aproximadamente 2,3 x 10-6metro3∙s-1(del 22 al 24 de agosto de 2014);
el caudal del río fue de aproximadamente 0,12 m3∙s-1. Flujo de agua de salmón del Atlántico comenzó a las 15:00
(22 de agosto) y se detuvo cuando el suministro de agua se agotó aproximadamente a las 09:00 del
24 de agosto (tiempo de flujo total: ~42 horas). Dado que se descubrió que el eDNA se degrada rápidamente en
(Barnes et al. 2014), un período de descarga de 42 horas permitió que el tiempo de eDNA introducido
para equilibrarse, unirse potencialmente al sustrato que flota libremente y migrar en el sistema durante
retención realista. El muestreo de agua comenzó aproximadamente dos horas después de que el agua fuera
vaciado de las barricas (11:00 horas del 24 de agosto). Recolectamos muestras de agua superficial
(aproximadamente de 10 a 15 cm por debajo de la superficie) en 500 ml esterilizados (lejía al 10 %) de Nalgene
botellas y las almacenó en hieleras esterilizadas llenas de hielo. El muestreo comenzó en la fuente.
sitio (0 km) y recolectamos todas las muestras a la distancia de un brazo (~0.60 m) mirando río arriba pero
caminar hacia atrás en dirección corriente abajo para minimizar el muestreo de sedimentos levantados.
Continuamos muestreando río abajo desde el sitio de origen hasta 1,2 km río abajo, tomando de 3 a
4 muestras cada 60 m. El muestreo tomó aproximadamente 5.5 horas, finalizando aproximadamente
16:30 del 24 de agosto. Se recogieron muestras de agua en el centro del río en cada muestreo
punto (los sitios que eran menos profundos solo se muestrearon tres veces). Superficie del agua
se tomó la temperatura en cada punto de muestreo y la media fue de 16,8oC (± SEM 0,2oC).
Se tomaron muestras de control positivo del tanque de almacenamiento de salmón del Atlántico en el FREC y
Artículo aceptado
Se tomaron muestras negativas 40 m y 60 m aguas arriba del sitio de origen antes de
muestreo aguas abajo. En total, se tomaron 73 muestras de agua aguas abajo de la fuente,
cuatro controles positivos tomados del tanque de retención en la instalación de crianza, y seis controles negativos
Se tomaron controles aguas arriba de la fuente. Se tomaron tres muestras de agua adicionales
dos días (~48 horas, a las 08:30 del 26 de agosto) después de la finalización inicial del muestreo en el
sitio de origen para determinar si las cantidades traza de eDNA residual de salmón del Atlántico aún podrían ser
detectado.
Experimento de 2015: el estudio se replicó en 2015 utilizando la misma configuración y eDNA
fuente como en 2014 (Fig. 1). Todas las muestras se recogieron y almacenaron como antes. Sin embargo, en 2015
Se recolectaron muestras de control del río antes de iniciar el flujo del agua del salmón del Atlántico.
en el sitio de origen (0 m; N = 3), y 60 m (N = 3) río arriba para un total de 6 controles de río. En
Además, se recolectaron tres controles de tanque positivos del tanque de almacenamiento de salmón del Atlántico
en la FREC. El flujo de agua del salmón del Atlántico comenzó a las 14:00 el 6 de junio de 2015 y se detuvo en
aproximadamente a las 7:00 el 8 de junio de 2015 (tiempo de flujo total: ~41 horas). El muestreo comenzó a las 9:00 del
8 de junio, dos horas después de que se agotara el suministro de agua de salmón del Atlántico. Empezamos
muestrear 7,5 km aguas abajo del sitio de origen y trasladarse río arriba al sitio de origen,
recolectando tres muestras de agua superficial cada 500 m con la botella extendida ~0.6 m
río arriba. Ampliamos la distancia de muestreo aguas abajo en 2015 para determinar si los residuos
El eDNA podría detectarse a mayores distancias aguas abajo (Fig. 1). El muestreo terminó a las 18:30
el 8 de junio, aproximadamente 9,5 horas después de que comenzamos el muestreo aguas abajo. Superficie del agua
se tomó la temperatura en cada punto de muestreo con y la media fue de 19.7oC (± SEM 0,3oC).
En total, se recolectaron 60 muestras de agua. También incluimos tres muestras de agua adicionales
tomado en el sitio de origen dos días (~48 horas, a las 08:00 el 10 de junio) después del muestreo inicial para
Determinar si aún se puede detectar eDNA residual del salmón del Atlántico.
Artículo aceptado
Filtrado y extracción de eDNA
Dentro de las 24 horas posteriores al muestreo, todas las muestras de agua se filtraron utilizando vidrio Whatman®
papeles de filtro de microfibra (47 mm de diámetro; tamaño de poro de 1,2 µm; Whatman, Maidstone, Reino Unido).
Primero, 500 mL de ddH2O se filtró para actuar como controles instrumentales para probar el laboratorio
contaminación, seguido de la filtración de una muestra de río en un nuevo papel de filtro en el mismo
aparato. Esto permitió que cada muestra tuviera su propio control instrumental. Si alguna
control instrumental dio positivo para ADN de salmón del Atlántico, el río correspondiente
la muestra no se utilizaría en nuestro análisis debido a la posible contaminación. Embudos de filtro
fueron esterilizados entre muestras empapando las copas del embudo en lejía al 10 % y enjuagándolas
dos veces con ddH2O. Las muestras que tenían muchos sedimentos requerían de 2 a 3 filtros adicionales (cada uno
con un control instrumental correspondiente) y se incluyeron en el análisis qRT-PCR. Todos los filtros
se colocaron en tubos Falcon de 15 ml y se almacenaron a -20oC hasta la extracción de ADN.
Para la extracción de ADN se cortaron filtros (muestras de río y controles instrumentales)
aproximadamente a la mitad utilizando fórceps estériles y hojas de afeitar (limpiar entre cada uso)
utilizando etanol al 95 %); la mitad se almacenó para uso futuro, mientras que la segunda mitad se usó para
extracción de ADN electrónico. Cada sección de papel de filtro se cortó en tiras más pequeñas para ayudar con la digestión.
y se colocaron en tubos de 2 mL que contenían 400 µL de perlas de vidrio de 1,0 mm empacadas en seco (Fisher
Scientific LTD, BioSpec. Gato. n.º 11079110), 400 µL de ddH esterilizado en autoclave2O, 400 µL de fenol-
cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) y 400 µL de bromuro de cetiltrimetilamonio
Tampón de digestión (CTAB). Las muestras se homogeneizaron durante 3 minutos a 3000
golpes∙minuto-1(configuración de velocidad 3 para el Mini-Beadbeater-24; Fisher Scientific LTD, BioSpec.)
para una completa digestión y mezcla del filtro y el contenido. Después de centrifugar a 13 000
Artículo aceptado
rpm durante 20 minutos, se eliminó el sobrenadante para una segunda fase de separación. Nosotros
agitó el sobrenadante con un volumen igual de cloroformo-alcohol isoamílico para eliminar
cualquier fenol residual en la solución y centrifugar nuevamente durante 20 minutos a 13 000 rpm. los
El sobrenadante se combinó con volúmenes iguales de isopropanol y 0,6x volumen de 3M
acetato de sodio (pH 5.2), luego se dejó precipitar el ADN durante la noche a -20oC. El ADN se peletizó.
por centrifugación a 13 000 rpm durante 20 minutos, luego se descarta el sobrenadante y se sedimenta
se lavó una vez con etanol al 70% enfriado con hielo. El ADN se peletizó mediante una centrifugación final a
13 000 rpm durante 20 minutos, se descarta el sobrenadante y se dejan secar al aire durante dos
horas para eliminar completamente el etanol residual. Una vez seco, el ADN se resuspendió en 30 µL
de tampón TE 10 mM y 0,5 µl de ARNasa A para eliminar cualquier ARN potencialmente interferente. Todos
Las muestras de ADN se almacenaron a -20oC hasta el análisis.
Marcadores genéticos
Utilizamos cebadores que apuntan al genoma mitocondrial debido a la estabilidad de
la molécula de mtDNA circular y el alto número de copias presente en cada célula. Nosotros usamos
Cebadores D-loop específicos de especies de salmón del Atlántico desarrollados por Karlsson et al (2012)
(Salmo_Mito-951) basado en la secuencia D-loop para el salmón del Atlántico y la trucha marrón (Salmo
trutta). Este conjunto de cebadores amplifica un tamaño de fragmento de ADN de aproximadamente 230 pb (Karlsson et al.
Alabama. 2012). La eficacia del cebador se probó utilizando ADN de salmón del Atlántico en una serie de diluciones de 10 veces
(curva estándar) y analícelo por triplicado usando qRT-PCR (consulte a continuación los detalles de qRT-PCR). Nosotros
utilizó Primer Basic Local Alignment Search Tool (Primer-BLAST; Ye et al. 2012) contra el
Base de datos Genbank para verificar la especificidad del cebador que devolvió resultados solo parasalmo salary
salmo trutta(ambas especies no se encuentran en Little River).

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Análisis qRT-PCR
Todas las muestras de eDNA (excepto los controles positivo y negativo qRT-PCR) se sometieron a un
Dilución de 10 veces. Diluir las muestras de esta manera puede ayudar a corregir la inhibición de qRT-PCR ya que
la dilución disminuirá la concentración de elementos inhibidores en la muestra. qRT-PCR fue
ejecutar para cada muestra de eDNA por triplicado en reacciones de 20 µL usando 10 µL de SYBR® Select Master
Mezcle (Life Technologies Inc., Burlington, ON, CA), 0,2 µM de cada cebador directo e inverso,
0,2 mg∙mL-1BSA, 0,1 unidadesTaqpolimerasa y 2,0 μL de eDNA de plantilla. Sin plantilla
controles y controles positivos utilizando ADN extraído de clips de aleta de salmón del Atlántico también fueron
incluido por triplicado para cada placa qRT-PCR de 96 pocillos. Las condiciones del termociclador se establecieron en
una inicial 95oC desnaturalización durante 10 minutos, seguido de 55 ciclos de 94oC desnaturalización para
30s, y recocido a los 60oC para 60s. Todos los datos de qRT-PCR se analizaron en QuantStudioTM
Sistema de PCR en tiempo real 12K Flex (Life Technologies Inc. Burlington, ON, CA).
Muestras que producen un valor de umbral de ciclo medio (Ct) mayor que el límite de
cuantificación (LOQ; explicado más adelante en la siguiente sección), o amplificación inconsistente entre
Las réplicas se ejecutaron por segunda vez por triplicado usando las mismas condiciones de qRT-PCR, pero usando
2,0 μL de eDNA de plantilla. Para cualquier muestra que no produjo amplificación después de un segundo qRT-
PCR, se asignó a la muestra un valor de Ct de 55 (número máximo de ciclos). Un subconjunto de
los productos qRT-PCR se corrieron en un gel de agarosa para confirmar que una sola banda de la adecuada
el tamaño objetivo (~230 pb) estaba presente. Productos de PCR para seis muestras de eDNA (tres muestras de
2014 y tres muestras de 2015) que produjeron bandas claras fueron secuenciadas en el
McGill University Gènome Québec Innovation Center (Montreal, QC, Canadá) para confirmar
que el eDNA del salmón del Atlántico había sido amplificado. Una herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST)
se usó para alinear las secuencias resultantes con las secuencias de la base de datos de nucleótidos de GenBank
para el salmón del Atlántico y la trucha marrón para verificar la amplificación de la especie objetivo.
Artículo aceptado
Análisis de datos
Para estimar la eficiencia del cebador, se analizó el ADN del salmón del Atlántico mediante qRT-PCR con
concentraciones que van desde 32 ng∙µL-1a 3,2x10-8ng∙µL-1y ajustado a un logaritmo
Modelo de regresión. El LOQ corresponde a la concentración de ADN plantilla más baja que puede
cuantificarse (Armbruster & Pry 2008; Bustin et al. 2009). Este valor se calcula utilizando el
Intervalo de confianza del 95 % del Ct medio ± SEM para la réplica de control sin plantilla. Este
el valor se establece como nuestro umbral LOQ (McKee et al. 2015); los valores medios de Ct por debajo de este valor son
identificado como positivo para el ADN del salmón del Atlántico y los valores medios de Ct por encima de este valor son
identificado como negativo. Las concentraciones de la plantilla de ADN se midieron usando Quant-iTTM
Ensayo PicoGreen dsDNA (ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.) y verificado con NanoVue
espectrofotometría y análisis de gel utilizando una serie de diluciones dobles de ADN lambda
(ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.). La curva estándar también se utilizó para estimar nuestra
Eficiencia del cebador qRT-PCR usando la siguiente ecuación (Yun et al. 2006):
Eficiencia = [10(-1/pendiente)– 1] x 100%
Los valores medios de Ct para el río y las muestras de control de laboratorio se calcularon para cada
sitio promediando los valores de Ct para todas las réplicas por muestra por sitio. corregimos la media
Valores de Ct para todas las muestras que se diluyeron (10 veces) para la amplificación utilizando la pendiente
obtenido de la curva estándar. Valores medios de Ct por sitio y distancia desde el sitio de origen
se ajustaron a un modelo de regresión curvilínea (ajuste cúbico) para probar una relación entre
Señal de detección de eDNA (valor Ct) y distancia.

Artículo aceptado
Resultados
Los ecosistemas acuáticos que fluyen, como los ríos, pueden ser problemáticos para la detección de
Un objetivo
especies usando análisis de eDNA (Roussel et al. 2015). En 2014, muestreamos desde la fuente
sitio dos
horas después de que cesó el flujo de agua del salmón del Atlántico y se recolectó río abajo (Fig. 1). En
2015, nosotros
comenzó a tomar muestras río abajo desde el sitio de origen y se movió río arriba hasta el origen
sitio (Fig. 1).
Dado que nuestras muestras de eDNA contenían potencialmente inhibidores debido a la extracción conjunta de ácidos húmicos,
fúlvico
ácidos o materia orgánica (Hoshino & Inagaki 2012; Doi et al. 2015; McKee et al. 2015), todos
eADN
muestras, incluidos los positivos de tanque y los controles de río, se diluyeron 10 veces antes de
qRT-PCR
amplificación para minimizar los efectos inhibitorios y mantener la consistencia (McKee et al. 2015).
Aquellos
Los valores medios de Ct se corrigieron usando nuestro gráfico de sensibilidad qRT-PCR produciendo una pendiente (PCR
eficiencia,
Apéndice S1, Información de apoyo) de -3.3 (R2= 0.97) con una eficiencia global de 101.0%
(Figura 2).
El umbral de LOQ fue de 44,0 ciclos, calculado utilizando el IC del 95 % inferior de nuestro modelo sin plantilla.
control
con un Ct medio de 50,5 (± SEM 3,24) ciclos. Después de la corrección de Ct, nuestras muestras de control positivo
Artículo aceptado
tomado
del tanque de almacenamiento de salmón del Atlántico produjo un valor Ct medio de 31,5 (± SEM 0,6) ciclos
para 2014
y 34,1 (± SEM 0,7) ciclos para 2015. En 2014, cinco sitios produjeron valores medios de Ct por debajo de nuestro
LOQ
umbral (0 m, 60 m, 180 m, 600 m y 960 m) con una curvatura positiva global
relación
entre la distancia desde la fuente y los valores medios de Ct (Fig. 3A; R2= 0,67,d.f.=17,PAGS=
0.00024,
Apéndice S2, Información de apoyo). Todos los controles instrumentales de 2014 fueron negativos para
atlántico
ADN de salmón, sin embargo, una réplica del control del río de 2014 tomada 40 m río arriba del
sitio de origen
estaba contaminado con ADN de salmón del Atlántico (la media de Ct de réplicas técnicas fue 39,7 (±
SEM 6.0));
el resto de los controles fluviales de 2014 estuvieron por encima de nuestro LOQ para el salmón del Atlántico (Fig. 3). Por lo tanto, en 2015
para evitar
la posibilidad de contaminación cruzada en el campo o el reflujo del río que potencialmente transporta
ADN de salmón
río arriba, todas las muestras de control del río se tomaron dos días antes de la instalación de campo de The Atlantic
salmón
Los controles de río e instrumentos de 2015 fueron negativos. En 2015, solo un sitio tenía un Ct medio
valor por debajo
nuestro umbral LOQ (0 m) y también encontramos una relación curvilínea significativa entre
Artículo aceptado
distancia
de la fuente con valores medios de Ct (Fig. 3B; R2= 0,49,d.f.=12,PAGS=0.037, Apéndice S3,
Secundario
Información). Secuenciamos tres amplicones de PCR de las muestras del río para ambos años y
Se confirmó que las secuencias eran salmón del Atlántico (Fig. 4). No hubo detecciones de eDNA
bajo el
Umbral LOQ en el sitio de origen después de 48 horas después de la eliminación de la fuente de eDNA en cualquier año
(Ct medio de
49,0 (± SEM 2,5) ciclos en 2014 y 50,3 (± SEM 1,4) ciclos en 2015.
Discusión
El flujo de agua no solo mueve físicamente el eDNA de la especie objetivo río abajo, lejos
desde su ubicación física, pero el flujo también puede contribuir a una mayor degradación del ADN
y dilución (Thomsen et al. 2012). Esto es especialmente problemático si las concentraciones de eDNA en
el sistema ya son bajos, como en los estudios que se centran en las especies invasoras en las primeras etapas de
el proceso de invasión, o especies raras como especies en riesgo. Además, las concentraciones de
El eDNA detectable también disminuye cuando las especies objetivo abandonan el sistema (por ejemplo, captura,
depredación, dispersión o migración). En tales situaciones, los estudios de eDNA se basan en la
detección de moléculas de ADN que se han retenido en el sistema, es decir, eDNA residual.
El eDNA residual es presumiblemente moléculas de eDNA menos sujetas a factores ambientales
resultando en tasas de degradación más lentas y mayor persistencia. Sin embargo, incluso flotando libremente
El eDNA residual se perderá con el tiempo debido a cambios físicos, químicos y biológicos naturales.
procesos (Levy-Booth et al. 2007; Dejean et al. 2011) y, por lo tanto, su detectabilidad
declinar con el tiempo. La producción y liberación natural de moléculas de ADN también puede depender
Artículo aceptado
en la especie, biomasa (Pilliod et al. 2014; Jane et al. 2015) y/o etapa de vida (Maruyama et al.
Alabama. 2014) que a su vez puede afectar la concentración de eDNA en el sistema. Por ejemplo, Pilliod
et al. (2014) encontraron que las tasas de producción de eDNA aumentaron con la salamandra gigante de Idaho
(Dicamptodon aterrimus) biomasa; sin embargo, Jane et al. (2015) encontraron que la biomasa de arroyo
trucha (Salvelinus fontinalis) tuvo poca influencia en la concentración de eDNA a mayores distancias
aguas abajo de la fuente. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue observar eDNA residual
de muestras de agua superficial en un río después de un período de tiempo conocido desde que la especie objetivo
eliminación de la fuente. Al tomar muestras de agua superficial, redujimos en gran medida el potencial de muestreo
eDNA unido a sedimentos que puede dar lugar a falsos positivos ya que el eDNA unido a sedimentos puede
persisten mucho más tiempo que el eDNA de la columna de agua (Turner et al. 2015).
Los valores medios de Ct para nuestras muestras de 2014 tenían altos errores estándar asociados (Fig.
3A) debido a la variabilidad en la cuantificación usando qRT-PCR para ADN molde altamente diluido. Si
la amplificación falló y no se alcanzó el umbral del ciclo a un nivel cuantificable dentro de los 55
ciclos de nuestro protocolo, se asignó un valor de Ct de 55 a las réplicas biológicas y técnicas.
La inclusión de los valores Ct asignados aumentó el valor Ct medio general, que también
inflado la estimación del error. Sin embargo, en 2015, los errores estándar fueron bajos y, en
promedio, consistente entre sitios ya que la mayoría de las muestras tenían ADN de plantilla bajo
concentraciones Esto probablemente se debió a que el muestreo comenzó 7,5 km aguas abajo del
sitio de origen y tardó 11,5 horas en llegar al sitio de origen, mientras que en 2014 comenzamos
muestreo en el sitio de origen y traslado río abajo; comenzando aguas abajo probablemente
permitió que pasara más tiempo para que el eDNA residual se diluyera y degradara. Como un
resultado, a la mayoría de las réplicas biológicas y técnicas dentro de los sitios se les asignó un Ct
valor de 55 reduciendo las estimaciones de error, pero produciendo valores medios de Ct por encima del LOQ.
Sin embargo, el eDNA residual mostró un aumento funcional en el valor medio de Ct aguas abajo
Artículo aceptado
distancia de la fuente aumentó en ambos años, pero se mantuvo por encima del umbral LOQ para
la mayoría de las distancias aguas abajo (Fig. 3). Esta relación implica que como
la distancia aguas abajo desde la fuente de eDNA aumenta, la concentración de eDNA en cada muestra
disminuye en una respuesta funcional, y mientras que la mayoría de los valores medios de Ct están por encima del
umbral para la detección positiva, es probable que los valores de Ct aún reflejen el salmón del Atlántico residual
concentraciones de eDNA. Por lo tanto, es posible utilizar la intensidad de la señal de eDNA residual en función de
Valores qRT-PCR Ct para inferir la presencia reciente y la ubicación aproximada del objetivo
especies. Por ejemplo, en nuestro estudio, el sitio de origen se identifica sin ambigüedades por un dramático
caída en el valor medio de Ct, incluso en 2015 donde las señales de eDNA después de que el punto de origen fue
relativamente alto (Fig. 3). En 2014, más sitios produjeron valores medios de Ct por debajo del LOQ probablemente
debido al muestreo más cercano al sitio de origen, lo que resulta en muestras que contienen mayor
concentraciones de eDNA diana a medida que transcurría menos tiempo y distancia. En general, el máximo
la distancia que produjo una señal de eDNA residual positiva en ambos años fue de 960 m río abajo
desde el sitio de origen (Fig. 3A). Además, la detección y localización de la fuente fue
posible para la especie objetivo incluso después de haber sido eliminada. En nuestro protocolo, la fuente
fue eliminado, pero en aplicaciones naturales la especie objetivo puede haberse movido fuera del
sido capturada y removida, o posiblemente consumida. Cuantificación y mapeo residual
Las señales de eDNA pueden ser aplicables para especies de baja abundancia, como especies en riesgo o especies recién
especies introducidas, ya que es probable que estén más localizadas en un área (por ejemplo, hábitat crítico),
imitando un sitio de origen o un área de origen con la señal de eDNA disminuyendo aguas abajo. Abundante
Es probable que las especies estén más dispersas espacialmente y repongan continuamente el eDNA en el
sistema, lo que resulta en señales fuertes que se extienden por todo el hábitat y dificultan la
identificar ubicaciones precisas de las especies.
En nuestro estudio, el eDNA residual fue detectable en el sitio de origen hasta 11,5 horas después
Artículo aceptado
Eliminación de la fuente de eDNA en un sistema de flujo. Aunque fuera del objetivo de este estudio,
Se tomaron muestras adicionales dos días después de la finalización de los experimentos en el
sitio de origen y no hubo evidencia de eDNA de salmón del Atlántico residual en las muestras en
ambos años, lo que indica que la persistencia a largo plazo del eDNA residual en los sistemas de flujo es
improbable. Basado en mesocosmos de laboratorio, Thomsen et al. (2012) informó haber detectado
sapo común de espuelas (Pelobates fuscus) y gran tritón crestado (Triturus cristatus) ADN electrónico
hasta 14 días después de la eliminación de la especie, mientras que Strickler et al. (2015) detectó rana toro
(Lithobates catesbeianus) eDNA hasta 54 días después de la eliminación de especies; ambos estudios utilizaron
mesocosmos de laboratorio. Caracol de barro de Nueva Zelanda (Potamopyrgus antípodarum) El eDNA fue
detectable 21 días después de la eliminación de especies en acuarios de laboratorio (Goldberg et al. 2013), y
salamandra gigante de Idaho (Dicamptodon aterrimus) eDNA se detectó hasta 8 días con
exposición al sol, y 11 días en tratamientos de sombra (Pilliod et al. 2014). Mientras nuestra ventana de
detección de eDNA residual fue del orden de unas pocas horas, nuestro experimento es novedoso en que
examina la detección de eDNA residual después de la eliminación de la fuente de eDNA dentro de un flujo natural
ecosistema. No tenemos conocimiento de ningún otro estudio que mida el eDNA residual en pacientes no controlados.
ríos Los ecosistemas que fluyen son a menudo puntos críticos para las especies de interés para la conservación, como los ríos
mantener una mayor diversidad de especies de peces en comparación con los lagos o estanques (Helfrich & Neves 2009),
y actuar como corredores de invasión para posibles invasores (Yamanaka & Minamoto 2016). Para
ejemplo, gobio redondo (Neogobius melanostomus) se ha extendido por los Grandes Lagos
incluida la dispersión a través de los afluentes (Kornis et al. 2012), y las carpas asiáticas
(Hipoftalmitisspp.) tienen un potencial corredor de invasión en la cuenca de los Grandes Lagos como un
resultado de los canales que unen el río Mississippi con el lago Michigan (Jerde et al. 2011). Por lo tanto, la
la dinámica del eDNA en los ecosistemas que fluyen es de vital importancia para identificar las especies objetivo
hábitat, y para estimar cuánto tiempo puede persistir el eDNA si se elimina la fuente.
Artículo aceptado
La capacidad de detectar especies acuáticas raras espacialmente localizadas, como especies en riesgo o
invasores acuáticos tempranos, es un desafío cuando se utilizan métodos convencionales que se basan en física
captura de individuos (Thomsen & Willerslev 2014) y tienen bajas probabilidades de detección.
El enfoque de eDNA no invasivo ofrece un enfoque de topografía alternativo, capaz de
detectando cantidades muy bajas de eDNA residual. Una vez que una especie objetivo es eliminada del
sistema, la concentración de eDNA se agotará rápidamente ya que ya no es repuesta por el eDNA
(Barnes et al. 2014), reduciendo así los falsos positivos. En sistemas de flujo como
ríos, la detección de eDNA es aún más débil debido a la migración aguas abajo de las moléculas de eDNA
resultando en dilución y degradación física (Fukumoto et al. 2015). demostramos que
El eDNA residual se puede utilizar para proporcionar una estimación muy precisa del eDNA objetivo.
ubicación de la fuente en un sistema de flujo no controlado, después de que la fuente de eDNA haya sido
eliminado del sistema. El uso de qRT-PCR también es más sensible que el tradicional end-
punto PCR que es menos probable que resulte en falsos negativos (Thomsen et al. 2012; Wilcox et al.
2013; Mc Kee et al. 2015). Esta técnica se puede utilizar como herramienta de levantamiento inicial en sistemas lóticos.
para determinar si y dónde se encuentra la especie objetivo, en qué manejo o
los esfuerzos de muestreo pueden enfocarse mejor en los sitios apropiados, ahorrando tiempo, costos y
y esfuerzo de conservación.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por la Red Canadiense de Especies Invasoras Acuáticas y un NSERC
Subvención Discovery a DDH. Un agradecimiento especial al Dr. Trevor Pitcher de la Universidad de Windsor
Artículo aceptado
para el uso de su Centro de Ecología de Restauración de Agua Dulce (LaSalle, ON, Canadá), Atlántico
agua de salmón y equipo, a Todd Leadley (Universidad de Windsor) por su ayuda en el campo
diseño e implementación de aparatos, y al Dr. Jan Ciborowski (Universidad de Windsor) por
equipo de campo y apoyo. El muestreo de campo y la ayuda de laboratorio fueron proporcionados por Jennifer
Smith, Sara Jamieson, Stacey McIntyre, Jason Lewis, Meghan Donovan, James Mumby,
Marco Hernández, Mattias Johansson, Sarah Johansson, Mariam Sameem y Ahmed
Sameem. Gracias al Dr. Subbarao Chaganti, Xiaoping He y Kyle Wellband del
Universidad de Windsor por el diseño del protocolo qRT-PCR y la discusión en curso de este proyecto.
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Artículo aceptado
Contribuciones de autor
KDB, RPW y DDH contribuyeron al concepto de investigación y al diseño de campo. KDB realizó
experimentos. KDB y DDH analizaron los datos de qRT-PCR. KDB, RPW y DDH escribieron y editaron el
manuscrito.
Accesibilidad de datos
Secuencias de ADN: números de acceso de Genbank KX078463-KX078468. Secuencias de ADN de Genbank utilizadas para comparar
productos secuenciadossalmo salarJQ390055.1 ysalmo truttaM97984.1. Información de respaldo: datos para la eficiencia de qRT-
PCR en el Apéndice S1, datos de qRT-PCR para muestras de 2014 (Fig. 3A) en el Apéndice S2 y datos de qRT-PCR para muestras de
2015 (Fig. 3B) en el Apéndice S3; disponible en Dryad doi:10.5061/dryad.5rf92.
Artículo aceptado
Cifras
Figura 1.Sitios de muestreo de eDNA de Little River para 2014 (círculos; N = 21) y 2015 (triángulos; N = 16).
El muestreo en 2014 comenzó en el sitio de origen (0 km) y se movió río abajo hasta 1,2 km. Los hexágonos
representan los controles de los ríos. El muestreo en 2015 comenzó 7,5 km río abajo y se movió río arriba
hacia el sitio de origen. Las detecciones de eDNA representan sitios con valores medios de Ct por debajo de
nuestro límite calculado del umbral de cuantificación de 44,0 ciclos.
Aceptado A cle
Figura 2.Serie de dilución de ADN de plantilla de PCR de 10 veces utilizando el conjunto de cebadores específicos de especie Salmo_Mito-
951 (Karlsson et al. 2012). Se muestran los valores medios de Ct (± SEM) para cada dilución por triplicado con
concentración de plantilla de partida inicial de 32 ng∙uL-1. LOQ a 44,0 ciclos.
Ar aceptado
Figura 3.Gráfica cúbica de los valores medios de Ct (± SEM) frente a la distancia desde la fuente de eDNA para (A) 2014, y
(B) 2015 con cada punto que muestra sitios de muestra en Little River. Los controles de río aguas arriba se
muestran como distancias negativas. La línea discontinua gris representa el umbral LOQ de 44,0 ciclos. Las
líneas continuas son las líneas de regresión cúbica ajustadas para 2014 (A; R2= 0,67,d.f.=17,PAGS = 0,00024)
y 2015 (B; R2= 0,49,d.f.=12,PAGS=0,037).
Figura 4.Alineación de secuencias de 2014 y 2015 eDNA Little River mitochondrial D-loop PCR
amplicones con salmón del Atlántico conocido (salmo salar; acceso a GenBank: JQ390055.1) y trucha
marrón (S. trutta; Acceso a GenBank: M97984.1) secuencias. Las regiones resaltadas indican diferencia de
Aceptado
bases, los guiones representan brechas de secuencia y el nucleótido N representa todas las bases o una
llamada de base desconocida.

Residual eDNA Detection Sensitivity Assessed by Quantitative Real Time PCR in A River Ecosystem - En.es

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Residual eDNA Detection Sensitivity Assessed by Quantitative Real Time PCR in A River Ecosystem - En.es

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Fecha de recepción: 17 de abril de 2016

PCR cuantitativa en tiempo real en un ecosistema fluvial

1Departamento de Biología, Instituto de Investigación Ambiental de los Grandes Lagos, Universidad

Título consecutivo:Análisis qRT-PCR de eDNA residual

Palabras clave: ADN ambiental, qRT-PCR, río, persistencia de ADN, residual

sistemas, y la fuerza de la señal de eDNA residual relativa puede permitir la determinación de la

el momento de la presencia de las especies objetivo.

Detección de especies acuáticas sin utilizar métodos de captura convencionales como

ecosistema), es de particular importancia cuando se monitorea la distribución de especies raras

2013). La integración de técnicas de genética molecular y ecología acuática (análisis eDNA)

riesgo de dañar a las personas o a su entorno.

especies detectadas incluyen la rana toro americana (Lithobates catesbeianus) en el suroeste

inferir la presencia/ausencia de especies, no proporciona información sobre la intensidad de la señal, ni

estimación cuantitativa de la sensibilidad de detección. Cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real

correlación entre la concentración de eDNA y la abundancia de anfibios. plantilla de ADN electrónico

tasa de degradación del ADN influenciada por la temperatura, el metabolismo microbiano y

descomposición química/física (Barnes & Turner 2016). La relación entre el

concentración de eDNA y la abundancia de especies de destino se vuelve más compleja en el flujo

dilución y descomposición física/química (Jane et al. 2015). No obstante, qRT-PCR

hábitats (es decir, sobreexplotados o extirpaciones potenciales), número de especies objetivo y

la dinámica del eDNA residual de baja concentración en sistemas de flujo no controlados.

y la degradación asociada con el flujo de moléculas de eDNA reduce la retención. tal

Área de estudio y especies de estudio

no contiene la especie objetivo experimental, salmón del Atlántico, y la accesibilidad para

El experimento se repitió dos veces, una en 2014 y otra en 2015.

aproximadamente 200L, se instalaron en un terreno al lado de Little River (42o16'56.1” N, 82o54'45,6” O;

caudal a una tasa de descarga de aproximadamente 2,3 x 10-6metro3∙s-1(del 22 al 24 de agosto de 2014);

(aproximadamente de 10 a 15 cm por debajo de la superficie) en 500 ml esterilizados (lejía al 10 %) de Nalgene

4 muestras cada 60 m. El muestreo tomó aproximadamente 5.5 horas, finalizando aproximadamente

Experimento de 2015: el estudio se replicó en 2015 utilizando la misma configuración y eDNA

en el sitio de origen (0 m; N = 3), y 60 m (N = 3) río arriba para un total de 6 controles de río. En

la muestra no se utilizaría en nuestro análisis debido a la posible contaminación. Embudos de filtro

se colocaron en tubos Falcon de 15 ml y se almacenaron a -20oC hasta la extracción de ADN.

Para la extracción de ADN se cortaron filtros (muestras de río y controles instrumentales)

cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) y 400 µL de bromuro de cetiltrimetilamonio

golpes∙minuto-1(configuración de velocidad 3 para el Mini-Beadbeater-24; Fisher Scientific LTD, BioSpec.)

agitó el sobrenadante con un volumen igual de cloroformo-alcohol isoamílico para eliminar

El sobrenadante se combinó con volúmenes iguales de isopropanol y 0,6x volumen de 3M

Las muestras de ADN se almacenaron a -20oC hasta el análisis.

Utilizamos cebadores que apuntan al genoma mitocondrial debido a la estabilidad de

salmo trutta(ambas especies no se encuentran en Little River).

la dilución disminuirá la concentración de elementos inhibidores en la muestra. qRT-PCR fue

0,2 mg∙mL-1BSA, 0,1 unidadesTaqpolimerasa y 2,0 μL de eDNA de plantilla. Sin plantilla

PCR, se asignó a la muestra un valor de Ct de 55 (número máximo de ciclos). Un subconjunto de

concentraciones que van desde 32 ng∙µL-1a 3,2x10-8ng∙µL-1y ajustado a un logaritmo

Eficiencia = [10(-1/pendiente)– 1] x 100%

Señal de detección de eDNA (valor Ct) y distancia.

sitio (Fig. 1).

umbral (0 m, 60 m, 180 m, 600 m y 960 m) con una curvatura positiva global

valor por debajo

depredación, dispersión o migración). En tales situaciones, los estudios de eDNA se basan en la

El eDNA residual es presumiblemente moléculas de eDNA menos sujetas a factores ambientales

ciclos de nuestro protocolo, se asignó un valor de Ct de 55 a las réplicas biológicas y técnicas.

sido capturada y removida, o posiblemente consumida. Cuantificación y mapeo residual

identificar ubicaciones precisas de las especies.

Se tomaron muestras adicionales dos días después de la finalización de los experimentos en el

El enfoque de eDNA no invasivo ofrece un enfoque de topografía alternativo, capaz de

sistema, la concentración de eDNA se agotará rápidamente ya que ya no es repuesta por el eDNA

resultando en dilución y degradación física (Fukumoto et al. 2015). demostramos que

para determinar si y dónde se encuentra la especie objetivo, en qué manejo o

diseño e implementación de aparatos, y al Dr. Jan Ciborowski (Universidad de Windsor) por

Marco Hernández, Mattias Johansson, Sarah Johansson, Mariam Sameem y Ahmed