Un examen de electroferogramas que contienen datos de STR generalmente revela la presencia de

pequeños picos de varias bases más cortos que cada pico de alelo de STR. Estos picos de "producto
de tartamudeo" son el resultado del proceso de PCR cuando los loci STR se copian mediante un
polimetro de ADN. En la literatura, este producto de tartamudez también se conoce como una
banda de sombra o un producto de deslizamiento de ADN polimerasa (Hauge & Litt 1993).

La cantidad de producto de tartamudeo puede caracterizarse en términos de proporciones de

tartamudeo o proporciones de tartamudeo (Gill et al. 2000, Brookes et al. 2012). Los cálculos de
las proporciones de tartamudeo implican dividir la altura de un pico de tartamudeo por la altura
de su alelo correspondiente. Las proporciones de tartamudeo, que no se usan con tanta
frecuencia, reflejan la altura de un pico de tartamudeo dividido por la altura del producto alélico
total.

El producto alélico total es la suma de un alelo y su (s) tartamudeo (s) altura (s) pico (s). Aunque las
alturas máximas se mencionan aquí, las áreas máximas también se pueden usar en los cálculos,
aunque esto rara vez se hace con datos de electroforesis capilar.

La figura 3.10 muestra múltiples productos de tartamudeo alrededor de un alelo DYS481 que
contiene 27 repeticiones CTT. Este ejemplo se usa aquí porque tiene un grado de tartamudeo
inusualmente alto debido a su motivo de repetición más corto (trinucleótido en lugar del
tetranucleótido más comúnmente usado) y su gran número de unidades de repetición
ininterrumpidas (en este caso 27 repeticiones CTT). Además, como un cromosoma Y de copia
única STR, debe haber un solo alelo con DYS481 en muestras de una sola fuente.

Tenga en cuenta que se producen picos adicionales en ambos lados del pico primario del alelo 27.
Los picos "N-3" (alelo menos tres nucleótidos) y "N-6" (alelo menos seis nucleótidos) contienen
una y dos unidades repetidas menos, respectivamente, que el alelo de longitud completa. En
ocasiones, estos picos se denominan "tartamudeo negativo", "tartamudeo posterior" o
"tartamudeo inverso". El pico "N + 3" (alelo más tres nucleótidos) contiene una unidad de
repetición adicional y se ha denominado "tartamudeo positivo" o "tartamudeo directo" (Gibb et al.
2009).

El nivel de tartamudeo disminuye cuando se aleja del alelo primario, de modo que para los
productos de tartamudeo inverso la altura del pico N-3 es 29.4% de la altura del pico alelo y la
altura del pico N-6 es 4.1% (82 unidades de fluorescencia relativa ( RFU) en comparación con 1994
RFU para el pico del alelo). El tartamudeo directo siempre es menor que el tartamudeo inverso
(2.7% vs. 29.4%), y muchas veces con repeticiones de tetranucleótidos puede no observarse en
absoluto.

Un estudio detallado realizado por la Real Policía Montada de Canadá proporcionó porcentajes de
tartamudeo en términos de alturas máximas y áreas pico para 325 muestras de casos y 754
muestras de bases de datos (Leclair et al. 2004). Para los valores de tartamudeo de altura máxima
D18S51, este estudio observó una mediana más tres desviaciones estándar de 16.2% de
tartamudeo en muestras de bases de datos y 15.6% de tartamudeo en muestras de casos.
Un examen minucioso de los electroferogramas que contienen datos de STR generalmente revela
la presencia de pequeños picos de varias bases más cortos que cada pico de alelo de STR (Figura
6.1). Estos picos de "producto de tartamudeo" resultan del proceso de PCR cuando los loci STR se
copian mediante una ADN polimerasa. En la literatura, este producto de tartamudez también se
conoce como una banda de sombra o un producto de deslizamiento de ADN polimerasa (Hauge y
Litt 1993).

El análisis de secuencia de productos de tartamudeo del locus de repetición de tetranucleótidos

VWA ha demostrado que contienen una unidad de repetición menor que el pico del alelo principal
correspondiente (Walsh et al. 1996). Los productos de tartamudeo que son más grandes en una
unidad de repetición que los alelos correspondientes rara vez se sirven en los loci STR de
repetición de tetranucleótidos de uso común.

Se han reportado productos de tartamudeo en la literatura desde que se describieron por primera
vez los STR (microsatélites). El mecanismo principal que se ha propuesto para explicar la existencia
de productos de tartamudeo es el mal emparejamiento de hebras deslizantes (Hauge y Litt 1993,
Walsh et al. 1996). En el modelo de emparejamiento erróneo de hebra deslizada, una región del
complejo cebador-plantilla se desunirá durante la extensión del cebador, permitiendo el
deslizamiento de la hebra cebadora o plantilla de tal manera que una repetición forme un bucle no
emparejado con base (Hauge y Litt 1993). La consecuencia de este ciclo de repetición es un
producto de PCR acortado que es menor que el amplicón primario (alelo STR) en una sola unidad
de repetición (Figura 6.2).

IMPACTO DE LOS PRODUCTOS STUTTER EN LA INTERPRETACIÓN DE DATOS

Los productos Stutter impactan la interpretación de los perfiles de ADN, especialmente en los
casos en que dos o más personas pueden haber contribuido a la muestra de ADN (ver Capítulo 7).
Debido a que los productos de tartamudeo son del mismo tamaño que los productos de PCR de
alelos reales, puede ser difícil determinar si un pico pequeño es un alelo real de un contribuyente
menor o un producto de tartamudeo de un alelo adyacente.

La interpretación de la mezcla requiere una buena comprensión del comportamiento de los

productos de tartamudeo en muestras de fuente única. A menudo, un laboratorio cuantificará el
porcentaje de alturas máximas del producto de tartamudeo en comparación con sus alturas
máximas de alelos correspondientes. El porcentaje de formación de producto de tartamudeo para
un alelo se determina simplemente dividiendo la altura del pico de tartamudeo por la altura del
pico del alelo correspondiente.

Una gráfica de los alelos de cada uno de los 13 loci STR estándar revela la variación en el
porcentaje de tartamudeo para cada locus, así como los alelos del mismo locus (Figura 6.3). Tal
argumento ilustra varios principios importantes. Primero, cada locus tiene una cantidad diferente
de formación de productos de tartamudeo. Segundo, los alelos más largos para un locus STR
exhiben un mayor grado de tartamudeo que los alelos más pequeños para el mismo locus. En
tercer lugar, el porcentaje de tartamudeo con las repeticiones de tetranucleótidos estándar es
generalmente inferior al 15% para los 13 loci STR centrales de CODIS en condiciones de
amplificación estándar.

Tartamudeo alelo-específico

Las cantidades de producto de tartamudeo aumentan con la longitud del alelo. La Tabla 3.4
muestra los porcentajes de tartamudeo del producto con alelos D18S51 que varían en longitud de
12 a 20 repeticiones AGAA en función de los resultados generados en el Instituto Nacional de
Estándares y Tecnología (NIST) con el kit PowerPlex 16 de Promega. Tenga en cuenta el aumento
constante en el porcentaje medio de tartamudeo con la duración de la repetición. Mientras que el
alelo 12 tiene un tartamudeo medio del 4,8%, el alelo 20 tiene un tartamudeo medio del 10,6%.
Con un porcentaje de tartamudeo promedio de locus general de 7.7 (+-1.9)%, un valor promedio
más tres desviaciones estándar sería 13.4%, que está cerca del filtro de tartamudeo D18S51
recomendado por Identifiler Plus de 13.7% que se calculó de manera similar (Tabla 3.3)

Filtros de tartamudeo

Los estudios de validación realizados en un laboratorio ayudan a definir el porcentaje máximo de

tartamudeo para cada locus.

Sin embargo, si el pico del alelo objetivo está fuera de escala, entonces el producto de tartamudeo
puede parecer más grande de lo que realmente es en relación con el pico del alelo
correspondiente (Moretti et al. 2001).

Para la interpretación de los datos, a menudo se establece un umbral de interpretación del

porcentaje de tartamudeo de límite superior para cada locus como tres desviaciones estándar por
encima del porcentaje de tartamudeo promedio normalmente observado en ese locus, aunque se
han utilizado una variedad de enfoques. Alternativamente, algunos laboratorios prefieren aplicar
un filtro de tartamudeo universal, generalmente en el rango de 10% a 20%. Un filtro de
tartamudeo implementado por software de genotipado elimina automáticamente las etiquetas de
pico en cualquier pico encontrado dentro del rango de tamaño designado (por ejemplo, 4 pb + -
0.25 pb) y altura relativa (por ejemplo, 10% a 20%) de los picos de alelo STR.

El software de genotipado utiliza filtros de tartamudeo para eliminar las designaciones de alelos de
posibles productos de tartamudeo. Los umbrales establecidos para estos filtros de tartamudeo
pueden variar según los datos de validación utilizados y el método (modelo estadístico) utilizado
para establecerlos. La Tabla 3.3 enumera algunos de los valores de filtro de tartamudeo
recomendados por el fabricante especificados para D18S51 en varios kits STR. Estos valores de
filtro de tartamudeo oscilan entre "12.89%" con el kit Identifiler Direct y "18%" con MiniFiler.
Tenga en cuenta que en algunos casos con los kits enumerados en la Tabla 3.3, el fabricante del kit
decidió utilizar el tartamudeo más alto observado para establecer el valor del filtro de tartamudeo,
mientras que en otros casos se usó el tartamudeo promedio más tres veces la desviación estándar.

CANTIDAD DE STUTTER

Tartamudeo delantero

Los productos de tartamudeo que son de mayor tamaño en una unidad de repetición que los
alelos correspondientes solo se observan raramente en los loci STR de repetición de
tetranucleótidos de uso común. Sin embargo, ocasionalmente este tartamudeo llamado "hacia
adelante" o "N + 4" se ha informado en el rango de 1% a 3% del alelo STR tetranucleotídico
asociado (Gibb et al. 2009). Los loci de trinucleótidos exhiben una mayor cantidad de
deslizamiento hacia adelante (tartamudeo N + 3) como se observa con el locus DYS392 (Mulero et
al. 2006) y los ejemplos de DYS481 que se muestran en la Figura 3.10. El locus trinucleotídico STR
autosómico D22S1045, que forma parte de los loci centrales europeos expandidos (Gill et al.
2006a, 2006b), puede mostrar tartamudeo N + 3 hacia adelante al nivel del 5% o más. Un grupo
estableció su umbral de tartamudeo N+3 para D22S1045 en 7.27% basado en 2,153 puntos de
datos en perfiles de ADN de referencia (Westen et al. 2012). Las características de tartamudeo de
locus individuales deben tenerse en cuenta al realizar la interpretación de la mezcla de ADN. A
veces, el pull-up desde un pico alto en un canal de color adyacente puede dar lugar a la aparición
de un tartamudeo hacia adelante que no es real.

Una comparación de los porcentajes de tartamudeo con el kit Identifiler versus Identifiler Direct e
IdeNtifiler Plus encontró valores ligeramente más altos de tartamudeo directo con los nuevos kits
(Sailus et al. 2012). Estos nuevos kits, Identifiler Direct e Identifiler Plus, poseen mayores
concentraciones de magnesio en su tampón de PCR para ayudar a superar los inhibidores de PCR.
El equipo de investigación de Applied Biosystems planteó la hipótesis de que estos niveles más
altos de magnesio pueden reducir la rigurosidad de la unión y, por lo tanto, permitir una extensión
más eficiente de las cadenas de ADN desalineadas después de los eventos de deslizamiento de la
cadena (consulte la siguiente sección). Este fenómeno conduciría a productos de mayor
tartamudeo. En un estudio de tartamudeo Identifiler Plus de 1,621 picos en la posición N + 4, se
realizaron 24 observaciones con tartamudeo N + 4 superior al 2% (Sailus et al. 2012). De los 15 loci
repetidos de tetranucleótidos amplificados con Identifiler Plus, D19S433 tuvo el promedio más
alto de tartamudeo directo N + 4 (1.25%) y TH01 el más bajo (0.44%). Es importante tener en
cuenta que con un pico de alelo padre que posee una altura de 5000 RFU, un pico de tartamudeo
N + 4 del 2% solo tendría una altura de 100 RFU. Dependiendo del umbral analítico utilizado,
muchos picos de tartamudeo directo pueden no detectarse con alelos por debajo del rango de
1000 RFU a 2000 RFU a menos que los efectos estocásticos eleven los niveles de tartamudeo
observados. Por lo tanto, el tartamudeo no es probable que sea un problema importante con el
análisis e interpretación de datos en la mayoría de los casos. Sin embargo, las variaciones en los
niveles de tartamudeo que son posibles con los nuevos kits STR requieren estudios de validación
interna con condiciones específicas en uso en un laboratorio.

Si bien los kits Identifiler® Direct e Identifiler® Plus tienen las mismas secuencias de unión del
cebador que el kit Identifiler®, contienen una mayor concentración de magnesio. En general, las
concentraciones más altas de magnesio dan como resultado porcentajes de tartamudeo más altos
que se cree que son el resultado de una rigurosidad de unión reducida que permite una extensión
más eficiente de cadenas de ADN desalineadas después de eventos de deslizamiento de cadena.

Posible mecanismo para la formación de productos de tartamudeo

Se han reportado productos de tartamudeo en la literatura desde que se describieron por primera
vez los STR (microsatélites). El mecanismo principal que se ha propuesto para explicar la existencia
de productos de tartamudeo es el mal emparejamiento de hebras deslizantes (Levinson y Gutman
1987, Hauge y Litt 1993, Walsh et al. 1996). En el modelo de emparejamiento erróneo de hebras
deslizadas, una región del complejo de plantillas primarias se desempareja durante la extensión
del cebador, lo que permite el deslizamiento del cebador o la hebra de la plantilla de modo que
una repetición forme un bucle no emparejado con bases (Hauge y Litt 1993).

La consecuencia de este ciclo de repetición es un producto de PCR acortado que es menor que el
amplicón primario (alelo STR) en una sola unidad de repetición (Figura 3.11). El análisis de
secuencia de productos de tartamudeo del locus de repetición de tetranucleótidos vWA encontró
que contienen una unidad de repetición menor que el pico del alelo principal correspondiente
(Walsh et al. 1996). En los ejemplos ilustrados hasta ahora, tanto D18S51 como DYS481 contienen
unidades de repetición simples. Por lo tanto, el número de alelo también refleja el número total
de repeticiones. Sin embargo, este no es siempre el caso con muchos loci STR complejos, como
D21S11, donde la longitud total del alelo puede contener diferentes secuencias internas. Tales loci
pueden poseer alelos con diferentes longitudes de tramos ininterrumpidos de repeticiones. Si un
alelo contiene múltiples secciones repetidas interrumpidas por una unidad de repetición no
consensuada o una secuencia conservada, entonces los niveles de tartamudeo serán típicamente
más bajos.

Por ejemplo, el alelo 9.3 de TH01 posee cinco repeticiones [TCAT], una repetición parcial de CAT y
luego cuatro repeticiones [TCAT] (o seis [AATG], una repetición parcial de ATG y tres repeticiones
[AATG], según la cadena que se examine ) Las características de porcentaje de tartamudeo de un
alelo TH01 9.3 están más cerca de un alelo 5 que de un alelo 9 o un alelo 10.

En varios estudios se observó un tipo de correlación de la longitud de las porciones

ininterrumpidas de la región de repetición de STR con la cantidad de tartamudeo (Walsh et al.
1996, Lazaruk et al. 2001, Klintschar & Wiegand 2003). Sin embargo, no fue hasta 2012 cuando se
introdujo el término "estiramiento ininterrumpido más largo" (LUS) para describir el
comportamiento de la formación de productos de tartamudeo (Brookes et al. 2012). LUS se define
como el tramo más largo de motivos básicos de repetición dentro de un alelo. Por lo tanto, en el
ejemplo TH01 a continuación, el alelo 9.3, que tiene cinco [TCAT] y cuatro [TCAT], tendría un LUS
igual a cinco. Este tipo de correlación LUS encaja bien en los loci STR. LUS se correlaciona mejor
con la proporción de tartamudeo que la designación de alelo basada en el número total de
unidades repetidas (Figura 3.12).

Muchos de los estudios de LUS hasta la fecha han utilizado valores promedio de LUS basados en la
información disponible en STRBase o el Apéndice 1 de Temas avanzados en tipificación forense de
ADN: metodología (Butler 2012). La caracterización LUS más precisa requiere la secuenciación de
alelos STR individuales, lo que requiere mucho tiempo con los métodos de secuenciación
tradicionales.

Impacto de los productos Stutter en la interpretación de datos

Los productos Stutter impactan la interpretación de los perfiles de ADN, especialmente en los
casos en que dos o más individuos pueden haber contribuido a la muestra de ADN (ver Capítulo 6).
Debido a que los productos de tartamudeo tienen la misma longitud que los productos de PCR de
alelos reales, puede ser difícil determinar si un pico pequeño es un alelo real de un contribuyente
menor de la muestra original o un producto de tartamudeo de un alelo adyacente creado durante
el proceso de amplificación de PCR.

La interpretación de mezclas requiere una buena comprensión del comportamiento de los

productos de tartamudeo en muestras de fuente única (SWGDAM 2010). Los estudios de
validación interna cuantifican el porcentaje de alturas máximas de productos de tartamudeo en
comparación con sus alturas máximas de alelos correspondientes. El porcentaje de formación de
producto de tartamudeo para un alelo se determina simplemente dividiendo la altura del pico del
tartamudeo por la altura del pico del alelo correspondiente como se realizó con el ejemplo DYS481
en la Figura 3.10.

Aunque el tartamudeo generalmente se considera un aspecto indeseable del tipeo STR, la

existencia de productos tartamudos puede ayudar a la interpretación de datos en algunas
situaciones. Los artefactos de recopilación de datos, como picos y picos de pull-up de datos fuera
de escala en otro canal de tinte, se pueden distinguir de la señal fluorescente de los alelos STR
verdaderos porque los picos y picos de pull-up no tendrán ningún producto de tartamudeo
asociado con ellos.

Por lo tanto, la presencia de picos de tartamudeo, aunque no es deseable en términos de

interpretación de mezclas limpias, en realidad ayuda a confirmar los alelos STR verdaderos. Por
supuesto, la señal para el verdadero alelo debe ser lo suficientemente alta como para detectar el
tartamudeo. Por lo tanto, si se espera un producto de tartamudeo en alrededor del 10% de un
alelo verdadero, entonces el alelo necesitará tener una altura máxima de al menos 500 RFU para
detectar un producto de tartamudeo cuando un umbral analítico de 50 RFU esté en su lugar.

Modelar y predecir el tartamudeo

El uso de un umbral de tartamudeo fijo (p. Ej., 12%) no refleja la naturaleza específica de locus y
alelos de la formación de productos de tartamudeo. Para mejorar las capacidades de los métodos
probabilísticos de genotipado, se están realizando esfuerzos para modelar el tartamudeo con el fin
de predecir los niveles potenciales de tartamudeo de la manera más efectiva posible (Bright et al.
2013a, 2013b, 2014, Brookes et al. 2012, Puch-Solis et al. 2013).

Las unidades de repetición STR con un mayor contenido de AT producen mayores cantidades de
tartamudeo probablemente debido a un enlace de hidrógeno más débil entre los nucleótidos A y
T, que tienen dos enlaces de hidrógeno en comparación con los tres enlaces de hidrógeno entre
pares de bases GC (Schlötterer y Tautz 1992, Brookes et al. 2012).

Además, se ha demostrado que el uso del producto alélico total, que es la suma del alelo
verdadero más todos los productos de tartamudeo observables, es efectivo para modelar la
cantidad de tartamudeo (Bright et al. 2013a). Como se discutió anteriormente, el factor más
importante para correlacionar el porcentaje de tartamudeo parece ser el valor LUS (Figura 3.12).

Se desarrolló un modelo de regresión lineal para predecir las alturas de tartamudeo Y-STR
utilizando la altura del pico alelo y parental como variables explicativas (Andersen et al. 2011). Los
autores de este estudio concluyeron que el uso de un único umbral de tartamudeo por locus no es
óptimo porque las tasas de tartamudeo son específicas de los alelos y difieren en función de la
cantidad de ADN molde. Si se utilizan valores altos de tartamudeo para los filtros de software, en
muchos casos los datos utilizables se desechan durante la interpretación de la mezcla de ADN.
Esfuerzos para reducir la formación de productos de tartamudeo

La cantidad de formación de producto de tartamudeo puede reducirse cuando se usan marcadores

STR con unidades de repetición más largas (por ejemplo, repeticiones de pentanucleótidos en
lugar de repeticiones de trinucleótidos), alelos STR con unidades de repetición imperfectas,
aditivos de PCR como sorbitol o betaína, y posiblemente con ADN polimerasas que poseen una
procesividad más rápida .

A fines de la década de 1990, Promega Corporation desarrolló varios loci repetidos de

pentanucleótidos en un esfuerzo por producir marcadores STR que exhiben bajas cantidades de
productos de tartamudeo para ayudar en la interpretación de la mezcla (Bacher y Schumm 1998).
Los primeros siete loci descubiertos fueron etiquetados Penta A a Penta G. Penta E se incorporó al
sistema PowerPlex 2.1, y el trabajo inicial demostró un porcentaje promedio de tartamudeo de
menos del 1% con Penta E (Bacher et al. 1999). Penta D y Penta E se convirtieron en parte del kit
PowerPlex 16 (Krenke et al. 2002) y en varios kits Promega posteriores, incluido PowerPlex Fusion.

Los alelos para un locus STR con un motivo de repetición algo variable exhiben una menor
cantidad de formación de productos de tartamudeo. Esto puede explicarse por la información de
estiramiento ininterrumpida más larga discutida anteriormente en este capítulo. Por ejemplo, el
motivo de repetición común para el marcador STR TH01 es AATG.

Sin embargo, con el alelo 9.3, hay una secuencia de nucleótidos ATG presente en el medio de la
región repetida (Puers et al. 1993). Cuando la secuencia de repetición del núcleo se ha
interrumpido, la formación del producto de tartamudeo se reduce en comparación con los alelos
que son similares en longitud pero que poseen secuencias de repetición del núcleo
ininterrumpidas. Este hecho se ha demostrado con resultados de secuenciación de varios alelos
vWA (Walsh et al. 1996).

Applied Biosystems presentó varias patentes sobre "Métodos para la reducción del tartamudeo en
la amplificación de microsatélites" (Coticone & Bloch 2004, 2005, 2007). Estas patentes incluyen la
adición de sorbitol a la reacción de PCR para reducir el tartamudeo D2S1338 del 6,7% al 4,5%
(Coticone & Bloch 2004). Algunas de las otras patentes mencionan la adición de betaína también
para ayudar a reducir la tartamudez.

Por lo general, la formación de productos de tartamudeo aumenta cuando se amplifican niveles

bajos de plantilla de ADN con números elevados de ciclos de PCR debido a efectos estocásticos
(por ejemplo, Butler 2012, Figura 11.2). Se descubrió que la disminución de la temperatura de
recocido / extensión durante la PCR reduce las proporciones de tartamudeo al amplificar muestras
de ADN de plantilla baja (Seo et al. 2014).

La cantidad de tartamudeo puede estar relacionada con la procesividad de la ADN polimerasa, o

con qué rapidez copia la cadena de plantilla. Se ha demostrado que los productos Stutter
aumentan en relación con sus alelos correspondientes con una polimerasa más lenta (Walsh et al.
1996). Una polimerasa más rápida puede copiar las dos cadenas de ADN antes de que se puedan
separar y volver a recocer sin registro durante la extensión del cebador.
Sin embargo, el trabajo reciente con la amplificación rápida por PCR de los loci STR con nuevas
ADN polimerasas rápidas no ha reducido significativamente la formación de productos de
tartamudeo observados con la procesividad de 50 a 60 bases de la ADN polimerasa Taq (Laurin y
Frégeau 2012).

Tartamudeo Tendencias y principios

Una superposición de información de múltiples loci STR revela variación en el porcentaje de

tartamudeo para cada locus y alelo (Figura 3.13). Nuevamente, como en la Figura 3.10, los alelos
Y-STR se usan para simplificar el problema de tener que separar alelos heterocigotos adyacentes
con loci autosómicos STR. En otras palabras, el tartamudeo no está enmascarado por un alelo
hermano en Y-STR ya que solo hay un solo alelo amplificado, con la excepción de la mayoría de las
muestras amplificadas con el locus Y-STR de múltiples copias DYS385a / b.

La figura 3.13 ilustra varios principios importantes al superponer el% de tartamudeo (eje y) en el
número de alelo (eje x), que representa un número putativo de unidades de repetición STR. La
figura 3.13 solo muestra el tartamudeo inverso observado con estos alelos Y-STR. Primero, cada
locus tiene una cantidad diferente de formación de productos de tartamudeo. El tetranucleótido
se repite con el mismo número de repeticiones que se agrupan bien juntos en la esquina inferior
izquierda del gráfico.

Segundo, los alelos más largos para un locus STR exhiben un mayor grado de tartamudeo que los
alelos más pequeños para el mismo locus. Por ejemplo, los alelos DYS390 que varían de 21 a 25
repeticiones aumentan constantemente de aproximadamente 6% de tartamudeo a 10% de
tartamudeo.

Tercero, las pendientes de las líneas que conectan el tartamudeo medido para los alelos en cada
locus STR muestran una buena correlación entre el número creciente de repeticiones y el motivo
central de repetición de cada locus. Por lo tanto, la pendiente para los alelos DYS448, que posee
un motivo de repetición de hexanucleótidos, es casi horizontal entre los alelos DYS448 observados
que contienen de 18 a 22 repeticiones (parte inferior central del gráfico), mientras que la
pendiente del tartamudeo para los alelos DYS481, que es un trinucleótido repetir, es mucho más
pronunciada con sus 21 a 29 alelos repetidos (parte superior del gráfico).

Cuarto, en algunos casos se observa una disminución en el porcentaje de tartamudeo al aumentar

la longitud del alelo dentro de un locus. El más obvio en la Figura 3.13 es el alelo 23 en DYS635,
que cae a aproximadamente un 5% de tartamudeo, en comparación con el alelo 22 que está más
cerca del 9% de tartamudeo. Esto probablemente se deba a un cambio en el tramo ininterrumpido
de repeticiones más largo del DYS635, según lo observado por investigadores en Copenhague
(Olofsson et al. 2012). Este grupo danés señaló en su conjunto de datos que cuando un alelo
DYS635 "23" tenía un LUS de 9, entonces la tasa media de tartamudeo era del 5,1%, mientras que
para el mismo alelo de longitud total que poseía un LUS de 13, entonces la tasa media de
tartamudeo se incrementó a 8.8% (Olofsson et al. 2012). Locus DYS389II, que tiene los alelos más
largos en la Figura 3.13 (más a la derecha en el gráfico), es realmente dos secciones separadas, y
por lo tanto, el LUS es aproximadamente la mitad de la longitud total del alelo. Se esperaría que
un locus STR de repetición de tetranucleótidos con alelos LUS que oscilan entre 28 y 32
repeticiones tenga un mayor% de tartamudeo.

El quinto y último principio para deducir de la figura 3.13 es que el porcentaje de tartamudeo con
los loci de repetición de tetranucleótidos es inferior al 15% en condiciones de amplificación
estándar. Por lo tanto, al igual que con los loci autosómicos STR, el 15% sirve como un filtro de
tartamudeo bastante efectivo.

A continuación se incluye un resumen de la formación de productos de tartamudeo:

• Principalmente una unidad de repetición más pequeña que el pico del alelo principal
correspondiente;

• Típicamente menos del 15% de la altura del pico del alelo correspondiente;

• La cantidad de tartamudeo depende del lugar, así como de las condiciones de PCR y la
polimerasa utilizada;

• La propensión al tartamudeo disminuye con unidades de repetición más largas (las repeticiones
de pentanucleótidos <tetra- <tri- <dinucleótidos);

• El tramo ininterrumpido más largo de repeticiones impacta la formación de productos de

tartamudeo;

• La cantidad de tartamudeo es mayor para alelos más largos dentro de un locus;

• La cantidad de tartamudeo es menor si la secuencia de repeticiones del núcleo se interrumpe

(por ejemplo, repetición compuesta);

• La cantidad de tartamudeo aumenta al amplificar niveles bajos de plantilla de ADN debido a los
efectos estocásticos.

PICOS FUERA DE LA ESCALA ALÉLICA Y PATRONES DE TRES BANDAS

Ocasionalmente, nuevos alelos raros pueden caer fuera del rango de alelos que abarca la escalera
alélica de locus. Si estos picos caen entre dos loci STR en un conjunto multiplex, pueden ser
difíciles de asignar a un locus particular a menos que la prueba se realice con conjuntos de
cebadores específicos de locus individuales o un multiplex diferente. Estos alelos extremos "fuera
de la escalera" se pueden confirmar con la amplificación de un soloplex de los dos loci en el
multiplexado del nuevo alelo. Alternativamente, la muestra podría amplificarse nuevamente
usando un múltiplex separado donde los loci están presentes en un orden diferente. Por ejemplo,
si se observó un producto de PCR entre los rangos alelos típicos VWA y D16S539 cuando se usa el
kit SGM Plus, entonces podría ser un alelo VWA grande o un alelo D16S539 pequeño, lo cual es
dudoso porque el alelo 5 es el más pequeño en La escalera D16S539. Se podría usar un kit
diferente, como PowerPlex 16, en esta misma muestra para ayudar a abordar la fuente del nuevo
alelo, ya que los loci se unen en una combinación diferente.

Con PowerPlex 16, un gran alelo de VWA aparecería entre los rangos de alelos esperados de VWA
y D8S1179, pero un pequeño alelo D16S539 caería entre D7S820 y D16S539 (ver Figura 5.4).

Los patrones de tres bandas o tri-alélicas a veces se observan en un solo locus en un perfil STR
múltiple. Estos picos adicionales no son el resultado de una mezcla, sino que son artefactos
reproducibles de la muestra. Se sabe que ocurrencias cromosómicas adicionales o mutaciones en
el punto cebador ocurren y dan como resultado un patrón de tres bandas (Crouse et al. 1999). Por
ejemplo, se han observado patrones de tres bandas en la línea celular 9948 con CSF1PO y en la
línea celular K562 con D21S11 (véase el cuadro 7.1 de D.N.A.).

Los tres picos o bandas vistos en un locus particular pueden o no tener la misma intensidad. Si
bien los patrones de tres bandas de TPOX informados por Crouse y sus compañeros de trabajo
(1999) fueron aproximadamente iguales en intensidad (similar a la Figura 6.7a), también hay
ocasiones en que se producen patrones triélicos con picos de intensidad desigual. En la Figura
6.7b, una suma de dos de los alelos es aproximadamente equivalente en cantidad como el tercer
alelo como se ve en la Figura 6.7b para D18S51. Las alturas máximas para los alelos 14 y 15 cuando
se agregan juntas son similares a la cantidad que el alelo D18S51 22. Por lo tanto, es probable que
los alelos 14 y 15 provengan de un progenitor mientras que el alelo de 22 repeticiones proviene
del otro. Probablemente hay algún tipo de duplicación cromosómica para la región que rodea el
marcador D18S51 en este individuo. Tenga en cuenta que en este ejemplo los otros loci STR
además de D18S51 tienen dos picos de intensidad similar, lo que sugiere que no es probable una
mezcla de muestra (ver Capítulo 7).

Se han reportado más de 50 patrones tri-alélicos diferentes en los 13 loci CODIS STR y la mayoría
de ellos se han visto en TPOX y FGA. Puede encontrar una lista actualizada con frecuencia de
patrones tri-alélicos en el sitio web de STRBase:
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/var_tab.htm.

Ocasionalmente, se pueden observar tres alelos en un locus en un perfil de ADN de fuente única
(Figura 5.2).

Estos patrones de tres alelos o triélicos son variantes de número de copia (CNV). Resultan de
fragmentos de cromosomas adicionales que están presentes en una muestra que produce un
producto de PCR adicional cuando se somete a cebadores de PCR para ese locus. En algunos casos,
puede estar presente un cromosoma extra completo, como en la trisomía 21 o el síndrome de
Down. De hecho, la detección de tres alelos en D21S11 y otros marcadores STR en el cromosoma
21 se ha utilizado como pantalla de diagnóstico para la detección del síndrome de Down (Pertl et
al. 1994, Samura et al. 2001, Yoon et al. 2002).

Los esfuerzos en expansión de la secuenciación del genoma humano han descubierto que las CNV
son más comunes de lo que se pensaba originalmente (Freeman et al. 2006, Sjödin y Jakobsson
2012). Los patrones tri-alélicos son típicamente raros en un locus específico, pero es probable que
ocurran dentro de un perfil STR de 15 locus aproximadamente una vez cada 1,000 muestras
(D.N.A., Recuadro 5.2). Un examen de 5.964 perfiles de ADN de Bélgica encontró tres casos de
patrones triaélicos, uno con D8S1179 y dos con D18S51 (Mertens et al. 2009). La duplicación y
triplicación cromosómica también se ha observado en los STR del cromosoma Y (Butler et al. 2005)
y los STR del cromosoma X (Lim et al. 2009).

Tri-alelos tipo 1 y tipo 2

Tim Clayton y sus colegas del Servicio de Ciencias Forenses del Reino Unido desarrollaron un
esquema de clasificación para patrones tri-alélicos (Clayton et al. 2004). El tipo 1, que es más
común, involucra patrones trialélicos donde la suma de las alturas máximas de dos de los alelos es
similar a la altura máxima del tercer alelo.

Los patrones trialélicos de tipo 2 implican un conjunto bastante equilibrado de tres alelos (Figura
5.3). En 15 patrones tri-alélicos reportados por un estudio de 32,800 perfiles PowerPlex 16, 12
fueron Tipo 1 y 3 Tipo 2 con estos tri alelos vistos en 10 de los 15 STR examinados (Huel et al.
2007).

Se han reportado más de 240 patrones tri-alélicos diferentes en los 13 loci CODIS STR, y la mayoría
de ellos se han visto en TPOX, D18S51, D21S11, VWA y FGA. Puede encontrar una lista actualizada
frecuentemente de patrones trialélicos en el sitio web NIST STRBase (STRBase 2014). Si bien solo 7
patrones trialélicos D18S51 diferentes se habían informado a STRBase hasta abril de 2005 (Butler
2006), a partir de enero de 2014, el número de trialelos D18S51 diferentes había aumentado a 35
(Tabla 5.2). Por lo tanto, la recopilación de más perfiles STR está dando como resultado más
observaciones de patrones tri-alélicos.

Estudios de herencia

Para comprender mejor el origen de los patrones tri-alélicos, varios estudios han examinado los
patrones de herencia (Rolf et al. 2002, Zamir et al. 2002, Lukka et al. 2006, Lane 2008, Vidal &
Cassar 2008).

Estos estudios sugieren que los tri-alelos surgen de la herencia de dos cromosomas o regiones
cromosómicas (por ejemplo, una duplicación de CNV) de uno de los padres.

Se observó un patrón tri-alélico en D3S1358 en un niño evaluado (17/18/19) durante las pruebas
de parentesco de rutina (Vidal y Cassar 2008). El análisis de seguimiento encontró que la supuesta
abuela paterna también era tri-alélica (15/18/19) mientras que la madre exhibía un genotipo
diploide normal (15/17). Por lo tanto, el niño probablemente heredó el 18/19 de su padre y el 17
de su madre. Desafortunadamente, el padre no estaba disponible para la prueba. Las muestras de
ADN de la madre, el niño y la supuesta abuela paterna se examinaron más a fondo en 11 loci
adicionales que rodean a D3S1358 en el cromosoma 3. Solo D3S1358 mostró una duplicación que
sugiere que la duplicación de CNV en este caso estaba confinada a una pequeña porción del
cromosoma 3 (Vidal y Cassar 2008). En otro estudio (Rolf et al. 2002), en el que la madre exhibió
tres alelos (18/19 / 33.2) en el locus SE33 (ACTBP2), estos tres alelos se separaron por separado a
sus cinco hijos que parecen recibir solo un alelo materno cada. Con un padre que posee un
genotipo SE33 29.2 / 31.2, los niños tenían genotipos normales de 29.2 / 33.2, 29.2 / 33.2, 31.2 /
33.2, 19 / 31.2 y 18 / 31.2, donde el subrayado se utiliza para ilustrar el alelo materno recibido. Los
autores de este estudio concluyeron que sus datos se pueden explicar mejor asumiendo el
mosaicismo somático, que está presente en los tejidos investigados, así como en las células
germinales maternas (Rolf et al. 2002). Los alelos 18 y 19 son probablemente los mosaicos y
pueden haber surgido de un evento de mutación temprana durante la embriogénesis. Este estudio
concluye que debido a que la frecuencia del mosaicismo somático está relacionada con la tasa de
mutación, los loci con tasas de mutación más altas exhibirán patrones tri-alélicos con mayor
frecuencia.

La herencia de un patrón trialélico TPOX se observó en un trío de paternidad donde el niño tenía
10/08/11, la madre tenía 8/8/10 y el padre tenía 11/11 (Lukka et al. 2006). El análisis de los loci
STR adyacentes a TPOX en el brazo corto del cromosoma 2 respalda la suposición de que la madre
en este caso suministró dos alelos al niño mientras que el padre suministró uno. Al observar que
los tri-alelos de TPOX son generalmente de tipo 2 (Figura 5.3), los autores de este estudio sugieren
una frecuencia relativamente alta de reordenamientos cromosómicos en la región de TPOX cerca
del telómero del cromosoma 2 (Lukka et al. 2006). Sin embargo, puede haber otra razón para los
patrones tri-alélicos tipo 2 observados frecuentemente en TPOX (Lane 2008).

TPOX Tri-Alleles y "Allele 10"

Un estudio de 2008 informó que aproximadamente el 2.4% de los sudafricanos indígenas tienen
tres alelos de TPOX en lugar de dos (Lane 2008). Los datos recopilados durante las pruebas de
paternidad de rutina revelaron que el alelo adicional casi siempre es el alelo 10 y que parece
segregarse independientemente de los otros alelos en el locus TPOX principal. Aproximadamente
el doble de hembras que de machos tienen genotipos tri-alélicos TPOX, lo que sugiere que el "alelo
10" adicional está en el cromosoma X.

Un análisis de los patrones de presentación de STRBase proporciona soporte para la observación

de que el alelo 10 es extremadamente común en los patrones trialélicos de TPOX. En 113
presentaciones de STRBase que involucran 18 patrones trialélicos de TPOX diferentes (informados
a partir de enero de 2014), solo 9 veces (8%) el alelo 10 no está presente. Hay cinco 8/9/11, tres
8/11/12, y un 9/11/12 tri-alelos. Asimismo, 30 informes de las 113 presentaciones son 10/08/11.
Este 23% de los tres alelos TPOX informados se correlaciona bastante bien con la frecuencia de
genotipo 8,11 observada del 27% que se encuentra en el conjunto de datos NIST 1036 (Butler et al.
2012, Hill et al. 2013).
Un conjunto de 20 muestras de TPOX tri-alélicas de la República Dominicana que contenía un tri-
alelo en una madre o en su hijo encontró en todos menos dos casos la presencia del alelo "10"
(Díaz et al. 2009). Una de estas instancias fue una madre 8/9/11 sin datos TPOX parentales
disponibles. En la otra instancia, el niño (un hijo) era un TPOX 8/8/11 con una madre de 8,8. Por lo
tanto, el padre, que no fue examinado, probablemente transmitió un 11 de septiembre a su hijo.
Dado que un hombre no transmitirá un cromosoma X a su hijo, la ausencia de un TPOX "10" en el
niño concuerda con la hipótesis de que el "alelo 10" duplicado está en el cromosoma X (Lane
2008).

Estimaciones de frecuencia

Es difícil determinar una estimación de frecuencia precisa para un trialelo específico. Si bien
algunas presentaciones de STRBase contienen información de frecuencia, solo se refiere a un
conjunto de datos específico en el momento de la presentación. Por ejemplo, un CSF1PO 10,12,13
tri-alelo se informó como 1 de cada 11,000 muestras examinadas por la Comisión Internacional de
Personas Desaparecidas y 1 de cada 31,330 muestras analizadas por un laboratorio en Corea. Sin
embargo, estos valores solo reflejan cuántas muestras fueron analizadas por su laboratorio en el
momento en que se envió la información a STRBase. Por lo tanto, solo tenemos información
limitada en el mejor de los casos para estimar una frecuencia. Si hay 12 millones de perfiles de EE.
UU. Con resultados D18S51 y probablemente más de 30 millones de perfiles en todo el mundo con
D18S51, entonces quizás estos valores podrían usarse como denominador en una estimación. Sin
embargo, no todos los patrones tri-alélicos observados se envían a STRBase y, por lo tanto, el
numerador de dicha estimación de frecuencia no sería exacto debido a la información incompleta.

De alguna manera, los tri-alelos son como la heteroplasmia en el ADNmt (Melton 2004) o la
duplicación / eliminación en los resultados de Y-STR (Butler et al. 2005). Como se puede ver en la
Tabla 5.2, la frecuencia de aparición de cada uno de los tres alelos D18S51, cuando se informó,
varía de 1 en 503 a 1 en 69,600.

Desafortunadamente, no existe un método comúnmente aceptado para incorporar frecuencias de

patrones tri-alélicos en el cálculo estadístico para la rareza del perfil STR. Mi recomendación actual
sería dejar el tri-alelo fuera de la comparación estadística debido a la incertidumbre con un
numerador o denominador adecuado para usar en la estimación específica de la frecuencia tri-
alélica. Sin embargo, el informe debe mencionar si la pregunta (Q) y las muestras conocidas (K)
coinciden cualitativamente en el locus que contiene el patrón tri-alélico. Si coinciden, entonces
está fortaleciendo la estadística de coincidencia, simplemente no sabemos cuánto.

Algunos autores han sugerido no incluir información tri-alélica en los informes de casos debido a la
posibilidad de que datos clínicamente relevantes sean revelados inadvertidamente si existe una
duplicación cromosómica, como la trisomía 21 (Lukka et al. 2006).

Anomalías Tri-Alélicas

Pueden producirse tres alelos falsos si un alelo extremo fuera de la escalera de un locus adyacente
en el múltiplex STR cae dentro del rango de un locus vecino e, a veces, incluso en un contenedor
de alelos legítimo (ver ejemplos en el Capítulo 3). Por lo tanto, el uso de diferentes kits STR, con
locus de diferentes tamaños y confirmaciones de color de tinte, puede ser útil para confirmar
patrones tri-alélicos (por ejemplo, Figura 3.8).

Los perfiles de ADN anormales pueden surgir de varios procesos biológicos, incluidas las variantes
del número de copias, ya sea como duplicaciones o deleciones, mutaciones somáticas (que
pueden variar entre los diferentes tejidos probados), duplicación cromosómica completa (como la
trisomía 21) y mosaicismo.

Algunos patrones tri-alélicos verdaderos de Tipo 1 pueden estar enmascarados por lo que parece
ser un tartamudeo alto en un alelo específico. En lugar de ser una mezcla de ADN de dos
individuos donde el componente menor solo se está "observando" en un solo locus, una muestra
que posee un alto tartamudeo en un solo alelo puede, de hecho, exhibir mosaicismo (una mezcla
de dos tipos de células) dentro de un solo individual (Zimmer 2013). Los científicos del Laboratorio
de Delitos de la Patrulla del Estado de Washington informaron este fenómeno con un resultado
anómalo en D3S1358 encontrado en un caso de homicidio por agresión sexual (Shutler y Roy
2012) (D.N.A., Recuadro 5.3).