Universidad Nacional del Nordeste

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

y Agrimensura

CÁTEDRA:
HEMATOLOGÍA CLÍNICA

TRABAJOS PRÁCTICOS

ALUMNO:…………………………………………
GRUPO:….......
AÑO: 2012

1
INTEGRANTES DE LA CÁTEDRA:

PROFESORA RESPONSABLE: BQCA. MARIA CRISTINA GUEVARA

JTP ORDINARIA: BQCA. RINA MARINA TEJADA DE MARTÍNEZ

AUXILIAR DOCENTE ORDINARIA: BQCA. ALENJANDRA SÁNCHEZ

JTPs ADSCRIPTOS: BQCO. GONZALO ADRIÁN OJEDA - BQCA. CLAUDIA PATRICIA

SERRANO - BQCA. VICTORIA IVAN

AYUDANTES ALUMNOS: FLORES EZEQUIEL, TOÑANES CYNTHIA, DE FRACESCHI

CRISTINA, HOCHMUTH INGRID, RADOVANCICH VIRGINIA, ARECHAVALA
MILAGROS

NÓMINA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

TP1: HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINA, VSG, COLORACION MGG)

TP2: HEMOGRAMA 2 (FÓRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB)

TP3: FÓRMULA PATOLÓGICA-ALTERACIONES SERIE BLANCA (MICROSCOPIA)

TP4: ANEMIA ARREGENERATIVAS (MICROSCOPIA)

TP5: ANEMIAS REGENERATIVAS (MICROSCOPIA Y RETICULOCITOS)

TP6: INMUNOHEMATOLOGÍA (GRUPO Y FACTOR, COOMBS D e I)

TP7: ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA

TP8: CITOQUÍMICA (MPO-PERLS-KLEIHAUER BETKE) – MEDULOGRAMA

(MICROSCOPIA)

TP9: LMA (MICROSCOPIA)

TP10: LLA-SLPC (MICROSCOPIA)

TP11: LMC-SLPC (MICROSCOPIA)

TP12: HEMOSTASIA PRIMARIA (RECUENTO DE Pq, TIEMPO DE SANGRÍA, TIEMPO

DE COAGULACIÓN, RETRACCIÓN DE COÁGULO)

TP13: HEMOSTASIA SECUNDARIA (TP, KPTT, MÉTODOS MANUALES Y

AUTOMATIZADOS)

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MODELO DE INFORME (EL INFORME ES INDIVIDUAL)

TP N°……… GRUPO DE LABORATORIO:……

FECHA……………
NOMBRE Y APELLIDO……………………………………………………………

1-ACTIVIDADES REALIZADAS (detallar en forma resumida las actividades realizadas)

2- RESULTADOS HALLADOS

Determinación
Valor hallado
Método
Valores de referencia

3- ELEMETOS OBSERVADOS

Para los TPs de microscopia especificar cada uno de los elementos observados (coloración y
aumento) así como también, en caso de disponer de ellos, datos referentes al cuadro en que fue
encontrado (edad, datos de hemograma, patología, tratamiento, etc).

Ej. Se observó un frotis con anisocitosis moderada (MGG 40x), correspondiente a un cuadro de
anemia ferropénica en recuperación (Niño 8 años, GB: 7300 cel/mm3 – GR: 4,18 x 106 cel/mm3
– Hb 11,2 g%, Hto: 37 %, VCM: 87,3 fL, HCM 26,7 pg, CHCM 30,2 g%, RDW 18 %, Pq
323x103 /mm3, Tratamiento: Hierro oral)

Ej. Se observaron numerosos esferocitos (MGG 100x) en un frotis perteneciente a un paciente

con AHAI.

4- DISCUSION DE RESULTADOS (variaciones fisiológicas, patológicas, posibles causas de

error, procedimientos para la validación del resultado)

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 TRABAJO PRÁCTICO N° 1

HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINA, VSG, COLORACION MGG)

Ojetivos Generales
- Puesta en práctica de normas de bioseguridad básicas.
- Práctica de los pasos para la obtención de muestras de sangre venosa para la realización de las
determinaciones incluidas en el hemograma.
- Aplicación de los criterios necesarios para la elección de anticoagulantes en función de las
determinaciones a realizar.
- Manejo del material necesario para las prácticas a desarrollar.
- Interpretación de resultados.

1 -Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa

1. Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene.
2. El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y, una vez
manipulado, no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo.
3. Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados en
recipientes para ese fin.
4. Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables, los cuales se
mantendrán puestos durante todo el procedimiento.
5. Antes de iniciar la toma de muestra, tener TODO el material preparado.
6. Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizándola visualmente y por palpación.
Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y cierre el puño para
facilitar la extracción.
7. Una vez identificada la vena, limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol.
Dejar secar.
8. En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja, se la colocará en la jeringa sin
tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del émbolo.
9. La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la sangre fluya
en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. La escala de la jeringa debe estar visible
(hacia arriba).
10. Después de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete y luego
la aguja, presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco.
11. LA AGUJA SE DESCARTARÁ EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE
FIN.
12. La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los
anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma y homogeneizando
inmediatamente por inversión suave.
13. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente.
14. En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más
sangrado.
15. La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra
y desecharlos inmediatamente. NO REUTILIZARLOS.
16. Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro de
muestras.

2 - Descripción de los anticoagulantes usados en Hematología

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las
características morfológicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las células
sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico. Para ello los
anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos, el tamaño eritrocitario, no
producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el

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máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso
refrigerada a 4° C).

Los anticoagulantes más utilizados son:

 EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido

etilendiaminotetraacético, actua mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++),
impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. ES EL ANTICOAGULANTE DE
ELECCIÓN PARA HEMOGRAMA. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente
para la realización de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite
además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la
extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. Las
sales de potasio tienen la ventaja, respecto a las de sodio, de ser más fácilmente solubles en
sangre cuando las usamos a partir del producto sólido, sin embargo , las tres sales afectan el
tamaño del eritrocito, especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada
por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology
(ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras
sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente
cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores
automáticos. El K2EDTA . 2H2O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100
mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4.8 ± 1,0. La cantidad de
EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/mL. de sangre total. Esta
cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la
cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. Los productos habitualmente
comercializados consisten en una solución equilibrada de sales sódicas y potásicas de
EDTA (0,342 mol/l) pH 7,2, con estas la proporción recoemendad es 1/100 Ej: 10 µL de
anticoagulante para 1 mL de sangre (990 µL estrictamente hablando).

 HEPARINA SÓDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiológico que actúa

impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un
mucopolisacárido ácido. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con
heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización
celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporción adecuada es de 15-20 UI
(0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.

 CITRATO TRISÓDICO, C6H5O7Na3, actúa impidiendo que el calcio se ionice, evitando

así la coagulación. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción
sangre: anticoagulante 9:1 (Por Ej.:2mL sangre con 250µL anticoagulante); así como
para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1
(Por Ej.: 2 mL sangre con 500 µL anticoagulante).

 ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de

sangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los
hematíes. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro volúmenes
de sangre. La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0.9 g, Citrato
disódico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 mL.

3 - Recuento de hematíes

RECUENTO MANUAL

Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. Es un método

poco usado debido al elevado error que presenta.

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Líquido diluyente: solución fisiológica o citrato de sodio 3,8%., o Solución de Hayem (HgCl2
0,25%, Na2SO4 2,5%, NaCl 0,5%)

La dilución empleada es de 1/200, para lo cual se mide exactamente:

Solución fisiológica o citratada: 3,98 mL
Sangre: 0,02 mL

El recuento se realiza en la cámara de Neubauer (40X) cuyo esquema es el siguiente:

El recuento de hematíes se realiza en el cuadrado central, se eligen 5 de los cuadrados que se

encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeños, como se muestra a continuación:

Las líneas reforzadas, o triples, sirven únicamente como límites de cada cuadrado que contiene
los 16 cuadrados pequeños. Se deben contar 5 de estos cuadrados. La superficie de este
cuadrado es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0,1 mm.

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Con la dilución indicada, luego de agitar adecuadamente, se carga la cámara y se cuentan los
glóbulos rojos de los 80 cuadrados pequeños (zona sombreada). La cámara puede ser cargada
con un capilar, evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente.

Considerando entonces, que el retículo tiene 400 cuadrados pequeños en total, el cálculo que se
debe hacer es el siguiente:

N x D x FC x ST = nº de glóbulos rojos/mm3
TC

Donde:

N: número de eritrocitos contados.

D: Título de la dilución realizada (200).
FC: Factor de corrección de la profundidad, para llevar a 1 mm3 (10).
ST: Total de cuadrados pequeños en la superficie de 1 mm2 (400).
TC: Total de cuadrados pequeños contados.

Causas de error en el recuento en cámara de Neubauer

El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a:

1. Errores de extracción: dilución o hemoconcentración. Coagulación parcial. Hemólisis.

2. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre.
3. Utilización de material mal calibrado, sucio o húmedo.
4. Falta de suficiente agitación de la sangre diluida.
5. Cámara de Neubauer mal ajustada, sucia o mojada.
6. Llenado incompleto de la cámara Neubauer.
7. Empleo de cubreobjetos deformable, no rígido.
8. Células mal distribuidas en el fondo de la cámara.
9. Errores del operador al realizar el recuento.
10. Errores al efectuar los cálculos.

VALORES DE REFERENCIA

Edad Sexo Intervalo de referencia

Recién nacidos ambos 4,7x1012/L - 6,3x1012/L
Niños (2-12 años) ambos 4,0x1012/L - 5,3x1012/L
Adultos jóvenes (12-18 años) mujeres 4,1x1012/L - 5,1x1012/L
varones 4,5x1012/L - 5,3x1012/L
Adultos jóvenes (19-60 años) mujeres 4,1x1012/L - 5,2x1012/L
varones 4,6x1012/L - 5,9x1012/L

4 - Hematocrito

DEFINICION

El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total

de sangre, expresado como porcentaje. Está directamente relacionado con la concentración de
hemoglobina, por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el
diagnóstico de anemia. Así, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el
aumento lo es de poliglobulia.

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El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en
tubo capilar (micrométodo), es una técnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja
complejidad.

En la actualidad, todos los autoanalizadores hematológicos suministran, dentro del contexto del
hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del
Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración
de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por
centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto
de las restantes células sanguíneas, por lo que es siempre algo inferior (1-3 %).

Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados, son un buen
parámetro del estado de la serie eritroide.

El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. Por Ej., un paciente en
estado de shock acompañado de hemoconcentración, el Hto. puede ser normal o alto, aún
cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. Por lo tanto no es
confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión.

METODO MANUAL

Micrométodo (microhematocrito)

Es una técnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, muy sencilla y
poderse realizar en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo.

Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm. de longitud por 1mm. de diámetro interno.
Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre
capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechará la primera gota después de la punción.

Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre
(aproximadamente 50 L). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el
proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa
el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. Una vez
cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera
y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000
rpm. Tan pronto se detiene la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta
se puede realizar con los lectores de hematocrito (ABACO), que nos darán el resultado
directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres:

A------- 100 x: hematocrito en tanto por ciento

B------- x A: longitud total
B: longitud de la parte corpuscular

La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores
obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01%.

Causas de error

 Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en
el valor, al perderse mayor proporción de células que de plasma.
 El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra
 En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los líquidos
tisulares que provoca hemodilución.

8
 En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce
hemoconcentración.
 La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hematíes vaya
tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal.

VALORES DE REFERENCIA ( x  2 DE)

El valor de Hto varía con la edad y el sexo.

Edad y sexo Hematocrito % Fracción

Recién Nacidos 54  10 0,54  0,1
Niños (hasta 10 años) 38  5 0,38  0,05
Mujeres (18-50 años) 42  5 0,42  0,05
Embarazadas 39  5 0,39  0,05
Varones (18-50 años) 45  5 0,45  0,05
5 - Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina

FUNDAMENTO

Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en

cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color característico cuya
absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de
concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva
de calibración). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina que
casi nunca es significativa, se transforman en HiCN según el siguiente proceso:

Hemoglobina + [K3 Fe(CN) 6]  metahemoglobina

Metahemoglobina + [CNK]  cianmetahemoglobina

MATERIAL

1. Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados

periódicamente mediante la solución patrón de HiCN, preparada de acuerdo a las
especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH)
2. Tubos: 12 x 100 mm.
3. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-Na2 (1,5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml).
Puede emplearse sangre capilar.
4. Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 mL.
5. Pipetas automáticas: de 20 L, debidamente calibradas.
6. Reactivo de Cianmetahemoglobina:

Composición (pH 7-7,4)

Ferricianuro potásico [K3 Fe(CN) 6 ] 200 mg

Cianuro potásico [CNK] 50 mg
Fosfato monopotásico [KH2 PO4] 140 mg
Detergente no iónico* 1 mL
Agua destilada hasta 1000 mL

Detergentes no iónicos: Tritón X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218.

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 El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la
transformación de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3 min.
Este reactivo debe tener un color amarillo pálido, ser completamente transparente y tener un
pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco
debe ser igual a cero. Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas
y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo).

7. Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia

corresponde a una determinada concentración de hemoglobina. Todo patrón de HiCN debe
cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN.

METODO

Se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos

detallados a continuación:

1. Conectar el espectrofotómetro.
2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático
(rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión
del tubo 20 veces.
3. Pipetear (CON PROPIPETA) 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio.
4. Mediante la micropipeta añadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml
de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operación, es fundamental eliminar el exceso de
sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el
reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la
pipeta.
5. Agitar el tubo mediante inversión (4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien
la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis
total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.
6. Leer la A de la solución a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco.
7. Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de
calibración.

Curva de calibración de hemoglobina

Se toma un Kit. de calibración con estándar de CC. Normal, de una CC. Alta y otro de una CC
.baja, y se miden las absorbancia de cada una de ellas o se toma un Standard de CC. conocida y
se hacen diluciones mayores y menores que el normal y se miden las absorbancia y se determina
un factor que es el promedio de las tres diluciones. Teniendo que A=ɛ . b. C y como b=1 cm
=> A/ ɛ = C para facilitar el calculo A . (1/ ɛ) = C donde (1/ ɛ)= F y es la inversa de la
pendiente de la curva tendremos que C= F . A. Dicho en otras palabras la recta se ajusta a
una ecuación del tipo y=ax+b.
Grafico:

10
De esta manera controlo:
• La linealidad del equipo
• El deterioro que sufre el reactivo

Puedo trabajar con un estándar diario, procesado por cada operador que realiza la determinación
de hemoglobina, como si fuese una muestra más y determino el factor del estándar.

Procesando un estándar todos los días:

CONTROLO EL DETERIORO QUE PUEDE SUFRIR EL REACTIVO DESDE EL DIA

QUE SE LO PREPARO Y SE REALIZÓ LA CURVA.

CONTROLO EL FACTOR HUMANO

CAMBIOS EN LA TENSIÓN DE LA RED O DESGASTE DE LA

LÁMPARA DEL FOTOCOLORÍMETRO

Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina

La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en
cuenta. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia
de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (50 x 109/l). No obstante, la mayoría de las veces los
errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen.

Errores en la obtención del espécimen de sangre:

1. Errores de extracción
2. Empleo de anticoagulantes no recomendados
3. Coagulación parcial de la sangre

Errores de la dilución:
1. Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o húmedas
2. No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de
introducirlo en el reactivo
3. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo

Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN:

1. Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido
2. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la Hb en HiCN

Errores de la determinación:
1. Empleo de instrumentos no calibrados
2. Cubetas sucias o deterioradas
3. Soluciones turbias de HiCN

Errores en la conservación del reactivo:

1. Congelación del reactivo, lo que produce transformación de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y
una oxidación parcial de la Hb.
Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formación
exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de concentración de Hb
obtenidos son inferiores a los reales.

11
6 - Velocidad de sedimentación globular (VSG) o Eritrosedimentación

FUNDAMENTO

El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en

su plasma nativo.

VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de
enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los
procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumática y tuberculosis) o la
respuesta a la terapia, por ejemplo con citostáticos (enfermedad de Hodgkin, linfomas y
mieloma múltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis
pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests más utilizados como screening
en el laboratorio clínico. Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere
equipamiento simple.

MECANISMO

El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado,

pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas
proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la
agregabilidad de estas células.

Desde el punto de vista físico, este fenómeno depende de los siguientes factores:

a. Tamaño de los GR
b. Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma,
c. Viscosidad del plasma.
d. Temperatura.

Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR

como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra
una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad  a una
velocidad v: R = 6vr

La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR

con formación de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un período durante el cual los
agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de
sedimentación se hace más lenta al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del
recipiente.

La etapa más importante es la primera o de aglutinación, ya que de ella dependerá la velocidad

de todo el proceso. Así, cuanto más pequeño sean los agregados, más lentamente se producirá
la sedimentación y viceversa.

Dado que, como se mencionó más arriba, el test también está influenciado por la forma y el
tamaño de los GR, éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia
falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.

La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y

otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albúmina retarda la VSG. El mecanismo
por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce
fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que
normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es
producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que

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estas células se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida
de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones
de albúmina, globulinas y fibrinógeno. Así, mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial
zeta, las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto
el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos
esférica que la albúmina, lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el
potencial zeta eritrocitario. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como
consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de
moneda”. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio
entre las principales proteínas plasmáticas.

METODOLOGIA

Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el
método de Wintrobe. Ambos métodos poseen limitaciones. El método de Westergren es menos
sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y así
puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening.

El método de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG
Westergren es marcadamente elevada. Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación
entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no específico
de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre
los agregados en sedimentación. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias, pero
no resultaron confiables.

Tradicionalmente, la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren

que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standardization
in Hematology (ICSH).

Durante los últimos años, han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que
emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable. Estos sistemas, aunque
reproducen exactamente el método de Westergren, se diferencian de éste por su carácter cerrado
(recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de
anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan
la rapidez y precisión del llenado de las pipetas.

MÉTODO DE WESTERGREN

Es el método de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un método poco
reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar, como es la necesidad de
prediluir la sangre.

A. MATERIALES.

A.1 Anticoagulante

Si utiliza citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) en solución acuosa 32,08 g/l.

A.2 Tubo de sedimentación

Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1.5 mm y de un

diámetro de 2.55 + 0.15 mm. El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm) todo a lo
largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200
mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de
ICSH deben aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países.

13
Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de
detergentes o dicromatos para la limpieza.
Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las
especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plásticos
resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de
taponamiento. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan
hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.

A.3 Gradillas

Las gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición
vertical inmóvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla
para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1. La misma debe
estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en
ella.

B. TÉCNICA

A) La sangre se obtiene por punción venosa, evitando contaminación con materiales utilizados
para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol
de solución de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en 0,5 ml de
anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a
temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs. si es mantenida a 4C.

B) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversión repetidas

veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda
por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero.

C) El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente

(18-25C), sin exposición a la luz del sol directa, libre de vibraciones y corrientes de aire,
manteniéndolo exactamente 60 min.

D) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la
columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca
cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de
la VSG durante la primera hora (mm/hora).

C. VALORES DE REFERENCIA

Valores de Límite superior de

EDAD (años)
referencia (mm) la normalidad
Niños mayores y 0-15 5 a 10 15
jóvenes
Varones adultos 17-50 4±3 10
51-60 6±3 12
61-70 6±4 14
Mujeres adultas 17-50 6±3 12
51-60 9±5 19
61-70 10 ± 5 20

14
Factores técnicos capaces de modificar la VSG

Causas de aumento
 Desviación de verticalidad de la pipeta
 Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta
 Elevación de la temperatura ambiente
 Dilución de la sangre
 Causas de disminución:
 Reducción del diámetro de la pipeta
 Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido)
 Cambio de anticoagulante

D. INTERPRETACION DE RESULTADOS

Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían

fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia),
el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos orales, etc.) La VSG
no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos.

Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente,
han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica, por lo que no se recomienda
su empleo.

Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con
modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de
enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda, y también en el
embarazo normal y el puerperio.

Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas.

La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, vera anormalidades de GR

(hemoglobinopatías, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.), hipofibrinogenemia,
defectos cardíacos congestivos, y ocasionalmente sin causa aparente.

Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener
falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe
enfermedad orgánica.

Para muestras pediátricas o cuando el volumen a obtener será escaso se puede utilizar las
pipetas de Chattas, estas requieren un volumen de sangre mucho menor (40 µL), la técnica se
realiza de la misma manera pero los resultados deben ser corregidos utilizando un nomograma o
tabla para conversión.

15
NOMOGRAMA DE CHATTAS

Chattas Westergren Chattas Westergren Chattas Westergren

(mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm)
1 a 10 1 a 10 21 31 32 95
11 12 22 34 33 106
12 13 23 38 34 120
13 14 24 42 35 >120
14 16 25 47 36 >120
15 18 26 53 37 >120
16 20 27 59 38 >120
17 22 28 65 39 >120
18 24 29 71 40 >120
19 26 30 77
20 28 31 84

7-OBTENCIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequeña de

sangre (1-2 mm) recién obtenida, ya se trate de punción digital, o del talón (en pediatría) o de la
última gota de sangre extraída con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar
sangre con anticoagulantes porque altera la morfología de las células.

Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ángulos (extensor),
se realiza la extensión de la gota de sangre: conservando un ángulo menor de 45 respecto al
portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta
tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se
avanza con firmeza y no muy rápidamente. Así se obtiene una fina película de sangre que
representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.

Secar rápidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las células.

Un extendido así obtenido poseerá tres áreas de diferente espesor y con distribución también
distinta de leucocitos:
1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la región inmediata al punto de partida de la
extensión (cabeza). En ella hay siempre un aumento del número de linfocitos.
2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión (cola) y en ésta se observa un
exceso de granulocitos y monocitos.
3. Zona ideal: Región central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las células.

16
 1
2
3

Para que un frotis sea valido:

1) No debe ser demasiado grueso (los elementos estarán retenidos y no serán identificados.
2) No debe ser demasiado delgado (será muy pobre en elementos lo que impediría una
lectura conveniente).
3) No debe alcanzar los bordes ni las extremidades del porta (se perderían los elementos
mas voluminosos). La gota debe agotarse sobre el porta.
4) No debe presentar agujeros (utilización de portas mal desengrasados) ni estrías o flecos
(provocados por un extensor de bordes no esmerilados, irregulares). Conviene elegir el
extensor observando sus bordes en el microscopio para asegurarse de que sean bien
lisos.
5) Debe ser regular (si no, el reparto de elementos es heterogéneo y por tanto el recuento
variara según los campos examinados).
6) Debe ser secado correctamente (un secado defectuoso produce artefactos: hematíes
festoneados por ejemplo).

Existen algunas sutilezas que es necesario cuidar:

 El tamaño de la gota debe ser el adecuado y esto lo enseñara la experiencia.

 Si ha caído un exceso de gota limpiar el porta con gasa o algodón. Repetir el procedimiento
las veces que sea necesario hasta que la cantidad de sangre sea la adecuada.
 Si tuvieran que elegir entre un extendido largo, y uno corto, es preferible el segundo, pero lo
ideal es que ocupe ¾ partes de la lamina.
 Se prefieren en general los frotis delgados pero el excesivamente fino tiene muchos
inconvenientes: los hematíes aparecen poligonales con su claridad central desaparecida, las
plaquetas se destruyen y los leucocitos resultan rotos o distorsionados.
 Nunca debe llevarse la gota de sangre por delante del extensor porque produciría erosión de
las células.
 Un buen frotis debe constar de una zona inicial gruesa (cabeza), una zona central mediana
(espesor ideal para la lectura) y la cola delgada terminada suavemente en un borde convexo
sin estrías prolongadas que hablan de un extensor defectuoso. Un buen extendido luce como
una pincelada sobre el vidrio.
 Aun cuando el frotis sea ideal y el reparto homogéneo no se puede evitar una cierta
segregación de los elementos. Los linfocitos (mas pequeños) predominan en el centro de la
extensión. Los polimorfonucleares y los monocitos son atraídos hacia los “bordes y cola”.
 FROTIS ARRASTRADOS: todos los elementos están en la cola. Deben rechazarse para la
formula.

Defectos observados en frotis con sangre anticoagulada:

1) Impide agrupación de plaquetas.
2) Los núcleos de los monocitos aparecen como con lóbulos, inclusive pueden estar
desintegrados o coloreados más homogeneamente, más compactos que con sangre
fresca, el citoplasma puede aparecer vacuolado.

17
Importante:
Lavar y secar bien el extensor entre una y otra extensión
Los portas nuevos deben ser desengrasados con agua jabonosa, enjuagados minuciosamente.

8-COLORACIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

La coloración se realiza por el método de May Grünwald-Giemsa.

Fundamento

Prácticamente todos los métodos empleados para teñir las células de la sangre se basan en el
empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno.

Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras
celulares, de modo que las que tienen carácter básico fijan en mayor medida la eosina (colorante
ácido), mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno
(colorante básico). Esto explica que ciertas estructuras basófilas presentes en el núcleo
(nucléolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes
acidófilos como la hemoglobina adquieren color rosado.

De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmáticas por dichos

colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrófilos, en los que la
granulación específica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultáneamente,
resultando en un color pardo; eosinófilos, en los que la granulación específica contiene
sustancias de intenso carácter básico que fijan fundamentalmente los colorantes ácidos, dando
un color rojo-naranja; y los basófilos, cuya granulación específica posee sustancias de carácter
ácido, que fijan colorantes básicos dando un color azul oscuro.

Reactivos

 Solución May Grünwald : eosinato de azul de metileno en metanol.

 Solución Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado

en medio alcalino: el azur II, y eosina (tetrabromofluoresceína).

Método

Cubrir el frotis de sangre seco con solución May Grünwald. Dejar 3 minutos. A continuación,
agregar buffer fosfato pH 6.8 o una mezcla de agua de canilla con agua destilada en partes
iguales, en proporción igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una
pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivén. Dejar 3-5 minutos. Volcar,
enjuagar bajo chorro de canilla suave y cubrir el preparado con una solución de Giemsa,
obtenida a razón de dos gotas del colorante por ml de agua (1/10). Dejar 10- 12 minutos. Lavar
con agua, limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodón y secar al aire.

18
 TRABAJO PRÁCTICO N°2

HEMOGRAMA 2 (FÓRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB)

Objetivos generales
-Familiarizarse con el uso de la cámara de Neubauer
-Adquirir destreza en la preparación de diluciones y manejo de muestras de sangre entera
-Adquirir destreza en el manejo del microscopio y la cámara de Neubauer para el recuento de
glóbulos blancos
-Delinear los criterios para la identificación de glóbulos blancos en preparados coloreados con
MGG
-Realizar fórmulas leucocitarias en muestras de pacientes sanos
-Interpretación y validación de resultados

1- RECUENTO DE LEUCOCITOS

Método manual

1) Agregar 20 l de sangre anticoagulada a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solución

de Türk. Esta solución contiene acido acético al 1 % en agua destilada y el agregado de una
punta de espátula de azul de metileno. DILUCION 1/20

2) Homogeneizar la mezcla.

3) Cargar la cámara de recuento

4) Ubicar el reticulado de la cámara con bajo aumento (10X), constatar la ausencia de burbujas
y que la distribución sea regular.

5) Proceder al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de
la cámara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre sí en más del 20%. En
caso contrario debe cargarse nuevamente la cámara.

19
La lectura se realiza en los cuatro campos L. Además de los leucocitos contados dentro de cada
uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos adheridos en la línea horizontal
superior y vertical exterior, o de lo contrario, todos los leucocitos adheridos a la línea horizontal
inferior y vertical interior.

Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el

recuento empleando una dilución 1:10. Si por el contrario el número resulta notablemente
elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.

6) Cálculo:

m x 10 x d
= N° de leucocitos/ mm3
n

Donde: m=número de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y

d=dilución utilizada, n= número de cuadrantes contados.

Valores de referencia

Adultos 4.000 - 11.000 / mm3

Recién nacidos 10.000 - 25.000 / mm3
Niños de 1 año 6.000 - 18.000 / mm3
Niños de 4 a 7 años 6.000 - 15.000 / mm3
Niños de 8 a 12 años 4.500 - 13.000 / mm3

2- DETERMINACIÓN DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA: RECUENTO

DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

En todo frotis coloreado con M.G.G. debe colocarse una delgada capa de aceite de inmersión,
aun para el pequeño aumento a seco. Si no se cumple este requisito la refringencia de los
elementos impide una buena observación. Para esto es suficiente depositar una gota en un
extremo, aplicar de plano sobre ella otro portaobjetos que puede contener otro extendido en
cuyo caso se harán coincidir ambas caras que los contengan y desplazarlos suavemente unos
contra otros.
La observación debe hacerse al principio de manera panorámica con objetivo de 10X para ver la
dispersión de los elementos. Con este aumento se observaran la presencia de células grandes
como los linfocitos hiperbasofilos de la mononucleosis. Por ello debe evitarse la tendencia a
usar e comienzo la inmersión.
Luego se pasa a 40 X aumento que resulta útil para evaluar alteraciones de tamaño de los
glóbulos rojos y finalmente se pasa a 100X para el recuento diferencial de los glóbulos blancos
y para la observación detallada de los elementos sanguíneos.

Un extendido correctamente realizado poseerá tres áreas de diferente espesor y con distribución
también distinta de leucocitos:

1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la región inmediata al punto de partida de la

extensión (cabeza). En ella hay siempre un aumento del número de linfocitos.

2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión (cola) y en ésta se observa un

exceso de granulocitos y monocitos.

3. Zona ideal: Región central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las células.

20
Formas de recorrer el preparado

Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada uno de ellos para establecer
los porcentajes. Refiriendo al valor de recuento de glóbulos blancos se puede expresar cada tipo
de leucocitos en valores absolutos por mm3 de sangre.
Siempre que sea posible se deben contar 100 elementos, recordar que se está haciendo una
estimación porcentual de las poblaciones, el recuento de 100 elementos resulta relativamente
sencillo en pacientes con valores absolutos de GB dentro de los valores de referencia. Distinto
es el caso de pacientes leucopénicos con recuento bajos por ej: 1500 GB / mm3 en estos casos
resultará muy tedioso llegar a encontrar 100 elementos para poder expresar en % , por ello es
aconsejable expresar literalmente lo que se vió al observar el preparado por ej: se realiza la
fórmula leucocitaria en un paciente leucopénico y solo se logró contar 80 elementos ( pueden
ser 70, 90 dependiendo del tiempo utilizado y del grado de leucopenia del paciente) entonces lo
aconsejable es expresar los resultados de la siguiente manera: DE 80 ELEMENTOS
CONTADOS “x” son Neutrófilos, “y” son eosinófilos, “z” son linfocitos, etc, etc, es decir se
expresa cuantos elementos de cada serie se observó en el total de GB contados Y NO EN
PORCENTAJE!

FORMULA LEUCOCITARIA EN ADULTOS SANOS

LEUCOCITOS (%) ABSOLUTO (cel / mm3 )
CAYADOS 0 – 1% 100 - 250
NEUTROFILOS SEGMENTADOS 55 – 70 % 3000 - 5000
EOSINOFILOS 1–4% 20 - 350
BASOFILOS 0–1% 10 - 60
LINFOCITOS 20 – 40 % 1500 - 4000
MONOCITOS 4–8% 100 - 500

No hay variación de la fórmula según el sexo, pero sí según la edad.

 Nacimiento: 70% de neutrófilos.
 Primera semana: 50% de neutrófilos y 50% de linfocitos.

21
 Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrófilos3-4 años: 50% de linfocitos y 50%
de neutrófilos.
 10-12 años: valores de referencia del adulto.

Descripción de cada uno de los elementos que componen una fórmula normal

1. Neutrófilos: Núcleo lobulado (2-5 lóbulos). Los lóbulos están unidos entre sí por filamentos
cromatínicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una célula terminal. Mide
aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una
granulación fina específica de color pardo rojiza.
2. Eosinófilos: Mide aproximadamente 13 m. El núcleo es segmentado, con predominio del
bisegmentado en forma de anteojo aunque pueden aparecer con más lóbulos. El citoplasma
es abundante y está cubierto de granulaciones esféricas de mayor tamaño que las del
neutrófilo y que se colorean de anaranjado.
3. Basófilos: Mide aproximadamente 10 m. El núcleo está irregularmente lobulado. La
cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relación al citoplasma. Las
granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamaño pudiendo quedar
superpuestas al núcleo, cubriéndolo parcialmente.
4. Linfocitos: Es una célula generalmente pequeña (7 m), pero puede llegar hasta 12 m. La
forma más pequeña posee sólo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un
10% de los linfocitos circulantes son células más grandes y con citoplasma más abundante.
El núcleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es
densa.
Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamaño (18-24 m). El núcleo presenta forma
irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporción núcleo-citoplasma es
aproximadamente semejante. El citoplasma se tiñe de celeste plomizo y no presenta
granulaciones.

22
 TRABAJO PRÁCTICO N° 3:

ELEMETOS SANGUÍNEOS NORMALES Y PATOLÓGICOS –

ALTERACIONES DE LA SERIE BLANCA

Objetivos Generales
-Identificar los diferentes elementos sanguíneos normales y patológicos
-Desarrollar criterios para la clasificación de elementos patológicos
-Correlacionar los elementos encontrados con diferentes patologías y datos de contador
hematológico.

GLOBULOS ROJOS:

PROERITROBLASTO (1):
Célula voluminosa (20-30 um. de diámetro)
Núcleo: ocupa la mayor parte de la célula.
Cromatina con aspecto de esponja uno o dos
nucleolos teñidos de rosa por el giemsa.
Citoplasma: intensamente basófilo por el gran
contenido de ARN. Presenta sobre uno de los
costados del núcleo una formación redondeada que
se destaca por su coloración rosada: el arcoplasma
que corresponde al APARATO DE GOLGI y
CENTRO CELULAR.
Hay numerosos ribosomas. Escasos organoides
membranosos, excepto mitocondrias.

ERITROBLASTO BASOFILO (1):

Tamaño: menor (15-18 um.)
Núcleo: menor tamaño nuclear. Desaparición de los
nucleolos. Cromatina condensada en grumos.
Citoplasma: intensamente basófilo. El halo
perinuclear es menos notorio. Contiene mitocondrias.
Ferritina en mayor cantidad formando acumulos.

23
ERITROBLASTO POLICROMATÓFILO (2):
Tamaño: se sigue reduciendo 11-13 um.
Núcleo: menor tamaño, se va condensando la cromatina.
Citoplasma: comienza a cargarse de un tinte lilaceo, debido a la superposición de la basofilia
ribosómica con la acidofilia de la hemoglobina. A medida que los estadios progresan
predominan
los tintes rojizos sobre los azulados. Presentan mitocondrias donde se metaboliza el HEM.
Ferritina en acumulos groseros (siderosomas).

ERITROBLASTO ORTOCROMÁTICO (2):

Perdió la capacidad de división.
Tamaño: alrededor de 10 um.
Núcleo: picnotico, retraído.
Citoplasma: acidofilo (rosado).Menos
mitocondrias y ribosomas.
Gran cantidad de siderosomas.

RETICULOCITO:
Es la célula anterior que ha perdido el núcleo por
expulsión o lisis (aunque se acepta más lo
primero).
Contiene todavía algunos ribosomas y
mitocondrias. En un extendido coloreado con
Giemsa aparece de tamaño algo mayor que el
glóbulo rojo maduro y con una ligera
policromatofilia.
Pero con una coloración supravital (colorea los
elementos vivos, fuera del organismo) el
colorante precipita los ribosomas, formando una
sustancia retículo-filamentosa, que toma distintos
aspectos según la cantidad de ARN que
contienen, siendo los mas maduros aquellos que contienen menos ARN.

GLOBULO ROJO MADURO, ERITROCITO O HEMATIE:

Es un residuo celular desprovisto de núcleo en todos

los mamíferos.
Forma: disco bicóncavo.
Diámetro: 7,5 um.
Esta recubierto por una membrana cuya estructura
responde al modelo de mosaico fluido, al igual que
todas las unidades de membrana biológicas.
Tiene forma de disco bicóncavo

24
GRANULOPOYESIS:

Durante la maduración de la serie granulocítica se suceden una serie de cambios morfológicos

que consisten en la desaparición de los nucléolos, la reducción de la relación núcleo/citoplasma,
la condensación de la cromatina, la desaparición de la basofilia citoplasmática, la aparición de
las granulaciones primarias o azurófilas en el estadio de promielocito y de las secundarias o
específicas a partir del estadio de mielocito. Por último en esta serie de cambios morfológicos se
va a comenzar a producir la segmentación nuclear que se puede apreciar en el metamielocito,
para dar origen al polimorfonuclear en banda o cayado y por último a la célula más madura de
esta serie, el polimorfonuclear segmentado.

MIELOBLASTO:
Elemento iniciador de la
progenie.
Tamaño: aproxim. 20 um.
Núcleo: de gran tamaño,
ocupa casi toda la célula, con
una fina membrana nuclear
lisa y delgada y una cromatina
muy fina, muy delicada que
no hace condensación cerca de
la membrana nuclear. Suele
tomar el aspecto de una red o tamiz. Contiene uno o
dos NUCLEOLOS.
Citoplasma: se colorea de celeste claro, es apenas un
halo alrededor del núcleo tan voluminoso. Con el
microscopio común no se observan granulaciones. Sin
embargo el microscopio electrónico detecta la presencia
de lisosomas que en otras etapas van a constituir las
granulaciones inespecíficas.

PROMIELOCITO:
Tamaño: mayor que el
anterior (25-30 um.)
Núcleo: grande, pero la
relación núcleo citoplasma
es menor. Puede ser
redondo u ovalada,
generalmente es excéntrico.
La cromatina todavía es
laxa, aunque algo menos
que en el anterior. Presenta
NUCLEOLOS.
Citoplasma: presenta una zona clara perinuclear llamada arcoplasma (corresponde a la zona del
complejo de golgi y centro celular). Sigue siendo basófilo y ya son visibles con el microscopio
óptico numerosas granulaciones inespecíficas (se llaman así porque no permite identificar a la
célula como precursora de neutrofilo-eosinofilo-basófilo). Tambien son llamadas primarias.
Contienen enzimas y la más características es a mieloperoxidasa. Los gránulos primarios son
lisosomas rodeados por lo tanto de unidades de membrana.

25
 MIELOCITO (1):
Tamaño: 20-25 um.
Núcleo: ya no muestra NUCLEOLOS. La
cromatina comienza a mostrar
condensaciones.
Citoplasma: es todavía basófilo, pero
además de las granulaciones primarias
presenta en la zona del arcoplasma,
granulaciones específicas que permiten
hablar de mielocito neutrofilo-eosinofilo-
basófilo según el contenido de sus gránulos
específicos o secundarios. El mielocito es el
último elemento en el cual se presenta
división.

METAMIELOCITO:
Tamaño: algo menor que el mielocito.
Núcleo: de forma arriñonada con cromatina en forma
parcelada, mostrando zonas condensadas. No presenta
nucleolos.
Citoplasma: policromatofilo (intermedio entre azul y
rosado). Predominan las granulaciones específicas. Las
granulaciones primarias son escasas y van poco a poco
perdiendo su coloracion.

GRANULOCITO EN BANDA O CAYADO:

Tamaño: menor que el metamielocito.

Núcleo: en forma de “C” (bastón o cayado)
“S” o en una banda. Con cromatina condensada,
disposición parcelada.
Citoplasma: acidofilo (rosado) con
granulaciones específicas o secundarias. Las
granulaciones primarias ya no son visibles al
microscopio común.
De acuerdo a los gránulos que presenta
será neutrofilo, eosinofilo o basófilo.

GRANULOCITO MADURO: granulocito con núcleo segmentado.

26
GRANULOCITO NEUTRÓFILO:
Es el elemento más abundante del frotis normal
de un adulto
Núcleo: lobulado o segmentado. Presenta de 2
a 5 lóbulos que se van formando a partir de
estrangulaciones en el núcleo del granulocito en
cayado, que se van profundizando de manera
que van quedando los segmentos o lóbulos
unidos por filamentos de cromatina.
La cromatina tiene una disposición en mosaico,
con zonas de cromatina muy condensada y otras
de cromatina extendida. La mayor cantidad de
lóbulos indica mayor madurez de la célula.
Tamaño: de 12 a 14 um.
Citoplasma: rosado con granulaciones
específicas muy finas, que toman tanto los
colorantes ácidos como los básicos (de allí el
nombre de neutrófilos) y aparecen de color
violeta. Contienen enzimas como la fosfatasa
alcalina y sustancias de acción bactericida.

GRANULOCITOS EOSINÓFILOS:
Tamaño: 12-15 um.
Núcleo: predomina el núcleo
bilobulado, semejante a un anteojo.
Disposición de la cromatina en
mosaico.
Citoplasma: cubierto de granulaciones
esféricas de mayor tamaño que las
neutrófilos, coloreadas de color naranja
(o pardo rojizo) por la eosina.
Prácticamente cubren todo el
citoplasma y se consideran lisosomas.

GRANULOCITO BASÓFILO:

Tamaño: 10-12 um.

Núcleo: irregularmente lobulado.
Cromatina muy densa, masa nuclear
voluminosa en relación al citoplasma.
Citoplasma: rosado. Contiene
granulaciones grandes, irregulares en
forma y tamaño, de color azul oscuro,
casi negro, que a veces, por el aspecto
esférico de la célula viva, cuando se
transforma en disco por la desecación
(al realizar el frotis) quedan
superpuestas al núcleo cubriéndolo
parcialmente. Son solubles en agua,
por eso muchas se disuelven durante

27
la coloración. Contiene heparina e histamina.

ORIGEN DE LOS MONOCITOS:

Se acepta como único lugar productor de monocitos en el organismo, la médula ósea.

MONOBLASTO:

Tamaño: aproximadamente 20
um.
Es muy parecido al mieloblasto,
se diferencia de el en que el
núcleo presenta una ligera
indentacion (que hace recordar al
monocito maduro) presenta
tambien varios nucleolos. La otra
diferencia es que el citoplasma es ligeramente grisáceo y a veces marca pliegues.

PROMONOCITO:

Tamaño: algo mayor que el monoblasto.

Cromatina nuclear: con aspecto de fina red. Queda
restos de nucleolos. Núcleo de contorno irregular
con indentaciones.
Citoplasma: de un color grisáceo mas basófilo que
su predecesor.

MONOCITO:

Célula de mayor tamaño en el extendido (18-24 um)

Forma: irregular.
Núcleo: con lobulaciones incompletas como si se
replegara sobre si mismo, de modo que recuerda las
circunvoluciones del cerebro. A veces forma arriñonada.
Con forma abigarrada en herradura, indentado o
doblado.
Cromatina laxa, delicada, condensada en grumos, dando
un aspecto como de pinceladas desparejas. No presenta
nucleolos.
Citoplasma: grisáceo. No presenta gránulos pero si un
polvillo muy fino, en el limite de visibilidad del microscopio y pequeñas vacuolas. Ese polvillo
esta constituido por acumulos de lisosomas.

LINFOPOYESIS: Se originan en médula ósea y luego sufren procesos de maduración y

diferenciación en órganos linfáticos secundarios.

28
LINFOBLASTO:

Tamaño: aproxim. 20 um.

Núcleo: grande, con membrana nuclear
gruesa debido a que la cromatina se condensa
cerca de la membrana. Esto permite
diferenciarlo de un mieloblasto y monoblasto.
Citoplasma: basófilo. Sin gránulos. Es
escaso porque el núcleo ocupa gran parte de
la célula.

PROLINFOCITO:

Tamaño: 15-18 um.

Núcleo: algo más pequeño, cromatina más condensada.
Generalmente es excéntrico. Todavía se identifican
nucleolos.
Citoplasma: mas abundante que en el linfoblasto. Sin
gránulos.

LINFOCITO MADURO:

Podemos encontrarlo como linfocito pequeño

o linfocito mediano y grande.
LINFOCITO PEQUEÑO:
Tamaño: aprox. 9 a 14 um.
Núcleo: color púrpura, cromatina muy
condensada. A veces puede atisbarse algún
nucleolo. Ocupa casi toda la célula.
Generalmente es redondo. A veces presenta
una escotadura.
Citoplasma: azul celeste muy escaso.

29
LINFOCITO GRANDE:

Tamaño: mayor 12-15 um. (A veces tamaño de un

monocito).
Núcleo: cromatina densa. Se ubica oralmente en forma
excéntrica.
Citoplasma: más abundante que en el pequeño y
mediano. Color celeste. Suele contener algunas
granulaciones muy pequeñas de color púrpura.

CELULA PLASMATICA:
Representa el 1-4% de las células nucleadas
de MO en un sujeto normal y es el estadio
final de la maduración y transformación del
linfocito B maduro. Es una célula redonda u
ovalada que mide entre 11 y 15 um. de
diámetro. Se caracteriza por el núcleo
redondo, denso y excéntrico con la
heterocromatina dispuesta en masas groseras
de disposición radial (“en rueda de carro”).
Por lo general no presentan nucléolo. El
citoplasma puede tener frecuentemente bordes
de apariencia irregular y se tiñe de azul
violáceo muy intenso, indicio de su riqueza en
RNA con una zona clara cercana al núcleo
denominada "arcoplasma". Normalmente no
contienen granulaciones, pero pueden mostrar
vacuolas o cuerpos de inclusión pálida o rosa,
que corresponden a acumulos de
inmunoglobulinas (cuerpos de Russell).
Cuando estas inclusiones son muy numerosas,
el aspecto de la célula es el de una mórula (célula de Mott). En algunos procesos reactivos que
cursan con estimulación antigénica crónica (por ej. artritis reumatoidea activa) pueden aparecer
en SP en un pequeño número. Se pueden observar también plasmocitos con inclusiones que
representan acumulos de inmunoglobulinas en la cisterna perinuclear con la subsecuente
invaginación dentro del núcleo, que da la apariencia de ser intranucleares. Estas estructuras se
conocen como cuerpos de Dutcher.
En algunos pacientes con mielomas IgA se pueden observar células plasmáticas “flameadas”
caracterizadas por una coloración eosinofilica en la periferia o a veces en el citoplasma
completo. En raras ocasiones se pueden observar plasmocitos multinucleados o células
plasmáticas inmaduras (plasmoblastos) en aspirados de MO normal.

SERIE MEGACARIOCITICA-PLAQUETARIA

En la serie megacariocítica las divisiones nucleares no son seguidas de divisiones

citoplasmáticas, lo que da lugar a la existencia de células poliploides de gran tamaño. Se

30
distinguen cuatro estadios evolutivos: el megacarioblasto, el promegacariocito, el megacariocito
granular y el megacariocito formador de plaquetas o maduro.

MEGACARIOBLASTO:
Es la célula descendiente de la SC, con
orientación plaquetogénica. Su tamaño
oscila entre 10 - 25 micras. El núcleo
generalmente tetraploide u octaploide es
único, grande, ovalado o bilobulado con
cromatina laxa y numerosos nucléolos. El
citoplasma, es intensamente basófilo,
agranular y puede presentar algunas
prolongaciones a modo de seudópodos
muy característicos.

PROMEGACARIOCITO:
Mide 30 a 50 micras y se identifica
fácilmente en MO por su gran tamaño y por el
aspecto característico de su citoplasma que
posee bordes mal limitados y emite
numerosas prolongaciones. El núcleo es
multilobulado, su cromatina es densa y no
posee nucléolos. En el citoplasma persiste su
tonalidad basófila, con numerosas
granulaciones azurófilas que cubren distintas
zonas.

MEGACARIOCITO GRANULAR:
Es característico su gran tamaño (80
micras o más) y su elevada ploidía. Su
citoplasma amplio no posee basofilia y
está totalmente cubierto por granulación
azurófila rojo rosada. El núcleo es
multilobulado o segmentado con
cromatina condensada sin nucléolo.

31
MEGACARIOCITO MADURO ACTIVO:
En este estadio el núcleo sigue siendo
lobulado pero más compacto. Finalizada
la síntesis de ADN se inicia en el
citoplasma la granulogénesis que dará
origen a las plaquetas. Los gránulos
azurófilos se distribuyen especialmente
en la periferia, en pequeños agregados
rodeados por una zona hialina
citoplasmática correspondiente a las
membranas de demarcación que irán
delimitando las futuras plaquetas. Las
plaquetas son finalmente liberadas como
fragmentos citoplasmáticos por fusión de
las membranas de demarcación.

FORMULA LEUCOCITARIA NORMAL

Valores de referencia para adultos sanos

Valor relativo (%) Valor absoluto (x109/L)

Cayados 0–2 0 – 0,2
Neutrófilos Segmentados 50 – 70 2,3 – 6,5
Eosinófilos 1–5 0,05 – 0,5
Basófilos 0–1 0 – 0,1
Linfocitos 25 – 40 1,5 – 4,0
Monocitos 3–8 0,1 – 0,8

ALTERACIONES CUANTITATIVAS
Se refiere a una variación en la cantidad de los diferentes tipos leucocitos o bien a variaciones
en el recuento total.
Se evalúan mediante un conteo total de leucocitos y conteo diferencial de cada uno de ellos.
Pueden ser trastornos malignos o benignos.
Los trastornos malignos pueden ser ocasionados por transformación neoplásica de células
progenitoras
Los trastornos benignos pueden ser adquiridos o hereditarios.

1-ALTERACIONES FISIOLÓGICAS

Son todas aquellas alteraciones desencadenadas por causas diferentes a la enfermedad

subyacente del paciente, son transitorias y no necesitan tratamiento ya que NO constituyen un
parámetro de enfermedad.
Edad
Embarazo
Stress emocional
Ejercicio
Raza (algunas personas de raza negra tienen tendencia a leucopenia)

2-ALTERACIONES PATOLÓGICAS

32
2.1-LEUCOCITOSIS: >11.0 x 109/L (Neutrofilia, eosinofilia, basofilia, linfocitosis,
monocitosis)
2.2-LEUCOPENIA: < 4.0 x 109/L (Neutropenia, eosinopenia, monocitopenia, linfopenia)
2.3-REACCIONES LEUCEMOIDES entre 20.0 – 50.0 x 109/L

2.1 – LEUCOCITOSIS

Neutrofilia: > 6.5 x 109 /L

Aumento absoluto de los neutrófilos
La causa más común es la infección bacteriana. Mecanismo: La invasión bacteriana estimula los
precursores en la M.O, esto intensifica la proliferación, el pool marginal se desplaza hacia el
pool circulante; reflejándose en la sangre como leucocitosis y neutrofilia.
También es causada por quemaduras, medicamentos, lesiones, y leucemia mieloide crónica.
(LMC).
Los corticoides, actividad física intensa, situaciones de stress pueden manifestarse con
neutrofilias sin desviación a la izquierda.

Eosinofilia: > 0.5 x 109 /L

Puede verse en infecciones con parásitos metazoarios, trastornos alérgicos, cáncer y estados
inflamatorios crónicos.
Se observa también en el síndrome de Loeffler, el cual parece ser producido por una reacción
alérgica. Una causa común es la migración del parásito Ascaris lumbricoides a través del tracto
respiratorio. Otros parásitos de la familia Ascaris también pueden producir el síndrome. Entre
las posibles causas adicionales se puede incluir la alergia a medicamentos, por ejemplo
antibióticos sulfonamida. También se puede presentar en coexistencia con tumores sólidos.

Basofilia: > 0.1 x 109 /L

Aumento absoluto de los basófilos. Está vinculada con reacciones de hipersensibilidad
inmediata y afecciones mieloproliferativas crónicas (LMC). Se observa también en
enfermedades inflamatorias del intestino, el mixedema y después de la exposición a la radiación

Linfocitosis: > 4 x 109/ L

Incremento absoluto en el número de linfocitos.
Generalmente responde a una infección viral.
Un marcado incremento en el número de linfocitos puede estar asociado a una leucemia linfática
crónica.

Monocitosis: > 0.8 x 109/ L

Incremento absoluto del número de monocitos.
Este estado se encuentra asociado a períodos largos y crónicos de infección bacteriana
(brucelosis, tuberculosis, fiebre tifoidea)
Se presenta en la etapa de recuperación de las infecciones agudas.
Otras causas son leucemia monocítica y enfermedades del colágeno

2.2 – LEUCOPENIAS

Neutropenias: < 2.3 x 109 /L

Disminución en la producción medular: aplasia medular, agentes citotóxicos que deprimen la
división celular (sulfamidas, cloranfenicol), hematopoyesis ineficaz.
Exceso de destrucción por Ac antineutrófilos, por medicamentos como la fenotiazina.
Se observa en enfermedades virales, bacterianas y protozoarias (paludismo, tifo, etc)
Fase inicial de la infección: la salida de los PNN a los tejidos es mayor que la salida medular
(gran demanda tisular).

Eosinopenia: < 0.05 x 109 /L

33
Disminución en la cantidad de eosinófilos. Difícil de establecer debido a su bajo recuento.
La ACTH aumenta los PMN circulantes pero disminuye los eosinófilos circulantes.
Se presenta en situaciones estresantes agudas, reacciones inflamatorias y con la administración
de glucocorticoides.
La infección bacteriana puede causar disminución debido a una marginación creciente y a la
migración de estas células a los tejidos, pero la recuperación se puede acompañar de eosinofilia
leve

Monocitopenias: < 0.1 x 109/L

Se encuentra en trastornos de las células progenitoras como en la anemia aplásica, en las
leucemias, y después de la terapia con glucocorticoides.
En la fase inicial de procesos infecciosos.

Linfopenias: < 1.5 x 109/L

Disminución en el número de linfocitos
Puede originarse por: falla en la producción, exceso en su destrucción, o pérdidas celulares a
través de los conductos linfáticos del intestino.
Las linfopenias por defectos en la producción son característica de algunas IDP, tales como:
inmunodeficiencia severa combinada, síndrome de DiGeorge completo, hipoplasia cartílago-
pelo, inmunodeficiencia común variable, SIDA

2.3 - REACCION LEUCEMOIDE

Reacción benigna de leucocitos caracterizada por leucocitosis con muchos precursores

inmaduros de leucocitos circulantes.
Esta respuesta puede ser linfocítica, eosinofílica, así como neutrofílica.
Puede producir un cuadro sanguíneo indistinguible de la leucemia mielocítica crónica.
Es transitoria y desaparece cuando el estímulo desencadenante se elimina, por ejemplo
extirpación del tumor y control de la infección.
Como sucede con la leucemia, la persona que presenta una reacción leucemoide presenta una
proliferación desorganizada de glóbulos blancos inmaduros en la sangre y en la médula ósea.

REACCION LEUCEMOIDE NEUTROFILICA

Se encuentra aumento de los PNN, acompañados de mielocitos y metamielocitos.
Causas:
 Neoplasias Broncopulmonares y gástricas
 Tumores malignos de mama y próstata
 Algunas infecciones bacterianas: Osteomielitis, tuberculosis.

ALTERACIONES CUALITATIVAS

1-ALTERACIONES NUCLEARES

Anomalía de Pelger Hüet

Es un trastorno nuclear hereditario autosómico dominante o adquirido debido a quimioterapia,

síndromes mieloproliferativos agudos o crónicos, quemaduras, reacciones a fármacos e
infecciones. Hay una falla en el desarrollo del núcleo durante la diferenciación terminal, el
núcleo es en forma de nuez o maní. Hay hipercondensación de la cromatina. Se observa
hiposegmentación nuclear .No hay pérdida de la función celular.

34
Hipersegmentación Nuclear

Trastorno hereditario (autosómico dominante) o adquirido. Se debe a una anormalidad en la

maduración del núcleo (síntesis de DNA). Presentación de PMN con 6 o más lóbulos. Células
de mayor tamaño que las normales. Se observa asociada a la eritropoyesis megaloblástica.
También puede estar asociado a infecciones crónicas o a déficit de vitamina B12, folatos, etc.

2-ALTERACIONES CITOPLASMATICAS

Síndrome de Chediak – Higashi.

Esta rara enfermedad autosómica recesiva se caracteriza por albinismo parcial, gránulos
lisosómicos gigantes en la mayoría de las células granulosas (aunque también se observan en
linfocitos y monocitos), y mayor susceptibilidad a las infecciones. Es fácil observar las células
sanguíneas anormales en los frotis sanguíneos de rutina. La enfermedad se diagnostica por lo
general en niños. Hay diversas anomalías en los neutrófilos incluyendo neutropenia moderada,
reducción en la quimiotaxis de neutrófilos. Además, en estudios microbicidas, se observa que
los gránulos primarios gigantes se degranulan con lentitud, y por lo tanto, se retarda la muerte
de las bacterias fagocitadas.

Anomalía de Alder Reilly.

Trastorno de tipo autosómico. Presencia de gránulos azurófilos agrupados en racimos en el

citoplasma de granulocitos, monocitos y linfocitos. Se diferencian de las granulaciones tóxicas
ya que se presentan en otras células diferentes a los neutrófilos y la ausencia de vacuolas
tóxicas. Esta asociada a mucopolisacaridosis.

Anomalía de May – Hegglin.

Trastorno autosómico dominante. Asociado con hemorragias leves, macroplaquetas con

escasos gránulos y trombocitopenia. Se caracteriza por aparición en los neutrófilos segmentados
de unos cuerpos de inclusión muy similares a los cuerpos de Döhle; se observan coloreados azul
pálido, con la diferencia que por lo general no están
hacia la periferia de la célula sino distribuidos indistintamente en el citoplasma.

Cuerpos de Döhle.

No son exclusivos de los neutrófilos, igualmente se pueden encontrar en el citoplasma de los

monocitos, se observan como inclusiones redondeadas basófilas únicas o múltiples que se
depositan en la periferia de las células y son poco nítidos. La presencia de estas inclusiones
indica hiperactividad celular. Se encuentran en condiciones tóxicas tales como Fiebre
escarlatina, sepsis, quemaduras, embarazo y tuberculosis

Granulaciones Tóxicas.

Las granulaciones tóxicas de los segmentados neutrófilos son gránulos hipertrofiados que le
dan un aspecto hipergranular al citoplasma de los neutrófilos que junto con las vacuolas y los
cuerpos de Döhle se encuentran en condiciones tóxicas como infecciones, septicemia,
quemaduras. Son gránulos primarios que debido a algún desbalance en la maduración del
neutrófilo no lograron ser eliminados eficazmente.

Cuerpos o bastones de Auer.

Inclusiones intracitoplasmáticas en forma de varilla o de bastón que se observa en los

mieloblastos, promielocitos y monoblastos. Se cree que son gránulos azurófilos que se fusionan,

35
tienen afinidad por la eosina. Se encuentran en la leucemia mieloide aguda y durante la crisis
blástica de la leucemia mieloide crónica.

Linfocitos atípicos

Llamados también células linfomonocitoides, linfocitos activados, inmuncitos, etc. Miden de

15µm a 30µm, núcleo irregular, indentado, excéntrico y puede observarse nucleolos. El
citoplasma es amplio, color azul tenue o intenso, y puede presentar gránulos azurófilos y
vacuolas. Estas células pueden observarse en mononucleosis infecciosa, hepatitis viral, herpes
zoster, enfermedades autoinmunes y normalmente pueden hallarse hasta en 5%.

Vacuolas

Se pueden presentar en el citoplasma de neutrófilos tóxicos, monocitos, eosinófilos y menos

frecuentemente linfocitos.
Al MO se observan como puntos blancos en sacabocado.
En frotis realizados del frasco de hemograma estas vacuolas se pueden presentar en muestras
envejecidas por fagocitosis de las sales del anticoagulante, por lo tanto para su confirmación
resulta imprescindible el extendido de punta de aguja.

Degranulación

Neutrófilo sin granulaciones, “citoplasma limpio”, indicativo de hemopatías severas, SMD y

SMP. Sepsis de mala evolución, etc.

36
 TRABAJO PRÁCTICO 4 Y 5

ALTERACIONES SERIE ROJA - ANEMIAS

HEMATIES NORMOCÍTICOS - NORMOCRÓMICOS

Discos cuya biconcavidad hace que aparezcan con cierta palidez central. Miden
aproximadamente de 7,2 µm a 7,4 µm.

Las alteraciones eritrocitarias se dividen en:

♦ Alteraciones en tamaño (Anisocitosis)
♦ Alteraciones en su forma (Poiquilocitosis)
♦ Alteraciones de color (Anisocromía)
♦ Inclusiones anormales.

♦ Alteraciones en el tamaño.

Pueden ser de dos tipos:

Macrocitos: Hematíes que presentan un tamaño superior al normal (más de 9 µm) y su
expresión máxima es el megalocito. Suelen aparecer en la anemia megaloblástica debida a
déficit de vitamina B12 o ácido fólico. Se suele observar cuando hay un aumento de la actividad
eritropoyética, como un mecanismo de compensación a la pérdida de los hematíes, sea por
anemia severa o hemorragias. En la sangre periférica se pueden observar como hematíes
grandes policromatófilos o reticulocitos.

Microcitos: Hematíes que presentan un tamaño inferior al normal (menos de 6 µm) y se

encuentran en pacientes con anemia ferropénica y talasemias.

♦ Alteraciones en la forma

Esferocitos: Son hematíes esféricos, no son bicóncavos, presentan un diámetro inferior al

normal pero más grueso. Su vida media es de 14 días, producen taponamiento de los vasos
sanguíneos. Se encuentran en la esferocitosis hereditaria o enfermedad de Mihkowski-
Chauffard (defecto congénito de la membrana eritrocitaria). También pueden ser adquiridos por
factores extraeritrocitarios (autoanticuerpos, quemaduras extensas, etc.)

Codocitos o Target cells: Llamados también dianocitos. En la región central presentan

un área con mayor contenido hemoglobínico (zona densa). La interfase entre la membrana
celular y el centro es transparente. Se encuentran en hemoglobinopatías (Hb C), talasemias,
anemia ferropénica y en algunas hepatopatías crónicas con aumento de colesterol y fosfolípidos.

Drepanocitos: Son hematíes con HbS precipitada. Su apariencia es propia del estado
homocigoto de la hemoglobina S, aunque también se puede presentar en estados de
heterocigozis.

Eliptocitos: Los hematíes son alargados (ovalocitos). Se encuentran en la eliptocitosis

hereditaria. Su presencia se debe a una alteración congénita de la membrana del hematíe,
aunque puede ser adquirida en caso de una anemia megaloblástica, ferropénica o arregenerativa.

Equinocitos: Son aquellos que presentan membrana ondulante e irregular. Se encuentran en

algunas anemias hemolíticas. Este fenómeno puede ser inducido in vitro exponiendo los

37
hematíes a una solución hipertónica. También se pueden encontrar en pacientes con IRC,
hepatopatías, déficit de PK, etc.

Acantocitos: Las prominencias de la membrana eritrocitaria son más aguzadas (alargadas) y

distribuidas irregularmente. Se encuentran en la acantocitosis que se caracterizan por la ausencia
de lipoproteínas plasmáticas. También pueden encontrase en pacientes con hepatopatías,
dislipidemias, hipotiroidismo, etc.

Dacriocitos: Son hematíes en forma de lágrima. Se encuentran en la anemia ferropénica,

anemia megaloblástica y talasemia. También se encuentran en situaciones en las que la MO
padece alguna patología severa (SMD, MFI, etc) y en esplenomegalia.

Esquistocitos: Son fragmentos hemáticos. Se encuentran en anemias hemolíticas

microangiopáticas (SUH, PTT, etc.), quemaduras, etc.

Estomatocitos: Son hematíes que en lugar de una depleción central clara tienen una banda
pálida central que les da un aspecto de boca. Se hereda como carácter autosómico dominante.
Esta enfermedad es causada por anormalidad hereditaria de la membrana eritrocitaria. También
se pueden encontrar en pacientes con hepatopatías y dislipidemias.

Excentrocitos: Son hematíes con distribución irregular de la hemoglobina. Su tamaño es

inferior al normal y se caracteriza por poseer contornos parcialmente arrugados, pero además se
observa una distribución irregular de la hemoglobina que aparece desplegada de la parte interna
hacia uno de los extremos.

Knocitos: Son hematíes que presentan un estoma o boca en la región central completamente
coloreada y lo demás incoloro. Morfológicamente es todo lo contrario a las características del
estomatocito. Se encuentran en algunas anemias como las ferropénicas.

♦ Alteraciones de color

Aquí observamos las diferentes tonalidades de color de los hematíes dependiendo del contenido
hemoglobínico u otros. Tenemos:

Hipocromía: Son hematíes con disminución del contenido de la hemoglobina y dependiendo de

la cantidad de este pigmento es que observamos a los hematíes con diferentes caracteres de
color. Aquí están incluidos los anulocitos, que son hematíes en forma de anillo en que solo la
membrana eritrocitaria está coloreada y que se traduce en una hipocromía de grado severo
(+++).

Pseudo - Hipercromía: Son hematíes ávidos de hemoglobina. Pueden encontrarse en caso de

enfermedades como la policitemia vera o la policitemia fisiológica y esferocitosis hereditaria

Policromatofilia: Presencia de hematíes con tonalidad (azul y rojo) morada. Se le relaciona con
inmadurez celular, células nucleadas, presencia de reticulocitos, macrocitos, etc. Esto debido a
su elevada cantidad de ARN.

Anisocromía: Diferentes tonalidades de color como hematíes hipocrómicos, hipercrómicos,

normocrómicos y policromatófilos. Se encuentran en ciertas anemias refractarias.

♦ Inclusiones anormales

Punteado basófilo: Son gránulos basófilos presentes en el citoplasma de los hematíes. Indica
una alteración de la eritropoyesis más que un aumento de la misma. Se produce en muchas
enfermedades sanguíneas: talasemia, anemias megaloblasticas, infecciones, hepatopatías,

38
intoxicación por plomo y otros metales pesados, hemoglobinas inestables y deficiencia de
pirimidina-5´-nucleotidasa. Actualmente el consumo de ciertos fármacos también puede
producir este fenómeno.

Cuerpos de Heinz: Son formaciones redondeadas de hasta 3 µm de diámetro localizadas

habitualmente en la periferia de la célula. Se observan con colorantes para reticulocitos. Estos
cuerpos son abundantes en sujetos esplenectomizados.

Anillos de Cabot: Se cree que sean restos de membrana nuclear eritroblástica o restos después
de una mitosis anormal. Se observan en forma de anillo u ocho invertido. Pueden ser
precipitados de ARN o proteína carente de importancia diagnóstica. Su presencia indica severas
signos de diseritropoyesis.

Cuerpos de Howel-Jolly: Son restos de cromatina nuclear, resultados de la pérdida del núcleo
por parte del eritroblasto ortocromático hasta la conversión del hematíe. Se les considera signos
de regeneración celular. Pueden observarse (habitualmente aislados) en un pequeño porcentaje
de hematíes en la anemia perniciosa. Las células que los contienen aparecen habitualmente tras
la esplenectomía y cuando se ha producido una atrofia esplénica. En general, solo se encuentran
unas cuantas células de este tipo, pero pueden ser muy numerosas en los casos de enfermedad
celiaca, en la que hay una atrofia esplénica y una deficiencia de folato concomitante.

Cuerpos de Pappenheimer: Los cuerpos de Pappenheimer son pequeñas inclusiones

eritrocitarias basòfilas (casi negras) dispuestas periféricamente. Habitualmente, solo hay una
pequeña cantidad en el interior de la célula. Están formados por hemosiderina y su presencia se
relaciona con una sobrecarga de hierro y con hipoesplenismo. A veces, se encuentran en la
mayoría de los hematíes circulantes. Su naturaleza puede confirmarse por medio de una tinción
de Perls. Corresponden a los gránulos sideroticos de los siderocitos y nunca se encuentran en
grandes cantidades en el interior de las células, como el clásico punteado basofilo. Sin embargo,
en una sola célula se pueden encontrar ambos elementos, es decir, el punteado basofilo y los
cuerpos de Pappenheimer. Con la tinción de Perls, los primeros de estos gránulos se tiñen de
rosa mientras que los últimos lo hacen de azul.

Siderocitos: Son hematíes con contenido de hierro libre no hemoglobínico de color verde
azulado.

Gránulos de Shuffner: Son gránulos que presentan algunos hematíes en caso de parasitismo
por plasmodium vivax.
Gránulos de Maurer: Son gránulos de color violeta oscuro que se encuentran en pacientes con
parasitismo por plasmodium falciparum.

ANEMIA:
Se define anemia como la incapacidad de la sangre para transportar oxígeno.
Según la definición de la OMS se acepta que existe Anemia cuando la concentración de
HEMOGLOBINA se halla por debajo de los límites establecidos en función de la edad y el
sexo; independientemente de que la concentración de eritrocitos se encuentre normal o incluso
elevada.
EDAD CONCENTRACION DE HEMOGLOBINA (g/dL) MENOR A ….
Recién nacidos (a termino) 14,0
Niños de 3 meses 9,0
Niños de 2 años 11,0
Mujeres (no embarazadas) 11,5
Varones 12,0
Mujeres embarazadas 11,0

39
CLASIFICACION MORFOLÓGICA:

Se debe recordar que el VCM se correlaciona con la HCM (que informa el contenido medio
hemoglobínico de los eritrocitos circulantes) de forma que disminuirá la HCM al hacerlo el
VCM (anemia microcítica hipocrómica) y aumenta cuando aumente el VCM (anemia
macrocítica “hipercrómica”).
Siempre se debe recordar que en determinadas situaciones el VCM puede estar afectado por
factores no debidos al tamaño de los eritrocitos, como alteraciones en la forma o la
deformabilidad celular, lo que obedece a los métodos automatizados para medir el VCM por lo
tanto, siempre que analicemos un histograma, debemos tener en cuenta que el VCM es un valor
medio y no informa sobre la homogeneidad celular y es necesario correlacionarlo con el índice
ADE y hacer una inspección al microscopio del frotis para que una posible anisocitosis no pase
desapercibida.

a) ANEMIAS MICROCITICAS (VCM< 82 fl)

 Anemia Ferropénica. Deficiencia de Hierro.

 Talasemias. Defectos en la síntesis de Hemoglobina.
 Anemia secundaria a enfermedades crónicas. Mala disponibilidad del hierro
orgánico.
 Anemia Sideroblástica. Defectos en la síntesis del grupo HEM.

b) ANEMIAS NORMOCITICAS (VCM: 82 – 98 fl)

 Anemias hemolíticas.
 Aplasia Medular.
 Invasión Medular.
 Anemia secundaria a enfermedades crónicas.
 Anemia secundaria a procesos hemorrágicos agudos.
 Anemias tempranas de otras anemias.

c) ANEMIAS MACROCITICAS (VCM> 98 fl)

i. HEMATOLOGICAS. (VCM > 115 fl)

 Anemias megaloblásticas. Deficiencia de folato o vit B12

 Anemias aplásicas.
 Anemias hemolíticas con crisis reticulocitaria.
 Síndromes mielodisplásicos.

ii. NO HEMATOLOGICAS. (VCM < 115 fl)

 Anemia secundaria a abuso de alcohol

 Anemia secundaria a Hepatopatía crónica
 Anemia secundaria a Hipotiroidismo
 Anemia secundaria a Hipoxia.

40
CLASIFICACIÓN FISIOPATOLOGICA DE LAS ANEMIAS

ANEMIAS ARREGENERATIVAS:

En este tipo de Anemias también llamadas Arregenerativas, la medula ósea no presenta una
capacidad regenerativa normal y no se cumple una relación inversa entre la disminución de la
concentración de la hemoglobina y el aumento de Reticulocitos. Esto es, la Medula Ósea no
puede responder adecuadamente al grado de anemia.
 Defecto de proliferación y diferenciación de stem cells: aplasia medular,
leucemia, mielodisplasias.
 Defecto de proliferación y diferenciación de progenitores de los GR: aplasia
roja pura, insuficiencia renal, enfermedades endocrinas, etc.
 Defecto en síntesis de DNA: deficiencia de vitamina B12 y folatos.
 Defecto en síntesis de Hemoglobina: deficiencia de fierro, talasemias.
 Mecanismos múltiples o desconocidos: anemia de enfermedades crónicas,
infiltración medular (metástasis), anemias sideroblásticas.

ANEMIAS REGENERATIVAS:

En general, obedecen a una perdida periférica de eritrocitos por hemorragias o hemólisis. Son
anemias regenerativas, es decir que la medula presenta una capacidad de respuesta normal y
existe una relación inversa entre el grado de anemia y el aumento de Reticulocitos.

 DEFECTOS INTRÍNSECOS:
- De membrana: esferocitosis, acantocitosis, etc.
- De enzimas: deficiencias de G-6-PD, piruvato kinasa, etc.
- De globinas: enfermedad de las células falciformes (HbS), Hemoglobinas
inestables, etc.
 DEFECTOS EXTRÍNSECOS:
- Mecánicos: microangiopatía, prótesis, etc.
- Químicos o físicos: hemólisis por drogas, venenos.
- Infecciones: clostridium, malaria, otras septicemias...
- Anticuerpos: autoinmune, aloinmune, drogas.
- Hiperactividad monocito-macrófago: hiperesplenia.
- Pérdida de sangre: hemorragia aguda.

RECUENTO DE RETICULOCITOS

Los Reticulocitos son eritrocitos no nucleados, inmaduros, que contienen ARN y que continúan
sintetizando hemoglobina después de la pérdida del núcleo.

El carácter regenerativo o arregenerativo de una anemia puede conocerse a través del recuento
de Reticulocitos. Además, el recuento de Reticulocitos sirve para el seguimiento en el
tratamiento de ciertas anemias. Por ejemplo, la respuesta de los reticulocitos en el día 6 después

41
de la terapia confirma la respuesta a la terapia con folato o con B12 siempre que sólo se hayan
dado dosis bajas, en una anemia por déficit de folato o cabalamina. Podemos observar los
reticulocitos al microscopio óptico mediante la tinción con colorantes vital, azul de metileno o
azul brillante de cresilo. Estos colorantes dan lugar a la precipitación de los restos de ARN, y se
observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la célula.
El número de reticulocitos en sangre circulante es, probablemente el mejor y más sencillo
indicador de la eritropoyesis. Un aumento puede interpretarse como indicación de una elevada
demanda de nuevos eritrocitos y un correcto funcionamiento de la médula ósea. Por el contrario
cuando la demanda disminuye o la médula ósea falla en sus funciones, la cifra de reticulocitos
baja.
Según el grado de maduración que posea el reticulocito presentará un modelo de reticulocito
distinto, de ovillo denso en el caso de los más inmaduros o de gránulos escasos para los más
maduros

PROCEDIMIENTO:

1) Se prepara un tubo que ya contenga el colorante (azul brillante de cresilo).

2) La sangre debe ser anticoagulada con EDTA-Na2. (Debido a que los Reticulocitos
también maduran in vitro, es aconsejable que la sangre utilizada se haya extraído
recientemente, como máximo 6 horas antes de su análisis). Añadir 2 gotas de sangre a
uno de los tubos ya preparados que contienen 100 ul de colorante.
3) Mezclar e incubar durante 10-15 minutos a 37ºC.
4) Volver a mezclar la suspensión
5) Realizar un extendido
6) Dejar secar al aire
7) Una vez realizado todo esto observar al microscopio con el objetivo de 100x con aceite
de inmersión. En la coloración, los hematíes se tiñen de color verde amarillento y los
Reticulocitos se diferencian porque presentan en su interior unos hilos finos de color
azul.

50 hematíes

X= 5 campos

Luego se procede a contar los Reticulocitos en 5 campos, por ejemplo:

También se pueden contar 10 campos homogéneos y luego sacar un promedio y se obtiene así
el porcentaje. Si se utiliza esta técnica conviene moverse aleatoriamente por el preparado
buscando zonas de distribución homogénea realizando el recuento cada 2 o 3 campos. Recordar
que los campos en los que no se encuentran reticulocitos deben considerarse en el cálculo final.
Así por ejemplo para un paciente sano podríamos tener:

42
2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 2 = 1,1 %
10

Los Reticulocitos pueden expresarse de diferentes maneras:

PORCENTAJE DE RETICULOCITOS:
El porcentaje de Reticulocitos se determina en al menos 1,000 hematíes. El recuento de
Reticulocitos se determina multiplicando el porcentaje de Reticulocitos por el recuento de
hematíes.
Los adultos normales muestran un recuento de Reticulocitos de 0.5 a 2 %.
En los recién nacidos, el porcentaje oscila entre 2 a 6%.

VALOR ABSOLUTO:
Se expresa como Nº de Reticulocitos/mm3. Para adultos, el valor de referencia se sitúa entre
40.000 – 60.000.

VALOR CORREGIDO I:
Si se expresan los Reticulocitos en porcentaje van referidos a la concentración normal de
eritrocitos y no tiene en cuenta la salida prematura de Reticulocitos desde la medula ósea, por
ello siempre debe corregirse en función de la intensidad de la anemia:

% Ret x Hto paciente (%)

Hto normal (%)

VALOR CORREGIDO II:

En condiciones normales los Reticulocitos permanecen 4 días en la medula ósea y tardan de 1-2
días en sangre periférica en madurar; pero si hay anemia, el estimulo eritropoyético
compensador disminuye el periodo de maduración intramedular y se alarga en sangre periférica,
haciendo que el recuento de Reticulocitos sea falsamente elevado. Esto se conoce como
"desviación reticulocitaria" y se observa en el frotis por la aparición de hematíes grandes con un
color azulado. Este es el motivo por el cual suele corregirse por el periodo en días que tardan los
Reticulocitos en madurar a eritrocitos, y a esto se le llama índice de producción reticulocitaria
(IPR).

IPR = Valor corregido I

Factor

El factor en condiciones normales es de 1 y aumenta en 0,5 por cada 10% de disminución del
Hto.

43
 Reticulocitos 100 x – Azul Brillante de Cresilo
TRABAJO PRÁCTICO N° 6

Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs

FUENTE: UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATAFACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
CATEDRA DE ANALISIS CLINICOS I (HEMATOLOGIA)

A. TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR

SEDIMENTACION

a) Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2 % en salina

fresca (véase más abajo el apartado C. Preparación de la suspensión globular al 2%).
b) Agregar una gota de la suspensión globular, a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-
AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn.
c) Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A1, B y O al 2%
d) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
e) Leer primero los controles y luego los problemas microscópicamente en visor y
macroscópicamente.
f) Scores de lectura:
+++ un gran aglutinato
++ varios aglutinatos grandes
+ muchos aglutinatos pequeños
 pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo
- negativo no se observan aglutinatos

B. TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO

a) Tomar una muestra de suero libre de hematíes.

b) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los
siguientes hematíes:
1) hematíes A conocidos
2) hematíes B conocidos
3) hematíes del propio individuo
4) hematíes O conocidos
c) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
d) Leer primero los controles y luego los problemas, microscópicamente en visor y
macroscópicamente.

C. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2%

a) Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn.
b) Llenar el tubo con solución fisiológica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto.
c) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de
resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución
fisiológica.
d) Tomar una gota de culot (50 l) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la
suspensión al 2%.
D. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA

a) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota.

b) Agregar una gota de anti-A absorbido y mezclar bien con una varilla de punta fina.
c) Al terminar de mezclar, disparar el cronómetro.

44
d) Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto.

Los siguientes cuadros resumen los posibles resultados:

Anti A Anti B Anti AB Grupo ABO

Glóbulos rojos + - + A
problema - + + B
- - - O
+ + + AB

GR A GR B
- +
Suero problema + -
+ +
- -
GR AB Grupo ABO
+ A
+ B
+ O
- AB

E. TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh

a) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn.

b) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la
muestra.
c) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm.
d) Desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se hará microscópicamente con un
visor y macroscópicamente.
e) Proceda de la misma manera con los tubos controles.

E.1 Controles

a) Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + anti-D

b) Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D
c) Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB.

E.2 Reacciones

 Positiva: los hematíes D (Rho) positivos permanecerán aglutinados al querer desprender el

culot globular.

 Negativa: los hematíes (Rh-rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar aglutinación.

F. PRUEBA PARA DETECTAR Du

Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones
negativas frente a sueros anti –D. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia
de un individuo Du. Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs.

1) Coloque dos gotas de suero anti –D (Rho) en un tubo de Kahn.

2) Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en salina.
3) Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C.
4) Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen
del tubo). Centrifugue y elimine el sobrenadante.
5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana.

45
6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500
rpm, desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se hará macro y
microscópicamente.

F.1 Reacciones

 Positiva: los hematíes Du (Rhou) positivos permanecerán aglutinados luego de intentar

desprender el culot globular.

 Negativa: los hematíes Rh-(rh) y Du (Rhou) negativos se resuspenderán y no aglutinarán.

F.2 Controles utilizados

Se utilizan tres controles para

1. Probar la bondad del suero

2. Comprobar su especificidad
3. Para seudoaglutinación

Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r
(Cde/cde). Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con
el antígeno E(rh”) presente ,dado que, en tales hematíes el factor D(Rho) es mas reactivo.

El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga
aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no
absorbidos durante la preparación del suero). Estos dos primeros controles sirven para
demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda
falsear los resultados.
El tercer control, es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti –D por suero de
persona de grupo sanguíneo AB, se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados.

G. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE

LA PRUEBA DE COOMBS.

G.1 Prueba de Coombs indirecta

1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes

de grupo O Rh+ al 2%. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de
1 hora a 37 °C. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de
solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%.

2) Centrifugar, quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica, eliminando

completamente el sobrenadante en el último lavado.

3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2

4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.

5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer
microscópicamente con visor y microscópicamente.

46
G.2 Prueba de Coombs directa

6) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. Preparar un

tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%.

7) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F.2

8) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.

9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer
microscópicamente con visor y microscópicamente.

RECOMENDACIONES:
*es importante realizar con cuidado los sucesivos lavados, la temperatura que sea 37°C, la
ultima centrifugación no debe ser enérgica ni más de un minuto.
*siempre que una prueba de Coombs directa de negativa de debe dejarla 15-20 minutos a 37°C
y luego volver a realizar un corta centrifugación

Anti-A, Anti-B o Anti A,B

Monoclonal
Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO

SIGNIFICACION CLINICA
En el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en
A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos
altamente reactivos en su superficie. También demostró que existen anticuerpos (aglutininas)
para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el
antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee. Actualmente se
han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas
observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional.
Por este motivo, la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la
que se basan los demás ensayos pretransfusionales.

FUNDAMENTOS DEL METODO

Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B
monoclonal. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes, se
producirá una aglutinación visible macroscópicamente. La ausencia de aglutinación en todos los
casos, implica grupo O.

REACTIVOS PROVISTOS
Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos
monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón.

REACTIVOS NO PROVISTOS
De acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente:
- Solución fisiológica
- Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS)
- Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS)
- Albúmina Bovina 30% de Wiener lab.

INSTRUCCIONES PARA SU USO

Los Reactivos se proveen listos para usar.

47
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento
indicada en la caja.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS

Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.

MUESTRA
Glóbulos rojos o sangre entera
a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido cítrico,
citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).
Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab.
c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en
refrigerador (2-10oC). Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48
horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35
días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la
muestra.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Centrífuga
- Tubos de hemólisis
- Placas
- Palillos mezcladores descartables

PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

PROCEDIMIENTO
En las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con
solución fisiológica, PBS o LISS.

I- TECNICA EN PLACA
Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una
suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.0
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una placa
limpia, agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos.
2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de
2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar
aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. No debe emplearse
microscopio.

II- TECNICA EN TUBO (por centrifugación)

1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de
hemólisis, agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%.

III- TECNICA EN TUBO (por sedimentación)

1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de
hemólisis, agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 3-5%.
2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

48
La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción
positiva.

Antisuero
Grupo sanguíneo Anti-A Anti-B Anti-
A,B
A + - +
B - + +
0 - - -
AB + + +
Variants débiles +/- - +
del grupo A
como Ax

METODO DE CONTROL DE CALIDAD

El control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Reacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones:
- Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido.
Por esta razón deben extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros.
- Leucemias u otros desórdenes malignos.
- Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no
idéntico.
- Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los
grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes,
compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad.
- Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías, el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces
con solución fisiológica, resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la
tipificación. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos
antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de estas células con 2
gotas de solución
fisiológica. No debe producirse aglutinación.

PRESENTACION
Anti-A: frasco x 10 ml (Cód. 1443152).
Anti-B: frasco x 10 ml (Cód. 1443154).
Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. 1443153).

BIBLIOGRAFIA
- Moore, S. et al. “Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their
Characterization and use”. París, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59.
- Widman, F.K. “Technical Manual”. 9th Edition, Washington, D.C. American Association of
Blood Banks 1985. Chapter 8.
2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las células y
examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.

Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Téc.: Viviana E. Cétola

49
Bioquímica
Producto Inscripto M.S.
Disp. Nº: 1076/89 (Anti-A)
Disp. Nº: 1073/89 (Anti-B)
Disp. Nº: 1071/89 (Anti-A,B)

Anti-D (Rho)
monoclonal
Reactivo para la detección de antígeno D (Rho)

SIGNIFICACION CLINICA
Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940
establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en
el laboratorio de los anticuerpos anti-D.
Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza
negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno, ya sea
por transfusión o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de
severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido.
Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antígeno
D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO.

FUNDAMENTOS DEL METODO

Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la
superficie del eritrocito el antígeno correspondiente, se producirá una aglutinación visible
macroscópicamente.

REACTIVO PROVISTO
Anti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos.

REACTIVOS NO PROVISTOS
De acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente:
- Solución fisiológica.
- Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab.

INSTRUCCIONES PARA SU USO

Anti-D (Rho): listo para usar.

PRECAUCIONES
El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada
en la caja.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS

Desechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.

MUESTRA
Glóbulos rojos o sangre entera
a) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (ácido cítrico,
citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa,
adenina).

50
c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o
fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha
esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en
refrigerador (2-10oC).

Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras
recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean
coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

Dependiendo de la técnica que se emplee, podrán ser necesarios:
- Centrífuga
- Tubos de hemólisis
- Placa de vidrio
- Palillos mezcladores descartables

PROCEDIMIENTO
I- TECNICA EN PLACA
Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos, o solución
fisiológica. También puede emplearse sangre entera.
1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia.
2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.
3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de
diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar
macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.

II- TECNICA EN TUBO

Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos, o en solución
fisiológica.
1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis.
2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.
3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm.
4) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o
ausencia de aglutinación.
Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos, luego
centrifugar y volver a leer como se describió en 4). Las muestras que aún en estas condiciones
resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du.

III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du

Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos, o solución
fisiológica.
1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis.
2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar.
3) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos.
4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica, descartando perfectamente el
sobrenadante y resuspender las células luego de cada lavado.
5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico), mezclar, centrifugar 20 segundos
a 3500 rpm.
6) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción
positiva.

51
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse
solamente en medio salino. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos
sensibilizados.
Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-
50oC.

PRESENTACION
Frasco x 10 ml (Cód. 1443155).

BIBLIOGRAFIA
- Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940.
- Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959.
- Widman, F.K. - “Technical Manual” - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of
Blood Banks, Chapter 9, 1985.
- Race , R.R. and Sanger, R. - “Blood Groups in Man” - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific
Publications, pág. 178, 1975.

Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Téc.: Viviana E. Cétola
Bioquímica
Producto Inscripto M.S.
Disp. Nº: 1074/89

Suero Anti-humano
(poliespecífico)

Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta

SIGNIFICACION CLINICA
Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas
Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes
pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a
antígenos del sistema Rh.
Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en
casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica, siendo empleadas actualmente en los
siguientes casos:

Prueba Antiglobulina Indirecta

- Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos.
- Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión.
- Fenotipo de glóbulos rojos.
- Identificación y titulación de anticuerpos encontrados en
suero o eluatos.

52
Prueba Antiglobulina Directa
- Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido.
- Investigación de reacciones dudosas en una transfusión.
- Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o
fracciones del complemento a los glóbulos rojos.

FUNDAMENTOS DEL METODO

El agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de
inmunoglobulinas y/o
Fragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinación de los
glóbulos rojos visible macroscópicamente.

REACTIVO PROVISTO
Suero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con
inmunoglobulina G purificada y C3.

REACTIVOS NO PROVISTOS
- Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos.
De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente:
- Solución fisiológica.
- Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS).
- Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS).

INSTRUCCIONES PARA SU USO

Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar.

PRECAUCIONES
El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada
en la caja.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS

Desechar el reactivo si se observa contaminación del mismo.

MUESTRA
Glóbulos rojos
a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido cítrico,
citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).
Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab.
c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en
refrigerador (2-10oC). Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48
horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35
días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la
muestra.
Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca
(menos de 24 horas de la extracción).
Si los glóbulos provienen de coágulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas.

53
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Centrífuga
- Baño de agua a 37oC
- Tubos de hemólisis

PROCEDIMIENTO
I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal).
1) En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar.
2) Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y
resuspendidos en PBS.
3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.
4) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el
sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente
el sobrenadante luego del último lavado.
5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. Mezclar
perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm.
6) Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente. Tener en cuenta que
agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles.
7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados
con IgG débiles.

II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica).
El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos.
Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con
esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%.
1) Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar.
2) Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS.
3) Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua.
Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I).

III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA

Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la
superficie de los glóbulos rojos.
1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%.
2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7)
de la técnica I).

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

La observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción
positiva.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas:
- Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la
prueba.
- Lavado inadecuado de las células.
- Tiempo o temperatura de incubación inadecuados.
- Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados.
- Concentración inadecuada de glóbulos rojos.
- Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados.
Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y
fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro
origen.

PRESENTACION

54
Frasco x 10 ml (Cód. 1443156).

BIBLIOGRAFIA
- Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945.
- Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945.
- Widman, F.K. - “Technical Manual”. 9th ed. Washington D.C. American Association of
Blood Banks, pág. 376, 1985.

Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Téc.: Viviana E. Cétola
Bioquímica
Producto Inscripto M.S.
Disp. Nº: 2503/91

 Determinación de anticuerpos inmunes

A. TITULACIÓN DE ANTICUERPOS

A.1 Técnica básica de titulación

A.1.1. Preparación de diluciones madres.

a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede
aumentarse o disminuirse si fuera necesario).
b) En los tubos 2 al 10, colocar 0,100 ml de solución fisiológica (SF). Colocar 0,300 ml de
suero a titular en el tubo N°1.
c) Tomar 0,100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2.
d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Luego se toman 0,100 ml de la
misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. Homogeneizar y repetir la operación hasta
completar las diluciones.

A.1.2 Titulación

a) Se toman 10 tubos de Kahn, numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. Con una
pipeta Pasteur para cada dilución, colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes
tubos.
b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%. Agitar la mezcla.
c) Incubar a la temperatura apropiada, el tiempo requerido.
d) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del
suero.
e) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por
el tubo de mayor dilución. El grado de aglutinación se considerará según los scores
anteriormente indicados.

El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación . Si en la última

dilución, con aglutinación, el tipo de aglutinato es tr, el título se determinará promediando dicha

55
dilución con la precedente. Por ejemplo, si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16, el tipo de
aglutinato es tr, el título será (16+8)/2=12.

a) Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de hematíes a

usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes.
b) Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O con dos
gotas del suero a titular.

56
 TRABAJO PRÁCTICO N° 7

SEPARACION ELECTROFORETICA DE HEMOGLOBINAS

Fundamentos
La electroforesis consiste en la separación de partículas aprovechando su traslado mediante la
aplicación de campos eléctricos. La capacidad de movimiento de las diferentes moléculas
depende de la intensidad del campo aplicado, su carga y su peso molecular.
La hemoglobina, proteína presente en los glóbulos rojos, tiene varias formas moleculares,
algunas normales y otras anormales. El proceso de electroforesis aprovecha el hecho de que las
diferentes hemoglobinas migran a diferentes velocidades, permitiendo así su separación. En
acetato de celulosa, a pH alcalino, la HbA migra hacia el ánodo, mientras que la HbF (que en
condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades) queda cercana a esta. La HbA2 tiene
una velocidad menor por lo que queda cerca del cátodo.
Durante la electroforesis, una corriente eléctrica pasa a través de la muestra de sangre de una
persona, lo cual hace que los tipos de hemoglobina se separen en diferentes momentos y formen
bandas. Al comparar la forma en la que se separan con la de una muestra de sangre normal, se
pueden ver los tipos y las cantidades de hemoglobina existentes en la muestra de sangre.
Entre sus ventajas están, que constituye una microtécnica y el costo en reactivos y tiempo
laboral es muy bajo; además mediante esta técnica pueden diferenciarse con precisión la
presencia de las hemoglobinas A, S y C.

Soporte: Acetato de celulosa gelatinizado, en medio alcalino (pH= 8,5).

 Las tiras deben conservarse en posición vertical y en un recipiente tapado conteniendo

metanol al 40%.
 Las tiras secas pierden las dimensiones y las características del gel.
 La superficie de las tiras que es penetrable a las proteínas se reconoce porque es más
opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro.

Reactivos

 Solución buffer:
Tris-(hidroximetil)-amino etano..........................10,2 g
EDTA di sódico.……………………......................0,6 g
Ácido Bórico.………………………………………3, 2 g
Agua Destilada………………………………….1000ml

 Solución colorante:
Amido Schwartz (0,5 g Amido Schwartz / 45 ml alcohol metílico / 10
ml ácido acético / 45 ml agua destilada)

 Solución decolorante:
Ácido acético 5%.
Ácido acético: metanol (1+9).

 Solución deshidratante:
Metanol puro.

 Solución de transparentización (preparar en el momento) :

Metanol..........................85 ml
Ácido acético..................14 ml

57
 Glicerol...........................1 ml

 Solución disolvente: Ácido acético 80%

Preparación de solución de hemoglobina

 Puede utilizarse sangre fresca con cualquier anticoagulante (EDTA di sódico).

 Centrifugar la sangre a 3000rpm durante 10 min en tubo de centrifuga cónico.
 Separar por aspiración el plasma sobrenadante y la capa de blancos y plaquetas.
 Lavar los glóbulos rojos 3 veces con solución fisiológica 5 min.
 Centrifugar cada vez a 3000 rpm.
 El último centrifugado dejarlo 15 min.
 Separar el sobrenadante.
 Agregar a los GR igual volumen de agua destilada.
 Mezclar bien por inversión con tapón.
 Dejar reposar 10 min.
 Agregar un volumen de tetracloruro de carbono igual a la mitad del volumen de GR.
 Agitar enérgicamente 5 a 10 min.
 Dejar reposar 30 min.
 Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min.
 Aspirar la solución límpida de Hb q queda en la parte superior del tubo.
 Se determina la concentración de hemoglobina en el hemolizado obtenido, mediante el
método de la cianometahemoglobina, se lleva la concentración hasta los valores 7-8 g/dl
de hemoglobina con agua destilada.
 Esta solución de Hb debe procesarse inmediatamente si se sospecha de hemoglobina H.
de no ser así puede conservase una semana a -20 °C.

Técnica
1. Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos.
2. Eliminar el exceso de líquido secando entre 2 papeles de filtro (suavemente).
3. Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética. La superficie penetrable
tiene que ir dirigida hacia arriba. La tira debe estar bien tiesa y plana. Operar
rápidamente para evitar evaporaciones.
4. Sembrar las muestras: hemolizado obtenido siguiendo la técnica expuesta en el presente
trabajo.
5. Conectar la fuente de poder, realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts,
durante 60 minutos.
6. Desconectar la corriente y retirar las tiras.
7. Colorear durante 5 minutos.
8. Decolorar de la siguiente manera:
- 5 minutos en AcH al 5%.
- 5 minutos en AcH al 5%.
- 5 minutos en AcH: metanol (1+9).
9. Determinación cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de
ensayo conteniendo la solución disolvente y agitar. Leer a 630 nm. si se usó colorante
Amido Schwartz.
10. Transparentización: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro
durante 30 segundos, a continuación se las coloca en la solución transparentizadora
durante 1 minuto como mínimo. Se colocan luego en una placa de vidrio, eliminando
cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos
minutos, hasta la transparencia completa. Así se conserva para leer en densitometría.

El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatías

58
TIPO Polo negativo Polo positivo ACLARACIONES
Normal HbA 98%

Anhidrasas HbA2 HbA HbA2 2%

Carbónicas
Recién nacido HbF Aprox 90%

Anhidrasas HbA2 HbF HbA HbA 10%

Carbónicas HbA2 1%
Drepanocitosis HbA2 2%
homocigota
Anhidrasas HbA2 Hb S HbS 98%
Carbónicas
Drepanocitosis HbA < 50%
heterocigota HbS > 50%
Anhidrasas HbA2 Hb S HbA HbA2 2%
Carbónicas
Hemoglobinopatía C HbC 98%
homocigota
Anhidrasas HbC HbA2 2%
carbónicas
Hemoglobinopatía C HbC > 50%
heterocigota
Anhidrasas HbC HbA HbA < 50%
Carbónicas
-talasemia
heterocigota HbA2 entre 4-8%
Anhidrasas HbA2 HbA
Carbónicas
-talasemia HbA2 normal
homocigota % de HbF y HbA,
Anhidrasas HbA2 HbF HbA variable según tipo de
Carbónicas Th homocigota
Doble Heterocigota HbS 50%
S/C
Anhidrasas HbC HbS HbC 50%
Carbónicas

59
 TRABAJO PRÁCTICO N° 8:

CITOQUÍMICA -MEDULOGRAMA
En el laboratorio de hematología, la citoquímica constituye un elemento de capital importancia
y un complemento indispensable al la observación morfológica convencional para la
identificación de las estirpes celulares. La citoquímica estudia la composición química de la
célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas,
metales pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de unión entre la morfología y la
bioquímica
En este trabajo se describirán las técnicas citoquímicas aplicadas con mayor frecuencia en la
Hematología tradicional.

TECNICAS CITOQUIMICAS:

RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS

Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls

La coloración de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de

célula pudiendo ser aplicada a las células presentes en un frotis o extensión de sangre o médula
ósea. La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina, que se considera el resultado de
la precipitación de varias moléculas desnaturalizadas de apoferritina. Normalmente, constituye
el hierro no hemínico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las células del
sistema mononuclear fagocítico.
CONSIDERACIONES
1. Frotis de la médula ósea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. Se
debe tener cuidado de evitar toda contaminación por exceso de hierro que pueda contener el
portaobjeto a utilizar en la coloración; para ello deberán ser sumergidos en una solución de
HCl 3 mol/L como mínimo dos minutos o más para poder eliminar todo exceso de hierro.
2. Solución clorhídrica de ferricianuro potásico. Debe prepararse extemporáneamente
mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de ferricianuro potásico al 2% en
agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0.2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente
(24ºC).

METODO
1. Fijar los frotis en metanol o etanol al 80% durante 10-20 minutos.
2. Dejarlos secar a temperatura ambiente.
3. Preparar en el momento la solución compuesta por partes iguales de ferrocianuro
de potasio (20gr/L) y HCl 0,2M.
4. Dejar actuar dicha solución durante 10 minutos.
5. Lavar con agua de canilla durante 20 minutos.
6. Enjuagar con agua destilada.
7. Contracolorear con Hematoxilina durante 1-2 minutos.
8. Dejar secar y luego observar en microscopio óptico.

60
 Tinción de Perls en Anemia Sideroblástica Refractaria

Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke

FUNDAMENTO
La hemoglobina fetal (HbF o 22) es ácido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un
preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la
fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos.
REACTIVOS
1. Alcohol etílico al 80%
2. Buffer de ácido cítrico, pH 3,4 constituido por dos soluciones:
Solución A:
Ácido cítrico............................ 4,2 g
Agua destilada......................... 100 ml
Solución B:
Citrato de sodio........................ 5,9 g
Agua destilada......................... 100 ml
Solución Buffer pH 3,4:
Solución A ................ 84 ml
Solución B................. 16 ml
3. Eosina al 0,1 % en agua.

DESARROLLO
1. Extendidos de sangre secos de no más de una hora de obtención, se fijan durante 5 minutos
en el alcohol etílico al 80%
2. Lavado rápido con agua y secado.
3. Inmersión en una cápsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a
37C un mínimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rápidamente en agua
común y secar en posición vertical.
4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solución de eosina. Lavar con agua y secar.

RESULTADOS
Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen
hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras.
El análisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hematíes coloreados e
incoloros.

61
 Hematies con Hemoglobina Fetal

RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS

PEROXIDASAS (MIELOPEROXIDASA)
Fundamento
Método de Washburn: frente al agregado de agua oxigenada, aquellas organelas que poseen la
enzima desprenden oxígeno naciente del agua oxigenada y este oxida la bencidina a un óxido
intermedio color azul oscuro al principio que luego vira al negro.
Reactivos
1. Colorante (conservar en heladera y oscuridad)
Bencidina 300 mg
Solución saturada de nitroprusiato de Na 1 ml
Alcohol etílico absoluto 99 ml

2. Solución H2O2-AcH
H2O2 (10 vol.) 2 gotas
H2O destilada 50 ml
AcH puro 1 gota
Preparar en el momento.
Procedimiento
1. Fijar el extendido con metanol o etanol 80% durante 5 minutos.
2. Impregnar el extendido con la solución 1 durante 3 minutos.
3. Volcar sobre la misma solución anterior la solución 2, dejar actuar durante 2 minutos.
4. Pasado el tiempo tomar el extendido con alguna pinza, lavarlo y dejarlo verticalmente hasta
que se seque.
5. Contracolorear con una solución de Giemsa diluido 1/10 durante 20 minutos.
6. Observar al microscopio óptico con aceite de inmersión.

Resultados
Positivo: citoplasma cubierto de color negro en aquellas células que poseen la enzima.

62
Reacción de Peroxidasa (+) en precursor mieloide

BIOPSIA Y ASPIRADO DE MEDULA ÓSEA - MEDULOGRAMA

La biopsia de médula ósea (BMO) se ha convertido en una herramienta útil en el diagnóstico de

enfermedades hematológicas, de neoplasias primarias o metastásicas y estadificación de las
mismas, de infecciones, y de enfermedades metabólicas. Para optimizar la valoración de la
BMO, es necesario conocer los datos clínicos y de laboratorio, incluyendo los resultados de la
sangre periférica y del aspirado de la médula ósea (MO), así como las posibilidades diagnósticas
del médico tratante. Se debe contar con un procedimiento técnico adecuado para obtener y
procesar la BMO. La médula ósea (MO) comprende entre 3.5 y 6% del peso corporal; es el
principal órgano de hemopoyesis; es un órgano linfoide primario y secundario que proporciona
un medio para la maduración celular y la interacción inmunológica; está influida por factores
reguladores para la producción normal de células sanguíneas.
La hemopoyesis es el proceso de producción de elementos formes de la sangre, y está localizada
en el compartimento extravascular de la MO. La hemopoyesis en la MO se inicia desde la
mitad de la gestación, y es el mayor sitio de hemopoyesis al nacimiento. Durante el primer año
de la vida la hemopoyesis tiene lugar en la MO de huesos axiales y radiales del esqueleto, y a
partir de la mitad de la adolescencia los huesos planos centrales se convierten en los principales
sitios de hemopoyesis.
Importa señalar que uno de los factores que modifican la hemopoyesis es la edad; los recién
nacidos pueden tener una celularidad entre el 80 y 100% en la MO, mientras que en los ancianos
de más de 70 años, la celularidad normal puede ser de menos del 50%. Conforme los niños
crecen, la celularidad de la MO va decreciendo; en menores de 9 años la celularidad es del 78%
± 13, y de 10 a 19 años es de 72% ± 11. Las células progenitoras o células madre circulan en la
sangre periférica y se alojan en la MO; de esta manera hay un suplemento continuo de células
pluripotenciales, capaces de autorenovarse y diferenciarse en células destinadas hacia
eritropoyesis, granulopoyesis, monocitopoyesis y megacariocitopoyesis.
Las células progenitoras pluripotenciales, además de dar orígen a los eritrocitos, granulocitos,
megacariocitos y plaquetas, también generan linfocitos (linfopoyesis), células cebadas y
macrófagos.

INDICACIONES
La BMO está indicada en todas las enfermedades que puedan afectarla, ya sea en forma
primaria o secundaria. La indicación hematológica más frecuente corresponde a la disminución
de elementos formes de la sangre periférica, las citopenias, leucopenia, anemia y
trombocitopenia, ya sea en forma aislada o de las tres series (pancitopenia). Las citopenias
periféricas pueden deberse a: 1) producción insuficiente de células en la MO; 2) incremento en

63
su utilización periférica, por destrucción o por pérdida, sin una adecuada producción
compensadora en la MO; 3) una combinación de estas causas.
El aspirdo de MO se utiliza frecuentemente para el diagnóstico de procesos proliferetivos ya sea
para la observación microscópica como para la inmunomarcación y posterior identificación por
citometría de flujo.
Las especialidades médicas que con mayor frecuencia solicitan la BMO corresponden a
hematología, oncología, infectología y medicina interna.
Las indicaciones de la BMO se agrupan en Cuadro 1.
Cuadro 1: Indicaciones de BMO
- En pacientes con citopenias no explicadas previamente por los estudios
hematológicos (incluye la evaluación de procesos mielodisplásicos)
- En la sospecha de infiltración de neoplasia con diagnóstico previo desconocido
- Para la estadificación oncológica de tumores con diagnóstico previo confirmado:
linfomas, otros tumores sólidos como neuroblastoma, rabdomiosarcoma, etc.
- Para conocer la respuesta al tratamiento de algunas neoplasias: remisión, recaída,
etc.
- Evaluación de la médula ósea antes del trasplante de células progenitoras
- En el estudio de pacientes con fiebre de origen desconocido: sospecha de agentes
infecciosos com o histoplasmosis, tuberculosis.
- En la evaluación de pacientes con enfermedad metabólica por depósito de
material anormal

CONTRAINDICACIONES
No existe una contraindicación absoluta para la BMO. Se debe tener controlado al paciente con
tendencia a sangrar y conocer el tipo de tratamiento que puede ocasionar hemorragias: aspirina
o anticoagulantes.

COMPLICACIONES
En general la BMO es un procedimiento relativamente bien tolerado y con bajo riesgo de
morbilidad. Las complicaciones de la toma de BMO son raras; corresponden a 0.08%,
generalmente debido a sangrados que pueden ocasionar hematomas. Otras complicaciones más
serias son aún menos frecuentes, como la neuropatía transitoria, una infección de la herida y
osteomielitis, reacción a medicamentos, así como dolor persistente. El riesgo de sangrado puede
ser mayor en pacientes con trombocitopenia y alteraciones de la función plaquetaria; ellos deben
tenerse en observación en el hospital por 24 horas después del procedimiento. La siembra de
células malignas puede ocurrir excepcionalmente en pacientes con metástasis diseminadas.

TECNICA
La BMO se debe realizar exclusivamente por personal capacitado y con experiencia en la
técnica. La BMO se puede tomar en forma uni o bilateral, generalmente de la cresta ilíaca
posterosuperior. Para el estudio de enfermedades hematológicas, un fragmento es suficiente.
Para el estudio de las neoplasias malignas, frecuentemente se toman biopsias de dos sitios
diferentes: una de cada cresta ilíaca.
El sitio de donde se obtiene la biopsia debe ser de fácil acceso, con mínimo trauma y sin peligro
para el paciente. En niños muy pequeños o en pacientes no cooperadores, la biopsia se toma
bajo anestesia general. En lesiones óseas precisas es importante la guía con estudios de imagen.
La aguja para biopsia que más se usa, especialmente por los hematólogos, es la de 11 a 8 gauge,
que obtiene una biopsia de 2 mm de diámetro, con una longitud de 1 a 2 cm, de acuerdo con la
profundidad a la que se introduce la aguja.
El aspirado de MO debe efectuarse después de haber tomado la biopsia del tejido, colocando la
aguja a 1 cm de esa zona; se hacen los frotis, y el material restante se puede colocar en tubos
con anticoagulante para estudio con citometría de flujo, para estudios citogenéticos, etc.

MANEJO DEL TEJIDO

La biopsia de MO se debe fijar de inmediato en formaldehido con amortiguador (buffer) de
fosfatos al 10%, cuando menos durante seis horas; posteriormente se coloca en solución
descalcificadora, generalmente suficiente por 24 h.

64
Los cortes histológicos no deben exceder 4 micras de espesor. Las tinciones iniciales más
usadas son hematoxilina y eosina, ácido periódico de Schiff (PAS), Giemsa, tinción para fibras
reticulares (Sweet) y para hierro (Perls).
Se realizarán estudios adicionales con imunohistoquímica, si son necesarios, sobre todo para el
diagnóstico diferencial de neoplasias.

INTERPRETACIÓN

Histología normal
En condiciones normales el tejido hematopoyético en los espacios medulares tiene una
distribución y topografía especiales: los grupos de células eritropoyéticas, los megacariocitos y
las formas maduras de la serie granulocítica, se localizan en sinusoides del centro del espacio
medular, mientras que los precursores mieloides tempranos se localizan con relación a la
superficie endosteal de las trabéculas óseas y en la vecindad de las arteriolas. Por lo tanto, las
variaciones espaciales de las diferentes series son importantes en la interpretación. Las células
madre no se identifican por la morfología tradicional en los aspirados de MO, aunque recuerdan
a las células linfoides pequeñas. Las células madre se identifican por su función y por el
inmunofenotipo que incluye la expresión de CD34, c-kit y Thy1, y están localizadas en la región
endosteal de la MO.
Celularidad. La celularidad en la MO corresponde a la proporción entre las células
hemopoyéticas y el tejido adiposo, que varía según la edad del paciente, es casi del 100% en
recién nacidos y disminuye aproximadamente 10% conforme avanza cada década de la vida
(Cuadro 2).
En los recién nacidos a término hay predominio de los precursores mieloides, que ocupan dos
terceras partes de la celularidad, y disminuyen a un tercio al mes de edad. Los linfocitos en
recién nacidos ocupan un 15%, y aumentan hasta 50% al mes de edad, lo que se prolonga hasta
los 18 meses.
Relación mieloide:eritroide (RM:E). Se refiere a la proporción relativa entre el componente
granulocítico y el eritroide; el resto de los componentes de la médula ósea (megacariocitos,
linfocitos, células plasmáticas) no se toman en cuenta en esta relación.
En la primera semana de vida hasta el 70% de las células corresponde a la serie eritroide,
principalmente proeritroblastos y eritroblastos basófilos, por lo que la RM:E en esta etapa de la
vida está invertida, y es de 1:2.

Posteriormente el componente granulocítico aumenta y la relación se estabiliza entre 2.5:1 y 4:1

en adultos. La tinción de PAS acentúa la diferencia entre los dos componentes, ya que la serie

65
granulocítica tiene citoplasma PAS positivo difuso. La IHQ con anticuerpos anti-
mieloperoxidasa y anti-glucoforina, identifica con mayor precisión los dos componentes.

MÉDULA ÓSEA NORMAL

Eritropoyesis. En condiciones normales la maduración de eritroblasto a normoblasto se lleva a

cabo en cinco días, y estos precursores nucleados de los eritrocitos se encuentran en grupos (seis
o más células) con grados variables de maduración. Frecuentemente se localiza un macrófago
(célula reticular) en el centro o en la vecindad de los grupos eritropoyéticos y aparentemente
tiene un papel importante en la producción normal de células rojas. La RM:E normalmente es de
1.5:1 a 3:1. Una disminución en esta relación, encontrada en una MO normo a hipocelular,
indica una hiperplasia eritroide, mientras no haya disminución en los otros elementos.
Las células eritroides tienen núcleo redondo, hipercromático con un halo perinuclear,
características que las distinguen de los linfocitos maduros. La tinción de Giemsa identifica a la
serie eritroide por la basofilia intensa de su citoplasma. Una de las alteraciones más frecuentes
es la modificación en la maduración con cambios megaloblásticos, en la que se observan
precursores rojos con núcleos más grandes e irregulares.

ISLOTE ERITROBLÁSTICO

Granulopoyesis. En condiciones normales todas las células de la serie granulocítica se

identifican en la BMO: mieloblastos, promielocitos, mielocito, metamielocito, bandas y
segmentados (neutrófilos, eosinófilos y basófilos). Un incremento en la RM:E, en MO normal o
hipocelular, sin disminución de las otras series, indica hiperplasia granulocítica. Normalmente
los precursores granulocíticos como los promielocitos y los mielocitos, no exceden el 3% y se
encuentran distribuídos junto a la superficie del endocito de las trabéculas óseas. Los
metamielocitos, bandas y segmentados se localizan hacia el centro de la región intrertrabecular,
y las células maduras llegan a la circulación, migrando a traves del endotelio de sinusoides. Las
tinciones de IHQ con mieloperoxidasa, CD-117, CD-13, CD-15, CD-33 las identifican; las
células progenitoras se identifican con CD-34 y QBEND10.

66
Células cebadas. Generalmente se encuentran adyacentes a las células endoteliales de
sinusoides, bordeando la superficie endosteal de las trabéculas óseas, en el periostio y
adyacentes a la pared de pequeñas arterias; aparentemente se originan del mismo precursor de
los granulocitos basófilos. Se caracterizan por tener núcleo redondo u oval con gránulos
citoplásmicos basófilos, que son rojos con la tinción de Giemsa y positivos con CD117 por
IHQ. Puede aumentar su número en algunos procesos infecciosos y por efecto de
medicamentos.

Megacariocitos y trombopoyesis. Los megacariocitos son las células más grandes de la MO,
con diámetros que van de 12 a 150 µm; varían en tamaño y en la configuración nuclear, son
positivos con la tinción de PAS. Se reconocen tres etapas de maduración: 1) megacarioblasto
que mide 15 a 20 µm, con núcleo oval o arriñonado y citoplasma basófilo; 2) promegacariocito
que mide de 20 a 80 µm, cuyo citoplasma es menos basófilo y tiene una zona perinuclear de
gránulos en desarrollo; 3) megacariocito maduro con núcleo cerebriforme o multilobulado,
citoplasma eosinófilo con granularidad variable; en esta etapa se liberan las plaquetas. Los
megacariocitos maduros se hallan en relación a las sinusoides y liberan directamente las
plaquetas hacia la luz. Todo el megacariocito o parte de su citoplasma entra al sinusoide, y se
fragmenta directamente en el sistema vascular. En niños menores de nueve años normalmente
hay 20+/-8 megacariocitos por mm2; en adolescentes, 16+/-4, y disminuyen conforme avanza la
edad hasta 10+/-6 en los ancianos. Otra forma de cuantificarlos es de 1 a 3 por campo a 40x.
Puede haber agrupamiento de megacariocitos cuando hay regeneración de la MO, sin que esto
sugiera neoplasia. Las tinciones auxiliares de IHQ para facilitar su identificación son:
relacionado al Factor VIII, CD-41, CD-61 y CD-79a.

Monocitos/macrófagos y células dendríticas. Estas células tienen una progenitora común que
comparten con los granulocitos, y en condiciones normales generalmente son invisibles. Los
monocitos llegan de la circulación a la MO, son menos del 5% del total de las células, y
maduran hacia macrófagos/histiocitos. Los macrófagos tisulares tienen núcleo redondo con
nucléolo de tamaño variable y citoplasma abundante que frecuentemente muestra elementos
celulares fagocitados (eritrocitos, fragmentos nucleares, hemosiderina), y son responsables de la
fragmentación de eritrocitos viejos y del almacenamiento de hierro. Son positivas con CD68 y
para CD163 con IHQ. En estas células se encuentra el material de depósito anormal de las
enfermedades metabólicas por almacenamiento.
Las células dendríticas son escasas en la MO; se pueden identificar con IHQ porque son
positivas con proteína S-100 y CD1a.

Linfocitos y linfopoyesis. La función linfopoyética de la MO, existe desde las etapas

embrionarias y persiste hasta la vida adulta, aunque en menor proporción. Las células linfoides
se encuentran dispersas en la MO, independientemente de que se hayan originado en este sitio;
comprenden entre 15 y 20% de la celularidad, y conservan la misma proporción, que en la
sangre periférica: 65-75% son linfocitos T (CD-3+); 10-15% son linfocitos B (CD-20+), y 10-
20% son NK (CD-56+ y CD-16+). La proporción de cúmulos linfoides aumenta con la edad. En
los procesos benignos los cúmulos linfoides se localizan en la región intertrabecular y
perivascular; cuando son paratrabeculares sugieren malignidad.

Hematogonias. Son precursores de linfocitos B benignos, que generalmente no se identifican

en los aspirados de MO. En la BMO tienen núcleo denso, sin nucléolo prominente y escaso
citoplasma; presentan una mezcla de positividad para CD-45, CD-34, tdt, CD-20 y CD-10.
Importa señalar que sólo una pequeña proporción de ellas son positivas para tdt y CD-34. Su
presencia varía de 3 hasta 25% en recién nacidos y prematuros sanos. En condiciones normales
disminuyen las hematogonias a 9% en niños menores de dos años; hasta 3-4% a los 5 años de
edad. Pueden aumentar a más de 5% en MO con cambios regenerativos, sobre todo relacionados
con citopenias. La población de hematogonias siempre exhibe un espectro variable en la
expresión de antígenos que identifica una maduración normal, continua y completa de los

67
precursores B. Esto las distingue de las células de la LAL-pre-B, ya que éstas carecen de
maduración, y además pueden presentar expresiones aberrantes de antígenos asociados con
diferenciación mieloide. El conocimiento de este hallazgo es pertinente para la interpretación
adecuada de la BMO en los diferentes grupos de edad. Hay que destacar que las hematogonias
no se encuentran en sangre periférica.

Células plasmáticas. Representan la etapa final de la maduración de un grupo de linfocitos B;

corresponden al 1% de la celularidad de la BMO; son positivas con IHQ para kappa, lambda y
CD-138. En niños y adolescentes hay de 20 a 30 células por mm2. Cuando la IHQ muestra
restricción para una de las cadenas ligeras (kappa o lambda), es un dato útil para sospechar
monoclonalidad. Hay dos tipos de células plasmáticas normalmente presentes en la MO: uno
corresponde a las habituales previamente mencionadas y fácilmente identificables, denominadas
“reticulares” (Marschalko); el otro tipo es la célula plasmática “linfoplasmocitoide”, que deriva
de linfocitos B positivos para IgM; es más pequeña, con escaso citoplasma, núcleo menos
excéntrico, y zona de Golgi poco definida; frecuentemente aparece en infecciones virales.

Estroma. Proporciona el sostén del tejido hematopoyético, constituído por células adiposas,
fibroblastos y sus prolongaciones; por la extensa red de vasos sanguíneos, incluyendo
sinusoides y por los nervios acompañantes. Las fibras reticulares normalmente sólo se localizan
alrededor de los vasos con muy ocasionales fibras en las celdillas, que se visualizan con
tinciones de Gomori o de Gordon-Sweet..
Todo esto constituye el microambiente de la MO, con una estrecha relación entre todos los
elementos mesenquimatosos y la hemopoyesis. Las moléculas de adhesión son las responsables
de que las células madre permanezcan en el estroma. Las células adiposas ocupan una tercera
parte del volumen de la MO.

RESUMIENDO:
PROGENIE % RELATIVOS
ERITROIDE
Proeritroblastos– 0,5 – 7,5 %
Eritroblastos basófilos
Eritroblastos policromatófilos 7 – 40 %
y ortocromáticos
MIELOIDE
Mieloblastos 0,5 – 5 %
Promielocitos 0 – 7,5%
Mielocitos 5 – 25 %
Metamielocitos 5 – 20 %
Cayados 5 – 25 %
Segmentados 0,5 – 15 %
Eosinófilos 1–7%
Basófilos 0–1%
LINFOIDE
Linfoblastos 0,5 – 4 %
Linfocitos 2,5 – 15 %
Células plasmáticas 0,5 – 3%
MONOCITOS y su 0,5 – 3%
progenie
MEGACARIOCITOS 0,5 – 2 % (AUMENTO 40 X)

Artificios en médula ósea. Pueden ocurrir debido a una técnica inadecuada, a un error en la
toma de la muestra, o por artificios en la preparación histopatológica. La depleción de la
celularidad acompañada de hemorragia se puede presentar cuando se realiza primero el aspirado
y posteriormente se efectúa en el mismo sitio la biopsia de MO.

68
CITOPENIAS

Citopenia de serie roja

La aplasia pura de la serie roja puede ser congénita como en el síndrome de Blackfan-Diamond,
o adquirida, por inhibición selectiva de la eritropoyesis como en la insuficiencia renal crónica.
Hay formas transitorias como ocurre en el curso de procesos virales, en lupus eritematoso
sistémico y en estados preleucémicos En la BMO la vista panorámica puede no mostrar
alteraciones en la celularidad, pero a mayor aumento llama la atención que no se observan las
islas eritropoyéticas normales, y sólo en forma ocasional uno o dos precursores eritroides; puede
haber depósito de hierro en las células estromales y escasos agregados linfoides, que
frecuentemente corresponden a hematogonias

Citopenia de serie blanca

La causa más frecuente de neutropenia adquirida son los procesos infecciosos, en los que
aumenta la destrucción de neutrófilos. La BMO puede mostrar necrosis, edema y fibrina. Una
alteración semejante se puede observar en la citotoxicidad inducida por medicamentos.
El síndrome de Shwachman-Diamond es una enfermedad congénita con herencia autosómica
recesiva, caracterizado por insuficiencia pancreática exócrina y neutropenia severa. La BMO
muestra disminución acentuada de células precursoras y de granulocitos maduros
La neutropenia con una BMO hipercelular se puede ver en pacientes con enfermedades
autoinmunes: artritis reumatoide, síndrome de Felty, lupus eritematoso sistémico, y en ciertos
tipos de linfomas. Hay que recordar que las inmunodeficiencas primarias también pueden cursar
con neutropenia

Citopenia de megacariocitos
Los mecanismos de trombocitopenia pueden corresponder a: 1) defecto en la producción, donde
la BMO muestra disminución de megacariocitos; 2) pérdida o utilización acelerada como en la
coagulación intravascular diseminada, el síndrome urémico hemolítico, la septicemia, o los
procesos autoinmunes; 3) distribución anormal, particularmente en esplenomegalia. Al igual
que otras citopenias, también se divide en trombocitopenia primaria y adquirida.
Las trombocitopenias primarias incluyen las congénitas, como el síndrome de Tar en el que se
reduce el número de megacariocitos, y las constitucionales, donde la MO es celular con
ausencia virtual de megacariocitos; algo semejante se ve en trombocitopenias, en el síndrome de
Wiskott-Aldrich y sus variantes.
Las trombocitopenias adquiridas frecuentemente se deben a procesos infecciosos o tóxicos, a
infiltración neoplásica, en síndrome urémico hemolítico, en procesos autoinmunes como la
púrpura trombocitopénica idiopática donde hay anticuerpos con IgG contra los antígenos de las
plaquetas. Sin embargo, en estos casos la MO muestra megacariocitos normales en la fase
aguda, y elevada en número en la fase crónica.

Anemia Aplásica. Es la disminución acentuada de elementos maduros en la sangre periférica

(pancitopenia), debido a la producción insuficiente en la MO; puede ser familiar, congénita o
secundaria. La más frecuente es la secundaria, generalmente por exposición a agentes tóxicos.
Se requiere la BMO para excluir otras causas de pancitopenia, así como para conocer la
gravedad de la hipoplasia/ aplasia y la reacción del estroma. Para una adecuada valoración en
estos pacientes, se necesita de una biopsia de 20 a 30 mm de longitud, excluyendo la cortical
ósea
La BMO muestra acentuada hipocelularidad, de 5 a 10% o menos; escasas células maduras,
prácticamente sin mieloblastos, y entonces debido a la hipoplasia medular, otros elementos
como los linfocitos y las células plasmáticas pueden ser evidentes. Generalmente no hay fibrosis
reticulínica en los casos de anemia aplásica secundaria idiopática.

69
 MO
HIPOCELULAR MO NORMAL

HIPERPLASIA DE MO

La hiperplasia de la MO es frecuente en procesos no neoplásicos, como las infecciones

bacterianas y virales (virus de Epstein-Barr); las reacciones alérgicas y los medicamentos. En
ocasiones estos procesos elevan el número de células mieloides maduras, principalmente
granulocitos neutrófilos y ocasionan las llamadas reacciones leucemoides.
La diferenciación histológica entre una reacción leucemoide y una leucemia mieloide crónica,
exclusivamente con la BMO es prácticamente imposible; sin embargo, en los procesos reactivos
generalmente hay un incremento proporcionado de los tres elementos de la MO.
La eosinofilia periférica se refleja en la BMO con incremento en el número de eosinófilos
maduros que puede deberse a infecciones parasitarias, enfermedades alérgicas y dermatológicas,
a mastocitosis sistémica y a reacción a los medicamentos. La eosinofilia acentuada se puede
observar en el síndrome hipereosinofílico como precursor de leucemias/linfomas de tipo
linfoblástico, y en el linfoma de Hodgkin
El incremento en la megacariopoyesis puede verse en la púrpura trombocitopénica idiopática, en
la hemólisis, el hiperesplenismo, enfermedades linfoproliferativas, linfoma de Hodgkin y otras
neoplasias malignas. En estos casos el incremento de megacariocitos se presenta sin
pleomorfismo ni atipia.

MO HIPERBLÁSICA MO HIPERPLÁSICA

ALTERACIONES DE LA MADURACIÓN

70
Síndromes mielodisplásicos. La MO muestra un aumento en la proliferación de las células
germinales con alteración en la maduración (displasia), hemopoyesis defectuosa de una o más
líneas celulares con incremento en la apoptosis, lo que causa discrepancia entre la
hipercelularidad de la MO y las citopenias periféricas. En algunos casos la proliferación
sobrepasa a la apoptosis y entonces la hipercelularidad de la MO puede coexistir con elevación
de la cuenta de las células periféricas. Estos casos se pueden confundir fácilmente con
desórdenes mieloproliferativos y se designan como síndrome mielodisplásico/mieloproliferativo
mixto.
Los SMP son muy raros en niños: 4 por 1000000. Aproximadamente una tercera parte de los
niños con SMD tienen un trastorno genético predisponerte, como alteraciones cromosómicas,
inmunodeficiencias primarias o deficiencia en la reparación del ADN.
Es importante mencionar que la BMO puede mostrar cambios de tipo
mielodispoyéticos/mielodisplásicos (MD), que morfológicamente pueden ser indistinguibles del
SMD, pero clínicamente pueden corresponder a causas exógenas como deficiencias vitamínicas
o de hierro, neoplasias malignas (tumores sólidos), infecciones, reacción tóxica a
medicamentos, alteraciones autoinmunes, cambios regenerativos transitorios secundarios a
quimioterapia, a radioterapia o ambas, así como en hemopoyesis residual en las etapas
intermedias entre desordenes linfoproliferativos y linfomas.
La morfología que muestra la BMO en el SMD generalmente es de hipercelularidad con
maduración inadecuada cuando menos en dos de las tres series: frecuentemente cambios
megaloblásticos en la serie roja, hiperplasia de los precursores de la serie blanca con ausencia de
maduración a polimorfonucleares e hiperplasia de megacariocitos, que pueden estar
hipolobulados o ser pequeños, generalmente agrupados; se acompaña de localización anormal
de los precursores inmaduros. Se ha relacionado el incremento de células de fenotipo blástico a
mal pronóstico en pacientes con SMD. Frecuentemente se encuentran grados variables de
fibrosis reticulínica y puede haber hemosiderina. En algunos casos las BMO repetidas pueden
mostrar incremento de blastos o bien leucemia mieloide aguda. fibrosis no es común en EMPT,
pero muy frecuente en LAM M7. Aparentemente esta mielopoyesis anormal no predispone a
otro tipo de leucemia linfoide (Cuadro 8).

Lesiones infiltrativas mieloides: Es poco frecuente que se tome BMO para el diagnóstico de
LAM, ya que generalmente bastan los estudios hematológicos. En ocasiones se realiza porque
los aspirados no son suficientes en celularidad, o porque la cuenta de blastos no rebasa 30%,
sobre todo en el diagnóstico diferencial con síndrome mielodisplásico. El diagnóstico
morfológico de LAM se sospecha en una MO con celularidad del 100% con células monótonas
de citoplasma eosinófilo y núcleo con cromatina irregular y nucléolo prominente. La IHQ es
importante para corroborar la inmadurez homogénea de las células mieloides con
mieloperoxidasa, CD34 y CD117 positivos, acompañados de fibrosis reticulínica Grado II a III.

Lesiones infiltrativas no mieloides: La neoplasia linfoide más frecuente en niños es la

leucemia linfoblástica, ya sea pre-B o pre-T. Cuando se presenta el cuadro clínico típico de
leucemia con más de 30% de blastos en sangre periférica o en los aspirados, generalmente el
diagnóstico es hematológico y no es necesaria la BMO.
Solamente cuando los aspirados de MO son insuficientes para el diagnóstico hematológico
inicial o cuando se sospecha una recaída la BMO puede mostrar sustitución del tejido
hemopoyético por una neoplasia de morfología homogénea con células de núcleo de cromatina
fina, muy escaso citoplasma y frecuentemente fibrosis reticulínica en grado variable. La IHQ
con positividad para antígeno común leucocitario (CD45), tdt, CD10 y CD-34 corrobora que se
trata de blastos; si además es positiva para CD79a y PAX5, corresponde a LAL pre-B; si es
positiva para CD3 el diagnóstico es LAL pre-T.
El diagnóstico de linfoma en la BMO, generalmente se hace como parte del estudio de
estadificación, una vez que el diagnóstico se ha hecho en otro tejido, frecuentemente ganglio
linfático.

Histiocitosis: Las histiocitosis que pueden infiltrar la médula ósea son de dos tipos:

71
1) Histiocitosis de células de Langerhans (HCL). Es una enfermedad clonal de células
dendríticas epiteliales. La más frecuente es en niños, usualmente se observa en las dos primeras
décadas de la vida y puede ser una enfermedad generalizada o localizada (hueso). La forma
diseminada se caracteriza por lesiones en MO, huesos, hígado, bazo, ganglios linfáticos y otras
vísceras; frecuentemente tiene curso clínico agresivo.
La BMO muestra grupos intersticiales o láminas de histiocitos con citoplasma eosinófilo y
núcleo con hendiduras, pueden formar células gigantes multinucleadas y están mezclados con
un número variable de eosinófilos y linfocitos. También se puede encontrar fibrosis y
hematopoyesis displásica, acompañada de hemofagocitosis que puede ser muy notable. Algunos
casos de HCL pueden presentarse como síndromes hemofagocíticos. La IHQ corrobora la
presencia de células de Langerhans con positividad para S-100 y CD1a.
2) Histiocitosis hemofagocítica. Es frecuente en niños. Se caracteriza por incremento de
histiocitos que contienen elementos hemopoyéticos fagocitados. El síndrome hemofagocítico es
una enfermedad grave en el que la proliferación de histiocitos ocurre en respuesta a una
estimulación variada de citoquinas. Los pacientes presentan fiebre, hepatoesplenomegalia,
citopenias (anemia 80%; neutropenia, trombocitopenia o las dos 50%), incremento de
triglicéridos e hipofibrinogenemia

Procesos infecciosos
Son múltiples los microorganismos que pueden alterar la MO; sin embargo, la BMO sólo está
indicada en pacientes con fiebre en estudio en quienes múltiples estudios con cultivos,
serológicos y de imagen, no han identificado la etiología. Algunos de estos pacientes pueden
tener inmunodeficiencia primaria o secundaria (post-tratamiento de neoplasias o de
enfermedades autoinmunes, SIDA), causante de una pobre respuesta inmune. Los gérmenes que
frecuentemente se buscan en la MO son micobacterias y micosis, principalmente
histoplasmosis.
El parvovirus 19 puede ocasionar cuadros de anemia con reticulocitopenia por infección de los
precursores eritroides y la MO muestra hipoplasia de la serie eritroide con pronormoblastos
gigantes e inclusiones intranucleares que le dan aspecto de “vidrio esmerilado” con halo
perinuclear.

Enfermedades metabólicas Son susceptibles de biopsia de MO cuando se sospecha

clínicamente una enfermedad por depósito de material que se pueda reconocer, frecuentemente
en macrófagos: material eosinófilo fibrilar citoplásmico, PAS positivo en enfermedad de
Gaucher, o bien macrófagos vaculados por lípidos en enfermedad de Niemann-Pick.
Algunas enfermedades metabólicas con depósito sistémico de cristales, incluso en la MO, como
la cistinosis y la oxalosis, muestran además de los cristales, alteraciones en el estroma. En la
oxalosis los cristales son grandes y existen en el estroma y en la matriz ósea; son causa de
fibrosis acentuada, así como reacción a cuerpo extraño. Los cristales de la cistinosis son menos
visibles: son pequeños, rectangulares; están en el citoplasma de los macrófagos. Ambas
enfermedades son autosómicas recesivas y ocasionan insuficiencia renal crónica, además de
otras alteraciones multiorgánicas.

72
 TRABAJO PRÁCTICO N° 9:

LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS

La leucemia mieloide aguda (LMA) es un desorden caracterizado por presencia de células

progenitoras mieloides en medula ósea (MO), infiltración de la sangre periférica (SP) y otros
tejidos, así como también la interrupción de la hematopoyesis normal, ocasionando la
disminución de los componentes mieloides de la sangre
La LMA representa un grupo heterogéneo de enfermedades hematológicas que derivan de los
precursores mieloides, monocíticos, eritroides y megacariocíticos de la MO.
Las LMA se clasifican en primer lugar por su morfología (características del núcleo, citoplasma
y gránulos) y también según las características citoquímicas, inmunofenotípicas (expresión de
determinadas moléculas en la membrana o en el citoplasma de las células leucémicas, que son
reconocidas por anticuerpos monoclonales mediante técnicas como la citometría de flujo),
citogenéticas (alteraciones en el cariotipo) y moleculares (alteraciones que se detectan por
Southern blott, PCR).
Los mieloblastos difieren de los linfoblastos en que los primeros tienen una menor relación
núcleo–citoplasma, una cromatina nuclear más fina, y un nucleolo claramente en sacabocado.
Los gránulos citoplasmáticos están frecuentemente presentes en los mieloblastos y la detección
de cuerpos o bastones de Auer es patognomónica.

BLASTOS MIELOIDES
Aproximadamente un tercio de las LMA presentan bastones de Auer: inclusiones
citoplasmáticas, que representan aglomeraciones de gránulos azurófilos.
Los cuerpos de Auer contienen peroxidasa, enzimas lisosomales e inclusiones cristalinas.
Cuando están presentes, son encontradas típicamente en solo 1 a 10% de los blastos.
Se ven predominantemente en granulocitos inmaduros y solo raramente en monocitos
inmaduros. Los promielocítos malignos pueden contener múltiples bastones de Auer agrupados
en paquete, recibiendo estas células el nombre de células de faggot y las inclusiones del mismo
Sultan bodies.

BASTON DE AUER

Dos clasificaciones han sido usadas en la LMA.

73
La primera, creada en 1976 por el Grupo Franco-Américo-Británico (FAB) se basa en la
descripción morfológica de las células neoplásicas comparándolas con los precursores
hematopoyéticos normales.
Esta clasificación (si bien ha sido superada por la clasificación de la OMS que incluye
citogenética, inmunofenotipo, etc.) será la mas importante en la práctica de rutina, ya que, como
bioquímicos, en un laboratorio clínico o de urgencias, jugamos un rol relevante en la detección
del paciente con leucemia, para lo cual la morfología y algún signo clínico que aporte el médico
en la solicitud de análisis, serán la única herramienta con que contamos en ese momento.

La clasificación French-American-British (FAB) usada desde 1976 utiliza un umbral de

30% de blastos en MO para diagnóstico y divide a la LMA en subgrupos que van de M0 a
M7.
El diagnóstico de LMA según la WHO, y a diferencia de FAB, se confirma al encontrar
más de 20% de mieloblastos en SP o en MO.

Clasificación FAB. Criterios para los diferentes subtipos

Según el grupo FAB, la LMA se clasifica en:
M0=Mieloide con mínima diferenciación
M1= Mieloide inmadura
M2= Mieloide con maduración
M3= Promielocítica
M4= Mielomonocítica
M5= Monocítica,
M6= Eritroleucemia,
M7= Megacarioblástica

Criterio para LMA M0 (indiferenciada):

Con mínima diferenciación mieloide. No estaba incluida en la primera versión de la
clasificación FAB. No puede ser diagnosticada sobre una base morfológica solamente, dado que
los blastos son grandes y agranulares, a veces semejando linfoblastos L2 o raramente L1 y
deberían ser identificados por una reacción de mieloperoxidasa (MPO) y sudan black (SB)
negativas (o positivas en menos de 3% de los blastos), marcadores de linaje B y T negativos y
expresión de antígenos mieloides reconocidos por al menos uno de los anticuerpos
monoclonales CD13 o CD33.
Frecuentemente, otros marcadores mieloides son positivos, e incluyen CD11b y la enzima MPO
demostrada por inmunocitoquímica y/o análisis por microscopía electrónica.

Criterio para LMA M1 (sin maduración):

La suma de células blásticas tipo I y II en MO debe ser 90% o mas de las células no eritroides y
por lo menos 3% de estas células blásticas serán peroxidasa o sudan black positivo. Las
restantes (10%) células serán granulocitos desde promielocitos en adelante, o monocitos.

Criterio para LMA M2 (con maduración):

La suma de los blastos tipo I y II en MO es de 30% a 89% de las células no eritroides; las
células monocíticas son menores al 20%; y los granulocitos de promielocitos a neutrófilo
maduro son mas del 10%.

Criterio LMA para M3 (promielocítica) (LPM):

Es la leucemia hipergranular promielocítica.
A) La gran mayoría de las células son promielocitos anormales, con un modelo característico de
granulación densa; B) el núcleo varía ampliamente en tamaño y forma y es frecuentemente
reniforme o bilobulado; C) el citoplasma de la mayoría de las células esta ocupado
completamente por granulación roja, rosa o púrpura.
D) En algunas células el citoplasma esta cubierto de finos gránulos como polvo.

74
Las células características conteniendo manojos de cuerpos de Auer ("faggots"), azarosamente
esparcidos por el citoplasma, están invariablemente presentes en MO y a veces en SP. El
citoplasma de las células que contienen faggots es frecuentemente claro o está pálidamente
teñido, pero puede también contener gránulos azurófilos.
La mayoría de los casos de M3 cumple esta descripción, pero existe una forma atípica
caracterizada por una minima granulación denominada "M3 Variante". Su característica
citomorfológica más saliente se relaciona a la configuración nuclear y a la aparición “escasa” de
células con densa granulación y de células conteniendo múltiples bastones de Auer. El núcleo
de casi todas las células en SP es bilobulado, multilobulado o reniforme, pero la mayoría de las
células están desprovistas de gránulos o contienen unos pocos finos gránulos azurófilos. Sin
embargo, están presentes algunas células con característica de la típica M3. La morfología
atípica es propia de células en SP. En MO la morfología es semejante a la de M3 típica.

Criterio para LMA M4 (mielomonocítica):

En MO las células blásticas son mas del 30% de las células no eritroides. La suma de
mieloblastos, promielocito, mielocito y granulocitos en sus últimos estadios de maduración es
>30%, pero < de 80% de células no eritroides. Mas del 20% de células no eritroides son de
estirpe monocítica en diferentes estadios de maduración; generalmente son promonocitos y
monocitos. Cuando las células monocíticas exceden 80%, se diagnostica LMA M5. Cuando los
hallazgos en MO son como se ha indicado y el recuento de monocitos periférico (monoblastos,
promonoblasto y monocito) es ≥ 5. 109/l, el diagnostico es LMA M4.
Si el recuento de monocitos es < 5.109/l, aun persiste el diagnostico de M4 si los hallazgos en
MO son como se describió y se demuestra la presencia de un componente monocítico, como la
estimación de lisozima o métodos histoquímicos que incorporan una doble reacción de
esterasas, cloroacetato esterasa especifica, alfa naftil acetato esterasa no especifica, u otras
esterasas que identifican monocitos como naftol ASD acetato con o sin incubación con fluoruro
de sodio.
El diagnostico de M4 se establece si mas de 20% de precursores de MO son monocitos,
evidenciados por reacción citoquímica, o si la concentración de lisozima excede 3 veces el valor
normal de suero u orina. Si la medula parece la de los casos de LMA M2, el diagnostico de M4
es aun posible si el recuento de monocitos periférico es de ≥ 5. 109/l y uno de los tests
mencionados señala un aumento de componente monocítico en MO.
M4 con eosinofilia: Estos eosinófilos son anormales y algunos tienen además de los gránulos
eosinófilos específicos, amplios gránulos basófilos (inmaduros) y puede tener un único núcleo
no segmentado. Tiñe con cloroacetato esterasa y PAS.

Criterio para M5 o monocítica

Se basa en el aspecto de la MO. El 80% o más de todas las células no eritroides en MO son
monoblastos, promonocitos o monocitos.
Se describen dos variedades.
-M5a: 80% o más de todas las células monocíticas son monoblastos.
-M5b: menos del 80% de todas las células monocíticas son monoblastos, las restantes son
predominantemente promonocitos y monocitos.

Criterio para LMA M6 (eritroleucemia):

El criterio de diagnostico para M6 es diferente del utilizado para los otros subtipos de LMA
(M1-M5).
El criterio revisado para el diagnostico de M6 requiere que 30% o mas de las células no
eritroides en MO sean blastos tipo I o II.

Criterio para LMA M7 (megacariocítica):

Estas células son altamente polimórficas y van desde pequeñas células redondas con escasa
cantidad de citoplasma y densa cromatina, a veces semejando linfoblastos (L1), a células que
semejan los blastos vistos en L2, con o sin gránulos y con 1 a 3 nucleolos prominentes. El
núcleo es redondo con cromatina finamente reticulada. Hay cierta heterogeneidad en el tamaño

75
debido a que aproximadamente 20 % al 30 % de los blastos presentan 3 veces o mas el tamaño
de un linfocito normal.
A veces, las células en MO o SP pueden tener mamelones, o se ve un núcleo desnudo con
grupos de plaquetas alrededor.
Los blastos son Sudan Black o MPO negativos. Puede ocurrir confusión con monocitos dado
que la alfa naftil acetato esterasa o la naftil AS-D acetato esterasa da reacción positiva y la
reacción puede ser inhibida significativamente con fluoruro.
Sin embargo los megacariocitos son casi siempre negativos a la alfa naftol butirato esterasa (lo
que los diferencia de los monocitos). Además, los megacarioblastos frecuentemente tienen una
positividad localizada y distintiva con la alfa naftil acetato esterasa en contraste con una tinción
citoplasmática más difusa en los monocitos.
La reacción de PAS o fosfatasa acida son también frecuentemente positivas con un modelo
característico.

La incidencia de los distintos tipos FAB es, aproximadamente: M1:18%, M2:28%,

M3:8%, M4:27%, M5:10%, M6:4%, M7:5%.

En 2002, la OMS propuso un sistema de clasificación que incorporaba información citogenética

diagnóstica que se correlacionaba de forma más confiable con los resultados.
En esta clasificación, los pacientes con t (8;21), inv (16), t(15;17) y aquellos con
desplazamientos MLL, los cuales de manera colectiva constituían casi la mitad de los casos de
LMA infantil, fueron clasificados como "LMA con anomalías citogenéticas recidivantes".
Esta clasificación también disminuyó los requisitos en cuanto al porcentaje de blastos en la MO
para el diagnostico de LMA (de 30 a 20%). Se hizo una aclaración de que los pacientes con
“anomalías citogenéticas recidivantes” no necesitaban cumplir con los requisitos mínimos de
blastos para considerárseles con LMA.

El análisis citogenético, identifica la presencia de ciertas anomalías genéticas asociadas con un

pronostico favorable (denominado de “bajo riesgo”) como lo son: inv(16)(p13q22),
t(8;21)(q22;q22) y t(15;17) (q22;q12).
Mientras que alteraciones en el 11q23, t(6;9), t(9;22), -7, del(5q), inv(3) o t(3), están asociadas a
un pobre pronostico (es decir de “alto riesgo”).

Dada su importancia, este aspecto fue reconocido por la OMS, creando así, los grupos:
- Grupo I: “LMA con Anormalidades Genéticas Recurrentes” que incluye,
como se menciono anteriormente, subgrupos genéticos específicos.
- Grupo II: La LMA que comparte anormalidades citogenéticas y otras características clínicas
y biológicas con el SMD fue clasificada como “LMA con Displasia Multilinaje (DML)”. La
OMS sugiere que el principal determinante para el diagnóstico de este tipo LMA sea la
evidencia o historia de SMD o de neoplasia mielodisplásica/mieloproliferativa (SMD/NMP) de
seis meses de evolución.
En la nueva clasificación, el diagnostico de LMA con DML sin antecedentes de SMD o
SMD/NMP se hace cuando los blastos alcanzan el 20% en el aspirado de MO y cuando el 50%
o mas de las células en dos o mas líneas mieloides son displásicas en una muestra previa al
tratamiento.
- Grupo III: Los casos inducidos por la exposición a terapias antineoplásicas (agentes
alquilantes, radiaciones e inhibidores de la Topoisomerasa II) son incluidos en “LMA Y SMD
relacionados con terapias previas”. Los alquilantes y la radiación inducen aberraciones
citogenéticas cuatro a siete anos después de la exposición mientras que para el tratamiento con
inhibidores de la Topoisomerasa II el periodo es entre uno a tres años.
- Grupo IV: Las LMA que no cumplen los criterios de los anteriores grupos conforman el
“LMA no clasificable de otra forma” cuyos subtipos no difieren mucho de su correspondiente
en la clasificación FAB incluyendo además la leucemia basofílica aguda, panmielosis aguda con
mielofibrosis y sarcoma mieloide.

76
Clasificación de la OMS para la LMA
LMA con anomalías genéticas recidivantes
LMA con t(8;21)(q22;q22), RUNX1-RUNX1T1(CBFA/ETO).
LMA con inv(16)(p13q22) o t(16;16)(p13;q22), CBFB-MYH11.
Leucemia promielocítica aguda con t(15;17)(q22;q11-12), PML-RARA.
LMA con t(9;11)(p22;q23), MLLT3-MLL.
LMA con t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214.
LMA con inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2), RPN1-EVI1.
LMA (megacarioblástica) con t(1;22)(p13;q13), RBM15-MKL1.
LMA con NPM1 mutado.
LMA con CEBPA mutado.
LMA con características relacionadas con la mielodisplasia
Neoplasia mieloide relacionado a terapia
LMA no especificada de otra manera
LMA con diferenciación minima.
LMA sin maduración.
LMA con maduración.
Leucemia aguda mielomonocítica.
Leucemia monoblástica y monocíticas aguda.
Leucemia eritroide aguda.
Leucemia megacarioblástica aguda.
Leucemia basofílica aguda.
Panmielosis aguda con mielofibrosis.
Sarcoma mieloide.
Proliferaciones mieloides relacionadas con el síndrome de Down:
Mielopoyesis anormal transitoria.
Leucemia mieloide relacionada con el síndrome de Down.
Neoplasma celular dendrítico plasmocitoide blástico

CITOQUÍMICA DE LAS LMA

M0 M1-M2-M3 M4 M5 M6 M7
MPO - + + - - -
ENE
CAE - + + +/- - -
ANAE - - +* +* - +/- *
SUDAN - + + - - -
PAS - - +/- +/- + -

* Inhibidas por fluoruro

INMUNOFENOTIPO MÁS RELEVANTE

M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7
CD13 CD 13 CD 13 CD 13 CD 13 CD 13 Gly A CD 61
CD 33 CD33 CD 33 CD 33 CD 33 CD 33 CD CD 41
CD CD 11 b CD 11 HLA DR – CD 14 CD 14 71 CD 13 y
14- CD 65 b CD 14 – CD 15 HLA DR + CD 33 +/-
+/- CD 15 HLA DR CD 65 36
+++

77
LMA – M0 LMA – M1

LMA – M2 LMA – M3

LMA – M3 V LMA – M4

LMA – M5 LMA – M6

78
LMA – M7

79
 TRABAJO PRÁCTICO N° 10

LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA

Leucemia Linfoblástica Aguda

Es también conocida como leucemia linfoide aguda o leucemia linfoblástica aguda (LLA). Es el
cáncer mas frecuente en pediatría.
La LLA puede ser de estirpe B o T. Aproximadamente 85% de los casos de LLA son de células
linfocíticas de linaje B (LLA-B), la LLA-T es diagnosticada en el 15% de los niños y adultos
con LLA.

1- Generalidades

5200 casos/año en US (National Cancer Institute),

Pico de incidencia a la edad de 4 años, generalmente menores de 15 años
80% de las leucemias en niños son LLA
- 85% son de célula B,
-15% son T, pero ambas frecuentemente presentan expresión aberrante de antígenos mieloides o
linfoides asociados.
Factores de riesgo: radiación in útero, síndrome de Down, ataxia telangiectasia, sin embargo la
mayoría de los casos no presentan causa conocida.
Síntomas: de abrupto establecimiento, relacionados a depresión de la MO, (fatiga, fiebre,
sangrado), dolor óseo, dolor de articulaciones, linfadenopatía generalizada,
hepatoesplenomegalia, compromiso testicular, manifestaciones de sistema nervioso central.
Presentación atípica: hipercalcemia, lesiones óseas, ausencia de blastos circulantes.
Laboratorio: la anemia es común, el recuento de plaquetas es <100x109/l en el 75% de los
casos y <10x109 /l en el 15%; la leucopenia se presenta en el 25% de los afectados, en un 10 %
de los pacientes se observa leucocitosis (WBC>100x109/l)
Pronóstico favorable: edad entre 2-10 años, sexo femenino, raza blanca; fenotipo preB,
hiperdiploidía >50, t(12,21), recuento de blancos normal a la presentación, respuesta rápida a la
quimioterapia, CD10+.
Pronóstico intermedio: hiperploidía 47-50, diploidía, 6q-, reárelos del 8q24
Pronóstico desfavorable: < de 2 años (pues generalmente presentan translocaciones 11q23) o
>de 10 años; t (9;22) (pero no si es >de 59 años); hipoploidía, casi tetraploide, 17p-, t(11q23);
LLA preB CD10 negativa; expresión de MDR1 en niños y adultos. Hiperleucocitosis y
plaquetopenia.

2- Epidemiología

La LLA es la enfermedad maligna mas frecuente en la edad pediátrica. Constituye un 25% de

los tumores pediátricos y el 75% de todas las leucemias pediátricas.
El pico de incidencia se sitúa entre los 2 y 5 años. En países con poblaciones heterogéneas se ha
observado un aumento de frecuencia en la raza blanca.
Es algo mas frecuente en los varones, sobre todo en la edad puberal.
Desde el punto de vista geográfico, la LLA es mas frecuente en los países más industrializados.
Se cree que esto es debido a la mayor exposición a agentes leucemogénicos en dichos países.

3- Etiopatogenia

La LLA es la consecuencia de la transformación maligna de una célula progenitora linfoide

inmadura que tiene la capacidad de expandirse y formar un clon de células progenitoras
idénticas bloqueadas en un punto de su diferenciación. La secuencia de eventos que llevan a la
transformación maligna es multifactorial. Estos eventos se producen durante el desarrollo

80
linfoide, momento en el que los precursores linfoides tienen mayor riesgo de presentar
mutaciones espontáneas debido a la alta tasa de proliferación de estas células y al
reordenamiento genético que se lleva a cabo en ese proceso.
La acumulación de estos linfoblastos en la MO y en diversos órganos provoca las
manifestaciones clínicas de las LLA.
Se han identificado pocos factores que estén relacionados con un aumento en el riesgo de LLA.
Los factores de riesgo no genéticos primarios aceptados son la exposición prenatal a los rayos X
y la exposición postnatal a dosis altas de radiación.
Se han identificado múltiples translocaciones cromosómicas en las LLA. Existe un mayor riesgo
de desarrollar leucemia aguda en pacientes con síndrome de Down (hasta 15 veces más que en
la población normal), de Schwachman, Klinefelter, neurofibromatosis y en síndromes
caracterizados por fragilidad cromosómica como la ataxia-telangiectasia, síndrome de Bloom o
la anemia de Fanconi. La frecuencia de LLA es mayor entre familiares de pacientes afectados.
Estos pacientes representan una minoría de casos de LLA.
Síndrome de Down. Los niños con síndrome de Down muestran un aumento en el riesgo de
presentar LLA y leucemia mieloide aguda, con un riesgo acumulativo de presentar leucemia de
aproximadamente 2,1% a la edad de 5 años y 2,7% a la edad de 30 años.
Aproximadamente de la mitad a dos tercios de los casos de LA en niños con síndrome de Down
son LLA.
Los pacientes con LLA y síndrome de Down tienen una incidencia más baja de hallazgos
citogenéticos, tanto de pronóstico favorable como desfavorable, y una incidencia menor de
fenotipo de células T. Aproximadamente un 20% de los casos de LLA que surgen en los niños
con síndrome de Down presentan mutaciones JAK2 somáticamente adquiridas. Mientras que la
vasta mayoría de casos de LMA en los niños con síndrome de Down se presentan antes de los
cuatro años de edad (mediana de edad, un año), la LLA tiene una distribución de edad similar a
la de los niños con LLA sin síndrome de Down, con una mediana de edad de 3 a 4 años.

Los factores que se han asociado claramente a un mayor riesgo de presentar LLA son el sexo
masculino, la edad entre 2 y 5 años, la raza caucásica, la exposición intraútero a radiaciones
ionizantes y la exposición posnatal a la radiación causada por bombas atómicas o tratamientos
con radioterapia. No se ha comprobado asociación clara entre el riesgo de desarrollar LLA y los
campos electromagnéticos de baja frecuencia o la exposición al radón. En los últimos años se ha
dado mucha importancia a la posible etiología viral en las LLA. La única asociación clara
descripta en pacientes pediátricos hasta ahora ha sido el virus de Epstein-Barr en el linfoma tipo
Burkitt y algunos tipos de linfoma de Hodgkin.

4- Clasificación Morfológica

Los criterios morfológicos se basan en la definición del Grupo “FAB” (de French- American–
British).
El grupo FAB reconoce tres variedades morfológicas de LLA: L1, L2 y L3.
El subtipo morfológico L1 es el más común (85%), le sigue el subtipo L2 (14%), y el L3 (1%).
En la actualidad solo tiene un valor relativo debido a que los subtipos L1 y 2 no definen a un
subtipo biológicamente relevante, y su valor pronóstico es muy limitado.

Rasgos citológicos L1 L2 L3

Tamaño celular Células pequeñas Células grandes Células grandes

Cromatina Homogénea Variable, Homogénea

Heterogénea mitosis >5%
Forma del núcleo Regular, Ocasionalmente Irregular, hendido o Regular ,oval o
hendido indentado redondo

81
Nucleolos No visibles o pequeños Uno o mas Uno o mas

Vacuolización Habitualmente ausente Habitualmente ausente Prominente

Basofilia Ligera Variable Muy intensa

citoplasmática

1-LINFOBLASTOS LINFOBLASTOS
2-LINFOCITOS

Los linfoblastos L1 son células pequeñas caracterizadas por una elevada relación
núcleo/citoplasma (N:C). El citoplasma es azul pálido y escaso, y esta limitado a una pequeña
porción del borde celular. Las células tienen nucleolo indistinto y la membrana nuclear varia de
redonda a clivada.
Los linfoblastos L2 son mayores, frecuentemente son una población más heterogénea, con
menor relación N:C. El nucleolo prominente (frecuentemente con condensación de cromatina
perinuclear). La membrana nuclear puede ser irregular o reniforme.
Los linfoblastos L3 son un grupo heterogéneo de células, caracterizado por una profunda
basofilia citoplasmática y prominente vacuolización citoplasmática.

La LLA no esta típicamente asociada con la presencia de gránulos azurófilos, que son una figura
mucho mas común de las LMA. Sin embargo, la LLA “granular” es un fenómeno morfológico
que debe ser reconocido y no debe ser confundido con LMA. Este error puede ocurrir
particularmente si existe una granulación densa en conjunción con la morfología FAB L2. Los
estudios inmunológicos y citoquímicos corroborarán el diagnóstico correcto. La variante
granular ocurre en aproximadamente 7% de niños con LLA.
La vacuolización citoplasmática es una característica de la categoría FAB L3 donde está
asociada con un gran tamaño celular e intensa basofilia citoplasmática. Sin embargo, tales
vacuolas no son exclusivas de la variante L3. Generalmente menores y mas escasas, se las
puede encontrar en células de una minoría de niños con LLA L1 y L2. Los blastos vacuolados
de la LLA pediátrica suelen ser PAS positivos y son mas comúnmente encontrados en pacientes
de 3 a 7 años de edad con bajos recuentos leucocitarios y positividad al CD 10.
El sistema de escarificación propuesto enfatiza la importancia de la elevada relación N:C y
ausencia de nucleolo para L1 y la baja relación N:C, nucleolo prominente, irregularidades
de membrana groseras y gran tamaño del blasto para la L2
Por otra parte el subtipo L3, que se reconoce inmunofenotípicamente como LLA B, se considera
como la fase leucémica del linfoma de Burkitt.

82
5- Citoquímica

Acido periódico de Schiff (PAS): Aproximadamente en el 80 % de los casos de LLA los

linfoblastos son PAS reactivos . La reacción es positiva en un 40- 70% de los blastos de las
LLA. Estas células característicamente presentan un patrón granular o en mazacote (rosado
fuerte) con un fondo negativo. Los blastos mieloides o monocíticos son débilmente positivos o
negativos. Los blastos en la LLA son negativos a la reacción de MPO, Sudan Black B y naftol
ASD cloroacetato esterasa, sin embargo hay casos descriptos de positividad al Sudan Black en
estas leucemias. En la LLA L3 las vacuolas se tiñen con la coloración aceite rojo O (oil red O).

CITOQUÍMICA LLA - B LLA - T

MPO - -
SUDAN BLACK - -
PAS + + débil
FAC - + focal
NASDA + débil/- +
NASDA – F- No se inhibe No se inhibe
ANABE - +
ANAE - +

6- Clasificación Inmunológica

Se basa en la expresión de antígenos específicos presentes durante las diferentes fases de la

diferenciación de la célula.
La co expresión en células blásticas de HLA-DR y antígenos asociados a la célula B como el
CD19, CD22 o CD10 es consistente con el diagnostico de LLA de célula B.
Dentro de las LLA, el grupo EGIL (European group for the immunological
characterization of leukaemia) ha establecido una clasificación inmunológica tanto de las LLA
de línea B como de las de línea T basada en la expresión de diferentes antígenos.
Dentro de las de línea B, uno de los aspectos mas importantes es identificar correctamente las
LLA B maduras. Estas se caracterizan por la expresión de cadenas livianas de Ig en la superficie
celular (ocasionalmente en el citoplasma).
Aunque se relacionan con el tipo morfológico L3, se han identificado casos sin esta morfología.
Su identificación es de gran importancia, ya que su tratamiento y pronóstico es diferente al del
resto de las LLA.

Clasificación inmunológica de las LLA

LLA de estirpe B
CD19+ y/o CD79+ y/o CD20+ (al menos 2 +). La mayoría Tdt+ y HLA-DR+
ProB : sin expresión de otros antígenos de diferenciación
Común : CD10+
PreB : IgM citoplasmática +
B madura : Ig superficie +

LLA estirpe T
CD3 citoplasmático +. La mayoría Tdt +, HLA-DR + y CD34 -
ProT : CD7 +
PreT : CD2 + y/o CD5 + y/o CD8 +
T intermedia : CD1a +
T madura: CD3 + en membrana.

Aproximadamente tres cuartos de los pacientes con LLA de células precursoras B, tienen

83
inmunofenotipo de la célula precursora B común y cuentan con el mejor pronostico.
Aproximadamente 5% de los pacientes tienen el inmunofenotipo de precursor pro-B. Este
fenotipo es el más frecuente en niños jóvenes y con frecuencia se relaciona con un t(4;11).
Las células leucémicas de pacientes con LLA PRE-B, contienen Igc y el 25% de los pacientes
con LLA PRE-B, tienen t(1;19).
Aproximadamente el 2% de los pacientes presentan leucemia de células B (expresión Ig de
superficie, generalmente con morfología FAB L3 y desplazamiento del gen C-MYC) también se
llama leucemia de Burkitt. Su tratamiento es completamente diferente del de otras formas de
LLA infantil.

7- Citogenética Convencional y Genética Molecular

La citogenética convencional detecta solo células neoplásicas en metafase. Actualmente, el

desarrollo de técnicas que incluyen nuevos métodos de bandeo cromosómico e hibridización de
fluorescencia in situ (FISH), técnicas de genética molecular de cariotipo espectral (SKY) e
hibridización genómica comparativa (CGH), permiten reconocer anormalidades cromosómicas
en las células leucémicas en la mayoría de los casos de LLA pediátrica.
Las anormalidades genéticas reportadas en LLA incluyen número cromosómico (ploidía) y
rearreglos estructurales.
Desplazamientos cromosómicos
De todas las anomalías cromosómicas estructurales, las translocaciones son las más frecuentes.
- La anormalidad cromosómica mas frecuente en pacientes pediátricos con cáncer es la t(12;21)
que se encuentra en 25% de los niños con LLA de linaje B. Estas alteraciones son el resultado
de la fusión del gen TEL (del cromosoma 12) con el AML (del cromosoma 21) y se asocia a
pronóstico favorable.
- La t(9;22) es común en adultos y en niños se presenta en aproximadamente el 5% de los casos,
asociada con mal pronostico.
- Los reordenamientos con el gen MLL(11q23) se presentan en alrededor del 8% de los niños
con LLA y se asocia generalmente a un aumento del riesgo de fracaso al tratamiento. La t(4;11)
es el desplazamiento mas frecuente relacionado con el gen MLL y se presenta en 2% de los
casos, estos pacientes son generalmente lactantes con recuentos elevados de leucocitos y
respuesta pobre al tratamiento. La t(11;19) se presenta en el 1%.
- La t(1;19) se presenta con una frecuencia del 5-6%, asociada con fenotipo PRE-B y resulta en
la formación del gen de fusión E2A en el cromosoma 19 al gen PBX1 en el cromosoma 1. Los
pacientes presentan hiperleucocitosis, y el pronóstico es pobre.
- La t(8;14)(q24;p32) afecta al 1-2% de los casos. Los genes afectados son MYC-IgH
- La desregulación TAL-1 es la anormalidad genética más común en LLA-T. Puede ocurrir
como resultado de t(1;14) o mas comúnmente debido a deleciones en el cromosoma 1p32
La LLA puede ser clasificada en 4 subgrupos en base al n° modal de cromosomas:
- hiperdiploide con mas de 47 cromosomas (35-45% de los casos)
-pseudodiploide 46 cromosomas con anormalidades numéricas o
estructurales (40%)
- hipodiploide < 46 cromosomas (aproximadamente 8% de los casos)
La hiperdiploidía es común y se ha comprobado que en los linfoblastos es un factor de buen
pronóstico. En la actualidad se sabe que esto probablemente se deba a que las células
leucémicas hiperdiploides tienen una mayor predisposición a la apoptosis porque son capaces de
acumular mayor concentración de metabolitos activos del metotrexato (poliglutamatos) y por
ello son más sensibles a este fármaco.

8- Presentación clínica

La LLA puede presentarse en forma insidiosa o aguda, como un hallazgo

incidental en un recuento de rutina en un niño asintomático o como una
hemorragia con riesgo de vida, infección, o episodio de distress respiratorio.

84
La duración de los síntomas en niños con LLA puede variar de días a meses. Los primeros
síntomas son generalmente no-específicos e incluyen, anorexia, irritabilidad y letargia. La fiebre
es el hallazgo más común, y ocurre en aproximadamente 60% de los pacientes. Progresivamente
el fallo medular conduce a palidez (anemia), sangrado (trombocitopenia) y susceptibilidad a las
infecciones (neutropenia).
La linfadenopatía (generalmente indolora, localizada o generalizada) debido a infiltración
leucémica es también un signo frecuente.
Los pacientes con LLA de estirpe T, generalmente de mayor edad, presentan manifestaciones
clínicas características, como mayor frecuencia de masa mediastinal y mayor porcentaje de
afectación del sistema nervioso central.
La exploración física debe ser exhaustiva y minuciosa, sin olvidar nunca la exploración de los
testículos en el varón.

9- Diagnóstico

La prueba complementaria que mas frecuentemente confirma la sospecha clínica inicial de una
LLA es el hemograma.
En el se puede encontrar leucocitosis en el 50% de los casos, anemia en el 80% y
trombocitopenia menor de 100x109/l en el 75% de los pacientes.
En el examen de la extensión periférica pueden observarse linfoblastos, aunque en algunas
ocasiones no aparecen.
El diagnóstico de una leucemia aguda siempre debe realizarse con el aspirado de MO.

La presencia de al menos un “20% de blastos en la MO” confirma el diagnóstico de

leucemia.

El diagnostico de LLA se establecerá con los estudios de inmunofenotipo, biología molecular y

citogenética de dicho aspirado.
Se deberá realizar exámen del líquido cefalorraquídeo en toda leucemia al diagnóstico, para
descartar la afectación del sistema nervioso central.
Una radiografía de tórax inicial permitirá conocer la existencia de una masa mediastínica (mas
frecuente en LLA de estirpe T).

10- Laboratorio

Al momento del diagnostico están generalmente presentes: anemia, recuento de leucocitos y

diferencial anormales, y trombocitopenia, reflejando el grado en el cual ha sido reemplazada la
medula ósea por linfoblastos leucémicos.
El recuento de leucocitos varia desde 0.1 a 150 x109/L (mediana 15x109/L) y se encuentra
elevado (>10x109/L) en casi mas de la mitad de los pacientes.
Hiperleucocitosis (> 100x109/L) ocurre en 10% a 15% de los pacientes.
El grado de elevación del recuento de leucocitos al diagnostico es un predictor muy importante
del pronostico en LLA.
Neutropenia (< de 500 granulocitos por mm3) es común y esta asociada con un aumento de
riesgo de infecciones serias.
Hipereosinofilia, generalmente reactiva, puede estar presente al diagnostico
Los recuentos disminuidos de plaquetas (mediana 50x109/L) están frecuentemente presentes al
diagnostico y pueden ser rápidamente diferenciados de una trombocitopenia inmune, dado que
la trombocitopenia aislada es rara en la leucemia.
Coagulopatía generalmente leve, puede ocurrir en LLA-T y esta solo raramente asociada con
sangrado severo. Mas del 75% de los pacientes presentan anemia, la cual es generalmente
normocítica y normocrómica y asociada con recuento de reticulocitos normales a bajos.
La anemia o trombocitopenia es frecuentemente leve (o aun ausente) en LLA T.
En raros casos una pancitopenia seguida por un periodo de recuperación hematopoyética
espontánea puede preceder al diagnostico de LLA y debe ser diferenciada de la anemia aplásica.

85
11 – LLA ACTUALIZACIÓN

1- Cambios en el diagnóstico y clasificación de neoplasias de célula precursora B y T.

A continuación se detallan cambios en la clasificación WHO de neoplasias de células B y T
precursoras:
1. La nomenclatura ha cambiado de “leucemia/linfoma linfoblástico precursor B” y
“leucemia/linfoma linfoblástico precursor T” a “leucemia/linfoma linfoblástico B” y
“leucemia/linfoma linfoblástico T”
2. Leucemia/linfoma linfoblástico B ha sido posteriormente dividido en 7 entidades distintivas
definidas por anormalidades cromosómicas recurrentes especificas; los casos de LLA-B que
carecen de estas anormalidades son consideradas como “sin otra especificación.”
Si bien la distinción entre leucemia linfoblástica y linfoma linfoblástico es obvia cuando el
paciente presenta una masa compuesta por linfoblastos B o T y sin blastos en SP o MO, es más
arbitraria cuando hay masa y compromiso medular limitado.
Se sugiere que cuando hay masa presente y 25% o mas de las células nucleadas en MO son
linfoblastos, el diagnóstico sea leucemia linfoblástica antes que linfoma linfoblástico.

Leucemia/linfoma linfoblástico B
• Leucemia/linfoma linfoblástico B, sin otra especificación
• Leucemia/linfoma linfoblástico B con anormalidades genéticas recurrentes
• Leucemia/linfoma linfoblástico B con t(9;22)(q34;q11.2);BCR-ABL 1
• Leucemia/linfoma linfoblástico B con t(v;11q23);reordenamientos MLL
• Leucemia/linfoma linfoblástico B con t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1
• (ETV6-RUNX1)
• Leucemia/linfoma linfoblástico B con hiperdiploidía
• Leucemia/linfoma linfoblástico B con hipodiploidía
• Leucemia/linfoma linfoblástico B con t(5;14)(q31;q32) IL3-IGH
• Leucemia/linfoma linfoblástico B con t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1
Leucemia/linfoma linfoblástico T

12 – TRATAMIENTO

Aunque el tratamiento de la LLA debe ser dirigido y específico para los distintos grupos de
riesgo, el tratamiento en todos ellos comprende las siguientes fases: inducción de la remisión,
tratamiento del sistema nervioso central, intensificación (consolidación) y mantenimiento.

- Tratamiento de inducción.
El objetivo inicial de todo tratamiento de una LLA es inducir una remisión completa con una
recuperación de la hematopoyesis normal. Obtener la remisión completa es la base del
tratamiento de la LLA y un requisito imprescindible para obtener una supervivencia prolongada.
Se define la remisión completa cuando no existe evidencia de leucemia en la exploración
física, en el examen de sangre periférica ni de MO. La remisión completa incluye también la
ausencia de afectación del sistema nervioso central o de afectación extramedular.
El tratamiento de inducción incluye necesariamente un glucocorticoide, un alcaloide de la vinca
(vincristina) y por lo menos otro fármaco (antraciclina o asparraginasa). Algunos protocolos que
incluyen un cuarto fármaco como la daunorrubicina han demostrado prolongar la duración de la
remisión completa incluso en grupos de riesgo alto.
El fracaso de la inducción es un acontecimiento raro que tan solo ocurre en un porcentaje
inferior al 5% de los pacientes pediátricos con LLA y determina un pronóstico muy
desfavorable.

- Tratamiento de intensificación (consolidación).

86
En la fase de consolidación se administra un tratamiento intensivo inmediatamente después de
finalizar el tratamiento de inducción, que se ha mostrado muy efectivo sobre todo en los
pacientes de alto riesgo.
La intensificación retardada o la reinducción promulgada por el grupo BFM (Berlín-Frankfurt-
Munich) es probablemente el régimen mas utilizado. Consiste en una repetición del tratamiento
de inducción a los 3 meses de la remisión completa y su beneficio es claro en los pacientes de
riesgo estándar

- Tratamiento de mantenimiento.
Los pacientes con LLA requieren un tratamiento prolongado de mantenimiento.
Con las nuevas y sofisticadas técnicas de laboratorio los investigadores han comprobado que en
pacientes que están en aparente remisión completa puede existir enfermedad minima residual
(EMR).
La combinación de metotrexato administrado semanalmente y 6-mercaptopurina a diario
constituye el tratamiento estándar de mantenimiento en las LLA.
En la actualidad, la norma general es prolongar el tratamiento un total de 2 años o 2 años y
medio. Muchos investigadores prefieren ampliarlo a 3 años en el caso de los varones, por su
peor pronóstico comparado con el sexo femenino.

-Tratamiento del sistema nervioso central.

La importancia de la afectación del SNC en el tratamiento de la LLA estriba en que dicho
sistema actúa como un “refugio” para las células leucémicas que residen en el, al quedar
protegidas por la barrera hematoencefálica de las dosis terapéuticas sistémicas de los distintos
quimioterápicos.
Actualmente, la mayoría de los protocolos en Europa y EE.UU. han prescindido de la
irradiación intracraneal como profilaxis del SNC y se utiliza mayoritariamente la profilaxis
intratecal con metotrexato en monoterapia, junto con la quimioterapia intensiva sistémica.

Trasplante hematopoyético.
En las ultimas 2 décadas los avances en el campo de los trasplantes de
progenitores hematopoyéticos han sido notables. Destacan la mejoría en la prevención de la
enfermedad del injerto contra huésped, el desarrollo de los bancos de donantes no
emparentados, la disminución del tiempo de injerto hematopoyético y las mejorías en el
tratamiento de soporte.
Sin embargo, el desarrollo paralelo de la quimioterapia hace que en la actualidad las
indicaciones de trasplante hematopoyético en pacientes en primera remisión sean difíciles de
establecer y tan solo se aceptan como claras en los pacientes con cromosoma Ph positivo y en
pacientes que no alcanzan la remisión completa al finalizar el tratamiento de inducción.

Enfermedad mínima residual (EMR)

La resistencia a agentes terapéuticos es el factor principal en el fracaso del tratamiento del
cáncer.
En la leucemia, las células resistentes remanentes en MO y/o SP constituyen la EMR y son
detectables por ensayos de alta sensibilidad cuando el paciente aparenta estar en remisión
completa.
La detección temprana de la expansión de células residuales permite intervención clínica con el
objetivo de revertir la proliferación de células leucémicas resistentes. De esta forma, la
medición exacta y precisa de EMR puede mejorar la optimización del manejo clínico del
paciente oncológico.
Varios estudios han demostrado el valor pronostico de la EMR durante. El análisis de EMR en
el final del tratamiento de inducción y comienzo del de consolidación ha mostrado tener la
significación más relevante en la identificación de pacientes con diferentes riesgos de recaída,
independientemente de otros parámetros biológicos y clínicos desde entonces utilizados como
criterio de estratificación.

87
LLA – L1

LLA – L2

LLA – L3

88
 TRABAJO PRÁCTIVO N° 11:

SLPC Y SMPC

SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS

El término síndrome linfoproliferativos crónicos (SLC) incluye una variedad de entidades

clínico-biológicas que resultan de la proliferación clonal de un linfocito B o T maduro e
inmunocompetente. El diagnóstico preciso de los SLC debe basarse en una constelación de
datos clínicos y de laboratorio. Estos últimos deben incluir: citología, histología, marcadores
inmunológicos y, en determinados casos, estudios citogenéticos y moleculares. Desde un punto
de vista práctico, la citología, histología e inmunofenotipo constituyen los pilares diagnósticos
fundamentales. En términos generales, la morfología de las células linfoides se
aprecia mejor en extensiones de sangre periférica y por consiguiente, ésta es la muestra que
deberá examinarse con preferencia en entidades que cursan con un cuadro leucémico. Si bien, es
recomendable la observación de otros tejidos como la médula ósea y/o improntas de ganglio
linfático, bazo u otros órganos ya que pueden existir discrepancias en cuanto a morfología en los
diferentes órganos que tal vez indiquen progresión o transformación del proceso. Por ejemplo,
en procesos de bajo grado, Ej. leucemia linfática crónica o linfoma folicular, el hallazgo de
células grandes en médula ósea es un signo que sugiere transformación. Otros puntos
importantes a tener en consideración para apreciar bien el detalle morfológico del linfocito son
los siguientes: 1 - las extensiones deben realizarse de sangre fresca y con una tinción adecuada
de May-Grunwald-Giemsa y, 2- la observación debe realizarse en una zona de la preparación en
la que los glóbulos rojos estén bien extendidos; por ejemplo un caso de leucemia prolinfocítica
B puede remedar una leucemia linfática crónica si se observa en una parte gruesa de la
extensión o por el contrario, asemejarse a una leucemia aguda si se observa en una zona
demasiado fina. Finalmente, la citomorfología tiene sus limitaciones y por tanto es esencial
disponer de la información del inmunofenotipo del linfocito neoplásico, es decir tener
conocimiento de si nos hallamos ante un SLC de naturaleza B o T. Así, la variante de células
pequeñas de Sézary puede asemejar morfológicamente un linfoma centrofolicular o bien, una
variante de células pequeñas de leucemia prolinfocítica T parecerse a una leucemia linfática
crónica atípica.

SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS B
PRIMARIAMENTE LEUCÉMICOS
Leucemia linfática crónica (LLC)
Las células de la LLC poseen unos rasgos morfológicos característicos. Son de tamaño pequeño
o mediano, el núcleo tiene un contorno regular, la cromatina es cuarteada, el nucléolo no es
visible o es muy pequeño y el citoplasma es escaso. En las formas típicas de LLC, esta
población es la predominante y constituye más del 80% de linfocitos circulantes; la presencia de
sombras de Grumpecht es común, especialmente en casos con recuentos linfocitarios elevados.
Existen dos variantes morfológicas de LLC cuya identificación tiene importancia desde un
punto de vista clínico y biológico: la LLC con cifras superiores al 10% de prolinfocitos o
LLC/PL y la LLC atípica en la que una cifra superior al 15% de células circulantes posee un
núcleo hendido o rasgos linfoplasmocíticos. El reconocimiento de estas dos formas es
importante ya que suelen asociarse a estadios más avanzados y a enfermedad progresiva con un
mayor índice de proliferación. Es probable que esta asociación clínico-morfológica tenga su
base en la elevada frecuencia en estas variantes de LLC de trisomía 12 así como de mutaciones
o deleciones del gen supresor de tumores p53, hechos ambos que son infrecuentes en las formas
de LLC típicas. Tan sólo la citología permite el diagnóstico de LLC/PL o LLC atípica ya que el
inmunofenotipo en estas dos variedades suele ser el característico de la LLC. La LLC, como
todo proceso de bajo grado, puede sufrir transformación a un linfoma de células grandes, cuadro
que se reconoce como síndrome de Richter. Aunque ello es más común que acontezca en
ganglios linfáticos periféricos o se manifieste con masas abdominales y durante el curso

89
evolutivo de la LLC, en algunos pacientes, el síndrome de Richter puede ser la manifestación
inicial de la enfermedad e incluso manifestarse en forma de leucemia con franca afectación de
sangre periférica y médula ósea. En estos pacientes, la observación de extensiones de sangre
periférica demuestra la presencia de dos poblaciones celulares, una de células pequeñas con una
morfología típica de LLC y una segunda población de células de tamaño grande con diámetro
superior a tres glóbulos rojos, cromatina reticular, nucléolo prominente y citoplasma basófilo.
Debido a que el perfil inmunológico de las células en el síndrome de Richter es similar al de la
LLC en la mayoría de los casos, si sólo se considera el inmunofenotipo y se prescinde de la
morfología, se realizará el diagnóstico erróneo de "LLC". Por tanto, la citología en esta
situación es esencial para el diagnóstico. El inmunofenotipo, por otro lado, es de ayuda
especialmente en pacientes en los que el síndrome de Richter se manifiesta en la fase
diagnóstica ya que, al ser característico de LLC, nos está indicando que se trata de la
transformación de una LLC. Existen casos en los que el linfoma de células grandes representa
una neoplasia "de novo" que resulta de la expansión clonal de una nueva clona independiente de
la LLC. La citología no distingue entre estas dos situaciones mientras que los datos
citogenéticos y moleculares permiten su distinción.

Leucemia prolinfocítica B (LP-B)

La LP-B fue inicialmente descrita por Galton y cols. (1974) como una variante de LLC. Si bien,
la LP-B representa una entidad clínico-biológica definida diferente a la LLC. El examen
morfológico de las células circulantes es esencial para establecer el diagnóstico. El prolinfocito
B posee un tamaño superior al del linfocito de la LLC; el núcleo es de contorno regular,
cromatina densa pero no cuarteada y posee un nucléolo único, prominente, vesicular y
generalmente en posición central. Estas células se hallan en sangre periférica en una proporción
superior al 55% del total de linfocitos circulantes. En algunos casos, pueden apreciarse formas
bilobuladas que sugieren cierto grado de transformación. El diagnóstico diferencial de la LP-B
se plantea con la LLC/PL, el linfoma de manto y la variante de tricoleucemia. El análisis
citológico es el test básico para el diagnóstico de la LP-B ya que el inmunofenotipo, si bien
difiere de la LLC, puede ser similar al de los linfomas B leucemizados incluyendo el del manto,
y al de la variante de tricoleucemia. En un 20% de LP-B se demuestra la presencia de la t (11;
14) (q23; q32) con expresión de ciclina Dl idéntica a la documentada en linfomas del manto, de
ahí los problemas de diagnóstico diferencial entre la LP-B y dicho linfoma en fase leucémica.
La citología y la histología del bazo, cuando se dispone de la misma, constituyen tests
diferenciales esenciales.

Tricoleucemia y variante de tricoleucemia

La tricoleucemia es un SLC que cursa habitualmente con citopenias, en particular

monocitopenia y una proporción variable de células atípicas circulantes con unos rasgos
citológicos muy característicos. El tricoleucocito es una célula de tamaño mediano que posee un
núcleo redondeado o más frecuentemente arriñonado o hendido y una cromatina algodonosa; el
nucléolo no es visible generalmente al microscopio óptico. Aunque la franca transformación de
la tricoleucemia a un proceso de alto grado no ha sido descrita, en una minoría de pacientes,
junto a los tricoleucocitos típicos se puede apreciar la presencia de células de tamaño superior
con una relación núcleo/citoplasmática más elevada, un núcleo de cromatina reticular y la
presencia o no de uno a tres nucléolos. Ello ha sido documentado en el curso evolutivo de la
tricoleucemia en aproximadamente el 5% de los pacientes y se halla asociado a masas
adenopáticas abdominales y cierto grado de resistencia a los análogos de las purinas,
deoxicoformicina y clorodeoxiadenosina. Todos estos datos sugieren un cierto de grado de
transformación de la tricoleucemia si bien, la agresividad clínica es menor si se compara a la de
un linfoma de células grandes que se desarrolla en uno de bajo grado. Además de la
tricoleucemia típica, existe una forma especial denominada variante de tricoleucemia. En ésta
y, a diferencia de la forma típica, los recuentos leucocitarios son elevados y no se constata

90
monocitopenia. La morfología del linfocito circulante podría considerarse intermedia entre el
tricoleucocito y el prolinfocito. El núcleo es redondeado y posee una cromatina más densa que
la del tricoleucocito y un nucléolo prominente similar al del prolinfocito; por el contrario, el
citoplasma es abundante con vellosidades similares al del tricoleucocito si bien con un grado
mayor de basofilia. El diagnóstico diferencial de la variante de tricoleucemia se plantea con la
forma típica, la leucemia prolinfocítica y el linfoma esplénico de células vellosas. La morfología
y marcadores inmunológicos son esenciales para distinguir entre la tricoleucemia y su variante
ya que la histología del bazo y médula ósea son similares en ambos procesos. La morfología e
histología del bazo y médula ósea permiten el diagnóstico diferencial entre la variante de
tricoleucemia y el linfoma esplénico de células vellosas o la leucemia prolinfocítica. La
distinción de estos tres procesos es importante por la diferente conducta terapéutica a adoptar.

Leucemia de células Plasmáticas

Este es un proceso muy infrecuente y que se define de forma arbitraria por la presencia de una
cifra superior a 2x109/l de células plasmáticas en sangre periférica. Este cuadro debe
diferenciarse de la leucemización de un mieloma múltiple, el cual en fases terminales puede
asociarse a la presencia de plasmocitos circulantes. Las manifestaciones clínicas de la leucemia
de células plasmáticas con alta frecuencia de organomegalia, hipercalcemia y su forma de
presentación aguda difieren asimismo del mieloma múltiple.
En la leucemia de células plasmáticas, los elementos circulantes muestran grados variables de
diferenciación. Así pues, los rasgos morfológicos pueden ser similares a los de células
plasmáticas maduras aunque en general con un cierto grado de asincronismo o atipía. El núcleo
suele ser excéntrico y poseer una cromatina densa aunque formas con cromatina reticular no son
raras; el citoplasma suele ser marcadamente basófilo. En general, la leucemia de células
plasmáticas no plantea problemas diagnósticos cuando la célula circulante que predomina es la
descrita, si bien hay formas indiferenciadas puramente blásticas en las que los marcadores
inmunológicos son esenciales para establecer el diagnóstico ya que demuestran la presencia de
inmunoglobulina en el citoplasma de los blastos con restricción clonal y expresión marcada de
cadena ligera y negatividad para muchos de los marcadores pan-B.

LINFOMAS NO HODGKIN B LEUCEMIZADOS

La leucemización de los linfomas no Hodgkin es altamente frecuente, en especial en aquellos de

bajo grado, aunque también puede acontecer en los linfomas de alto grado de células grandes.
La linfocitosis puede documentarse en la fase diagnóstica y no es infrecuente que estos
pacientes se diagnostiquen erróneamente de LLC si uno no tiene en consideración la morfología
de las células circulantes así como los marcadores inmunológicos. El significado pronóstico de
la manifestación leucémica de un linfoma varía de acuerdo al tipo histológico, grado de
linfocitosis y a la presencia o no de células grandes circulantes que sugieran transformación del
proceso. Describiremos a continuación los rasgos morfológicos que caracterizan los linfomas B
que con mayor frecuencia se leucemizan.

Linfoma centrofolicular

Los linfocitos son de tamaño muy pequeño, similar al de un glóbulo rojo, la cromatina es densa
pero uniforme, no cuarteada y en algunas células puede apreciarse una hendidura nuclear muy
estrecha; el citoplasma es apenas visible. En algunos pacientes, junto a estas células pequeñas,
pueden observarse células de tamaño superior con citoplasma abundante y un nucléolo
periférico, es decir, mostrando rasgos morfológicos de centroblastos. El diagnóstico diferencial
del linfoma centrofolicular se plantea con la LLC y más raramente con el linfoma del manto. Si
bien, la morfología de los linfocitos es diferente en estos tres procesos, la histología y/o
citogenética/estudios moleculares son pruebas esenciales para la confirmación del diagnóstico

91
de uno u otro tipo de linfoma mientras que el inmunofenotipo permite distinguir la LLC del
linfoma centrofolicular.

Linfoma esplénico de células vellosas

Como su nombre indica, este linfoma se caracteriza por la presencia en sangre periférica de una
cifra variable de linfocitos con un citoplasma irregular que muestra múltiples vellosidades finas.
La cromatina nuclear es densa e incluso en algunos casos cuarteada como la de los linfocitos de
la LLC y el nucléolo raramente puede observarse al microscopio óptico. A diferencia de la
tricoleucemia o su variante, el citoplasma de las células en este linfoma es menos abundante así
como el tamaño celular es menor. En algunos pacientes, junto a los linfocitos vellosos, pueden
apreciarse células con rasgos de linfoplasmocitos y de hecho, en aproximadamente el 20% de
casos, se documenta una pequeña banda monoclonal, generalmente lgG. El diagnóstico
diferencial se plantea con la LLC o con los otros procesos que cursan con células vellosas,
tricoleucemia y su variante, y ello es importante por cuanto pacientes con un linfoma de células
vellosas responden bien a la esplenectomía o bien a la fludarabina mientras que suelen mostrar
resistencia a los agentes alquilantes. Además de la morfología, los marcadores inmunológicos
son importantes para distinguir este linfoma de la LLC y, la histología del bazo y de la médula
ósea para diferenciarlo de la tricoleucemia y su variante. En un 5% de los casos el linfoma de
células vellosas puede sufrir transformación a un linfoma de células grandes, bien a nivel
ganglionar o incluso en sangre periférica. En tal situación, se observan células pequeñas de
citoplasma velloso junto a células grandes con núcleo de cromatina reticular y nucléolo
prominente.

Linfoma linfoplasmocítico

La manifestación leucémica de un linfoma linfoplasmacítico es relativamente frecuente. En las

extensiones de sangre periférica se puede apreciar "rouleaux" debido a la presencia de una
banda monoclonal. Los linfocitos circulantes poseen un aspecto maduro, cromatina densa y
citoplasma escaso o de mediano tamaño con diferentes grados de basofilia. El diagnóstico
diferencial de este linfoma se plantea con la LLC atípica y con el linfoma esplénico de células
vellosas, básicamente en aquellos pacientes en los que se detecta una pequeña banda
monoclonal. Además de la citología, los marcadores inmunológicos son de gran valor para
diferenciar la LLC atípica del linfoma linfoplasmocítico.

Linfoma de células del manto

Es ésta una entidad clínico-biológica cuya definición ha sido establecida durante la última
década. La frecuencia de un cuadro leucémico en este tipo de linfoma, bien al diagnóstico o
durante su evolución, se desconoce, ya que una proporción substancial de casos se diagnostican
de LLC atípicas. El cuadro morfológico en sangre periférica en el linfoma del manto se
caracteriza por su marcado pleomorfismo en lo que se refiere a tamaño celular e irregularidad
del contorno nuclear. La célula más típica es un linfocito de tamaño medio con un núcleo de
cromatina punteada, una o dos hendiduras de corta longitud y visibles al microscopio óptico y
un citoplasma escaso o mediano; el nucléolo no es visible o en caso de visualizarse es pequeño
y no prominente. Actualmente se considera que el linfoma de células del manto puede
transformarse a formas blásticas y/o anaplásicas lo que le confiere un peor pronóstico a un
linfoma que, de por sí, es de difícil manejo clínico por su resistencia a tratamiento o respuesta
corta al mismo. El diagnóstico diferencial del linfoma del manto leucemizado se plantea con la
LLC/PL ya que ésta suele manifestar un cierto pleomorfismo, la LP-B, especialmente en casos
asociados a la t(11;14) y con otros linfomas leucemizados, en particular el folicular y el
esplénico de células vellosas. Además de la citología, la histología es un pilar esencial para el
diagnóstico diferencial entre estas entidades y, los marcadores inmunológicos y la citogenética

92
son asimismo de gran valor siempre que se tenga presente que la t(11;1 4) no es estrictamente
específica de linfoma de manto.

Linfoma de células grandes

La manifestación leucémica de un linfoma de células grandes es infrecuente pero puede

acontecer ya como cuadro de presentación en la fase diagnóstica o durante el curso clínico. Las
células linfoides circulantes poseen gran tamaño y rasgos citológicos de inmunoblastos tales
como un núcleo con cromatina laxa, uno o varios nucléolos y un citoplasma marcadamente
basófilo; en algunos casos, las células asemejan centroblastos o bien muestran rasgos
anaplásicos. Raramente las células corresponden a un linfoma multilobulado. El diagnóstico
diferencial se plantea esencialmente con la leucemia aguda, en particular la monoblástica, y
muy en especial en aquellos pacientes en los que el cuadro se manifiesta "d'amblee" en forma de
leucemia y sin organomegalia. El inmunofenotipo es esencial para distinguir entre un linfoma
de células grandes y la leucemia aguda monoblástica ya que la morfología en la mayoría de los
casos no permite distinguirlos.

Linfocitosis B policlonal

Si bien este cuadro no puede considerarse como un SLO, lo describiremos aquí por los
problemas de diagnóstico que ofrece con linfomas leucemizados. El grado de linfocitosis en
estos pacientes, que suelen ser mujeres de mediana edad y con una historia marcada de
tabaquismo, no suele ser muy marcado, alrededor de 5 a 10x109/l. Los linfocitos muestran una
morfología muy peculiar. Estos poseen un tamaño grande y citoplasma abundante, un núcleo
hendido o bien bilobulado y algunas células poseen nucléolo. Formas con ciertos rasgos
linfoplasmocitoides pueden también hallarse presentes. Aunque esta morfología e incluso la
histología de médula ósea con presencia de agregados linfoides sugieren un linfoma, el
inmunofenotipo es esencial ya que si bien muestra la naturaleza B de la célula, no evidencia
restricción clonal. Ello se confirma mediante análisis de ADN de las cadenas pesada y ligeras de
la inmunoglobulina.

SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS T
PRIMARIAMENTE LEUCÉMICOS

Leucemia prolinfocítica T (LP-T)

Es ésta una entidad bien definida en cuanto a sus características clínicas y de laboratorio. Desde
un punto de vista morfológico, las células circulantes corresponden a prolinfocitos. Es decir son
células de tamaño mediano con un núcleo de cromatina densa y contorno regular o irregular
con un nucléolo único; el citoplasma muestra irregularidades o protusiones y suele ser
intensamente basófilo. No existen diferencias marcadas entre el prolinfocito B y el T en las
formas de leucemia prolinfocítica T típica excepto por el hecho de que los prolinfocitos T
poseen un tamaño inferior, el núcleo puede mostrar irregularidades en su contorno y el
citoplasma es más basófilo que el del prolinfocito B. Junto a la forma típica, existe una variante
de LP-T, designada de células pequeñas, la cual se caracteriza porque las células tienen un
tamaño inferior a la forma típica y el nucléolo solo es visible por microscopía óptica en una
proporción de células si bien se identifica mediante estudios ultraestructurales. Esta variante de
células pequeñas representa el 20% de casos de LP-T y se ha descrito en la literatura bajo el
término de LLC-T, designación que da lugar a confusión ya que la enfermedad no suele
comportarse como una leucemia crónica sino que tiene un curso agresivo y, por el hecho de que
la designación LLC-T se había empleado en las décadas de los 70 y 80 para describir la
leucemia de linfocitos granulares. Debido a que no existen diferencias entre la forma de LP-T
típica y la variante de células pequeñas en cuanto a clínica, marcadores inmunológicos y

93
citogenética es justificado que se incluya como variante de LP-T ya que ambas, la LP-T típica y
la variante, representan una única entidad clínico biológica. El diagnóstico diferencial de la LP-
T se plantea con la LP-B en aquellos casos con morfología típica mientras que la variante de
células pequeñas de LP-T puede erróneamente diagnosticarse de LLC. Los marcadores
inmunológicos permiten la distinción entre la LP-T y LP-B así como de la LP-T con la LLC.

Leucemia de linfocitos granulares (LLG)

Ésta representa una entidad definida y tal vez una de las primeras en las que se demostró el
origen T de los linfocitos circulantes. La sangre periférica se halla afectada en la mayoría de los
casos, aunque en unos pocos, la enfermedad se manifiesta en forma tumoral, ej. esplenomegalia,
y la sangre periférica solo se halla involucrada durante la evolución clínica y, en especial,
después de una esplenectomía que, en estos pacientes, suele realizarse con fines diagnósticos.
Las citopenias, particularmente neutropenia y anemia, son comunes. El grado de linfocitosis es
muy variable y generalmente no suele ser muy marcado e inferior a 20x109 /l. El cuadro
morfológico es homogéneo y la célula predominante es un linfocito de tamaño mediano o
grande con un núcleo de cromatina madura, generalmente excéntrico, de cromatina densa y
nucléolo no visible; el citoplasma es abundante, claro y posee varios gránulos azurófilos, de ahí
la denominación de leucemia de linfocitos granulares. Dicha granulación contiene enzimas tales
como la fosfatasa ácida así como otras citocinas (por ejemplo granzimas) que desarrollan un
papel importante en la función citotóxica/killer o "natural killer" de estos linfocitos. Estudios
ultraestructurales demuestran que algunos de estos gránulos poseen en su interior una estructura
peculiar integrada por haces de microtúbulos dispuestos en posición paralela y que por ello se
designan: haces de túbulos paralelos o PTA. De acuerdo al fenotipo, existen dos variantes de
leucemias de linfocitos granulares: la variante T-citotóxica y la de células "natural killer". No
existen grandes diferencias entre ambas excepto por: 1- su incidencia, la variante de células
natural killer es mas frecuente en países orientales, 2- curso clínico, que suele ser más agresivo
en la leucemia de células natural killer y 3- la morfología, ya que la granulación citoplasmática
es más marcada en la variante de células T. Los rasgos morfológicos de los linfocitos en la
leucemia de linfocitos granulares son idénticos o muy similares a los que muestran la pequeña
proporción (5-10%) de linfocitos granulares presentes en sangre periférica de individuos
normales. Raramente la leucemia de linfocitos granulares sufre transformación a un linfoma de
alto grado T; en algunos casos descritos, las células blásticas poseen unas características
citoplasmáticas similares a las de los linfocitos granulares incluyendo granulación
citoplasmática. El diagnóstico diferencial de la leucemia de linfocitos granulares se plantea
esencialmente con cuadros de linfocitosis reactivos a procesos virales o post-esplenectomía y
con la tricoleucemia. La leucemia de linfocitos granulares se diferencia de linfocitosis reactivas,
no clonales, mediante estudios citogenéticos o de análisis molecular investigando la
configuración de los genes que codifican las cadenas del receptor de células T (RCT) que
demuestra la presencia de una clona solamente en procesos leucémicos. Si bien, cuando no se
dispone de estas técnicas, datos que apoyan el diagnóstico de un cuadro leucémico no reactivo
son: una morfología y fenotipo uniformes (por ejemplo >90% de linfocitos CD8+>,
inmunofenotipos atípicos o muy infrecuentes en linfocitos normales (por ejemplo
CD4+CD16+CD56+) y una linfocitosis superior a 5x109/I que persista durante o más de 6
meses. El diagnóstico diferencial con la tricoleucemia se presenta en aquellos casos en los que
la enfermedad se manifiesta con marcada esplenomegalia y la linfocitosis no es obvia. La
histología del bazo en estos pacientes puede remedar la de la tricoleucemia ya que como ésta, la
leucemia de linfocitos granulares afecta primordialmente la pulpa roja del bazo. El
inmunofenotipo, particularmente en cortes del bazo permite distinguir entre ambos procesos.

Leucemia de linfocitos "Sézary-like"

Ésta es una entidad muy infrecuente que se caracteriza por la presencia de linfocitos circulantes
con una morfología similar o idéntica a la de las células de Sézary pero que, a diferencia del

94
síndrome de Sézary, la afectación cutánea es inexistente. La enfermedad tiene un curso
agresivo, similar al de la LP-T. Desde un punto de vista morfológico, las células circulantes son
idénticas a las de la variante pequeña o de células grandes del síndrome de Sézary; el núcleo es
cerebriforme y el nucléolo no puede visualizarse por microscopía óptica o ultraestructural,
mientras que el último análisis permite confirmar la configuración cerebriforme del núcleo de
estas células. Recientes estudios citogenéticos en una minoría de casos han demostrado la
presencia de anomalías características de la LP-T, tales como inv(14)(qll;q32) así como
anomalías que se observan con una frecuencia relativa en el síndrome de Sézary, como aquellas
que afectan a 17q. Por consiguiente, es incierto sí este tipo de leucemia puede clasificarse como
una entidad definida, con rasgos intermedios entre la LP-T y el síndrome de Sézary, o bien
encuadrarse como una variante cerebriforme de la LP-T.

LINFOMAS T LEUCEMIZADOS

Leucemia linfoma T del adulto (LLTA)

Éste es un síndrome linfoproliferativo T con una distribución racial y geográfica y etiología

características y que con una gran frecuencia (>75%) afecta sangre periférica. El cuadro
citológico se caracteriza por un marcado pleomorfismo en relación al tamaño celular, grado de
condensación cromatínica e irregularidades nucleares. La célula más característica es un
linfocito de mediano tamaño con citoplasma escaso y agranular y un núcleo polilobulado o con
múltiples hendiduras visibles al microscopio óptico. Por dicha configuración nuclear que
asemeja los pétalos de flores, esta célula se ha designado "célula en flor". Una proporción muy
pequeña de linfocitos en flor puede ser identificada en la sangre periférica de portadores del
retrovirus HTLV-l, agente causal de la LLTA. Asimismo en la LLTA, pueden observarse en
sangre periférica células linfoides de tamaño grande y con características de inmunoblastos,
especialmente en la forma aguda de presentación, aunque su proporción es pequeña. El
diagnóstico diferencial de la LLTA se plantea con otros linfomas T leucemizados, el síndrome
de Sézary y linfomas cutáneos con expresión periférica. La morfología es de gran ayuda en el
diagnóstico diferencial ya que existe un marcado "overlapping" en cuanto a datos histológicos e
inmunofenotipo que no permiten diferenciar entre la LLTA y los otros linfomas cutáneos T. El
test definitivo es la demostración del retrovirus HTLV-l bien mediante serología o análisis del
ADN ya que sólo se halla presente en la LLTA.

Síndrome de Sézary

El síndrome de Sézary es un linfoma cutáneo T que por definición afecta la sangre periférica.
Los recuentos linfocitarios en estos pacientes no suelen ser muy elevados, generalmente
inferiores a 50x109 /l pero en la extensión de sangre periférica destacan siempre linfocitos
atípicos. En base al tamaño celular se distinguen dos variantes de síndrome de Sézary: la de
células pequeñas y la de células grandes, si bien no es infrecuente hallar los dos tipos celulares
en un mismo paciente. La célula de Sézary posee unos rasgos nucleares muy característicos. En
las células de mayor tamaño, el núcleo es altamente convoluto con irregularidades que asemejan
las circunvoluciones del cerebro y por ello se designa núcleo cerebriforme. Este aspecto no
siempre se objetiva en las células de Sézary pequeñas, las cuales suelen exhibir un núcleo
hipercromático. El citoplasma en estas últimas es escaso, mientras que puede ser algo más
abundante en las de tamaño grande y contener o no vacuolas. El estudio ultraestructural permite
documentar de forma más precisa las irregularidades nucleares y demostrar un núcleo
serpentino con dos o más indentaciones de escasa amplitud. En general, no existen problemas
de diagnóstico diferencial entre el síndrome de Sézary y otros procesos T cuando se dispone de
los datos clínicos y de inmunofenotipo, excepto con la LLTA, en especial en países endémicos
para el HTLV-l. Como hemos mencionado antes, estudios serológicos o moleculares de este
retrovirus son esenciales junto con los otros datos clínicos y de laboratorio para distinguir el
síndrome de Sézary u otros linfomas cutáneos leucemizados de la LLTA.

95
Otros linfomas T con expresión leucémica

Los linfomas de células grandes T pueden manifestarse o evolucionar con un cuadro leucémico
como ocurre con los de origen B, si bien con una frecuencia menor. Desde un punto de vista
morfológico las células circulantes son de tamaño grande y no poseen rasgos que permitan
diferenciarlas de aquellas que se observan en los linfomas B de células grandes. El
inmunofenotipo, por consiguiente, es necesario para tal diferenciación. Los linfomas
pleomórficos T, anaplásicos y linfomas / raramente se leucemizan y el cuadro morfológico
es altamente variable.

LLC LPL – B

TL LEUCEMIA DE CELULAS PLASMATICAS

LINFOMA CENTROFOLICULAR LINFOMA DE MANTO

96
LEUCEMIA PROLINFOCITICA T LEUCEMIA LGG

SINDROME DE SEZARY

SINDROMES MIELOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS

Son alteraciones clonales de la célula madre hematopoyética, caracterizados por la proliferación

en la médula ósea, de una o más líneas celulares mieloides (granulocítica, eritroide y
megacariocítica). Pueden cursar con un grado variable de mielofibrosis. En su evolución tienen
el potencial de sufrir progresión de la enfermedad y fallo medular debido a mielofibrosis,
hematopoyesis inefectiva o transformación en una fase blástica aguda. Son enfermedades de
adultos, con edad de presentación comprendida entre 50 y 70 años. El tratamiento de los SMPC
no está encaminado a la curación de la enfermedad, sino a la supervivencia y mantenimiento de
una situación clínica óptima. La excepción la constituye la leucemia mieloide crónica (LMC)
que requiere un tratamiento más agresivo.

Son desordenes clonales de las células sanguíneas caracterizados por proliferación en MO

de uno o mas de los linajes mieloides (eritroide, granulocítico, megacariocítico)

Cambios en las Denominaciones

La clasificación WHO 2001 utilizaba la denominación de “enfermedades mieloproliferativas
crónicas”. La clasificacion WHO 2008, con el objeto de reflejar exactamente la naturaleza
neoplásica de estas entidades, paso a denominarlas “neoplasias mieloproliferativas” (NMP).
Se ha incorporado además, un nuevo subgrupo, el de las “neoplasias mieloides y linfoides con
eosinofilia y anormalidades del PDGFRA, PDGFRB, y FGFR1”.

Razones que justificaron los cambios

En los primeros esquemas de la clasificacion WHO, para confirmar el diagnostico
de Leucemia Mieloide Crónica (LMC) se consideraba la detección del cromosoma

97
Philadelphia (Ph) y/o el gen de fusión BCR-ABL1 mientras que los subtipos de NMP BCR-
ABL1 negativos eran diagnosticados de acuerdo a características clínicas y de laboratorio y
sustentado en mínimas contribuciones histopatológicas.
Hoy se reconoce que en las NMP la proliferación anormal es debida a rearreglos
clonales o mutaciones de genes que codifican proteínas tirosinquinasa.
Dos factores han influido para generar los cambios producidos en la revisión de
los criterios WHO para NMP:
1) el descubrimiento de anormalidades genéticas que pueden ser utilizadas como
marcadores diagnósticos en las NMP con transcripto genético BCR-ABL1– negativas y
2) y una mejor caracterización de figuras histológicas en estas neoplasias. El descubrimiento en
2005 de la mutación JAK2 V617F (gen Janus cinasa 2) fue un hecho relevante para la
comprensión de la fisiopatogenia en las NMP y ha generado una revolución en el diagnostico y
clasificacion de este grupo de enfermedades, y especialmente de la Policitemia Vera (PV).
Anormalidades, como el JAK2 o KIT mutado, no son específicas de un NMP específica, pero
proveen una prueba de que la proliferación es clonal permitiendo así eliminar la posibilidad de
un proceso reactivo. Hasta el presente la mutación más común reconocida en las NMP BCR-
ABL1 negativas es JAK2 V617F. Esta mutación se detecta en mas del 90% de pacientes con PV
y en casi la mitad de aquellos con mielofibrosis primaria (MFP) o trombocitemia esencial (TE).
De esta manera, JAK2 V617F no es específica de una NMP exclusiva, ni su ausencia excluye
una NMP.

Clasificacion WHO
-Neoplasias Mieloproliferativas (NMP)
• Leucemia mieloide crónica, BCR-ABL1–positiva
• Leucemia neutrofílica crónica
• Policitemia vera
• Mielofibrosis Primaria
• Trombocitemia Esencial
• Leucemia eosinofílica crónica, sin otra especificación
• Mastocitosis
• Neoplasias mieloproliferativas, inclasificables
-Neoplasias Mieloides y Linfoides con Eosinofilia asociada con anormalidades del
PDGFRA, PDGFRB, o FGFR1

Todos estos trastornos implican desregulación en la célula madre hematopoyética

multipotente (CD34), y comparten una o más de las siguientes características:
· Sobreproducción de uno o varios elementos sanguíneos con predominio de un clon
transformado.
· Medula hipercelular o fibrosis medular.
· Anomalías citogenéticas.
· Diátesis trombótica o hemorrágica.
· Hematopoyesis extramedular (hígado o bazo).
· Transformación a leucemia aguda.
· Superposición de características clínicas

LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA (LMC)

La LMC es una expansión clonal de celulas progenitoras hematopoyéticas

caracterizada clínicamente por hiperplasia mieloide, leucocitosis con
basofilia y esplenomegalia.

La LMC tiene una huella genética (el cromosoma Ph formado por la translocación entre los
cromosomas 9 y 22) y un correlato molecular (el gen de fusión BCR/ABL).

Características de la LMC

98
Examen clínico
Al momento del diagnostico, >80% de los pacientes están en fase crónica, que en muchos
pacientes se presenta asintomática.
El hallazgo mas común del examen físico en el momento del diagnostico es la esplenomegalia.
El bazo puede ocupar gran parte del abdomen, o puede presentarse solo un aumento mínimo. En
alrededor del 10% de los pacientes, el bazo no se palpa durante una exploración esplénica.
En aquellos pacientes que experimentan síntomas, estos son generalmente secundarios a
esplenomegalia, e incluyen dolor, plenitud abdominal, y perdida de peso.

Fases de la Enfermedad
La enfermedad suele presentar un curso evolutivo bifásico, con un periodo inicial o fase
crónica, fácil de controlar con distintas terapéuticas, y otro final o crisis blástica, muy similar
desde el punto de vista clínico y hematológico a una leucemia aguda, aunque de peor
pronóstico.
En algunos pacientes se intercala entre ambos un tercer periodo, la denominada fase de
aceleración.
1. Fase crónica (FC):
Durante esta fase la LMC es una enfermedad poco agresiva y fácil de controlar, y permite a los
pacientes una vida prácticamente normal. Al cabo de un periodo variable, cuyo promedio es de
unos 3,5 años, la enfermedad entra en una fase terminal muy agresiva y resistente al tratamiento.
2. Fase de aceleración (FA):
Se observa en alrededor de un tercio de los pacientes. En ella cambian las características de la
enfermedad y puede aparecer: fiebre y/o sudoración nocturna, esplenomegalia progresiva y
resistente al tratamiento.
Las celulas diferenciadas persisten, aunque a menudo muestran mayores anomalías
morfológicas.
Pueden presentar anemia o trombocitopenia no atribuibles a la quimioterapia, leucocitosis
resistente al tratamiento, trombocitosis (superior a 1.000 109/l), blastos del 10-15% en SP o
MO. Aparición de anomalías citogenéticas adicionales al cromosoma Ph. Algunos enfermos
fallecen en esta fase por infección o hemorragia, pero la mayoría acaban por presentar en pocos
meses los criterios de crisis blástica.
3. Crisis blástica (FB):
Consiste en el paso sin solución de continuidad de la FC a un cuadro superponible al de LA, con
la invasión mas o menos rápida de la MO, la SP y a veces otros órganos por blastos. Este patrón
evolutivo (sin fase de aceleración previa) es el más frecuente, ya que se da en el 60% de los
pacientes.

• Fase crónica
- Alteraciones citogenéticas (ver mas adelante)
- < 10% de blastos y promielocitos en SP y MO
• Fase acelerada (FA)
- Blastos 10-19% en SP o MO,
- Basófilos en SP ≥ 20%,
- Trombocitopenia o trombocitosis persistente que no responde a la Terapia (<100.109/l o
>1000.109/l respectivamente)
-Aumento del tamaño del bazo y aumento del recuento de leucocitos que no responde a la
terapia
-Evidencia citogenética de evolución clonal
-Una proliferación megacariocítica importante en clusters , asociada con marcada fibrosis
de reticulina o colágeno, y/o severa displasia granulocítica, debería ser considerada como
sugestiva de FA.
Estos hallazgos aun no han sido analizados en grandes estudios clínicos, así que no esta claro si
son criterios independientes para la FA. Ellos frecuentemente ocurren simultáneamente con una
o más de las características enumeradas.
• Fase blástica (FB)

99
- Blastos >20% en SP o MO,
- Proliferación extramedular de blastos,
- Grandes focos o clusters de blastos en biopsia de MO
Algunos estudios han indicado que ciertas características a la presentación tienen importancia
pronostica.
La transición de FC a FA y posteriormente a FB puede ocurrir gradualmente durante un periodo
de un ano o mas, o aparecer bruscamente (crisis blástica). La tasa de evolución anual de FC a
crisis blástica es de 5% a 10% los primeros dos anos y de 20% en los anos subsiguientes.

Los factores que predicen una FC de menor duración son:

· Padecer esplenomegalia o hepatomegalia creciente y dolorosa
· Ser de edad avanzada.
· Ser de sexo masculino.
· Tener una concentración elevada de lactato deshidrogenasa perica.
· Anomalías citogenéticas adicionales al cromosoma Ph1.
· Una proporción en el límite de blastos de MO o SP.
· Leucocitosis evolutiva.
· Basofilia.
· Eosinofilia.
· Trombocitosis o trombocitopenia.
· Anemia.
· Fiebre.
· Dolores óseos.
· Desarrollo de lesiones óseas destructivas.
· Complicaciones trombóticas o hemorrágicas

Exámen de MO y SP
La MO es hipercelular, y los recuentos diferenciales tanto de MO como SP muestran un
espectro de granulocitos maduros e inmaduros similares a los que se encuentran en una MO
normal.
A menudo se observan cantidades mayores de eosinófilos o basófilos, y a veces se observa
monocitosis. Con frecuencia se encuentra un aumento de megacariocitos en la MO, y en
ocasiones se observa en SP fragmentos de núcleos megacariocíticos, especialmente cuando el
recuento de plaquetas es muy alto.
El porcentaje de linfocitos es menor, tanto en MO como en SP, en comparación con sujetos
normales, y la proporción mieloide/eritroide en la MO es generalmente muy elevada.
El examen histopatológico del aspirado de MO demuestra un cambio en las series mieloides a
formas inmaduras que aumentan en numero a medida que el paciente progresa a la FB de la
enfermedad.

SP:
_ presenta recuento de leucocitos >10 x 109/l
_ con neutrófilos, metamielocitos y mielocitos,
_ generalmente < 5% mieloblastos en SP y MO;
_ se observa eosinofilia y basofilia;
_ 50% de los casos trombocitosis.

MO:
_ hipercelular (hasta 100% celular)
_ con precursores granulociticos aumentados, basófilos, eosinófilos y
ocasionalmente monocitos;
_ serie eritroide normal,
_ megacariocitos con disposición en clusters en número normal o aumentado,
_ presencia variable sea-blue histiocitos;
_ aumento de fibras de reticulina,

100
_ sin embargo la fibrosis medular es rara a la presentación y esta asociada con el n° de
megacariocitos CD61+.

Score de fosfatasa alcalina:

La fosfatasa alcalina leucocitaria (LAP) esta ausente o marcadamente reducida en
los neutrófilos de pacientes con LMC.
La LAP es un marcador de diferenciación terminal de neutrófilos. Para su cuantificación se
realiza un score (en 100 neutrófilos) de 0 a 4+ sobre la base de la intensidad del precipitado azul
en su citoplasma; se suman los valores de 100 celulas y se reporta la puntuación total.
Un score bajo: indica desarrollo de neutrófilos anormales, asociado con LMC, PNH.

Citogenética y Alteraciones Moleculares

Como se menciono en la introducción, la LMC es un trastorno clonal que generalmente se
diagnostica con facilidad porque las celulas leucémicas de más del 95% de los pacientes
presentan una anomalía citogenética distintiva, el cromosoma Ph.
Este cromosoma resulta de un desplazamiento reciproco entre los brazos largos
del cromosoma 9 y el 22 en todos los precursores hematopoyéticos. El desplazamiento o
translocación produce la transferencia de la región ABL (Abelson) en el oncogén del cromosoma
9 a un área en el cromosoma 22 denominada BCR (región de rotura de conglomerados). Esto a
su vez resulta en un gen fusionado BCR/ABL y en la producción de una proteína anormal con
actividad tirosinquinasa que puede estar relacionada con la mielopoyesis desordenada que se
encuentra en la LMC.
El seguimiento molecular de la enfermedad se realiza a través de la cuantificación de la
expresión del transcripto de fusión BCR/ABL, por técnicas de PCR cuantitativa.
La cuantificación de BCR/ABL tiene además importancia pronostica y ayuda a tomar decisiones
terapéuticas en el manejo de los pacientes con LMC.
Aunque las técnicas citogenéticas continúan siendo el gold standard para monitorear la
respuesta al tratamiento de los pacientes con LMC Ph positiva, una vez alcanzada la respuesta
citogenética completa (RCC), el único método que permite monitorear los niveles de
enfermedad del paciente es el estudio molecular.
En la actualidad, con el tratamiento con inhibidores de tirosinquinasa, mas de un
80% de los pacientes alcanzan RCC, por lo tanto es necesario introducir estas
técnicas de análisis más sensibles, que permiten medir respuesta al tratamiento.
En los enfermos que alcanzan RCC, el nivel del transcrito BCR/ABL sigue disminuyendo con el
tiempo, incluso en algunos casos hasta pasados tres anos de la obtención de la respuesta
citogenética.
La respuesta molecular completa se define como la desaparición de la detección de BCR/ABL
mediante PCR convencional o la disminución de 4,5 logaritmos mediante PCR cuantitativa.
La recaída molecular se define como el aumento del nivel de expresión del transcrito BCR/ABL
de un logaritmo, comprobado en dos determinaciones consecutivas. Cuando esto ocurre, la
probabilidad de recaída de la enfermedad es alta, y por ello deben considerarse señales de
alarma sobre las posibles causas y, si es necesario, modificar el tratamiento del enfermo.

LMC en edad pediátrica

La LMC comprende menos de 5% de todas las leucemias de la niñez, y en el rango de edad
pediátrica, se presenta principalmente en los adolescentes mayores.
El imatinib ha mostrado un índice alto de actividad en niños con LMC, que es comparable con
el que se observa entre adultos.
El único tratamiento curativo que se conoce actualmente para la LMC es el trasplante de celulas
madre hematopoyéticas autólogo. Informes publicados describen tasas de respuesta de 70 a 80%
cuando se utiliza un donante familiar HLA compatible en el tratamiento de niños en la fase
crónica temprana, con tasas de supervivencia mas bajas cuando se utilizan donantes HLA
compatible no emparentados con.

101
LEUCEMIA NEUTROFÍLICA CRÓNICA (LNC)

El interrogante que surge respecto de la LNC es si realmente es una enfermedad.

La clasificacion WHO la incluye en los desordenes mieloproliferativos, con la recomendación
de que sea cuidadosamente excluida una enfermedad subyacente.
Si esta presente otra neoplasia, tal como un mieloma, el diagnostico de LNC solo
debería ser considerado, si se demuestra evidencia genética de neoplasia mieloide.
La LNC es un trastorno mieloproliferativo crónico poco común de etiología desconocida, que se
caracteriza por una neutrofilia en SP (>25 × 109 /L) y hepatoesplenomegalia. La MO es
hipercelular. No hay displasia significativa en ningún linaje celular y la fibrosis de MO es poco
común. Los estudios citogenéticos son normales en casi el 90% de los pacientes. En el 10%
restante, las anomalías cariotípicas clonales, podrían incluir +8, +9, del(20q) y del(11q). No hay
cromosoma Ph o gen de fusión BCR/ABL.
• Leucocitosis en SP≥ 25 x 109/L
– Neutrófilos y cayados >80%
– Granulocitos inmaduros <10%
– Mieloblastos <1%
• Biopsia de MO hipercelular
– Aumento de granulocitos neutrófilos
– Mieloblastos <5%
– Maduración neutrofílica normal

La LNC es un trastorno que evoluciona lentamente y la supervivencia de los pacientes es

variable, oscilando entre seis meses y más de 20 anos.

POLICITEMIA VERA (PV)

Un poco de historia
La PV, TE y MFI son tres condiciones que comparten varias características, incluyendo
hipercelularidad de MO, predisposición a la trombosis y hemorragia, y riesgo de transformación
leucémica en el largo plazo.
La PV es una condición de “hipercelularidad persistente y excesiva acompañada por cianosis”
que fue reconocida por primera vez por Vazquez en 1892. La MFP fue descripta casi al mismo
tiempo y la TE reconocida en los 1930s.
Dameshek, en 1951, fue el primero en observar la considerable superposición de
características clínicas y de laboratorio en estas condiciones y propuso que, junto con la LMC y
otros desordenes constituían un espectro de desordenes relacionados. Uso el término de
“desordenes mieloproliferativos”.
En 1974, un experimento critico mostró que los progenitores eritroides de MO de
pacientes con PV eran capaces de crecer in vitro en ausencia de eritropoyetina (EPO).
Se determino que estas enfermedades se originan en un clon de stem cells
hematopoyéticas. Con el tiempo, se fueron encontrando otras claves del mecanismo responsable
de los desordenes mieloproliferativos. Estas incluyen la asociación de varias neoplasias
mieloides crónicas con tirosinquinasas activadas y el reconocimiento de pasos de señalización
aumentada a través de Janus cinasas y traductores de señales y activadores de transcripción
(JAK–STAT) y fosfatidil inositol 3-cinasa (PI3K) en celulas mieloides y eritroides.
El descubrimiento de la mutación JAK2V617F en PV, TE y MFP y de las mutaciones en el
exón 12 en PV y de MPLW515L/K en MFP y TE, ha ocasionado tal impacto en el diagnostico
de estas entidades que no solo se ha impuesto como prueba diagnostica esencial en la clínica
cotidiana, sino que ha obligado a efectuar la revisión de los criterios diagnósticos de la WHO
vigentes desde 2001 y ha llevado, en 2007, al grupo de expertos en estas enfermedades, a
publicar una nueva propuesta para las tres NMP Ph negativas clásicas.
.
Criterios para PV
Requiere la presencia de los 2 criterios mayores y uno de los criterios menores, o la

102
presencia del primer criterio mayor junto con 2 criterios menores.
Criterio Mayor
1- Hb >18.5g/dl en varones, > 16.5 g/dl en mujeres u otra evidencia de aumento de
la masa de celulas rojas*
2- Presencia de JAK2 V617F u otra mutación tal como la mutación del exón 12 de
JAK2
Criterio Menor
1- Biopsia de MO mostrando hipercelularidad para la edad con crecimiento de los 3
linajes (panmielosis) con prominente proliferación eritroide, granulocítica y
megacariocítica
2- Nivel de eritropoyetina sérica inferior al rango de referencia
3- Formación de colonias eritroides endógenas in Vitro

*Hb o hematocrito en el percentil 99 del rango de referencia o Hb 17 g/dL en varones, 15 g/dl

en mujeres si esta asociado con un aumento sostenido de al menos 2 g/dL del valor basal de una
persona que no pueda ser atribuido a corrección por deficiencia de Fe o masa de GR 25% sobre
el valor normal.

El estudio de la mutación JAK2 V617F ha tenido un gran impacto en la aproximación

diagnostica a las NMP, en especial a la PV. JAK2 2V617F se ha convertido en el primer
marcador biológico pronóstico
independiente, junto a los factores pronósticos convencionales, para PV, TE y MFP.

Los siguientes hallazgos confirmatorios ya no se requieren para emitir un diagnostico:

· Saturación de oxigeno con gasometría arterial venosa >92%.
· Esplenomegalia.
· Trombocitosis (>400.000 plaquetas/mm3).
· Leucocitosis (>12.000/mm3).
· Fosfatasa alcalina leucocitaria (>100 unidades en ausencia de fiebre o infección).

Algunos signos y síntomas de la PV:

• Dolor de cabeza, sudoración exagerada, zumbido en los oídos, trastornos visuales, como visión
borrosa o áreas ciegas, mareos o vértigo.
• En algunos pacientes aparece picazón en la piel, especialmente después de
baños o duchas tibias.
• Puede aparecer un aspecto rojizo o violáceo de la piel, especialmente en las
palmas, los lóbulos de la oreja, la nariz y las mejillas. Algunos pacientes tal vez experimenten
una sensación de ardor en los pies.
• Las ulceras pépticas se pueden asociar con la PV y pueden tener como resultado hemorragias
gastrointestinales
• Esplenomegalia.
• La angina de pecho o insuficiencia cardiaca congestiva pueden ser efectos
nocivos de la sangre viscosa y la elevación de plaquetas puede causar trombos.
• La gota puede aparecer o empeorar.
• Hemorragias o hematomas, generalmente leves, ocurren en aproximadamente
el 25% de los pacientes con PV.

MIELOFIBROSIS IDIOPÁTICA PRIMARIA (MFP)

Sinónimos: metaplasia mieloide agnogénica, mieloesclerosis con metaplasma mieloide, mielosis

crónica granulocítica-megacariocítica)
La MFP es una proliferación clonal de una célula madre hematopoyética pluripotencial, en la
que la fibrosis y la reacción del estroma constituyen fenómenos reactivos a la liberación de
citoquinas, fundamentalmente por los megacariocitos, los monocitos y las celulas endoteliales.
Esta enfermedad afecta fundamentalmente a personas de edad avanzada, si bien

103
también hay pacientes jóvenes.
Esta caracterizada por panmielopatia con maduración intacta, fibrosis medular progresiva,
hematopoyesis extramedular en bazo, hígado y nódulos linfáticos, y marcada esplenomegalia
(hasta 4 Kg.). También anemia, otras citopenias, síntomas “B” (fiebre, perdida de peso >10%,
sudoración nocturna), gota, infecciones, episodios tromboticos, sangrado.

La MFP se caracteriza por fibrosis de la MO, hemopoyesis extramedular con

esplenomegalia, anemia con dacriocitosis y síndrome leucoeritroblástico.

La MFP es heterogénea en su presentación y evolución, oscilando su espectro clínico desde

pacientes asintomáticos al diagnostico hasta otros con sintomatología constitucional o síntomas
derivados de la esplenomegalia y la anemia.

Cambios en MO
Presencia de proliferación megacariocítica con atipía (megacariocitos pequeños a
grandes con relación núcleo/citoplasma aberrante y núcleos hipercromáticos, con
mamelón, o irregularmente plegados y agrupamiento denso), generalmente esta
acompañada de fibrosis de colágeno o reticulina o, en ausencia de fibrosis
significativa, los cambios en megacariocitos deben estar acompañados por
aumento en la celularidad medular caracterizada por proliferación granulocítica y
frecuentemente disminución de la eritropoyesis.

EN SANGRE PERIFÉRICA DACRICITOS!!!

TROMBOCITEMIA ESENCIAL (ET)

Algunos investigadores argumentan que los pacientes con figuras clínicas y

morfológicas de TE pueden tener recuentos de plaquetas que exceden el rango normal, pero que
no alcanzan el umbral diagnostico requerido. En la ultima revisión de criterios para el
diagnostico de TE ha sido, por esto, bajado de 600 109/l a 450 109/l.
Cabe destacar, además de lo referido previamente, que en presencia de marcador
clonal JAK2V617F, MPLW515L/K, u otros, la presencia de trombocitosis reactiva asociada
no excluyen el diagnostico de TE si se cumplen los tres criterios mayores que se describen en la
tabla 5.

104
Cuando se mencionan cambios en MO compatibles con TE refieren a una biopsia de MO que
muestra proliferación principalmente del linaje megacariocítico con numero aumentado de
megacariocitos grandes, maduros; sin aumento significativo o desviación a la izquierda en la
granulopoyesis neutrófila o de la eritropoyesis.
Es importante destacar que la mutación JAK2V617F, aunque muy característica, no es
especifica de las NMP Ph negativas clásicas, ya que se puede detectar también en otras
patologías mieloides: en el 50% de las anemias refractarias con sideroblastos en anillo y
trombocitosis (ARSA-T), en el 20% de los SMD atípicos y en el 3% de los SMD o LMA de
novo. De modo que, ante la sospecha de TE, la detección de la mutación JAK2V617F no
descartaría un SMD o MFP si bien conviene resaltar que no se detecta en patología tumoral no
mieloide ni en LMC. plaquetaria disminuida.

Leucemia Eosinofílica Crónica (LEC) y Síndrome Hipereosinofílico (SHE)

La decisión de incluir LEC y SHE juntos no significa que la WHO considere que todos los
casos de SHE sean enfermedades mieloproliferativas clonales. Mas bien señala el problema de
que en la práctica es virtualmente imposible distinguir entre eosinofilia clonal y eosinofilia
secundaria a producción anormal de citosina para la cual no se reconocen bases etiológicas.
El diagnostico de LEC o SHE puede ser hecho solo tras la exclusión de un número
de enfermedades infecciosas, inflamatorias y neoplásicas con asociación conocida a eosinofilia
(incluyendo LMC, LMA con inv(16), otros desordenes mieloproliferativos crónicos, linfoma de
célula T, linfoma Hodgkin, y otros).
Entonces, si no hay evidencia de clonalidad, se prefiere establecer el diagnóstico
de SHE, mientras que el hallazgo de una anormalidad clonal mieloide soportaría el diagnostico
de LEC.

Características
• exclusión de causas reactivas, infecciosas y neoplásicas
• Eosinofilia persistente >1.5 x 109/L en SP
• Aumento de eosinófilos en MO
• Mieloblastos <20% en SP o MO

Los casos de Neoplasia Mieloide con Eosinofilia que carecen de reordenamientos

del PDGFRA, PDGFRB, o FGFR1 deberían ser clasificados como “LEC sin otras
especificaciones”, si se cumplen los siguientes criterios:
_ recuento de eosinófilos ≥ 1.5 109/l,
_ blastos < 20% en SP y MO,
_ ausencia de BCR-ABL1, inv(16)(p13.1q22) o t(16;16)(p13.1;q22), y
_ ausencia de evidencia de otra NMP o SMD/NMP,
pero hay:
_ una anormalidad clonal, citogenética relacionada mieloide
_ anormalidad genética molecular,
_ blastos >2 % en SP o 5% en MO.

Los casos con eosinofilia que carecen de evidencia de clonalidad pueden ser diagnosticados
como “SHE idiopático” tras descartar todas las causas de eosinofilia reactiva.

105
LMC – SP – FASE CRÓNICA LMC – MO – FASE CRÓNICA

LMC – MO – FASE ACELERADA LMC –MO – CRISIS BLÁSTICA

106
 TRABAJO PRÁCTICO N° 12:

HEMOSTASIA PRIMARIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
CATEDRA DE ANALISIS CLINICOS I (HEMATOLOGIA)

1. RECUENTO DE PLAQUETAS (METODO MANUAL)

Fundamento

El recuento de plaquetas se efectúa en sangre obtenida de punción venosa anticoagulada con

EDTA-Na2, y sometida a hemólisis por acción de una solución hipotónica de oxalato de amonio
en agua destilada.

Materiales y reactivos

 Tubos plásticos.
 Cápsula de Petri.
 Algodón.
 Anticoagulante EDTA (0,342 mol/L).
 Diluyente: Oxalato de amonio 1% en agua destilada.

Procedimiento

1. Se obtiene sangre por punción venosa en anticoagulante EDTA (0,342 mol/L), en tubos
plásticos.
2. Se homogeiniza bien la muestra y se toman 100 l que se colocan en otro tubo plástico que
contenga 1,9 ml de oxalato de amonio 1%.
3. Incubar 10-15 min , para provocar la hemólisis.
4. Cargar la cámara de Neubauer con el hemolizado y dejar que sedimenten las plaquetas en
ambiente húmedo: se recomienda colocar la cámara dentro de una cápsula de Petri
conteniendo un trozo de algodón humedecido.
5. Dejar 10-15 min en atmósfera húmeda.
6. Efectuar el recuento en microscopio (40 X) en el reticulado central de la cámara (dividido
en 400 cuadrados pequeños comprendidos en 1 mm2). El recuento de plaquetas se realiza en
el cuadrado central (al igual que el recuento de hematíes), se eligen 5 de los cuadrados que
se encuentran subdivididos en 16 cuadraditos, como se muestra a continuación .

Recuadro central

La superficie de este cuadrado central es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0,1
mm.

107
7. Contar los 4 cuadrados de los extremos y el cuadrado central (por ende, serán 5 cuadrados
con 16 cuadraditos c/u, o sea 80 cuadraditos).

8. Cálculo: sumar las plaquetas contadas en los 5 cuadrados y multiplicar por 1000 para
obtener el número de plaquetas por mm3. El factor 1000 surge del producto:

20 x 400
= 1000/mm3
80 x 0,1 mm3

Donde 20 es el factor de dilución, 400 son los cuadraditos totales y 80 los cuadraditos
contados. El volumen total del cuadrante es de 0,1 mm3 .

Valores de referencia (pacientes adultos) – 150.000 – 400.000 plaquetas / mm3

Observaciones

Actualmente, en muchos laboratorios, los recuentos de plaquetas se realizan en forma

automatizada en contadores hematológicos o en contadores específicos, habiéndose logrado un
alto nivel de precisión (incluso en trombocitopenias). El recuento manual suele efectuarse para
la comprobación de la cifra de plaquetas en trombocitopenias muy graves y en el caso de
plaquetas gigantes en las que el recuento automático no es fiable. O lo que es más frecuente en
la rutina, inspeccionar frotis de punta de aguja coloreados con MGG para corroborar el
recuento automatizado, esta última práctica es de vital importancia realizarla para
comprobar los recuentos automatizados.

2. TIEMPO DE SANGRIA

2.1 METODO DE IVY

Fundamento

Esta prueba valora la capacidad hemostática global in vivo y consiste en medir el tiempo
transcurrido desde la realización de una pequeña incisión cutánea hasta que cesa la hemorragia.
La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tapón hemostático eficaz y, por ende,
representa una valoración global y simultánea de la función plaquetaria (número, adhesión,
agregación y degranulación plaquetaria) y de la función vascular. Respecto al factor vascular, la
prueba depende de la integridad de la pared vascular y de su capacidad constrictora.

El método original del corte en el lóbulo de la oreja, introducido por Duke en 1910, es poco
sensible y menos reproducible, por lo que no es aconsejable continuar utilizándolo hoy en día.
En 1935, Ivy introdujo la aplicación de un manguito de presión en el brazo y la práctica de la
incisión en la cara anterior del antebrazo. Este método, con la modificación introducida por
Borchgrevink, que sustituye la punción con lanceta por un corte realizado con hoja de bisturí, ha
demostrado una alta sensibilidad. Por último, la introducción de plantillas o dispositivos
automáticos para la realización de la incisión ha venido a uniformar y aumentar la
reproducibilidad.

Materiales y reactivos

 Dispositivos automáticos para la realización de la incisión: Simplate y Simplate II (Organon

Teknika) y Surgicutt (Ortho Diagnostics).
 Lancetas (en el trabajo práctico se utilizarán estas últimas)
 Esfingomanómetro
 Cronómetro.

108
Procedimiento

1. Es aconsejable colocar un esfigmomanómetro en el brazo del paciente y se regula a 40 mm

de Hg, manteniéndolo a esta presión a lo largo de toda la prueba.
2. Se extrae el dispositivo automático de su reservorio estéril y se sitúa en la parte superior de
la cara anterior del antebrazo (previamente desinfectada), en una zona sin vello y alejada de
las venas superficiales, a unos 3 cm por debajo del pliegue del codo y paralelo al mismo.
3. Se presiona el disparador del dispositivo y al mismo tiempo se pone en marcha el
cronómetro (el corte tendrá un largo y profundidad predeterminados: 1 cm x 1 mm).
4. La sangre que brota espontáneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisión,
anotándose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que será el resultado de la prueba.
Cuando el tiempo se alarga más de 20 minutos puede detenerse la prueba aplicando una
compresa con material hemostático.

Valores de referencia

Hasta 6-8 minutos. Los tiempos superiores a 10 minutos son claramente patológicos.

2.2 METODO DE DUKE

Fundamento

El método original de Duke es, como dijimos antes, poco sensible y menos reproducible, pero
se continúa aplicando.

Procedimiento

1. Se practica una incisión de 2 mm de longitud en el lóbulo de la oreja utilizando una lanceta

con tope, descartable.
2. La sangre que brota espontáneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisión,
anotándose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que será el resultado de la prueba.

Valores de referencia: Inferior a 5 minutos.

Interpretación de resultados

La prueba se prolonga por reducción del número de plaquetas o por alteraciones funcionales
plaquetarias o plasmáticas (enfermedad de von Willebrand) relacionadas con los procesos de
adhesión, agregación o degranulación plaquetarias.

Está alterado en trombocitopenias, trombopatías, tromboastenias y déficit de fibrinógeno. Se

observan tiempos prolongados en uremias, mielomas, macroglobulinemias y después de la
ingesta de ácido acetilsalicílico.

En la enfermedad de von Willebrand generalmente es alargado, pero si es normal no invalida el

diagnóstico de dicha enfermedad.

3. TIEMPO DE COAGULACION

Fundamento

El tiempo de coagulación de sangre total es una de las pruebas llamadas globales y abarca la
activación intrínseca de la protrombina y el fibrinógeno.

109
La sangre, al ser extraída sin mayor contaminación con tromboplastina tisular, es capaz de
coagular cuando se la deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso está en
relación con el sistema de procoagulantes e inhibidores fisiológicos o adquiridos, que influyen
en la formación de dicho coágulo.

Este tiempo de coagulación in vitro reflejará mejor la eficacia del sistema in vivo, cuanto menos
se modifique esta sangre (contacto con el vidrio, burbujas de aire, detergentes, etc.).

Materiales y reactivos

Tubos de vidrio, perfectamente limpios.

Baño a 37C.
Cronómetro.

Procedimiento

1. Obtener 3 ml de sangre por punción venosa, de primera intención y con jeringa plástica.
2. Disparar el cronómetro en el instante en que la sangre venosa se introduce en la jeringa.
3. Desconectar la aguja y vaciar ordenadamente 1 ml de sangre en el primero de los tres tubos
de vidrio perfectamente limpios, previamente colocados en gradilla de baño a 37C.
4. Inclinar el primer tubo cada 30 seg. por la misma cara hasta que la sangre se coagule (deja
de escurrirse por las paredes del tubo).
5. De inmediato, inclinar el segundo tubo hasta que se coagule; luego, proceder de la misma
forma con el tercer tubo.
6. Se toma como tiempo de coagulación el valor obtenido en el tercer tubo.

Interpretación de resultados

Valores de referencia a 37C: 7-15 min.

El rango normal debe establecerse en cada laboratorio, con un grupo suficiente de controles (20
como mínimo). Conviene repetir un paciente normal semanalmente, para determinar cualquier
variabilidad de los valores previamente obtenidos.

Se considera alargado un tiempo de coagulación que difiere en más de 2 min del límite superior
del rango normal, establecido en cada laboratorio (media + 2 SD).

Se trata de un método poco sensible, pues se prolonga sólo en aquellos casos de déficit graves.
Un tiempo de coagulación normal no descarta la existencia de un trastorno de la coagulación,
pero un tiempo prolongado es siempre índice de un defecto severo de la misma, que puede
deberse a una deficiencia de cualquiera de los factores que intervienen en la formación del
coágulo de fibrina, con excepción de una deficiencia pura de los factores VII y XIII; pero el
método es mucho más sensible a los defectos de los factores que intervienen en la activación por
contacto y en la formación del activador intrínseco de la protrombina.

4. RETRACCION DEL COAGULO

Fundamento

La retracción del coágulo depende de la actividad trombodinámica de las plaquetas, por lo que
se requiere un número mínimo de plaquetas normales y adecuados niveles de Ca++.

Procedimiento

110
1. Los tres tubos utilizados para determinar el tiempo de coagulación deben dejarse en baño a
37C durante por lo menos 3 Hs. Al cabo de este tiempo, observaremos la mejor retracción
de los tres tubos, graduando de acuerdo a la magnitud de la retracción por apreciación visual
del tamaño del coágulo retraído y el suero libre en:

a) Normal o completa
b) Incompleta
c) No retrae
d) Hiperretráctil

Interpretación de resultados

Esta prueba depende del número de plaquetas, su actividad funcional y de la concentración de

fibrinógeno, aunque no se relacione muy bien con el número de plaquetas (en ciertas
condiciones da normal aún con 30.000/mm3). Un aumento importante de fibrinógeno reducirá la
retracción por efecto de volumen, mientras que lo opuesto ocurre en casos de
hipofibrinogenemia.

En la tromboastenia de Glazman (alteración funcional) se observan retracciones incompletas o

nulas.

a-Retracción normal o buena b- Retracción deficiente c- Ausencia de retracción

d- Hiperretracción

111
 TRABAJO PRÁCTICO N° 13

HEMOSTASIA SECUNDARIA

OBTENCIÓN DE MUESTRAS

INDICACIONES PARA EL PACIENTE: para realizar los estudios de coagulación no es

necesario un ayuno prolongado, pero es conveniente no ingerir alimentos grasos desde 4h antes
de la extracción .Debe tratar de evitarse situaciones de estrés o esfuerzo físico durante horas
previas a la toma de muestra ya que se producen variaciones importantes
La extracción de sangre debe realizarse por la mañana (entre las 8 y las 10) y con el mínimo
éstasis venoso posible (idealmente menos de 1 minuto y sin lazo, esto último raramente se
efectúa).
La noche anterior del estudio el paciente no debe realizar actividad física ni comer en forma
abundante debe recurrir al laboratorio realizando la menor actividad posible y en conocimiento
que al llegar debe permanecer en reposo por lo menos 30min antes de la extracción.

ANTICOAGULANTE: El anticoagulante mas ampliamente utilizado es el citrato trisódico en

cc. 0,109 o 0,129 M (3.2 o 3.8%) el comité de expertos de la Sociedad internacional de
Hemostasia y Trombosis (ISHT) recomienda el citrato al 3.2% .Los plasmas patrones
liofilizados con los cuales se calcula el índice de sensibilidad internacional (ISI) se obtienen con
citrato trisódico 3.2%.
Se debe mantener la relación anticoagulante /sangre 1:9 hay que tener presente que se deberá
ajustar la relación de acuerdo al hematocrito sobre todo los por debajo de 25% y por arriba de
55%.

EXTRACCIÓN: Para realizar la extracción sanguínea se debe utilizar jeringas plásticas de

buena calidad. Las agujas descartarles de calibre entre 21 y 19 para adultos y 23 G para
pediatría. Los tubos para recoger la sangre deben ser de material no reactivo como polipropileno
o vidrio siliconado.
No se aconseja utilizar sangre capilar para pruebas de coagulación, si no es posible obtener una
muestra de sangre venosa, la muestra puede ser obtenida del pulpejo del dedo en los adultos o
del talón del pie en los neonatos. Es esencial que la punción realizada permita que la sangre
fluya espontáneamente y forme una gota de volumen importante, la cual se deberá recoger en
tubos con la proporción de anticoagulante ajustada.
La punción venosa debe ser rápida y precisa, sin dificultades, evitando la formación de espuma,
el éstasis venoso y la contaminación con tromboplastina tisular
Cuando la extracción es dificultosa se recomienda el cambio de jeringa luego de extraer 2 a 3 ml
de sangre. La muestra extraída en la segunda jeringa será utilizada para los estudios de
coagulación.
En los pacientes canalizados se recomienda evitar la extracción por catéter, de ser ello
indispensable, realizar la doble extracción con jeringa y descartar los primeros 5 mL. Los
pacientes canalizados, en ocasiones puede recibir heparina, para mantener la permeabilidad del
catéter y en el laboratorio de hemostasia la heparina es “mala palabra” prolonga todas las
pruebas.
Una vez realizada la extracción se vierte suavemente la sangre por la pared de los tubos, hasta la
marca prevista, evitando la formación de espuma
Todo el material utilizado en hemostasia es de plástico, para evitar que el vidrio active la
cascada de la coagulación.
Es conveniente recoger la sangre en dos tubos, pues al tener la posibilidad de procesar en un
segundo tubo se reducirán las posibilidades de error.
Descartar los plasmas con signos de hemólisis visibles.

112
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Plasma citratado rico en plaquetas (prp): la sangre obtenida de acuerdo a las condiciones ya
señaladas es centrifugada a 1000 r.p.m durante 5 minutos. Trasvasar el plasma rico a un tubo de
plástico con pipeta plástica. Mantener a Tº ambiente hasta su uso (no mas de 2h). El plasma así
obtenido es el plasma rico en plaquetas.
Se utiliza fundamentalmente para el estudio de la función plaquetaria y para el tiempo de
plasma recalcificado (Tiempo de Howell)

Plasma citratado: Se obtiene centrifugando la sangre durante al menos 10 min. a 3000 r.p.m.
El plasma así obtenido es relativamente “pobre en plaquetas” (menor de 10000/mm3 ). Se utiliza
dentro de las 4 h de extracción para los estudios pre- quirúrgicos, control de anticoagulación en
los pacientes sin antecedentes de sangrado o trombosis.

Plasma pobre en plaquetas: Se obtiene por doble centrifugación (primero de sangre entera y
luego el plasma citratado y separado) de 15 minutos a 4000 rpm (idealmente en centrífuga
refrigerada a 4°C). El plasma así obtenido es “pobre en plaquetas” (menor de 5000/mm3) reúne
las condiciones para realizar todos los estudios. Puede ser fraccionado y congelado para estudios
posteriores. En este caso se aconseja procesar de igual forma muestras normales.

Pool de plasmas normales: Se debe extraer sangre de sujetos normales, sin historia previa de
manifestaciones hemorrágicas, ni trombóticas, ni hepáticas, que no estén recibiendo ninguna
medicación. Se prepara plasma pobre en plaquetas de por lo menos 10 sujetos que tengan las
pruebas básicas de coagulación normal. Se puede fraccionar y congelar a-70ºC máximo 6 meses
y 1 mes si se conserva a -20ºC

Activación intrínseca de la protrombina

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (APTT)

Fundamento
El APTT, es la prueba más sensible para evaluar la vía intrínseca de la coagulación. Consiste en
activar el plasma por contacto con superficies cargadas negativamente (caolín, sílica, etc.). En
esta prueba se fija la concentración de fosfolípidos presentes en la reacción, mediante el
agregado de cefalina (tromboplastina parcial). La activación por contacto se ve favorecida por el
agregado de caolín (sustancia inerte, con cargas negativas) que aumenta la superficie de
contacto.

Expresión de resultados
Los resultados se expresan en segundos.

Interpretación de resultados
Valor normal: según el reactivo utilizado y el método de detección: 37-48 seg.
Valores menores a 37 seg indican concentración aumentada de factores o muestra activada.
Valores prolongados revelan un defecto en la vía intrínseca.
El APTT es más sensible al defecto de los factores VIII, IX, XI, XII o fase de contacto como
precalicreína (PK), quininógenos de alto peso molecular (HMWK). Es menos sensible al
defecto de factores de la vía común (X, V o II). En casos de deficiencias de fibrinógeno, el
APTT se prolonga a partir de concentraciones menores a 100 mg/dL.
Presencia de inhibidores, ya sean específicos contra un factor (neutralizantes) o inespecíficos
(interferencia) afectan la prueba del APTT (dependiendo de la sensibilidad del reactivo), que no
corrige por el agregado de plasma normal. La heparina no fraccionada (UFH), que potencia la
acción inhibitoria de la antitrombina frente a la trombina, puede afectar el resultado del APTT.

113
FACTORES DE VIA INTRINSECA (VIII, IX, XI, XII, PK, HMWK)

Fundamento
Este método mide la formación de fibrina por acción de la trombina generada en un sistema
coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulación
del sistema es dependiente de la concentración del factor presente en la muestra problema.

Expresión de resultados
Los resultados se expresan en por ciento de actividad.
Para la construcción de la curva de calibración, en papel doble logarítmico, se transportan las
concentraciones de factor (%) sobre la abscisa y los tiempos de coagulación (seg) sobre la
ordenada. Se interpola la concentración del factor en el plasma problema en la curva obtenida.

Interpretación de resultados
Valores normales: 50-150 %
El descenso de los niveles plasmáticos de cualquiera de estos factores puede deberse a un déficit
congénito (cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores.

Activación extrínseca de la protrombina

TIEMPO DE QUICK O TIEMPO DE PROTROMBINA

Fundamento
Se utiliza como reactivo tromboplastina cálcica (comercial) que, en contacto con el plasma
citratado, genera la activación del mecanismo extrínseco y la producción de fibrina. El tiempo
de coagulación de la prueba depende de la concentración de los factores plasmáticos que
participan en el mecanismo extrínseco de la coagulación.

Expresión de resultados
Los resultados se expresan en por ciento de actividad y/o tiempo en segundos. Se realiza el
tiempo de protrombina y se interpola el tiempo en la curva de Quick o curva de tasa de
protrombina (VER INSERTO).

Interpretación de resultados
Valor normal: 70-100%
Resultados de tiempo de protrombina menores a 70% evidencian una anormalidad del
mecanismo extrínseco debida a un defecto o a la inhibición de uno o más de los factores
intervinientes en la vía extrínseca. Se deberá corregir la prueba con plasma normal para
descartar un efecto inhibitorio y realizar la determinación individual de cada uno de los factores
para identificar el o los factores deficientes.
El general, tiempo de Quick es más sensible al defecto de los factores VII, X y V que a la
deficiencia de protrombina. No detecta disminuciones moderadas de fibrinógeno, pero se ve
afectado por concentraciones menores a 100 mg/dL.

FACTORES DE VIA EXTRINSECA (II, V, VII y X). METODO EN UNA ETAPA

Fundamento
El método mide la formación de fibrina por acción de la trombina generada en un sistema
coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulación
del sistema es dependiente de la concentración del factor presente en la muestra problema.

Expresión de resultados
Los resultados se expresan en por ciento de actividad.

114
Curva de calibración: graficar en papel doble logarítmico la concentración del factor sobre la
abscisa y los tiempos de coagulación (seg) sobre la ordenada. De la recta resultante, se interpola
la concentración del factor presente en el plasma problema.

Interpretación de resultados
Valores normales: 70-120 %
El descenso de los niveles plasmáticos de los factores puede deberse a un déficit congénito
(cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores. Las deficiencias adquiridas
pueden ser causadas por consumo, alteraciones en la función hepática, aumento en la actividad
fibrinolítica o presencia de inhibidores.

Transformación fibrinógeno-fibrina

TIEMPO DE TROMBINA (TT)

Fundamento
Esta prueba mide el tiempo de coagulación del plasma citratado en presencia de trombina.
Permite evaluar la transformación de fibrinógeno a fibrina.

Expresión de resultados
Se informa el tiempo de coagulación de la muestra (TT) expresado en segundos, junto con el
tiempo de trombina del plasma normal.

Interpretación de resultados
Valores prolongados del TT pueden deberse a:
-Baja concentración de fibrinógeno (menor 200 mg/dL.), o ausencia del mismo (hipo o
afibrinogenemia). Puede ser de origen congénito o adquirido. Los niveles de fibrinógeno
plasmático pueden disminuir en hepatopatías severas, CID, por efecto del tratamiento con
estreptoquinasa, r-tPA o L-asparaginasa, o también en respuesta a la actividad física.
-Presencia de un fibrinógeno anómalo (disfibrinogenemias congénitas o adquiridas)
-Inhibidores de la polimerización de los monómeros de fibrina, productos de degradación del
fibrinógeno/fibrina o proteínas plasmáticas anormales.
-Tratamiento o contaminación con heparina
-Prolongaciones inespecíficas (hiperbilirrubinemia, hipoalbuminemia, hemólisis)
-Aumento muy marcado de fibrinógeno (>800-1000mg/dl)*

Valores acortados de TT: es muy controvertida su interpretación; algunas disfibrinogenemias

trombóticas cursan con TT acortados.

*Los valores aumentados de fibrinógeno no suelen afectar el TT, excepto en situaciones

particulares, como por ejemplo pacientes con síndrome nefrótico. Dado que el fibrinógeno es
una proteína reactante de fase aguda, su concentración plasmática está aumentada en procesos
infecciosos e inflamatorios, cirugía, sepsis, cáncer o ateroesclerosis y constituye un marcador de
riesgo para eventos vasculares oclusivos. Los niveles de fibrinógeno aumentan con la edad,
masa corporal, embarazo, tabaquismo, estrés y con el uso de anticonceptivos orales.

FACTOR XIII (FACTOR ESTABILIZADOR DE LA FIBRINA) PRUEBA DE

SOLUBILIDAD DEL COAGULO

Introducción
Las pruebas de laboratorio fundadas en la medida del tiempo de coagulación no detectan los
defectos o alteraciones del FXIII, dado que no participa en las reacciones que llevan a la
formación de fibrina soluble. El FXIIIa actúa en una fase posterior, estableciendo uniones

115
covalentes entre las moléculas de fibrina, transformándola en “insoluble”. La deficiencia severa
de FXIII puede ser detectada por la disolución temprana del coágulo de fibrina en medio
hidrofóbico (urea, ácido monocloroacético) (prueba de solubilidad del coágulo).

Fundamento
La prueba consiste en evaluar la presencia de un coágulo de fibrina insoluble (estable); el
plasma del paciente, en presencia de iones calcio coagula, dicho coágulo de coloca en un medio
hidrofóbico y se observa si se disuelve o no el coágulo. En pacientes con deficiencias severas
del FXIII (≤1-5 U/dl) se produce un coágulo, que se disuelve tempranamente, comparado con
los controles normales.

Expresión de resultados
Los resultados se expresan como normal (coágulo insoluble) o anormal (coágulo soluble).

Interpretación de resultados
En ausencia de FXIII o en presencia de concentraciones menores a 1-5U/dl (depende del
método), el coágulo de fibrina se disuelve en el término de pocos minutos u horas. A pesar de su
escasa sensibilidad, la técnica es útil para detectar defectos clínicamente importantes. Se
requiere muy baja concentración de FXIII para obtener una hemostasia adecuada (valor
hemostático: 1-5 U/dl).
Las alteraciones del FXIII pueden deberse a defectos cualitativos o cuantitativos, ya sean
congénitos o adquiridos. La prueba de solubilidad puede dar anormal por la presencia de
inhibidores específicos del FXIII.

COAGULÓMETRO AUTOMATIZADO
Son equipos utilizados para determinar cualquiera de las pruebas de hemostasia que utilicen
método coagulométrico (TP, APTT, TT, Fibrinógeno, factores, etc.). Desde el punto de vista
práctico ahorran tiempo para procesar muchas muestras (más de 30 en una mañana por Ej.) pero
fundamentalmente logran altos grados de reproducibilidad.
Básicamente su funcionamiento se basa en dos métodos de detección: óptico
(turbodensitometría) y/o magnético. Los que utilizan el método magnético toman el tiempo que
tarda en formarse el coágulo desde el momento de mezcla hasta que una varillita de metal deja
de girar. Los basados en métodos ópticos utilizan medidas de transmitancia para dar el tiempo
de formación del coágulo.
Dentro de las funciones que pueden brindar estos equipos está la incubación de muestras por
medio de fuentes secas, ésta se realiza por el tiempo estipulado para cada prueba que debe ser
determinado por el operador o bien ya viene estandarizado en el equipo.
Cabe aclarar que en estos equipos se trabaja de modo muy similar al método manual en lo que
se refiere a preparación de diluciones y curvas de actividad, la ventaja de estos equipos radica
en agilizar el trabajo en caso de elevado número de muestras y la de permitir mayor
reproducibilidad.

116
APTTest
Reactivos para la determinación del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada

SIGNIFICACION CLINICA
El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de
factores procoagulantes del plasma así como a la presencia de ciertos inhibidotes de la
coagulación.
Sirve para detectar anormalidades en la vía intrínseca de la coagulación, como son los factores
necesarios para la formación del activador intrínseco de la protrombina, o sea los factores VIII,
IX, XI y XII.
También detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibrinógeno, no siendo así con
los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas
vasculares.
La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de
la terapéutica anticoagulante por heparina. También permite la identificación rápida de
hemofílicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirúrgicos y
evitar problemas hemorrágicos.

FUNDAMENTOS DEL METODO

El ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado,
colocado en un baño a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio.

REACTIVOS PROVISTOS
Reactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador
particulado.
Cloruro de Calcio: solución de cloruro de calcio 0,025 mol/l.

REACTIVOS NO PROVISTOS
Agua bidestilada o desionizada.

INSTRUCCIONES PARA SU USO

Cloruro de Calcio: listo para usar.
Reactivo APTT, preparación:
- Abrir un vial quitando el precinto metálico y retirando lentamente el tapón de goma para evitar
pérdidas del material.
- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase.
- Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor a 37°C
- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensión homogénea. Volver a homogeneizar
cada vez que se emplee.

PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10 °C) hasta la fecha de vencimiento indicada
en la caja.
Reactivo APTT: una vez reconstituido es estable durante 14 días en refrigerador o 30 días
congelado (-20 °C). El congelado y descongelado sólo puede realizarse una vez. Por esto se
recomienda dividirlo en porciones, de acuerdo a las necesidades de trabajo.

MUESTRA
Plasma
a) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un
tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de

117
Anticoagulante TP de Wiener lab.). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes
de los 30 minutos. Es recomendable efectuar la extracción con jeringas plásticas.
b) Aditivos: para obtener el plasma debe emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato
de sodio 0,130 mol/l.
c) Sustancias interferentes conocidas:
- Las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados.
- No debe emplearse EDTA o heparina para obtener plasma. Referirse a la bibliografía de
Young para los efectos de las drogas en el presente método.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en refrigerador
(2-10°C) hasta el momento de efectuar la prueba. Este período no debe prolongarse más de 4
horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20°C. Este
procedimiento al igual que el descongelado debe realizarse con rapidez (sumergiendo en baño a
37°C) previo a la determinación. La muestra debe conservarse hasta el momento de su análisis
en tubos plásticos para minimizar los efectos de activación por contacto que pueden ocurrir con
los tubos de vidrio.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Tubos de hemólisis.
- Pipetas y micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
- Baño de agua a 37°C.
- Cronómetro.
- Fuente luminosa, para la observación del coágulo.

PROCEDIMIENTO
Precalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en baño de agua a 37°C.
En un tubo de hemólisis colocar:
Muestra (plasma desconocido o control) 100 ul
Reactivo APTT (homogeneizado) 100 ul
Mezclar e incubar de 3 a 5 minutos a 37°C, luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37°C) 100 ul
Disparar simultáneamente un cronómetro. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido,
mantener en el baño unos 25 segundos. Luego sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una
vez por segundo y detener el cronómetro en el momento de la formación del coágulo. Tomar
nota del tiempo de coagulación.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Los resultados pueden expresarse de distinta forma:
1) Como tiempo de tromboplastina parcial activada en segundos.
2) Como relación entre el tiempo obtenido con el desconocido y el de un plasma control.

METODO DE CONTROL DE CALIDAD

Plasma Control normal - patológico.

VALORES DE REFERENCIA
El intervalo de valores observados en individuos normales
oscila entre 33-48 segundos.
Se considera fuera de lo normal valores que difieran en más de 6 segundos de un plasma
control.
Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos
empleado y que correlacione los valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma,
haciendo constar estos resultados en el informe.

CURVA DE CALIBRACION
Este método es útil como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este
anticoagulante.
La técnica empleada es la siguiente:

118
1) Preparar una Solución de Trabajo de heparina en solución fisiológica cuya concentración sea
10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente.
2) Preparar diluciones de esta Solución de Trabajo utilizando un pool de plasmas frescos
normales o Plasma Control normal como diluyente. Se deberán obtener diluciones de 0,8; 0,6;
0,4; 0,2; y 0,1 Unidades/ml.
3) Determinar el tiempo de tromboplastina parcial para cada una de estas soluciones así como
para el pool de plasmas y graficar en papel semilogarítmico APTT vs. Concentración de
heparina.
El valor obtenido para el paciente debe correlacionarse con los valores de la gráfica, para
obtener la concentración actual de heparina circulante.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver Sustancias interferentes conocidas y Estabilidad e instrucciones de almacenamiento en
MUESTRA.
El mecanismo de la coagulación involucra una serie de reacciones enzimáticas que pueden ser
influenciadas por toda condición que afecte a los sistemas enzimáticos en general, razón por la
cual se deben observar las mismas precauciones metodológicas.
Debe tenerse en cuenta que variaciones en la relación anticoagulante/muestra o en la
concentración de citrato utilizada afectan los tiempos de tromboplastina parcial activada, por lo
que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra.

PERFORMANCE
Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se
obtuvieron los siguientes resultados:

Nivel D.S. C.V.

45 seg +1,1 seg 2,5%
62 seg +1,8 seg 3,0%

PRESENTACION
Equipo para 150 determinaciones (6 x 2,5 ml) (Cód. 1705002).

BIBLIOGRAFIA
- Bell, W.N.; Alton, H.G. - Nature 174:880 (1954).
- Dacie, J.B.; Lewis, S.M. - Hematología Práctica – Ediciones Toray, 2º Edición (1970).
- Wintrobe, M.M. - Hematología Clínica 3ª Edición Intermédica (1969).
- Bragos, I; Rodríguez Pécora, S; Lorenzo, L; Capriotti, G. -
“Evaluación de un nuevo Reactivo de Tiempo Parcial de
Tromboplastina Activada” - 53º Triduo Bioquímico Científico Anual; Bahía Blanca (1988).
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Soluplastin
Tromboplastina cálcica para la determinación del Tiempo
de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa

SIGNIFICACION CLINICA
El fenómeno de la coagulación puede desencadenarse por una “vía extrínseca” (lesión tisular) o
por una “vía intrínseca” contacto de la sangre con epitelios distintos del vascular normal).
La determinación del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick es una prueba global para
evaluar la coagulación extrínseca, siendo sensible a: factor II o protrombina, factor V o
proacelerina, factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower.
Por lo tanto la determinación se aplica a:

119
- estudios de rutina en los análisis prequirúrgicos;
- detección de alteraciones en los niveles de uno o más factores involucrados en la vía
extrínseca;
- control de la terapéutica con anticoagulantes orales.

FUNDAMENTOS DEL METODO

Este ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado,
colocado a 37°C y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. El método no
detecta deficiencias de factores de la vía intrínseca (VIII, IX, XI y XII).

REACTIVO PROVISTO
Soluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro de calcio para una
concentración final de 0,0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentración final de 0,1 mol/l.

REACTIVO NO PROVISTO
Agua bidestilada o deionizada.

INSTRUCCIONES PARA SU USO

- Abrir un vial quitando el precinto metálico y retirando lentamente el tapón de goma para evitar
pérdidas del material.
- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. Verificar que la
temperatura del agua empleada no sea mayor de 37°C.
- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensión homogénea. Volver a homogeneizar
cada vez que se emplee.

PRECAUCIONES
El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

Soluplastin provisto: estable en refrigerador (2-10°C) hasta la fecha de vencimiento indicada
en la caja.
Soluplastin reconstituido: en refrigerador (2-10°C), es estable 5 días a partir del momento de
su reconstitución.

MUESTRA
Plasma
a) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un
tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de
anticoagulante). Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab., se requerirán 7 gotas para 4,5
ml de sangre). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos.
b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato
de sodio 0,130 mol/l.
c) Sustancias interferentes conocidas:
- las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados;
- la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados;
- hemólisis visibles dificultan la medición foto-óptica de los resultados.
Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:
el plasma debe mantenerse en el refrigerador (2-10°C) hasta el momento de efectuar el ensayo.
En caso de no procesarse dentro de las 4 horas contadas desde la obtención, la muestra se debe
congelar (a -20°C); de tal forma, puede conservarse durante un mes. Este último procedimiento
debe ser realizado con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en baño a 37°C)
previo a la determinación.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

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- Tubos de hemólisis.
- Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados.
- Baño de agua a 37°C.
- Cronómetro.
- Fuente luminosa para la observación del coágulo.

PROCEDIMIENTO
1- Colocar el plasma (desconocido o control) en baño de agua a 37°C durante 2-3 minutos (no
más de 10 minutos).
2- En un tubo de hemólisis, colocar 0,2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37° C
durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos).
3- Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rápidamente al tubo conteniendo 0,2 ml de
Soluplastin, disparando simultáneamente el cronómetro.
4- Mantener el tubo dentro del baño y cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de
coagulación, sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener
el cronómetro en el momento de la aparición del coágulo.
5- Calcular el tiempo promedio de coagulación de la determinación por duplicado para cada
plasma (desconocido o control). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es
mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. En caso
de emplear un instrumento de medición, deben seguirse las instrucciones del fabricante del
mismo.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Los resultados pueden expresarse de distintas formas:
1- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en segundos.
2- Porcentaje de Actividad Protrombínica respecto de un plasma normal (100% de
actividad): para ello se debe trazar la curva de actividad protrombínica de un pool de plasmas
frescos normales.
Curva de calibración
En tubos de hemólisis, preparar 5 diluciones (cada una por duplicado) de un pool de por lo
menos 3 plasmas normales o Plasma Control normal, según:

Diluciones 1:1 1:2 1:3 1:4 1:8

Porcentaje de actividad 100 50 33,3 25 12,5
(%)
Pool plasmas normales 0,5 0,3 0,3 0,2 0,2
(ml)
Solución fisiológica - 0,3 0,6 0,6 1,4

Determinar el Tiempo de Protrombina para cada dilución, empleando el PROCEDIMIENTO

descripto. En un papel milimetrado, graficar los resultados en un sistema de coordenadas.
Colocar los Tiempos de Protrombina en segundos sobre el eje de las ordenadas y los Porcentajes
de Actividad Protrombínica en el eje de las abscisas. Cada laboratorio debe trazar su propia
curva de calibración, correspondiente al lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de
reactivos.

3- Razón Internacional Normatizada (R.I.N.)

Para su cálculo, deberá emplearse la tabla de valores adjunta al equipo.

METODO DE CONTROL DE CALIDAD

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Plasma Control normal - patológico.

VALORES DE REFERENCIA
El rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila entre:
- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 - 14 seg
- Porcentaje de Actividad Protrombínica: 70 - 100%
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia.
Para pacientes bajo tratamiento con antivitaminas K se ha establecido un rango terapéutico que
se puede expresar como:
- Porcentaje de Actividad Protrombínica: 25 - 35%
- R.I.N.: 2,4 - 2,5

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
Otras causas de resultados erróneos son:
- Extracción defectuosa de sangre venosa.
- Las variaciones en la relación anticoagulante/muestra o en la concentración de citrato utilizada
afectan los Tiempos de Quick por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante
empleada al tomar la muestra.
- La preincubación en el 2o paso del PROCEDIMIENTO no debe exceder los 10 minutos
indicados como límite máximo. Por otra parte, es conveniente que el reactivo reconstituido se
retire del refrigerador inmediatamente antes de iniciar la prueba y vuelva a guardarse al
finalizarla, ya que la exposición por varias horas a temperatura ambiente en forma reiterada,
deteriora el reactivo produciendo el alargamiento de los tiempos de protrombina.

PERFORMANCE
a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día, se
obtuvieron los siguientes datos:

X (n=20 D.S. C.V.

11,5 seg +0,4 seg 3,5%
21,2 seg +0,6 seg 2,8%

b) Comparación con método de referencia: procesando distintas muestras con Soluplastin y

con otro método tomado como referencia, se observa:

Reactivo X (n=60) D.S. C.V.

Soluplastin 13,2 seg +0,3 seg 2,3%
Referencia 12,8 seg +0,3 seg 2,3%

PRESENTACION
- Equipo para 100 determinaciones (10 x 2 ml) (Cód. 1705001).
- Equipo para 10 x 20 determinaciones (10 x 4 ml) (Cód. 1705005).
- Equipo para 320 determinaciones (8 x 8 ml) (Cód. 1705003).

BIBLIOGRAFIA
- Quick, A.J. - “Fisiología y Patología de la Hemostasis” - Ed. El Ateneo, Buenos Aires (1952).
- Araldi, H.T., et al. - “Primer Reactivo Nacional Argentino de Referencia de Tromboplastina de
Cerebro Humano” – Acta Bioquím. Clín. Latinoam. XVI/1:131 (1982).
- Comité de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biológicos - Inf. Nº 28: Normalización de la
Vigilancia del Tratamiento Anticoagulante (oral) - Serv. Inf. Tec. Nº 610:49-56 (1977).

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- Comité de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biológicos - Inf. Nº 31: Requerimientos para
Tromboplastinas y Plasmas usados en la terapia anticoagulante oral - Serv. Inf. Téc. Nº
658:202-223 (1981).
- Suñer Casadevall, F. - “Nuevas Normas Internacionales para la Expresión del Tiempo de
Quick” - Análisis Clínicos X/40:240-245 (1985).
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Téc.: Viviana E. Cétola
Bioquímica
Producto Inscripto M.S.
Disp. Nº: 1589/89 - 255/99

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