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Guía2012 PDF
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CTEDRA:
HEMATOLOGA CLNICA
TRABAJOS PRCTICOS
ALUMNO:
GRUPO:.......
AO: 2012
1
INTEGRANTES DE LA CTEDRA:
2
MODELO DE INFORME (EL INFORME ES INDIVIDUAL)
TP N GRUPO DE LABORATORIO:
FECHA
NOMBRE Y APELLIDO
2- RESULTADOS HALLADOS
Determinacin
Valor hallado
Mtodo
Valores de referencia
3- ELEMETOS OBSERVADOS
Para los TPs de microscopia especificar cada uno de los elementos observados (coloracin y
aumento) as como tambin, en caso de disponer de ellos, datos referentes al cuadro en que fue
encontrado (edad, datos de hemograma, patologa, tratamiento, etc).
Ej. Se observ un frotis con anisocitosis moderada (MGG 40x), correspondiente a un cuadro de
anemia ferropnica en recuperacin (Nio 8 aos, GB: 7300 cel/mm3 GR: 4,18 x 106 cel/mm3
Hb 11,2 g%, Hto: 37 %, VCM: 87,3 fL, HCM 26,7 pg, CHCM 30,2 g%, RDW 18 %, Pq
323x103 /mm3, Tratamiento: Hierro oral)
3
TRABAJO PRCTICO N 1
Ojetivos Generales
- Puesta en prctica de normas de bioseguridad bsicas.
- Prctica de los pasos para la obtencin de muestras de sangre venosa para la realizacin de las
determinaciones incluidas en el hemograma.
- Aplicacin de los criterios necesarios para la eleccin de anticoagulantes en funcin de las
determinaciones a realizar.
- Manejo del material necesario para las prcticas a desarrollar.
- Interpretacin de resultados.
Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las
caractersticas morfolgicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las clulas
sanguneas a estudiar se encuentren en el estado ms parecido al fisiolgico. Para ello los
anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los leucocitos, el tamao eritrocitario, no
producir hemlisis e impedir la agregacin plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el
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mximo perodo de conservacin de la muestra (generalmente no ms de 24 horas incluso
refrigerada a 4 C).
3 - Recuento de hemates
RECUENTO MANUAL
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Lquido diluyente: solucin fisiolgica o citrato de sodio 3,8%., o Solucin de Hayem (HgCl2
0,25%, Na2SO4 2,5%, NaCl 0,5%)
Las lneas reforzadas, o triples, sirven nicamente como lmites de cada cuadrado que contiene
los 16 cuadrados pequeos. Se deben contar 5 de estos cuadrados. La superficie de este
cuadrado es de 1 mm2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm.
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Con la dilucin indicada, luego de agitar adecuadamente, se carga la cmara y se cuentan los
glbulos rojos de los 80 cuadrados pequeos (zona sombreada). La cmara puede ser cargada
con un capilar, evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente.
Considerando entonces, que el retculo tiene 400 cuadrados pequeos en total, el clculo que se
debe hacer es el siguiente:
N x D x FC x ST = n de glbulos rojos/mm3
TC
Donde:
El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a:
VALORES DE REFERENCIA
4 - Hematocrito
DEFINICION
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El mtodo de referencia para la determinacin del Hto es la centrifugacin de sangre total en
tubo capilar (micromtodo), es una tcnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja
complejidad.
En la actualidad, todos los autoanalizadores hematolgicos suministran, dentro del contexto del
hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un clculo electrnico a partir del
Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentracin
de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrnicamente difiere del obtenido por
centrifugacin en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto
de las restantes clulas sanguneas, por lo que es siempre algo inferior (1-3 %).
Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugacin o por mtodos automatizados, son un buen
parmetro del estado de la serie eritroide.
El Hto refleja la concentracin y no la masa total de glbulos rojos. Por Ej., un paciente en
estado de shock acompaado de hemoconcentracin, el Hto. puede ser normal o alto, an
cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la prdida de sangre. Por lo tanto no es
confiable como indicador de anemia poco despus de una hemorragia o una transfusin.
METODO MANUAL
Micromtodo (microhematocrito)
Es una tcnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, muy sencilla y
poderse realizar en gran nmero de muestras a la vez y en muy poco tiempo.
Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm. de longitud por 1mm. de dimetro interno.
Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre
capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechar la primera gota despus de la puncin.
Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre
(aproximadamente 50 L). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el
proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa
el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellndolo a la llama del mechero. Una vez
cerrados se colocan los capilares en la centrfuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera
y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000
rpm. Tan pronto se detiene la centrfuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta
se puede realizar con los lectores de hematocrito (ABACO), que nos darn el resultado
directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres:
La determinacin del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores
obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01%.
Causas de error
Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminucin en
el valor, al perderse mayor proporcin de clulas que de plasma.
El uso de anticoagulantes lquidos provoca un error por dilucin de la muestra
En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los lquidos
tisulares que provoca hemodilucin.
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En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce
hemoconcentracin.
La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hemates vaya
tomando forma de bisel si el capilar permanece en posicin horizontal.
FUNDAMENTO
MATERIAL
Detergentes no inicos: Tritn X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218.
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El detergente no inico facilita la solubilizacin de protenas insolubles y acelera la
transformacin de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3 min.
Este reactivo debe tener un color amarillo plido, ser completamente transparente y tener un
pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco
debe ser igual a cero. Para su conservacin utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas
y mantener a temperatura ambiente (el fro modifica el color del reactivo).
METODO
1. Conectar el espectrofotmetro.
2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitacin suave con un sistema automtico
(rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mnimo de 5 min o manualmente por inversin
del tubo 20 veces.
3. Pipetear (CON PROPIPETA) 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio.
4. Mediante la micropipeta aadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml
de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operacin, es fundamental eliminar el exceso de
sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el
reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la
pipeta.
5. Agitar el tubo mediante inversin (4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien
la mezcla sangre-reactivo y esperar un mnimo de 5 min para que se produzca la hemlisis
total y se complete la transformacin de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.
6. Leer la A de la solucin a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco.
7. Para calcular la concentracin de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de
calibracin.
Se toma un Kit. de calibracin con estndar de CC. Normal, de una CC. Alta y otro de una CC
.baja, y se miden las absorbancia de cada una de ellas o se toma un Standard de CC. conocida y
se hacen diluciones mayores y menores que el normal y se miden las absorbancia y se determina
un factor que es el promedio de las tres diluciones. Teniendo que A= . b. C y como b=1 cm
=> A/ = C para facilitar el calculo A . (1/ ) = C donde (1/ )= F y es la inversa de la
pendiente de la curva tendremos que C= F . A. Dicho en otras palabras la recta se ajusta a
una ecuacin del tipo y=ax+b.
Grafico:
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De esta manera controlo:
La linealidad del equipo
El deterioro que sufre el reactivo
Puedo trabajar con un estndar diario, procesado por cada operador que realiza la determinacin
de hemoglobina, como si fuese una muestra ms y determino el factor del estndar.
La determinacin de hemoglobina est sometida a posibles errores que deben ser tenidos en
cuenta. Algunos de ellos obedecen a caractersticas peculiares del espcimen como la presencia
de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (50 x 109/l). No obstante, la mayora de las veces los
errores se deben a defectos tcnicos en la manipulacin y el anlisis del espcimen.
Errores de la dilucin:
1. Empleo de pipetas automticas descalibradas u otras pipetas sucias o hmedas
2. No eliminacin del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de
introducirlo en el reactivo
3. Dilucin incompleta de la sangre en el reactivo
Errores de la determinacin:
1. Empleo de instrumentos no calibrados
2. Cubetas sucias o deterioradas
3. Soluciones turbias de HiCN
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6 - Velocidad de sedimentacin globular (VSG) o Eritrosedimentacin
FUNDAMENTO
VSG es un test no especfico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de
enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crnicas como los
procesos inflamatorios crnicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumtica y tuberculosis) o la
respuesta a la terapia, por ejemplo con citostticos (enfermedad de Hodgkin, linfomas y
mieloma mltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis
pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests ms utilizados como screening
en el laboratorio clnico. Se trata de un mtodo sencillo para realizar y que requiere
equipamiento simple.
MECANISMO
Desde el punto de vista fsico, este fenmeno depende de los siguientes factores:
a. Tamao de los GR
b. Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma,
c. Viscosidad del plasma.
d. Temperatura.
Dado que, como se mencion ms arriba, el test tambin est influenciado por la forma y el
tamao de los GR, ste resulta poco confiable como un ndice de enfermedad en la anemia
falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.
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estas clulas se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida
de la composicin proteica del plasma y especialmente de la relacin entre las concentraciones
de albmina, globulinas y fibringeno. As, mientras la albmina tiende a aumentar el potencial
zeta, las globulinas y sobre todo el fibringeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto
el fibringeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformacin menos
esfrica que la albmina, lo que aumenta la constante dielctrica del plasma y reduce el
potencial zeta eritrocitario. La disminucin del potencial zeta de los GR tiene como
consecuencia una mayor tendencia de stos a agregarse y formar las llamadas pilas de
moneda. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio
entre las principales protenas plasmticas.
METODOLOGIA
Existen dos mtodos comnmente utilizados para medir la VSG: el mtodo de Westergren y el
mtodo de Wintrobe. Ambos mtodos poseen limitaciones. El mtodo de Westergren es menos
sensible a pequeos aumentos de los factores que causan la sedimentacin de los GR y as
puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening.
El mtodo de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG
Westergren es marcadamente elevada. Ambos mtodos son altamente sensitivos a la relacin
entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no especfico
de la VSG probablemente acelerando la agregacin y reduciendo las fuerzas de friccin entre
los agregados en sedimentacin. Se trataron de aplicar factores de correccin para anemias, pero
no resultaron confiables.
Durante los ltimos aos, han aparecido sistemas semiautomticos para medir la VSG que
emplean soportes especiales y pipetas de material plstico desechable. Estos sistemas, aunque
reproducen exactamente el mtodo de Westergren, se diferencian de ste por su carcter cerrado
(recogida de los especmenes en tubos al vaco que incorporan una cantidad precisa de
anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan
la rapidez y precisin del llenado de las pipetas.
MTODO DE WESTERGREN
Es el mtodo de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un mtodo poco
reproducible y sometido a diversas variables difciles de controlar, como es la necesidad de
prediluir la sangre.
A. MATERIALES.
A.1 Anticoagulante
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Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de
detergentes o dicromatos para la limpieza.
Tubos plsticos descartables: Se fabrican tubos plsticos descartables segn las
especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plsticos
resultan inadecuados pues unen GR siendo as ms susceptibles a los problemas de
taponamiento. Otros tubos plsticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan
hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.
A.3 Gradillas
Las gradillas o dispositivos de sostn estn diseados para sostener los tubos en una posicin
vertical inmvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla
para asegurar que la posicin de los tubos sea vertical dentro de un lmite de 1. La misma debe
estar construida de modo tal que no existan prdidas de sangre cuando el tubo est colocado en
ella.
B. TCNICA
A) La sangre se obtiene por puncin venosa, evitando contaminacin con materiales utilizados
para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporcin de 4 Vol de sangre a 1 Vol
de solucin de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en 0,5 ml de
anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a
temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs. si es mantenida a 4C.
D) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la
columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca
cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de
la VSG durante la primera hora (mm/hora).
C. VALORES DE REFERENCIA
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Factores tcnicos capaces de modificar la VSG
Causas de aumento
Desviacin de verticalidad de la pipeta
Incremento de la longitud y el dimetro de la pipeta
Elevacin de la temperatura ambiente
Dilucin de la sangre
Causas de disminucin:
Reduccin del dimetro de la pipeta
Utilizacin tarda de la sangre (especimen envejecido)
Cambio de anticoagulante
D. INTERPRETACION DE RESULTADOS
Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente,
han demostrado ser poco fiables y de escasa significacin clnica, por lo que no se recomienda
su empleo.
Existen numerosas patologas con alteraciones proteicas del plasma que cursan con
modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de
enfermedades principalmente relacionadas a las protenas de fase aguda, y tambin en el
embarazo normal y el puerperio.
Adems de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener
falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe
enfermedad orgnica.
Para muestras peditricas o cuando el volumen a obtener ser escaso se puede utilizar las
pipetas de Chattas, estas requieren un volumen de sangre mucho menor (40 L), la tcnica se
realiza de la misma manera pero los resultados deben ser corregidos utilizando un nomograma o
tabla para conversin.
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NOMOGRAMA DE CHATTAS
Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ngulos (extensor),
se realiza la extensin de la gota de sangre: conservando un ngulo menor de 45 respecto al
portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta
tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se
avanza con firmeza y no muy rpidamente. As se obtiene una fina pelcula de sangre que
representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.
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1
2
3
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Importante:
Lavar y secar bien el extensor entre una y otra extensin
Los portas nuevos deben ser desengrasados con agua jabonosa, enjuagados minuciosamente.
Fundamento
Prcticamente todos los mtodos empleados para teir las clulas de la sangre se basan en el
empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno.
Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras
celulares, de modo que las que tienen carcter bsico fijan en mayor medida la eosina (colorante
cido), mientras que las que poseen propiedades cidas fijan principalmente el azul de metileno
(colorante bsico). Esto explica que ciertas estructuras basfilas presentes en el ncleo
(nuclolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes
acidfilos como la hemoglobina adquieren color rosado.
Reactivos
Mtodo
Cubrir el frotis de sangre seco con solucin May Grnwald. Dejar 3 minutos. A continuacin,
agregar buffer fosfato pH 6.8 o una mezcla de agua de canilla con agua destilada en partes
iguales, en proporcin igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una
pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivn. Dejar 3-5 minutos. Volcar,
enjuagar bajo chorro de canilla suave y cubrir el preparado con una solucin de Giemsa,
obtenida a razn de dos gotas del colorante por ml de agua (1/10). Dejar 10- 12 minutos. Lavar
con agua, limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodn y secar al aire.
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TRABAJO PRCTICO N2
Objetivos generales
-Familiarizarse con el uso de la cmara de Neubauer
-Adquirir destreza en la preparacin de diluciones y manejo de muestras de sangre entera
-Adquirir destreza en el manejo del microscopio y la cmara de Neubauer para el recuento de
glbulos blancos
-Delinear los criterios para la identificacin de glbulos blancos en preparados coloreados con
MGG
-Realizar frmulas leucocitarias en muestras de pacientes sanos
-Interpretacin y validacin de resultados
1- RECUENTO DE LEUCOCITOS
Mtodo manual
2) Homogeneizar la mezcla.
4) Ubicar el reticulado de la cmara con bajo aumento (10X), constatar la ausencia de burbujas
y que la distribucin sea regular.
5) Proceder al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de
la cmara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre s en ms del 20%. En
caso contrario debe cargarse nuevamente la cmara.
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La lectura se realiza en los cuatro campos L. Adems de los leucocitos contados dentro de cada
uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos adheridos en la lnea horizontal
superior y vertical exterior, o de lo contrario, todos los leucocitos adheridos a la lnea horizontal
inferior y vertical interior.
6) Clculo:
m x 10 x d
= N de leucocitos/ mm3
n
Valores de referencia
En todo frotis coloreado con M.G.G. debe colocarse una delgada capa de aceite de inmersin,
aun para el pequeo aumento a seco. Si no se cumple este requisito la refringencia de los
elementos impide una buena observacin. Para esto es suficiente depositar una gota en un
extremo, aplicar de plano sobre ella otro portaobjetos que puede contener otro extendido en
cuyo caso se harn coincidir ambas caras que los contengan y desplazarlos suavemente unos
contra otros.
La observacin debe hacerse al principio de manera panormica con objetivo de 10X para ver la
dispersin de los elementos. Con este aumento se observaran la presencia de clulas grandes
como los linfocitos hiperbasofilos de la mononucleosis. Por ello debe evitarse la tendencia a
usar e comienzo la inmersin.
Luego se pasa a 40 X aumento que resulta til para evaluar alteraciones de tamao de los
glbulos rojos y finalmente se pasa a 100X para el recuento diferencial de los glbulos blancos
y para la observacin detallada de los elementos sanguneos.
Un extendido correctamente realizado poseer tres reas de diferente espesor y con distribucin
tambin distinta de leucocitos:
3. Zona ideal: Regin central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las clulas.
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Formas de recorrer el preparado
Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada uno de ellos para establecer
los porcentajes. Refiriendo al valor de recuento de glbulos blancos se puede expresar cada tipo
de leucocitos en valores absolutos por mm3 de sangre.
Siempre que sea posible se deben contar 100 elementos, recordar que se est haciendo una
estimacin porcentual de las poblaciones, el recuento de 100 elementos resulta relativamente
sencillo en pacientes con valores absolutos de GB dentro de los valores de referencia. Distinto
es el caso de pacientes leucopnicos con recuento bajos por ej: 1500 GB / mm3 en estos casos
resultar muy tedioso llegar a encontrar 100 elementos para poder expresar en % , por ello es
aconsejable expresar literalmente lo que se vi al observar el preparado por ej: se realiza la
frmula leucocitaria en un paciente leucopnico y solo se logr contar 80 elementos ( pueden
ser 70, 90 dependiendo del tiempo utilizado y del grado de leucopenia del paciente) entonces lo
aconsejable es expresar los resultados de la siguiente manera: DE 80 ELEMENTOS
CONTADOS x son Neutrfilos, y son eosinfilos, z son linfocitos, etc, etc, es decir se
expresa cuantos elementos de cada serie se observ en el total de GB contados Y NO EN
PORCENTAJE!
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Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrfilos3-4 aos: 50% de linfocitos y 50%
de neutrfilos.
10-12 aos: valores de referencia del adulto.
Descripcin de cada uno de los elementos que componen una frmula normal
1. Neutrfilos: Ncleo lobulado (2-5 lbulos). Los lbulos estn unidos entre s por filamentos
cromatnicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una clula terminal. Mide
aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una
granulacin fina especfica de color pardo rojiza.
2. Eosinfilos: Mide aproximadamente 13 m. El ncleo es segmentado, con predominio del
bisegmentado en forma de anteojo aunque pueden aparecer con ms lbulos. El citoplasma
es abundante y est cubierto de granulaciones esfricas de mayor tamao que las del
neutrfilo y que se colorean de anaranjado.
3. Basfilos: Mide aproximadamente 10 m. El ncleo est irregularmente lobulado. La
cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relacin al citoplasma. Las
granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamao pudiendo quedar
superpuestas al ncleo, cubrindolo parcialmente.
4. Linfocitos: Es una clula generalmente pequea (7 m), pero puede llegar hasta 12 m. La
forma ms pequea posee slo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un
10% de los linfocitos circulantes son clulas ms grandes y con citoplasma ms abundante.
El ncleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es
densa.
Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamao (18-24 m). El ncleo presenta forma
irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporcin ncleo-citoplasma es
aproximadamente semejante. El citoplasma se tie de celeste plomizo y no presenta
granulaciones.
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TRABAJO PRCTICO N 3:
Objetivos Generales
-Identificar los diferentes elementos sanguneos normales y patolgicos
-Desarrollar criterios para la clasificacin de elementos patolgicos
-Correlacionar los elementos encontrados con diferentes patologas y datos de contador
hematolgico.
GLOBULOS ROJOS:
PROERITROBLASTO (1):
Clula voluminosa (20-30 um. de dimetro)
Ncleo: ocupa la mayor parte de la clula.
Cromatina con aspecto de esponja uno o dos
nucleolos teidos de rosa por el giemsa.
Citoplasma: intensamente basfilo por el gran
contenido de ARN. Presenta sobre uno de los
costados del ncleo una formacin redondeada que
se destaca por su coloracin rosada: el arcoplasma
que corresponde al APARATO DE GOLGI y
CENTRO CELULAR.
Hay numerosos ribosomas. Escasos organoides
membranosos, excepto mitocondrias.
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ERITROBLASTO POLICROMATFILO (2):
Tamao: se sigue reduciendo 11-13 um.
Ncleo: menor tamao, se va condensando la cromatina.
Citoplasma: comienza a cargarse de un tinte lilaceo, debido a la superposicin de la basofilia
ribosmica con la acidofilia de la hemoglobina. A medida que los estadios progresan
predominan
los tintes rojizos sobre los azulados. Presentan mitocondrias donde se metaboliza el HEM.
Ferritina en acumulos groseros (siderosomas).
RETICULOCITO:
Es la clula anterior que ha perdido el ncleo por
expulsin o lisis (aunque se acepta ms lo
primero).
Contiene todava algunos ribosomas y
mitocondrias. En un extendido coloreado con
Giemsa aparece de tamao algo mayor que el
glbulo rojo maduro y con una ligera
policromatofilia.
Pero con una coloracin supravital (colorea los
elementos vivos, fuera del organismo) el
colorante precipita los ribosomas, formando una
sustancia retculo-filamentosa, que toma distintos
aspectos segn la cantidad de ARN que
contienen, siendo los mas maduros aquellos que contienen menos ARN.
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GRANULOPOYESIS:
MIELOBLASTO:
Elemento iniciador de la
progenie.
Tamao: aproxim. 20 um.
Ncleo: de gran tamao,
ocupa casi toda la clula, con
una fina membrana nuclear
lisa y delgada y una cromatina
muy fina, muy delicada que
no hace condensacin cerca de
la membrana nuclear. Suele
tomar el aspecto de una red o tamiz. Contiene uno o
dos NUCLEOLOS.
Citoplasma: se colorea de celeste claro, es apenas un
halo alrededor del ncleo tan voluminoso. Con el
microscopio comn no se observan granulaciones. Sin
embargo el microscopio electrnico detecta la presencia
de lisosomas que en otras etapas van a constituir las
granulaciones inespecficas.
PROMIELOCITO:
Tamao: mayor que el
anterior (25-30 um.)
Ncleo: grande, pero la
relacin ncleo citoplasma
es menor. Puede ser
redondo u ovalada,
generalmente es excntrico.
La cromatina todava es
laxa, aunque algo menos
que en el anterior. Presenta
NUCLEOLOS.
Citoplasma: presenta una zona clara perinuclear llamada arcoplasma (corresponde a la zona del
complejo de golgi y centro celular). Sigue siendo basfilo y ya son visibles con el microscopio
ptico numerosas granulaciones inespecficas (se llaman as porque no permite identificar a la
clula como precursora de neutrofilo-eosinofilo-basfilo). Tambien son llamadas primarias.
Contienen enzimas y la ms caractersticas es a mieloperoxidasa. Los grnulos primarios son
lisosomas rodeados por lo tanto de unidades de membrana.
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MIELOCITO (1):
Tamao: 20-25 um.
Ncleo: ya no muestra NUCLEOLOS. La
cromatina comienza a mostrar
condensaciones.
Citoplasma: es todava basfilo, pero
adems de las granulaciones primarias
presenta en la zona del arcoplasma,
granulaciones especficas que permiten
hablar de mielocito neutrofilo-eosinofilo-
basfilo segn el contenido de sus grnulos
especficos o secundarios. El mielocito es el
ltimo elemento en el cual se presenta
divisin.
METAMIELOCITO:
Tamao: algo menor que el mielocito.
Ncleo: de forma arrionada con cromatina en forma
parcelada, mostrando zonas condensadas. No presenta
nucleolos.
Citoplasma: policromatofilo (intermedio entre azul y
rosado). Predominan las granulaciones especficas. Las
granulaciones primarias son escasas y van poco a poco
perdiendo su coloracion.
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GRANULOCITO NEUTRFILO:
Es el elemento ms abundante del frotis normal
de un adulto
Ncleo: lobulado o segmentado. Presenta de 2
a 5 lbulos que se van formando a partir de
estrangulaciones en el ncleo del granulocito en
cayado, que se van profundizando de manera
que van quedando los segmentos o lbulos
unidos por filamentos de cromatina.
La cromatina tiene una disposicin en mosaico,
con zonas de cromatina muy condensada y otras
de cromatina extendida. La mayor cantidad de
lbulos indica mayor madurez de la clula.
Tamao: de 12 a 14 um.
Citoplasma: rosado con granulaciones
especficas muy finas, que toman tanto los
colorantes cidos como los bsicos (de all el
nombre de neutrfilos) y aparecen de color
violeta. Contienen enzimas como la fosfatasa
alcalina y sustancias de accin bactericida.
GRANULOCITOS EOSINFILOS:
Tamao: 12-15 um.
Ncleo: predomina el ncleo
bilobulado, semejante a un anteojo.
Disposicin de la cromatina en
mosaico.
Citoplasma: cubierto de granulaciones
esfricas de mayor tamao que las
neutrfilos, coloreadas de color naranja
(o pardo rojizo) por la eosina.
Prcticamente cubren todo el
citoplasma y se consideran lisosomas.
GRANULOCITO BASFILO:
27
la coloracin. Contiene heparina e histamina.
MONOBLASTO:
Tamao: aproximadamente 20
um.
Es muy parecido al mieloblasto,
se diferencia de el en que el
ncleo presenta una ligera
indentacion (que hace recordar al
monocito maduro) presenta
tambien varios nucleolos. La otra
diferencia es que el citoplasma es ligeramente grisceo y a veces marca pliegues.
PROMONOCITO:
MONOCITO:
28
LINFOBLASTO:
PROLINFOCITO:
LINFOCITO MADURO:
29
LINFOCITO GRANDE:
CELULA PLASMATICA:
Representa el 1-4% de las clulas nucleadas
de MO en un sujeto normal y es el estadio
final de la maduracin y transformacin del
linfocito B maduro. Es una clula redonda u
ovalada que mide entre 11 y 15 um. de
dimetro. Se caracteriza por el ncleo
redondo, denso y excntrico con la
heterocromatina dispuesta en masas groseras
de disposicin radial (en rueda de carro).
Por lo general no presentan nuclolo. El
citoplasma puede tener frecuentemente bordes
de apariencia irregular y se tie de azul
violceo muy intenso, indicio de su riqueza en
RNA con una zona clara cercana al ncleo
denominada "arcoplasma". Normalmente no
contienen granulaciones, pero pueden mostrar
vacuolas o cuerpos de inclusin plida o rosa,
que corresponden a acumulos de
inmunoglobulinas (cuerpos de Russell).
Cuando estas inclusiones son muy numerosas,
el aspecto de la clula es el de una mrula (clula de Mott). En algunos procesos reactivos que
cursan con estimulacin antignica crnica (por ej. artritis reumatoidea activa) pueden aparecer
en SP en un pequeo nmero. Se pueden observar tambin plasmocitos con inclusiones que
representan acumulos de inmunoglobulinas en la cisterna perinuclear con la subsecuente
invaginacin dentro del ncleo, que da la apariencia de ser intranucleares. Estas estructuras se
conocen como cuerpos de Dutcher.
En algunos pacientes con mielomas IgA se pueden observar clulas plasmticas flameadas
caracterizadas por una coloracin eosinofilica en la periferia o a veces en el citoplasma
completo. En raras ocasiones se pueden observar plasmocitos multinucleados o clulas
plasmticas inmaduras (plasmoblastos) en aspirados de MO normal.
SERIE MEGACARIOCITICA-PLAQUETARIA
30
distinguen cuatro estadios evolutivos: el megacarioblasto, el promegacariocito, el megacariocito
granular y el megacariocito formador de plaquetas o maduro.
MEGACARIOBLASTO:
Es la clula descendiente de la SC, con
orientacin plaquetognica. Su tamao
oscila entre 10 - 25 micras. El ncleo
generalmente tetraploide u octaploide es
nico, grande, ovalado o bilobulado con
cromatina laxa y numerosos nuclolos. El
citoplasma, es intensamente basfilo,
agranular y puede presentar algunas
prolongaciones a modo de seudpodos
muy caractersticos.
PROMEGACARIOCITO:
Mide 30 a 50 micras y se identifica
fcilmente en MO por su gran tamao y por el
aspecto caracterstico de su citoplasma que
posee bordes mal limitados y emite
numerosas prolongaciones. El ncleo es
multilobulado, su cromatina es densa y no
posee nuclolos. En el citoplasma persiste su
tonalidad basfila, con numerosas
granulaciones azurfilas que cubren distintas
zonas.
MEGACARIOCITO GRANULAR:
Es caracterstico su gran tamao (80
micras o ms) y su elevada ploida. Su
citoplasma amplio no posee basofilia y
est totalmente cubierto por granulacin
azurfila rojo rosada. El ncleo es
multilobulado o segmentado con
cromatina condensada sin nuclolo.
31
MEGACARIOCITO MADURO ACTIVO:
En este estadio el ncleo sigue siendo
lobulado pero ms compacto. Finalizada
la sntesis de ADN se inicia en el
citoplasma la granulognesis que dar
origen a las plaquetas. Los grnulos
azurfilos se distribuyen especialmente
en la periferia, en pequeos agregados
rodeados por una zona hialina
citoplasmtica correspondiente a las
membranas de demarcacin que irn
delimitando las futuras plaquetas. Las
plaquetas son finalmente liberadas como
fragmentos citoplasmticos por fusin de
las membranas de demarcacin.
ALTERACIONES CUANTITATIVAS
Se refiere a una variacin en la cantidad de los diferentes tipos leucocitos o bien a variaciones
en el recuento total.
Se evalan mediante un conteo total de leucocitos y conteo diferencial de cada uno de ellos.
Pueden ser trastornos malignos o benignos.
Los trastornos malignos pueden ser ocasionados por transformacin neoplsica de clulas
progenitoras
Los trastornos benignos pueden ser adquiridos o hereditarios.
1-ALTERACIONES FISIOLGICAS
2-ALTERACIONES PATOLGICAS
32
2.1-LEUCOCITOSIS: >11.0 x 109/L (Neutrofilia, eosinofilia, basofilia, linfocitosis,
monocitosis)
2.2-LEUCOPENIA: < 4.0 x 109/L (Neutropenia, eosinopenia, monocitopenia, linfopenia)
2.3-REACCIONES LEUCEMOIDES entre 20.0 50.0 x 109/L
2.1 LEUCOCITOSIS
2.2 LEUCOPENIAS
33
Disminucin en la cantidad de eosinfilos. Difcil de establecer debido a su bajo recuento.
La ACTH aumenta los PMN circulantes pero disminuye los eosinfilos circulantes.
Se presenta en situaciones estresantes agudas, reacciones inflamatorias y con la administracin
de glucocorticoides.
La infeccin bacteriana puede causar disminucin debido a una marginacin creciente y a la
migracin de estas clulas a los tejidos, pero la recuperacin se puede acompaar de eosinofilia
leve
ALTERACIONES CUALITATIVAS
1-ALTERACIONES NUCLEARES
34
Hipersegmentacin Nuclear
2-ALTERACIONES CITOPLASMATICAS
Esta rara enfermedad autosmica recesiva se caracteriza por albinismo parcial, grnulos
lisosmicos gigantes en la mayora de las clulas granulosas (aunque tambin se observan en
linfocitos y monocitos), y mayor susceptibilidad a las infecciones. Es fcil observar las clulas
sanguneas anormales en los frotis sanguneos de rutina. La enfermedad se diagnostica por lo
general en nios. Hay diversas anomalas en los neutrfilos incluyendo neutropenia moderada,
reduccin en la quimiotaxis de neutrfilos. Adems, en estudios microbicidas, se observa que
los grnulos primarios gigantes se degranulan con lentitud, y por lo tanto, se retarda la muerte
de las bacterias fagocitadas.
Cuerpos de Dhle.
Granulaciones Txicas.
Las granulaciones txicas de los segmentados neutrfilos son grnulos hipertrofiados que le
dan un aspecto hipergranular al citoplasma de los neutrfilos que junto con las vacuolas y los
cuerpos de Dhle se encuentran en condiciones txicas como infecciones, septicemia,
quemaduras. Son grnulos primarios que debido a algn desbalance en la maduracin del
neutrfilo no lograron ser eliminados eficazmente.
35
tienen afinidad por la eosina. Se encuentran en la leucemia mieloide aguda y durante la crisis
blstica de la leucemia mieloide crnica.
Linfocitos atpicos
Vacuolas
Degranulacin
36
TRABAJO PRCTICO 4 Y 5
Alteraciones en el tamao.
Alteraciones en la forma
Drepanocitos: Son hemates con HbS precipitada. Su apariencia es propia del estado
homocigoto de la hemoglobina S, aunque tambin se puede presentar en estados de
heterocigozis.
37
hemates a una solucin hipertnica. Tambin se pueden encontrar en pacientes con IRC,
hepatopatas, dficit de PK, etc.
Estomatocitos: Son hemates que en lugar de una deplecin central clara tienen una banda
plida central que les da un aspecto de boca. Se hereda como carcter autosmico dominante.
Esta enfermedad es causada por anormalidad hereditaria de la membrana eritrocitaria. Tambin
se pueden encontrar en pacientes con hepatopatas y dislipidemias.
Knocitos: Son hemates que presentan un estoma o boca en la regin central completamente
coloreada y lo dems incoloro. Morfolgicamente es todo lo contrario a las caractersticas del
estomatocito. Se encuentran en algunas anemias como las ferropnicas.
Alteraciones de color
Aqu observamos las diferentes tonalidades de color de los hemates dependiendo del contenido
hemoglobnico u otros. Tenemos:
Policromatofilia: Presencia de hemates con tonalidad (azul y rojo) morada. Se le relaciona con
inmadurez celular, clulas nucleadas, presencia de reticulocitos, macrocitos, etc. Esto debido a
su elevada cantidad de ARN.
Inclusiones anormales
Punteado basfilo: Son grnulos basfilos presentes en el citoplasma de los hemates. Indica
una alteracin de la eritropoyesis ms que un aumento de la misma. Se produce en muchas
enfermedades sanguneas: talasemia, anemias megaloblasticas, infecciones, hepatopatas,
38
intoxicacin por plomo y otros metales pesados, hemoglobinas inestables y deficiencia de
pirimidina-5-nucleotidasa. Actualmente el consumo de ciertos frmacos tambin puede
producir este fenmeno.
Anillos de Cabot: Se cree que sean restos de membrana nuclear eritroblstica o restos despus
de una mitosis anormal. Se observan en forma de anillo u ocho invertido. Pueden ser
precipitados de ARN o protena carente de importancia diagnstica. Su presencia indica severas
signos de diseritropoyesis.
Cuerpos de Howel-Jolly: Son restos de cromatina nuclear, resultados de la prdida del ncleo
por parte del eritroblasto ortocromtico hasta la conversin del hemate. Se les considera signos
de regeneracin celular. Pueden observarse (habitualmente aislados) en un pequeo porcentaje
de hemates en la anemia perniciosa. Las clulas que los contienen aparecen habitualmente tras
la esplenectoma y cuando se ha producido una atrofia esplnica. En general, solo se encuentran
unas cuantas clulas de este tipo, pero pueden ser muy numerosas en los casos de enfermedad
celiaca, en la que hay una atrofia esplnica y una deficiencia de folato concomitante.
Siderocitos: Son hemates con contenido de hierro libre no hemoglobnico de color verde
azulado.
Grnulos de Shuffner: Son grnulos que presentan algunos hemates en caso de parasitismo
por plasmodium vivax.
Grnulos de Maurer: Son grnulos de color violeta oscuro que se encuentran en pacientes con
parasitismo por plasmodium falciparum.
ANEMIA:
Se define anemia como la incapacidad de la sangre para transportar oxgeno.
Segn la definicin de la OMS se acepta que existe Anemia cuando la concentracin de
HEMOGLOBINA se halla por debajo de los lmites establecidos en funcin de la edad y el
sexo; independientemente de que la concentracin de eritrocitos se encuentre normal o incluso
elevada.
EDAD CONCENTRACION DE HEMOGLOBINA (g/dL) MENOR A .
Recin nacidos (a termino) 14,0
Nios de 3 meses 9,0
Nios de 2 aos 11,0
Mujeres (no embarazadas) 11,5
Varones 12,0
Mujeres embarazadas 11,0
39
CLASIFICACION MORFOLGICA:
Se debe recordar que el VCM se correlaciona con la HCM (que informa el contenido medio
hemoglobnico de los eritrocitos circulantes) de forma que disminuir la HCM al hacerlo el
VCM (anemia microctica hipocrmica) y aumenta cuando aumente el VCM (anemia
macroctica hipercrmica).
Siempre se debe recordar que en determinadas situaciones el VCM puede estar afectado por
factores no debidos al tamao de los eritrocitos, como alteraciones en la forma o la
deformabilidad celular, lo que obedece a los mtodos automatizados para medir el VCM por lo
tanto, siempre que analicemos un histograma, debemos tener en cuenta que el VCM es un valor
medio y no informa sobre la homogeneidad celular y es necesario correlacionarlo con el ndice
ADE y hacer una inspeccin al microscopio del frotis para que una posible anisocitosis no pase
desapercibida.
Anemias hemolticas.
Aplasia Medular.
Invasin Medular.
Anemia secundaria a enfermedades crnicas.
Anemia secundaria a procesos hemorrgicos agudos.
Anemias tempranas de otras anemias.
40
CLASIFICACIN FISIOPATOLOGICA DE LAS ANEMIAS
ANEMIAS ARREGENERATIVAS:
En este tipo de Anemias tambin llamadas Arregenerativas, la medula sea no presenta una
capacidad regenerativa normal y no se cumple una relacin inversa entre la disminucin de la
concentracin de la hemoglobina y el aumento de Reticulocitos. Esto es, la Medula sea no
puede responder adecuadamente al grado de anemia.
Defecto de proliferacin y diferenciacin de stem cells: aplasia medular,
leucemia, mielodisplasias.
Defecto de proliferacin y diferenciacin de progenitores de los GR: aplasia
roja pura, insuficiencia renal, enfermedades endocrinas, etc.
Defecto en sntesis de DNA: deficiencia de vitamina B12 y folatos.
Defecto en sntesis de Hemoglobina: deficiencia de fierro, talasemias.
Mecanismos mltiples o desconocidos: anemia de enfermedades crnicas,
infiltracin medular (metstasis), anemias sideroblsticas.
ANEMIAS REGENERATIVAS:
En general, obedecen a una perdida perifrica de eritrocitos por hemorragias o hemlisis. Son
anemias regenerativas, es decir que la medula presenta una capacidad de respuesta normal y
existe una relacin inversa entre el grado de anemia y el aumento de Reticulocitos.
DEFECTOS INTRNSECOS:
- De membrana: esferocitosis, acantocitosis, etc.
- De enzimas: deficiencias de G-6-PD, piruvato kinasa, etc.
- De globinas: enfermedad de las clulas falciformes (HbS), Hemoglobinas
inestables, etc.
DEFECTOS EXTRNSECOS:
- Mecnicos: microangiopata, prtesis, etc.
- Qumicos o fsicos: hemlisis por drogas, venenos.
- Infecciones: clostridium, malaria, otras septicemias...
- Anticuerpos: autoinmune, aloinmune, drogas.
- Hiperactividad monocito-macrfago: hiperesplenia.
- Prdida de sangre: hemorragia aguda.
RECUENTO DE RETICULOCITOS
Los Reticulocitos son eritrocitos no nucleados, inmaduros, que contienen ARN y que continan
sintetizando hemoglobina despus de la prdida del ncleo.
El carcter regenerativo o arregenerativo de una anemia puede conocerse a travs del recuento
de Reticulocitos. Adems, el recuento de Reticulocitos sirve para el seguimiento en el
tratamiento de ciertas anemias. Por ejemplo, la respuesta de los reticulocitos en el da 6 despus
41
de la terapia confirma la respuesta a la terapia con folato o con B12 siempre que slo se hayan
dado dosis bajas, en una anemia por dficit de folato o cabalamina. Podemos observar los
reticulocitos al microscopio ptico mediante la tincin con colorantes vital, azul de metileno o
azul brillante de cresilo. Estos colorantes dan lugar a la precipitacin de los restos de ARN, y se
observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la clula.
El nmero de reticulocitos en sangre circulante es, probablemente el mejor y ms sencillo
indicador de la eritropoyesis. Un aumento puede interpretarse como indicacin de una elevada
demanda de nuevos eritrocitos y un correcto funcionamiento de la mdula sea. Por el contrario
cuando la demanda disminuye o la mdula sea falla en sus funciones, la cifra de reticulocitos
baja.
Segn el grado de maduracin que posea el reticulocito presentar un modelo de reticulocito
distinto, de ovillo denso en el caso de los ms inmaduros o de grnulos escasos para los ms
maduros
PROCEDIMIENTO:
50 hemates
X= 5 campos
42
2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 2 = 1,1 %
10
PORCENTAJE DE RETICULOCITOS:
El porcentaje de Reticulocitos se determina en al menos 1,000 hemates. El recuento de
Reticulocitos se determina multiplicando el porcentaje de Reticulocitos por el recuento de
hemates.
Los adultos normales muestran un recuento de Reticulocitos de 0.5 a 2 %.
En los recin nacidos, el porcentaje oscila entre 2 a 6%.
VALOR ABSOLUTO:
Se expresa como N de Reticulocitos/mm3. Para adultos, el valor de referencia se sita entre
40.000 60.000.
VALOR CORREGIDO I:
Si se expresan los Reticulocitos en porcentaje van referidos a la concentracin normal de
eritrocitos y no tiene en cuenta la salida prematura de Reticulocitos desde la medula sea, por
ello siempre debe corregirse en funcin de la intensidad de la anemia:
El factor en condiciones normales es de 1 y aumenta en 0,5 por cada 10% de disminucin del
Hto.
43
Reticulocitos 100 x Azul Brillante de Cresilo
TRABAJO PRCTICO N 6
a) Separar los hemates del plasma y trasvasar una porcin de los mismos a un tubo de Kahn.
b) Llenar el tubo con solucin fisiolgica al 0.85% y centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto.
c) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces ms, teniendo la precaucin de
resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solucin
fisiolgica.
d) Tomar una gota de culot (50 l) y agregarle 0,5 ml de solucin fisiolgica. Se tendr as la
suspensin al 2%.
D. SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA
44
d) Rotar la placa en forma circular y observar la aparicin de aglutinacin dentro del minuto.
GR A GR B GR AB Grupo ABO
- + + A
Suero problema + - + B
+ + + O
- - - AB
E.1 Controles
E.2 Reacciones
Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones
negativas frente a sueros anti D. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia
de un individuo Du. Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs.
45
6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500
rpm, desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se har macro y
microscpicamente.
F.1 Reacciones
Para el primer control positivo deben emplearse hemates Rh positivos de dador conocido OR1r
(Cde/cde). Es aconsejable usar esos hemates y evitar emplear eritrocitos D(Rho) positivos con
el antgeno E(rh) presente ,dado que, en tales hemates el factor D(Rho) es mas reactivo.
El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga
aglutininas inespecficas para el antgeno en cuestin (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no
absorbidos durante la preparacin del suero). Estos dos primeros controles sirven para
demostrar que el suero a emplear es especfico y no posee ningn contaminante que pueda
falsear los resultados.
El tercer control, es de seudoaglutinacin y para ello se reemplaza el suero anti D por suero de
persona de grupo sanguneo AB, se lo enfrenta con los hemates que estn siendo tipificados.
5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer
microscpicamente con visor y microscpicamente.
46
G.2 Prueba de Coombs directa
9) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer
microscpicamente con visor y microscpicamente.
RECOMENDACIONES:
*es importante realizar con cuidado los sucesivos lavados, la temperatura que sea 37C, la
ultima centrifugacin no debe ser enrgica ni ms de un minuto.
*siempre que una prueba de Coombs directa de negativa de debe dejarla 15-20 minutos a 37C
y luego volver a realizar un corta centrifugacin
SIGNIFICACION CLINICA
En el ao 1900 Landsteiner descubri que los glbulos rojos humanos podan ser clasificados en
A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antgenos
altamente reactivos en su superficie. Tambin demostr que existen anticuerpos (aglutininas)
para los anfgenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el
antgeno presente en sus propios glbulos rojos pero s contra los que no posee. Actualmente se
han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas
observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la prctica transfusional.
Por este motivo, la tipificacin de los grupos sanguneos ABO es la prueba fundamental sobre la
que se basan los dems ensayos pretransfusionales.
REACTIVOS PROVISTOS
Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos
monoclonales secretados por lneas celulares de hibridomas de ratn.
REACTIVOS NO PROVISTOS
De acuerdo a la tcnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente:
- Solucin fisiolgica
- Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfatos (PBS)
- Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS)
- Albmina Bovina 30% de Wiener lab.
47
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento
indicada en la caja.
MUESTRA
Glbulos rojos o sangre entera
a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico,
citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).
Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab.
c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en
refrigerador (2-10oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48
horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35
das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la
muestra.
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro".
PROCEDIMIENTO
En las siguientes tcnicas la suspensin de glbulos rojos a ensayar debe ser preparada con
solucin fisiolgica, PBS o LISS.
I- TECNICA EN PLACA
Preparar una suspensin de glbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una
suspensin al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.0
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una placa
limpia, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos.
2) Mezclar el Reactivo y los glbulos con un palillo descartable cubriendo un rea circular de
2 cm de dimetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar
aglutinacin visible microscpicamente hasta los 2 minutos. No debe emplearse
microscopio.
48
La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas utilizadas) indica una reaccin
positiva.
Antisuero
Grupo sanguneo Anti-A Anti-B Anti-
A,B
A + - +
B - + +
0 - - -
AB + + +
Variants dbiles +/- - +
del grupo A
como Ax
PRESENTACION
Anti-A: frasco x 10 ml (Cd. 1443152).
Anti-B: frasco x 10 ml (Cd. 1443154).
Anti-AB: frasco x 10 ml (Cd. 1443153).
BIBLIOGRAFIA
- Moore, S. et al. Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their
Characterization and use. Pars, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59.
- Widman, F.K. Technical Manual. 9th Edition, Washington, D.C. American Association of
Blood Banks 1985. Chapter 8.
2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las clulas y
examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Tc.: Viviana E. Ctola
49
Bioqumica
Producto Inscripto M.S.
Disp. N: 1076/89 (Anti-A)
Disp. N: 1073/89 (Anti-B)
Disp. N: 1071/89 (Anti-A,B)
Anti-D (Rho)
monoclonal
Reactivo para la deteccin de antgeno D (Rho)
SIGNIFICACION CLINICA
Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940
establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clnica de la deteccin en
el laboratorio de los anticuerpos anti-D.
Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza
negra carecen del antgeno D y son fcilmente estimulados cuando reciben este antgeno, ya sea
por transfusin o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de
severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemoltica del recin nacido.
Existen muchos otros antgenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antgeno
D el que posee mayor importancia en la clnica despus del sistema ABO.
REACTIVO PROVISTO
Anti-D (Rho): solucin de anticuerpos monoclonales humanos.
REACTIVOS NO PROVISTOS
De acuerdo a la tcnica empleada puede requerirse adicionalmente:
- Solucin fisiolgica.
- Suero Anti-humano (poliespecfico) provisto separadamente por Wiener lab.
PRECAUCIONES
El reactivo es para uso diagnstico "in vitro".
MUESTRA
Glbulos rojos o sangre entera
a) Recoleccin: obtener la sangre en forma asptica con o sin anticoagulantes.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (cido ctrico,
citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa,
adenina).
50
c) Sustancias interferentes conocidas: los glbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o
fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha
esta situacin deber realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en
refrigerador (2-10oC).
Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras
recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean
cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra.
PROCEDIMIENTO
I- TECNICA EN PLACA
Preparar una suspensin de glbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autlogos, o solucin
fisiolgica. Tambin puede emplearse sangre entera.
1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia.
2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.
3) Mezclar el antisuero y los glbulos rojos con un palillo descartable en un rea de 2 cm de
dimetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar
macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.
51
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
La prueba para tipificacin de antgeno D (Rho) de glbulos rojos sensibilizados debe realizarse
solamente en medio salino. La determinacin del Du no puede efectuarse sobre glbulos rojos
sensibilizados.
Pueden obtenerse resultados ms rpidos y mejor visualizacin precalentando la placa a 45-
50oC.
PRESENTACION
Frasco x 10 ml (Cd. 1443155).
BIBLIOGRAFIA
- Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940.
- Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959.
- Widman, F.K. - Technical Manual - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of
Blood Banks, Chapter 9, 1985.
- Race , R.R. and Sanger, R. - Blood Groups in Man - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific
Publications, pg. 178, 1975.
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Tc.: Viviana E. Ctola
Bioqumica
Producto Inscripto M.S.
Disp. N: 1074/89
Suero Anti-humano
(poliespecfico)
SIGNIFICACION CLINICA
Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas
Antiglobulina Humana resultaban los mejores mtodos para detectar anticuerpos sensibilizantes
pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente haca referencia a
antgenos del sistema Rh.
Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la deteccin de anticuerpos en
casi todos los grupos sanguneos de importancia clnica, siendo empleadas actualmente en los
siguientes casos:
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Prueba Antiglobulina Directa
- Diagnstico de laboratorio de anemia hemoltica y enfermedad hemoltica del recin nacido.
- Investigacin de reacciones dudosas en una transfusin.
- Investigacin de enfermedades autoinmunes que involucran la unin de inmunoglobulinas y/o
fracciones del complemento a los glbulos rojos.
REACTIVO PROVISTO
Suero Anti-humano (poliespecfico): suero obtenido de conejos inmunizados con
inmunoglobulina G purificada y C3.
REACTIVOS NO PROVISTOS
- Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos.
De acuerdo a la tcnica a emplear puede requerirse adicionalmente:
- Solucin fisiolgica.
- Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfato (PBS).
- Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS).
PRECAUCIONES
El Reactivo Provisto es para uso diagnstico "in vitro".
MUESTRA
Glbulos rojos
a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico,
citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).
Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab.
c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en
refrigerador (2-10oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48
horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35
das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la
muestra.
Cuando se efectan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca
(menos de 24 horas de la extraccin).
Si los glbulos provienen de cogulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas.
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MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Centrfuga
- Bao de agua a 37oC
- Tubos de hemlisis
PROCEDIMIENTO
I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin salina de fuerza inica normal).
1) En un tubo de hemlisis colocar 2 gotas del suero a probar.
2) Agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y
resuspendidos en PBS.
3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.
4) Lavar los glbulos 3 veces con PBS teniendo la precaucin de descartar completamente el
sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente
el sobrenadante luego del ltimo lavado.
5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico) al botn de clulas. Mezclar
perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm.
6) Resuspender las clulas por agitacin y observar macroscpicamente. Tener en cuenta que
agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones dbiles.
7) Los resultados negativos deben confirmarse por adicin de glbulos rojos sensibilizados
con IgG dbiles.
II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin fisiolgica de baja fuerza inica).
El empleo de esta solucin permite reducir el tiempo de incubacin a 15 minutos.
Los glbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con
esta solucin una suspensin de glbulos rojos al 3%.
1) Colocar en un tubo de hemlisis 1 gota de suero a probar.
2) Agregar 1 gota de glbulos rojos a probar al 3% en LISS.
3) Mezclar e incubar a 37C durante 15 minutos en bao de agua.
Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la tcnica I).
PRESENTACION
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Frasco x 10 ml (Cd. 1443156).
BIBLIOGRAFIA
- Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945.
- Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945.
- Widman, F.K. - Technical Manual. 9th ed. Washington D.C. American Association of
Blood Banks, pg. 376, 1985.
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Tc.: Viviana E. Ctola
Bioqumica
Producto Inscripto M.S.
Disp. N: 2503/91
A. TITULACIN DE ANTICUERPOS
a) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el nmero de tubos puede
aumentarse o disminuirse si fuera necesario).
b) En los tubos 2 al 10, colocar 0,100 ml de solucin fisiolgica (SF). Colocar 0,300 ml de
suero a titular en el tubo N1.
c) Tomar 0,100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N2.
d) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Luego se toman 0,100 ml de la
misma y se trasvasan al tubo de Kahn N3. Homogeneizar y repetir la operacin hasta
completar las diluciones.
A.1.2 Titulacin
a) Se toman 10 tubos de Kahn, numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. Con una
pipeta Pasteur para cada dilucin, colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes
tubos.
b) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensin de hemates al 2%. Agitar la mezcla.
c) Incubar a la temperatura apropiada, el tiempo requerido.
d) Simultneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinacin y de especificidad del
suero.
e) Leer los resultados macro y microscpicamente comenzando por los controles y luego por
el tubo de mayor dilucin. El grado de aglutinacin se considerar segn los scores
anteriormente indicados.
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dilucin con la precedente. Por ejemplo, si en el tubo N 5 cuya dilucin es 1/16, el tipo de
aglutinato es tr, el ttulo ser (16+8)/2=12.
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TRABAJO PRCTICO N 7
Fundamentos
La electroforesis consiste en la separacin de partculas aprovechando su traslado mediante la
aplicacin de campos elctricos. La capacidad de movimiento de las diferentes molculas
depende de la intensidad del campo aplicado, su carga y su peso molecular.
La hemoglobina, protena presente en los glbulos rojos, tiene varias formas moleculares,
algunas normales y otras anormales. El proceso de electroforesis aprovecha el hecho de que las
diferentes hemoglobinas migran a diferentes velocidades, permitiendo as su separacin. En
acetato de celulosa, a pH alcalino, la HbA migra hacia el nodo, mientras que la HbF (que en
condiciones normales se encuentra en pequeas cantidades) queda cercana a esta. La HbA2 tiene
una velocidad menor por lo que queda cerca del ctodo.
Durante la electroforesis, una corriente elctrica pasa a travs de la muestra de sangre de una
persona, lo cual hace que los tipos de hemoglobina se separen en diferentes momentos y formen
bandas. Al comparar la forma en la que se separan con la de una muestra de sangre normal, se
pueden ver los tipos y las cantidades de hemoglobina existentes en la muestra de sangre.
Entre sus ventajas estn, que constituye una microtcnica y el costo en reactivos y tiempo
laboral es muy bajo; adems mediante esta tcnica pueden diferenciarse con precisin la
presencia de las hemoglobinas A, S y C.
Reactivos
Solucin buffer:
Tris-(hidroximetil)-amino etano..........................10,2 g
EDTA di sdico.......................0,6 g
cido Brico.3, 2 g
Agua Destilada.1000ml
Solucin colorante:
Amido Schwartz (0,5 g Amido Schwartz / 45 ml alcohol metlico / 10
ml cido actico / 45 ml agua destilada)
Solucin decolorante:
cido actico 5%.
cido actico: metanol (1+9).
Solucin deshidratante:
Metanol puro.
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Glicerol...........................1 ml
Tcnica
1. Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos.
2. Eliminar el exceso de lquido secando entre 2 papeles de filtro (suavemente).
3. Extender las tiras sobre el puente de la cmara electrofortica. La superficie penetrable
tiene que ir dirigida hacia arriba. La tira debe estar bien tiesa y plana. Operar
rpidamente para evitar evaporaciones.
4. Sembrar las muestras: hemolizado obtenido siguiendo la tcnica expuesta en el presente
trabajo.
5. Conectar la fuente de poder, realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts,
durante 60 minutos.
6. Desconectar la corriente y retirar las tiras.
7. Colorear durante 5 minutos.
8. Decolorar de la siguiente manera:
- 5 minutos en AcH al 5%.
- 5 minutos en AcH al 5%.
- 5 minutos en AcH: metanol (1+9).
9. Determinacin cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de
ensayo conteniendo la solucin disolvente y agitar. Leer a 630 nm. si se us colorante
Amido Schwartz.
10. Transparentizacin: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro
durante 30 segundos, a continuacin se las coloca en la solucin transparentizadora
durante 1 minuto como mnimo. Se colocan luego en una placa de vidrio, eliminando
cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos
minutos, hasta la transparencia completa. As se conserva para leer en densitometra.
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TIPO Polo negativo Polo positivo ACLARACIONES
Normal HbA 98%
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TRABAJO PRCTICO N 8:
CITOQUMICA -MEDULOGRAMA
En el laboratorio de hematologa, la citoqumica constituye un elemento de capital importancia
y un complemento indispensable al la observacin morfolgica convencional para la
identificacin de las estirpes celulares. La citoqumica estudia la composicin qumica de la
clula y permite detectar la localizacin topogrfica de algunos principios inmediatos, enzimas,
metales pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de unin entre la morfologa y la
bioqumica
En este trabajo se describirn las tcnicas citoqumicas aplicadas con mayor frecuencia en la
Hematologa tradicional.
TECNICAS CITOQUIMICAS:
METODO
1. Fijar los frotis en metanol o etanol al 80% durante 10-20 minutos.
2. Dejarlos secar a temperatura ambiente.
3. Preparar en el momento la solucin compuesta por partes iguales de ferrocianuro
de potasio (20gr/L) y HCl 0,2M.
4. Dejar actuar dicha solucin durante 10 minutos.
5. Lavar con agua de canilla durante 20 minutos.
6. Enjuagar con agua destilada.
7. Contracolorear con Hematoxilina durante 1-2 minutos.
8. Dejar secar y luego observar en microscopio ptico.
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Tincin de Perls en Anemia Sideroblstica Refractaria
DESARROLLO
1. Extendidos de sangre secos de no ms de una hora de obtencin, se fijan durante 5 minutos
en el alcohol etlico al 80%
2. Lavado rpido con agua y secado.
3. Inmersin en una cpsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a
37C un mnimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rpidamente en agua
comn y secar en posicin vertical.
4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solucin de eosina. Lavar con agua y secar.
RESULTADOS
Los hemates con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen
hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacas y aparecen como sombras.
El anlisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hemates coloreados e
incoloros.
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Hematies con Hemoglobina Fetal
PEROXIDASAS (MIELOPEROXIDASA)
Fundamento
Mtodo de Washburn: frente al agregado de agua oxigenada, aquellas organelas que poseen la
enzima desprenden oxgeno naciente del agua oxigenada y este oxida la bencidina a un xido
intermedio color azul oscuro al principio que luego vira al negro.
Reactivos
1. Colorante (conservar en heladera y oscuridad)
Bencidina 300 mg
Solucin saturada de nitroprusiato de Na 1 ml
Alcohol etlico absoluto 99 ml
2. Solucin H2O2-AcH
H2O2 (10 vol.) 2 gotas
H2O destilada 50 ml
AcH puro 1 gota
Preparar en el momento.
Procedimiento
1. Fijar el extendido con metanol o etanol 80% durante 5 minutos.
2. Impregnar el extendido con la solucin 1 durante 3 minutos.
3. Volcar sobre la misma solucin anterior la solucin 2, dejar actuar durante 2 minutos.
4. Pasado el tiempo tomar el extendido con alguna pinza, lavarlo y dejarlo verticalmente hasta
que se seque.
5. Contracolorear con una solucin de Giemsa diluido 1/10 durante 20 minutos.
6. Observar al microscopio ptico con aceite de inmersin.
Resultados
Positivo: citoplasma cubierto de color negro en aquellas clulas que poseen la enzima.
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Reaccin de Peroxidasa (+) en precursor mieloide
INDICACIONES
La BMO est indicada en todas las enfermedades que puedan afectarla, ya sea en forma
primaria o secundaria. La indicacin hematolgica ms frecuente corresponde a la disminucin
de elementos formes de la sangre perifrica, las citopenias, leucopenia, anemia y
trombocitopenia, ya sea en forma aislada o de las tres series (pancitopenia). Las citopenias
perifricas pueden deberse a: 1) produccin insuficiente de clulas en la MO; 2) incremento en
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su utilizacin perifrica, por destruccin o por prdida, sin una adecuada produccin
compensadora en la MO; 3) una combinacin de estas causas.
El aspirdo de MO se utiliza frecuentemente para el diagnstico de procesos proliferetivos ya sea
para la observacin microscpica como para la inmunomarcacin y posterior identificacin por
citometra de flujo.
Las especialidades mdicas que con mayor frecuencia solicitan la BMO corresponden a
hematologa, oncologa, infectologa y medicina interna.
Las indicaciones de la BMO se agrupan en Cuadro 1.
Cuadro 1: Indicaciones de BMO
- En pacientes con citopenias no explicadas previamente por los estudios
hematolgicos (incluye la evaluacin de procesos mielodisplsicos)
- En la sospecha de infiltracin de neoplasia con diagnstico previo desconocido
- Para la estadificacin oncolgica de tumores con diagnstico previo confirmado:
linfomas, otros tumores slidos como neuroblastoma, rabdomiosarcoma, etc.
- Para conocer la respuesta al tratamiento de algunas neoplasias: remisin, recada,
etc.
- Evaluacin de la mdula sea antes del trasplante de clulas progenitoras
- En el estudio de pacientes con fiebre de origen desconocido: sospecha de agentes
infecciosos com o histoplasmosis, tuberculosis.
- En la evaluacin de pacientes con enfermedad metablica por depsito de
material anormal
CONTRAINDICACIONES
No existe una contraindicacin absoluta para la BMO. Se debe tener controlado al paciente con
tendencia a sangrar y conocer el tipo de tratamiento que puede ocasionar hemorragias: aspirina
o anticoagulantes.
COMPLICACIONES
En general la BMO es un procedimiento relativamente bien tolerado y con bajo riesgo de
morbilidad. Las complicaciones de la toma de BMO son raras; corresponden a 0.08%,
generalmente debido a sangrados que pueden ocasionar hematomas. Otras complicaciones ms
serias son an menos frecuentes, como la neuropata transitoria, una infeccin de la herida y
osteomielitis, reaccin a medicamentos, as como dolor persistente. El riesgo de sangrado puede
ser mayor en pacientes con trombocitopenia y alteraciones de la funcin plaquetaria; ellos deben
tenerse en observacin en el hospital por 24 horas despus del procedimiento. La siembra de
clulas malignas puede ocurrir excepcionalmente en pacientes con metstasis diseminadas.
TECNICA
La BMO se debe realizar exclusivamente por personal capacitado y con experiencia en la
tcnica. La BMO se puede tomar en forma uni o bilateral, generalmente de la cresta ilaca
posterosuperior. Para el estudio de enfermedades hematolgicas, un fragmento es suficiente.
Para el estudio de las neoplasias malignas, frecuentemente se toman biopsias de dos sitios
diferentes: una de cada cresta ilaca.
El sitio de donde se obtiene la biopsia debe ser de fcil acceso, con mnimo trauma y sin peligro
para el paciente. En nios muy pequeos o en pacientes no cooperadores, la biopsia se toma
bajo anestesia general. En lesiones seas precisas es importante la gua con estudios de imagen.
La aguja para biopsia que ms se usa, especialmente por los hematlogos, es la de 11 a 8 gauge,
que obtiene una biopsia de 2 mm de dimetro, con una longitud de 1 a 2 cm, de acuerdo con la
profundidad a la que se introduce la aguja.
El aspirado de MO debe efectuarse despus de haber tomado la biopsia del tejido, colocando la
aguja a 1 cm de esa zona; se hacen los frotis, y el material restante se puede colocar en tubos
con anticoagulante para estudio con citometra de flujo, para estudios citogenticos, etc.
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Los cortes histolgicos no deben exceder 4 micras de espesor. Las tinciones iniciales ms
usadas son hematoxilina y eosina, cido peridico de Schiff (PAS), Giemsa, tincin para fibras
reticulares (Sweet) y para hierro (Perls).
Se realizarn estudios adicionales con imunohistoqumica, si son necesarios, sobre todo para el
diagnstico diferencial de neoplasias.
INTERPRETACIN
Histologa normal
En condiciones normales el tejido hematopoytico en los espacios medulares tiene una
distribucin y topografa especiales: los grupos de clulas eritropoyticas, los megacariocitos y
las formas maduras de la serie granuloctica, se localizan en sinusoides del centro del espacio
medular, mientras que los precursores mieloides tempranos se localizan con relacin a la
superficie endosteal de las trabculas seas y en la vecindad de las arteriolas. Por lo tanto, las
variaciones espaciales de las diferentes series son importantes en la interpretacin. Las clulas
madre no se identifican por la morfologa tradicional en los aspirados de MO, aunque recuerdan
a las clulas linfoides pequeas. Las clulas madre se identifican por su funcin y por el
inmunofenotipo que incluye la expresin de CD34, c-kit y Thy1, y estn localizadas en la regin
endosteal de la MO.
Celularidad. La celularidad en la MO corresponde a la proporcin entre las clulas
hemopoyticas y el tejido adiposo, que vara segn la edad del paciente, es casi del 100% en
recin nacidos y disminuye aproximadamente 10% conforme avanza cada dcada de la vida
(Cuadro 2).
En los recin nacidos a trmino hay predominio de los precursores mieloides, que ocupan dos
terceras partes de la celularidad, y disminuyen a un tercio al mes de edad. Los linfocitos en
recin nacidos ocupan un 15%, y aumentan hasta 50% al mes de edad, lo que se prolonga hasta
los 18 meses.
Relacin mieloide:eritroide (RM:E). Se refiere a la proporcin relativa entre el componente
granuloctico y el eritroide; el resto de los componentes de la mdula sea (megacariocitos,
linfocitos, clulas plasmticas) no se toman en cuenta en esta relacin.
En la primera semana de vida hasta el 70% de las clulas corresponde a la serie eritroide,
principalmente proeritroblastos y eritroblastos basfilos, por lo que la RM:E en esta etapa de la
vida est invertida, y es de 1:2.
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granuloctica tiene citoplasma PAS positivo difuso. La IHQ con anticuerpos anti-
mieloperoxidasa y anti-glucoforina, identifica con mayor precisin los dos componentes.
ISLOTE ERITROBLSTICO
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Clulas cebadas. Generalmente se encuentran adyacentes a las clulas endoteliales de
sinusoides, bordeando la superficie endosteal de las trabculas seas, en el periostio y
adyacentes a la pared de pequeas arterias; aparentemente se originan del mismo precursor de
los granulocitos basfilos. Se caracterizan por tener ncleo redondo u oval con grnulos
citoplsmicos basfilos, que son rojos con la tincin de Giemsa y positivos con CD117 por
IHQ. Puede aumentar su nmero en algunos procesos infecciosos y por efecto de
medicamentos.
Monocitos/macrfagos y clulas dendrticas. Estas clulas tienen una progenitora comn que
comparten con los granulocitos, y en condiciones normales generalmente son invisibles. Los
monocitos llegan de la circulacin a la MO, son menos del 5% del total de las clulas, y
maduran hacia macrfagos/histiocitos. Los macrfagos tisulares tienen ncleo redondo con
nuclolo de tamao variable y citoplasma abundante que frecuentemente muestra elementos
celulares fagocitados (eritrocitos, fragmentos nucleares, hemosiderina), y son responsables de la
fragmentacin de eritrocitos viejos y del almacenamiento de hierro. Son positivas con CD68 y
para CD163 con IHQ. En estas clulas se encuentra el material de depsito anormal de las
enfermedades metablicas por almacenamiento.
Las clulas dendrticas son escasas en la MO; se pueden identificar con IHQ porque son
positivas con protena S-100 y CD1a.
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precursores B. Esto las distingue de las clulas de la LAL-pre-B, ya que stas carecen de
maduracin, y adems pueden presentar expresiones aberrantes de antgenos asociados con
diferenciacin mieloide. El conocimiento de este hallazgo es pertinente para la interpretacin
adecuada de la BMO en los diferentes grupos de edad. Hay que destacar que las hematogonias
no se encuentran en sangre perifrica.
Estroma. Proporciona el sostn del tejido hematopoytico, constitudo por clulas adiposas,
fibroblastos y sus prolongaciones; por la extensa red de vasos sanguneos, incluyendo
sinusoides y por los nervios acompaantes. Las fibras reticulares normalmente slo se localizan
alrededor de los vasos con muy ocasionales fibras en las celdillas, que se visualizan con
tinciones de Gomori o de Gordon-Sweet..
Todo esto constituye el microambiente de la MO, con una estrecha relacin entre todos los
elementos mesenquimatosos y la hemopoyesis. Las molculas de adhesin son las responsables
de que las clulas madre permanezcan en el estroma. Las clulas adiposas ocupan una tercera
parte del volumen de la MO.
RESUMIENDO:
PROGENIE % RELATIVOS
ERITROIDE
Proeritroblastos 0,5 7,5 %
Eritroblastos basfilos
Eritroblastos policromatfilos 7 40 %
y ortocromticos
MIELOIDE
Mieloblastos 0,5 5 %
Promielocitos 0 7,5%
Mielocitos 5 25 %
Metamielocitos 5 20 %
Cayados 5 25 %
Segmentados 0,5 15 %
Eosinfilos 17%
Basfilos 01%
LINFOIDE
Linfoblastos 0,5 4 %
Linfocitos 2,5 15 %
Clulas plasmticas 0,5 3%
MONOCITOS y su 0,5 3%
progenie
MEGACARIOCITOS 0,5 2 % (AUMENTO 40 X)
Artificios en mdula sea. Pueden ocurrir debido a una tcnica inadecuada, a un error en la
toma de la muestra, o por artificios en la preparacin histopatolgica. La deplecin de la
celularidad acompaada de hemorragia se puede presentar cuando se realiza primero el aspirado
y posteriormente se efecta en el mismo sitio la biopsia de MO.
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CITOPENIAS
Citopenia de megacariocitos
Los mecanismos de trombocitopenia pueden corresponder a: 1) defecto en la produccin, donde
la BMO muestra disminucin de megacariocitos; 2) prdida o utilizacin acelerada como en la
coagulacin intravascular diseminada, el sndrome urmico hemoltico, la septicemia, o los
procesos autoinmunes; 3) distribucin anormal, particularmente en esplenomegalia. Al igual
que otras citopenias, tambin se divide en trombocitopenia primaria y adquirida.
Las trombocitopenias primarias incluyen las congnitas, como el sndrome de Tar en el que se
reduce el nmero de megacariocitos, y las constitucionales, donde la MO es celular con
ausencia virtual de megacariocitos; algo semejante se ve en trombocitopenias, en el sndrome de
Wiskott-Aldrich y sus variantes.
Las trombocitopenias adquiridas frecuentemente se deben a procesos infecciosos o txicos, a
infiltracin neoplsica, en sndrome urmico hemoltico, en procesos autoinmunes como la
prpura trombocitopnica idioptica donde hay anticuerpos con IgG contra los antgenos de las
plaquetas. Sin embargo, en estos casos la MO muestra megacariocitos normales en la fase
aguda, y elevada en nmero en la fase crnica.
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MO
HIPOCELULAR MO NORMAL
HIPERPLASIA DE MO
MO HIPERBLSICA MO HIPERPLSICA
ALTERACIONES DE LA MADURACIN
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Sndromes mielodisplsicos. La MO muestra un aumento en la proliferacin de las clulas
germinales con alteracin en la maduracin (displasia), hemopoyesis defectuosa de una o ms
lneas celulares con incremento en la apoptosis, lo que causa discrepancia entre la
hipercelularidad de la MO y las citopenias perifricas. En algunos casos la proliferacin
sobrepasa a la apoptosis y entonces la hipercelularidad de la MO puede coexistir con elevacin
de la cuenta de las clulas perifricas. Estos casos se pueden confundir fcilmente con
desrdenes mieloproliferativos y se designan como sndrome mielodisplsico/mieloproliferativo
mixto.
Los SMP son muy raros en nios: 4 por 1000000. Aproximadamente una tercera parte de los
nios con SMD tienen un trastorno gentico predisponerte, como alteraciones cromosmicas,
inmunodeficiencias primarias o deficiencia en la reparacin del ADN.
Es importante mencionar que la BMO puede mostrar cambios de tipo
mielodispoyticos/mielodisplsicos (MD), que morfolgicamente pueden ser indistinguibles del
SMD, pero clnicamente pueden corresponder a causas exgenas como deficiencias vitamnicas
o de hierro, neoplasias malignas (tumores slidos), infecciones, reaccin txica a
medicamentos, alteraciones autoinmunes, cambios regenerativos transitorios secundarios a
quimioterapia, a radioterapia o ambas, as como en hemopoyesis residual en las etapas
intermedias entre desordenes linfoproliferativos y linfomas.
La morfologa que muestra la BMO en el SMD generalmente es de hipercelularidad con
maduracin inadecuada cuando menos en dos de las tres series: frecuentemente cambios
megaloblsticos en la serie roja, hiperplasia de los precursores de la serie blanca con ausencia de
maduracin a polimorfonucleares e hiperplasia de megacariocitos, que pueden estar
hipolobulados o ser pequeos, generalmente agrupados; se acompaa de localizacin anormal
de los precursores inmaduros. Se ha relacionado el incremento de clulas de fenotipo blstico a
mal pronstico en pacientes con SMD. Frecuentemente se encuentran grados variables de
fibrosis reticulnica y puede haber hemosiderina. En algunos casos las BMO repetidas pueden
mostrar incremento de blastos o bien leucemia mieloide aguda. fibrosis no es comn en EMPT,
pero muy frecuente en LAM M7. Aparentemente esta mielopoyesis anormal no predispone a
otro tipo de leucemia linfoide (Cuadro 8).
Lesiones infiltrativas mieloides: Es poco frecuente que se tome BMO para el diagnstico de
LAM, ya que generalmente bastan los estudios hematolgicos. En ocasiones se realiza porque
los aspirados no son suficientes en celularidad, o porque la cuenta de blastos no rebasa 30%,
sobre todo en el diagnstico diferencial con sndrome mielodisplsico. El diagnstico
morfolgico de LAM se sospecha en una MO con celularidad del 100% con clulas montonas
de citoplasma eosinfilo y ncleo con cromatina irregular y nuclolo prominente. La IHQ es
importante para corroborar la inmadurez homognea de las clulas mieloides con
mieloperoxidasa, CD34 y CD117 positivos, acompaados de fibrosis reticulnica Grado II a III.
Histiocitosis: Las histiocitosis que pueden infiltrar la mdula sea son de dos tipos:
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1) Histiocitosis de clulas de Langerhans (HCL). Es una enfermedad clonal de clulas
dendrticas epiteliales. La ms frecuente es en nios, usualmente se observa en las dos primeras
dcadas de la vida y puede ser una enfermedad generalizada o localizada (hueso). La forma
diseminada se caracteriza por lesiones en MO, huesos, hgado, bazo, ganglios linfticos y otras
vsceras; frecuentemente tiene curso clnico agresivo.
La BMO muestra grupos intersticiales o lminas de histiocitos con citoplasma eosinfilo y
ncleo con hendiduras, pueden formar clulas gigantes multinucleadas y estn mezclados con
un nmero variable de eosinfilos y linfocitos. Tambin se puede encontrar fibrosis y
hematopoyesis displsica, acompaada de hemofagocitosis que puede ser muy notable. Algunos
casos de HCL pueden presentarse como sndromes hemofagocticos. La IHQ corrobora la
presencia de clulas de Langerhans con positividad para S-100 y CD1a.
2) Histiocitosis hemofagoctica. Es frecuente en nios. Se caracteriza por incremento de
histiocitos que contienen elementos hemopoyticos fagocitados. El sndrome hemofagoctico es
una enfermedad grave en el que la proliferacin de histiocitos ocurre en respuesta a una
estimulacin variada de citoquinas. Los pacientes presentan fiebre, hepatoesplenomegalia,
citopenias (anemia 80%; neutropenia, trombocitopenia o las dos 50%), incremento de
triglicridos e hipofibrinogenemia
Procesos infecciosos
Son mltiples los microorganismos que pueden alterar la MO; sin embargo, la BMO slo est
indicada en pacientes con fiebre en estudio en quienes mltiples estudios con cultivos,
serolgicos y de imagen, no han identificado la etiologa. Algunos de estos pacientes pueden
tener inmunodeficiencia primaria o secundaria (post-tratamiento de neoplasias o de
enfermedades autoinmunes, SIDA), causante de una pobre respuesta inmune. Los grmenes que
frecuentemente se buscan en la MO son micobacterias y micosis, principalmente
histoplasmosis.
El parvovirus 19 puede ocasionar cuadros de anemia con reticulocitopenia por infeccin de los
precursores eritroides y la MO muestra hipoplasia de la serie eritroide con pronormoblastos
gigantes e inclusiones intranucleares que le dan aspecto de vidrio esmerilado con halo
perinuclear.
72
TRABAJO PRCTICO N 9:
BLASTOS MIELOIDES
Aproximadamente un tercio de las LMA presentan bastones de Auer: inclusiones
citoplasmticas, que representan aglomeraciones de grnulos azurfilos.
Los cuerpos de Auer contienen peroxidasa, enzimas lisosomales e inclusiones cristalinas.
Cuando estn presentes, son encontradas tpicamente en solo 1 a 10% de los blastos.
Se ven predominantemente en granulocitos inmaduros y solo raramente en monocitos
inmaduros. Los promieloctos malignos pueden contener mltiples bastones de Auer agrupados
en paquete, recibiendo estas clulas el nombre de clulas de faggot y las inclusiones del mismo
Sultan bodies.
BASTON DE AUER
73
La primera, creada en 1976 por el Grupo Franco-Amrico-Britnico (FAB) se basa en la
descripcin morfolgica de las clulas neoplsicas comparndolas con los precursores
hematopoyticos normales.
Esta clasificacin (si bien ha sido superada por la clasificacin de la OMS que incluye
citogentica, inmunofenotipo, etc.) ser la mas importante en la prctica de rutina, ya que, como
bioqumicos, en un laboratorio clnico o de urgencias, jugamos un rol relevante en la deteccin
del paciente con leucemia, para lo cual la morfologa y algn signo clnico que aporte el mdico
en la solicitud de anlisis, sern la nica herramienta con que contamos en ese momento.
74
Las clulas caractersticas conteniendo manojos de cuerpos de Auer ("faggots"), azarosamente
esparcidos por el citoplasma, estn invariablemente presentes en MO y a veces en SP. El
citoplasma de las clulas que contienen faggots es frecuentemente claro o est plidamente
teido, pero puede tambin contener grnulos azurfilos.
La mayora de los casos de M3 cumple esta descripcin, pero existe una forma atpica
caracterizada por una minima granulacin denominada "M3 Variante". Su caracterstica
citomorfolgica ms saliente se relaciona a la configuracin nuclear y a la aparicin escasa de
clulas con densa granulacin y de clulas conteniendo mltiples bastones de Auer. El ncleo
de casi todas las clulas en SP es bilobulado, multilobulado o reniforme, pero la mayora de las
clulas estn desprovistas de grnulos o contienen unos pocos finos grnulos azurfilos. Sin
embargo, estn presentes algunas clulas con caracterstica de la tpica M3. La morfologa
atpica es propia de clulas en SP. En MO la morfologa es semejante a la de M3 tpica.
75
debido a que aproximadamente 20 % al 30 % de los blastos presentan 3 veces o mas el tamao
de un linfocito normal.
A veces, las clulas en MO o SP pueden tener mamelones, o se ve un ncleo desnudo con
grupos de plaquetas alrededor.
Los blastos son Sudan Black o MPO negativos. Puede ocurrir confusin con monocitos dado
que la alfa naftil acetato esterasa o la naftil AS-D acetato esterasa da reaccin positiva y la
reaccin puede ser inhibida significativamente con fluoruro.
Sin embargo los megacariocitos son casi siempre negativos a la alfa naftol butirato esterasa (lo
que los diferencia de los monocitos). Adems, los megacarioblastos frecuentemente tienen una
positividad localizada y distintiva con la alfa naftil acetato esterasa en contraste con una tincin
citoplasmtica ms difusa en los monocitos.
La reaccin de PAS o fosfatasa acida son tambin frecuentemente positivas con un modelo
caracterstico.
Dada su importancia, este aspecto fue reconocido por la OMS, creando as, los grupos:
- Grupo I: LMA con Anormalidades Genticas Recurrentes que incluye,
como se menciono anteriormente, subgrupos genticos especficos.
- Grupo II: La LMA que comparte anormalidades citogenticas y otras caractersticas clnicas
y biolgicas con el SMD fue clasificada como LMA con Displasia Multilinaje (DML). La
OMS sugiere que el principal determinante para el diagnstico de este tipo LMA sea la
evidencia o historia de SMD o de neoplasia mielodisplsica/mieloproliferativa (SMD/NMP) de
seis meses de evolucin.
En la nueva clasificacin, el diagnostico de LMA con DML sin antecedentes de SMD o
SMD/NMP se hace cuando los blastos alcanzan el 20% en el aspirado de MO y cuando el 50%
o mas de las clulas en dos o mas lneas mieloides son displsicas en una muestra previa al
tratamiento.
- Grupo III: Los casos inducidos por la exposicin a terapias antineoplsicas (agentes
alquilantes, radiaciones e inhibidores de la Topoisomerasa II) son incluidos en LMA Y SMD
relacionados con terapias previas. Los alquilantes y la radiacin inducen aberraciones
citogenticas cuatro a siete anos despus de la exposicin mientras que para el tratamiento con
inhibidores de la Topoisomerasa II el periodo es entre uno a tres aos.
- Grupo IV: Las LMA que no cumplen los criterios de los anteriores grupos conforman el
LMA no clasificable de otra forma cuyos subtipos no difieren mucho de su correspondiente
en la clasificacin FAB incluyendo adems la leucemia basoflica aguda, panmielosis aguda con
mielofibrosis y sarcoma mieloide.
76
Clasificacin de la OMS para la LMA
LMA con anomalas genticas recidivantes
LMA con t(8;21)(q22;q22), RUNX1-RUNX1T1(CBFA/ETO).
LMA con inv(16)(p13q22) o t(16;16)(p13;q22), CBFB-MYH11.
Leucemia promieloctica aguda con t(15;17)(q22;q11-12), PML-RARA.
LMA con t(9;11)(p22;q23), MLLT3-MLL.
LMA con t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214.
LMA con inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2), RPN1-EVI1.
LMA (megacarioblstica) con t(1;22)(p13;q13), RBM15-MKL1.
LMA con NPM1 mutado.
LMA con CEBPA mutado.
LMA con caractersticas relacionadas con la mielodisplasia
Neoplasia mieloide relacionado a terapia
LMA no especificada de otra manera
LMA con diferenciacin minima.
LMA sin maduracin.
LMA con maduracin.
Leucemia aguda mielomonoctica.
Leucemia monoblstica y monocticas aguda.
Leucemia eritroide aguda.
Leucemia megacarioblstica aguda.
Leucemia basoflica aguda.
Panmielosis aguda con mielofibrosis.
Sarcoma mieloide.
Proliferaciones mieloides relacionadas con el sndrome de Down:
Mielopoyesis anormal transitoria.
Leucemia mieloide relacionada con el sndrome de Down.
Neoplasma celular dendrtico plasmocitoide blstico
INMUNOFENOTIPO MS RELEVANTE
M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7
CD13 CD 13 CD 13 CD 13 CD 13 CD 13 Gly A CD 61
CD 33 CD33 CD 33 CD 33 CD 33 CD 33 CD CD 41
CD CD 11 b CD 11 HLA DR CD 14 CD 14 71 CD 13 y
14- CD 65 b CD 14 CD 15 HLA DR + CD 33 +/-
+/- CD 15 HLA DR CD 65 36
+++
77
LMA M0 LMA M1
LMA M2 LMA M3
LMA M3 V LMA M4
LMA M5 LMA M6
78
LMA M7
79
TRABAJO PRCTICO N 10
1- Generalidades
2- Epidemiologa
3- Etiopatogenia
80
linfoide, momento en el que los precursores linfoides tienen mayor riesgo de presentar
mutaciones espontneas debido a la alta tasa de proliferacin de estas clulas y al
reordenamiento gentico que se lleva a cabo en ese proceso.
La acumulacin de estos linfoblastos en la MO y en diversos rganos provoca las
manifestaciones clnicas de las LLA.
Se han identificado pocos factores que estn relacionados con un aumento en el riesgo de LLA.
Los factores de riesgo no genticos primarios aceptados son la exposicin prenatal a los rayos X
y la exposicin postnatal a dosis altas de radiacin.
Se han identificado mltiples translocaciones cromosmicas en las LLA. Existe un mayor riesgo
de desarrollar leucemia aguda en pacientes con sndrome de Down (hasta 15 veces ms que en
la poblacin normal), de Schwachman, Klinefelter, neurofibromatosis y en sndromes
caracterizados por fragilidad cromosmica como la ataxia-telangiectasia, sndrome de Bloom o
la anemia de Fanconi. La frecuencia de LLA es mayor entre familiares de pacientes afectados.
Estos pacientes representan una minora de casos de LLA.
Sndrome de Down. Los nios con sndrome de Down muestran un aumento en el riesgo de
presentar LLA y leucemia mieloide aguda, con un riesgo acumulativo de presentar leucemia de
aproximadamente 2,1% a la edad de 5 aos y 2,7% a la edad de 30 aos.
Aproximadamente de la mitad a dos tercios de los casos de LA en nios con sndrome de Down
son LLA.
Los pacientes con LLA y sndrome de Down tienen una incidencia ms baja de hallazgos
citogenticos, tanto de pronstico favorable como desfavorable, y una incidencia menor de
fenotipo de clulas T. Aproximadamente un 20% de los casos de LLA que surgen en los nios
con sndrome de Down presentan mutaciones JAK2 somticamente adquiridas. Mientras que la
vasta mayora de casos de LMA en los nios con sndrome de Down se presentan antes de los
cuatro aos de edad (mediana de edad, un ao), la LLA tiene una distribucin de edad similar a
la de los nios con LLA sin sndrome de Down, con una mediana de edad de 3 a 4 aos.
Los factores que se han asociado claramente a un mayor riesgo de presentar LLA son el sexo
masculino, la edad entre 2 y 5 aos, la raza caucsica, la exposicin intratero a radiaciones
ionizantes y la exposicin posnatal a la radiacin causada por bombas atmicas o tratamientos
con radioterapia. No se ha comprobado asociacin clara entre el riesgo de desarrollar LLA y los
campos electromagnticos de baja frecuencia o la exposicin al radn. En los ltimos aos se ha
dado mucha importancia a la posible etiologa viral en las LLA. La nica asociacin clara
descripta en pacientes peditricos hasta ahora ha sido el virus de Epstein-Barr en el linfoma tipo
Burkitt y algunos tipos de linfoma de Hodgkin.
4- Clasificacin Morfolgica
Los criterios morfolgicos se basan en la definicin del Grupo FAB (de French- American
British).
El grupo FAB reconoce tres variedades morfolgicas de LLA: L1, L2 y L3.
El subtipo morfolgico L1 es el ms comn (85%), le sigue el subtipo L2 (14%), y el L3 (1%).
En la actualidad solo tiene un valor relativo debido a que los subtipos L1 y 2 no definen a un
subtipo biolgicamente relevante, y su valor pronstico es muy limitado.
Rasgos citolgicos L1 L2 L3
81
Nucleolos No visibles o pequeos Uno o mas Uno o mas
1-LINFOBLASTOS LINFOBLASTOS
2-LINFOCITOS
Los linfoblastos L1 son clulas pequeas caracterizadas por una elevada relacin
ncleo/citoplasma (N:C). El citoplasma es azul plido y escaso, y esta limitado a una pequea
porcin del borde celular. Las clulas tienen nucleolo indistinto y la membrana nuclear varia de
redonda a clivada.
Los linfoblastos L2 son mayores, frecuentemente son una poblacin ms heterognea, con
menor relacin N:C. El nucleolo prominente (frecuentemente con condensacin de cromatina
perinuclear). La membrana nuclear puede ser irregular o reniforme.
Los linfoblastos L3 son un grupo heterogneo de clulas, caracterizado por una profunda
basofilia citoplasmtica y prominente vacuolizacin citoplasmtica.
La LLA no esta tpicamente asociada con la presencia de grnulos azurfilos, que son una figura
mucho mas comn de las LMA. Sin embargo, la LLA granular es un fenmeno morfolgico
que debe ser reconocido y no debe ser confundido con LMA. Este error puede ocurrir
particularmente si existe una granulacin densa en conjuncin con la morfologa FAB L2. Los
estudios inmunolgicos y citoqumicos corroborarn el diagnstico correcto. La variante
granular ocurre en aproximadamente 7% de nios con LLA.
La vacuolizacin citoplasmtica es una caracterstica de la categora FAB L3 donde est
asociada con un gran tamao celular e intensa basofilia citoplasmtica. Sin embargo, tales
vacuolas no son exclusivas de la variante L3. Generalmente menores y mas escasas, se las
puede encontrar en clulas de una minora de nios con LLA L1 y L2. Los blastos vacuolados
de la LLA peditrica suelen ser PAS positivos y son mas comnmente encontrados en pacientes
de 3 a 7 aos de edad con bajos recuentos leucocitarios y positividad al CD 10.
El sistema de escarificacin propuesto enfatiza la importancia de la elevada relacin N:C y
ausencia de nucleolo para L1 y la baja relacin N:C, nucleolo prominente, irregularidades
de membrana groseras y gran tamao del blasto para la L2
Por otra parte el subtipo L3, que se reconoce inmunofenotpicamente como LLA B, se considera
como la fase leucmica del linfoma de Burkitt.
82
5- Citoqumica
6- Clasificacin Inmunolgica
LLA estirpe T
CD3 citoplasmtico +. La mayora Tdt +, HLA-DR + y CD34 -
ProT : CD7 +
PreT : CD2 + y/o CD5 + y/o CD8 +
T intermedia : CD1a +
T madura: CD3 + en membrana.
Aproximadamente tres cuartos de los pacientes con LLA de clulas precursoras B, tienen
83
inmunofenotipo de la clula precursora B comn y cuentan con el mejor pronostico.
Aproximadamente 5% de los pacientes tienen el inmunofenotipo de precursor pro-B. Este
fenotipo es el ms frecuente en nios jvenes y con frecuencia se relaciona con un t(4;11).
Las clulas leucmicas de pacientes con LLA PRE-B, contienen Igc y el 25% de los pacientes
con LLA PRE-B, tienen t(1;19).
Aproximadamente el 2% de los pacientes presentan leucemia de clulas B (expresin Ig de
superficie, generalmente con morfologa FAB L3 y desplazamiento del gen C-MYC) tambin se
llama leucemia de Burkitt. Su tratamiento es completamente diferente del de otras formas de
LLA infantil.
8- Presentacin clnica
84
La duracin de los sntomas en nios con LLA puede variar de das a meses. Los primeros
sntomas son generalmente no-especficos e incluyen, anorexia, irritabilidad y letargia. La fiebre
es el hallazgo ms comn, y ocurre en aproximadamente 60% de los pacientes. Progresivamente
el fallo medular conduce a palidez (anemia), sangrado (trombocitopenia) y susceptibilidad a las
infecciones (neutropenia).
La linfadenopata (generalmente indolora, localizada o generalizada) debido a infiltracin
leucmica es tambin un signo frecuente.
Los pacientes con LLA de estirpe T, generalmente de mayor edad, presentan manifestaciones
clnicas caractersticas, como mayor frecuencia de masa mediastinal y mayor porcentaje de
afectacin del sistema nervioso central.
La exploracin fsica debe ser exhaustiva y minuciosa, sin olvidar nunca la exploracin de los
testculos en el varn.
9- Diagnstico
La prueba complementaria que mas frecuentemente confirma la sospecha clnica inicial de una
LLA es el hemograma.
En el se puede encontrar leucocitosis en el 50% de los casos, anemia en el 80% y
trombocitopenia menor de 100x109/l en el 75% de los pacientes.
En el examen de la extensin perifrica pueden observarse linfoblastos, aunque en algunas
ocasiones no aparecen.
El diagnstico de una leucemia aguda siempre debe realizarse con el aspirado de MO.
10- Laboratorio
85
11 LLA ACTUALIZACIN
Leucemia/linfoma linfoblstico B
Leucemia/linfoma linfoblstico B, sin otra especificacin
Leucemia/linfoma linfoblstico B con anormalidades genticas recurrentes
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(9;22)(q34;q11.2);BCR-ABL 1
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(v;11q23);reordenamientos MLL
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1
(ETV6-RUNX1)
Leucemia/linfoma linfoblstico B con hiperdiploida
Leucemia/linfoma linfoblstico B con hipodiploida
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(5;14)(q31;q32) IL3-IGH
Leucemia/linfoma linfoblstico B con t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1
Leucemia/linfoma linfoblstico T
12 TRATAMIENTO
Aunque el tratamiento de la LLA debe ser dirigido y especfico para los distintos grupos de
riesgo, el tratamiento en todos ellos comprende las siguientes fases: induccin de la remisin,
tratamiento del sistema nervioso central, intensificacin (consolidacin) y mantenimiento.
- Tratamiento de induccin.
El objetivo inicial de todo tratamiento de una LLA es inducir una remisin completa con una
recuperacin de la hematopoyesis normal. Obtener la remisin completa es la base del
tratamiento de la LLA y un requisito imprescindible para obtener una supervivencia prolongada.
Se define la remisin completa cuando no existe evidencia de leucemia en la exploracin
fsica, en el examen de sangre perifrica ni de MO. La remisin completa incluye tambin la
ausencia de afectacin del sistema nervioso central o de afectacin extramedular.
El tratamiento de induccin incluye necesariamente un glucocorticoide, un alcaloide de la vinca
(vincristina) y por lo menos otro frmaco (antraciclina o asparraginasa). Algunos protocolos que
incluyen un cuarto frmaco como la daunorrubicina han demostrado prolongar la duracin de la
remisin completa incluso en grupos de riesgo alto.
El fracaso de la induccin es un acontecimiento raro que tan solo ocurre en un porcentaje
inferior al 5% de los pacientes peditricos con LLA y determina un pronstico muy
desfavorable.
86
En la fase de consolidacin se administra un tratamiento intensivo inmediatamente despus de
finalizar el tratamiento de induccin, que se ha mostrado muy efectivo sobre todo en los
pacientes de alto riesgo.
La intensificacin retardada o la reinduccin promulgada por el grupo BFM (Berln-Frankfurt-
Munich) es probablemente el rgimen mas utilizado. Consiste en una repeticin del tratamiento
de induccin a los 3 meses de la remisin completa y su beneficio es claro en los pacientes de
riesgo estndar
- Tratamiento de mantenimiento.
Los pacientes con LLA requieren un tratamiento prolongado de mantenimiento.
Con las nuevas y sofisticadas tcnicas de laboratorio los investigadores han comprobado que en
pacientes que estn en aparente remisin completa puede existir enfermedad minima residual
(EMR).
La combinacin de metotrexato administrado semanalmente y 6-mercaptopurina a diario
constituye el tratamiento estndar de mantenimiento en las LLA.
En la actualidad, la norma general es prolongar el tratamiento un total de 2 aos o 2 aos y
medio. Muchos investigadores prefieren ampliarlo a 3 aos en el caso de los varones, por su
peor pronstico comparado con el sexo femenino.
Trasplante hematopoytico.
En las ultimas 2 dcadas los avances en el campo de los trasplantes de
progenitores hematopoyticos han sido notables. Destacan la mejora en la prevencin de la
enfermedad del injerto contra husped, el desarrollo de los bancos de donantes no
emparentados, la disminucin del tiempo de injerto hematopoytico y las mejoras en el
tratamiento de soporte.
Sin embargo, el desarrollo paralelo de la quimioterapia hace que en la actualidad las
indicaciones de trasplante hematopoytico en pacientes en primera remisin sean difciles de
establecer y tan solo se aceptan como claras en los pacientes con cromosoma Ph positivo y en
pacientes que no alcanzan la remisin completa al finalizar el tratamiento de induccin.
87
LLA L1
LLA L2
LLA L3
88
TRABAJO PRCTIVO N 11:
SLPC Y SMPC
SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS B
PRIMARIAMENTE LEUCMICOS
Leucemia linftica crnica (LLC)
Las clulas de la LLC poseen unos rasgos morfolgicos caractersticos. Son de tamao pequeo
o mediano, el ncleo tiene un contorno regular, la cromatina es cuarteada, el nuclolo no es
visible o es muy pequeo y el citoplasma es escaso. En las formas tpicas de LLC, esta
poblacin es la predominante y constituye ms del 80% de linfocitos circulantes; la presencia de
sombras de Grumpecht es comn, especialmente en casos con recuentos linfocitarios elevados.
Existen dos variantes morfolgicas de LLC cuya identificacin tiene importancia desde un
punto de vista clnico y biolgico: la LLC con cifras superiores al 10% de prolinfocitos o
LLC/PL y la LLC atpica en la que una cifra superior al 15% de clulas circulantes posee un
ncleo hendido o rasgos linfoplasmocticos. El reconocimiento de estas dos formas es
importante ya que suelen asociarse a estadios ms avanzados y a enfermedad progresiva con un
mayor ndice de proliferacin. Es probable que esta asociacin clnico-morfolgica tenga su
base en la elevada frecuencia en estas variantes de LLC de trisoma 12 as como de mutaciones
o deleciones del gen supresor de tumores p53, hechos ambos que son infrecuentes en las formas
de LLC tpicas. Tan slo la citologa permite el diagnstico de LLC/PL o LLC atpica ya que el
inmunofenotipo en estas dos variedades suele ser el caracterstico de la LLC. La LLC, como
todo proceso de bajo grado, puede sufrir transformacin a un linfoma de clulas grandes, cuadro
que se reconoce como sndrome de Richter. Aunque ello es ms comn que acontezca en
ganglios linfticos perifricos o se manifieste con masas abdominales y durante el curso
89
evolutivo de la LLC, en algunos pacientes, el sndrome de Richter puede ser la manifestacin
inicial de la enfermedad e incluso manifestarse en forma de leucemia con franca afectacin de
sangre perifrica y mdula sea. En estos pacientes, la observacin de extensiones de sangre
perifrica demuestra la presencia de dos poblaciones celulares, una de clulas pequeas con una
morfologa tpica de LLC y una segunda poblacin de clulas de tamao grande con dimetro
superior a tres glbulos rojos, cromatina reticular, nuclolo prominente y citoplasma basfilo.
Debido a que el perfil inmunolgico de las clulas en el sndrome de Richter es similar al de la
LLC en la mayora de los casos, si slo se considera el inmunofenotipo y se prescinde de la
morfologa, se realizar el diagnstico errneo de "LLC". Por tanto, la citologa en esta
situacin es esencial para el diagnstico. El inmunofenotipo, por otro lado, es de ayuda
especialmente en pacientes en los que el sndrome de Richter se manifiesta en la fase
diagnstica ya que, al ser caracterstico de LLC, nos est indicando que se trata de la
transformacin de una LLC. Existen casos en los que el linfoma de clulas grandes representa
una neoplasia "de novo" que resulta de la expansin clonal de una nueva clona independiente de
la LLC. La citologa no distingue entre estas dos situaciones mientras que los datos
citogenticos y moleculares permiten su distincin.
La LP-B fue inicialmente descrita por Galton y cols. (1974) como una variante de LLC. Si bien,
la LP-B representa una entidad clnico-biolgica definida diferente a la LLC. El examen
morfolgico de las clulas circulantes es esencial para establecer el diagnstico. El prolinfocito
B posee un tamao superior al del linfocito de la LLC; el ncleo es de contorno regular,
cromatina densa pero no cuarteada y posee un nuclolo nico, prominente, vesicular y
generalmente en posicin central. Estas clulas se hallan en sangre perifrica en una proporcin
superior al 55% del total de linfocitos circulantes. En algunos casos, pueden apreciarse formas
bilobuladas que sugieren cierto grado de transformacin. El diagnstico diferencial de la LP-B
se plantea con la LLC/PL, el linfoma de manto y la variante de tricoleucemia. El anlisis
citolgico es el test bsico para el diagnstico de la LP-B ya que el inmunofenotipo, si bien
difiere de la LLC, puede ser similar al de los linfomas B leucemizados incluyendo el del manto,
y al de la variante de tricoleucemia. En un 20% de LP-B se demuestra la presencia de la t (11;
14) (q23; q32) con expresin de ciclina Dl idntica a la documentada en linfomas del manto, de
ah los problemas de diagnstico diferencial entre la LP-B y dicho linfoma en fase leucmica.
La citologa y la histologa del bazo, cuando se dispone de la misma, constituyen tests
diferenciales esenciales.
90
monocitopenia. La morfologa del linfocito circulante podra considerarse intermedia entre el
tricoleucocito y el prolinfocito. El ncleo es redondeado y posee una cromatina ms densa que
la del tricoleucocito y un nuclolo prominente similar al del prolinfocito; por el contrario, el
citoplasma es abundante con vellosidades similares al del tricoleucocito si bien con un grado
mayor de basofilia. El diagnstico diferencial de la variante de tricoleucemia se plantea con la
forma tpica, la leucemia prolinfoctica y el linfoma esplnico de clulas vellosas. La morfologa
y marcadores inmunolgicos son esenciales para distinguir entre la tricoleucemia y su variante
ya que la histologa del bazo y mdula sea son similares en ambos procesos. La morfologa e
histologa del bazo y mdula sea permiten el diagnstico diferencial entre la variante de
tricoleucemia y el linfoma esplnico de clulas vellosas o la leucemia prolinfoctica. La
distincin de estos tres procesos es importante por la diferente conducta teraputica a adoptar.
Este es un proceso muy infrecuente y que se define de forma arbitraria por la presencia de una
cifra superior a 2x109/l de clulas plasmticas en sangre perifrica. Este cuadro debe
diferenciarse de la leucemizacin de un mieloma mltiple, el cual en fases terminales puede
asociarse a la presencia de plasmocitos circulantes. Las manifestaciones clnicas de la leucemia
de clulas plasmticas con alta frecuencia de organomegalia, hipercalcemia y su forma de
presentacin aguda difieren asimismo del mieloma mltiple.
En la leucemia de clulas plasmticas, los elementos circulantes muestran grados variables de
diferenciacin. As pues, los rasgos morfolgicos pueden ser similares a los de clulas
plasmticas maduras aunque en general con un cierto grado de asincronismo o atipa. El ncleo
suele ser excntrico y poseer una cromatina densa aunque formas con cromatina reticular no son
raras; el citoplasma suele ser marcadamente basfilo. En general, la leucemia de clulas
plasmticas no plantea problemas diagnsticos cuando la clula circulante que predomina es la
descrita, si bien hay formas indiferenciadas puramente blsticas en las que los marcadores
inmunolgicos son esenciales para establecer el diagnstico ya que demuestran la presencia de
inmunoglobulina en el citoplasma de los blastos con restriccin clonal y expresin marcada de
cadena ligera y negatividad para muchos de los marcadores pan-B.
Linfoma centrofolicular
Los linfocitos son de tamao muy pequeo, similar al de un glbulo rojo, la cromatina es densa
pero uniforme, no cuarteada y en algunas clulas puede apreciarse una hendidura nuclear muy
estrecha; el citoplasma es apenas visible. En algunos pacientes, junto a estas clulas pequeas,
pueden observarse clulas de tamao superior con citoplasma abundante y un nuclolo
perifrico, es decir, mostrando rasgos morfolgicos de centroblastos. El diagnstico diferencial
del linfoma centrofolicular se plantea con la LLC y ms raramente con el linfoma del manto. Si
bien, la morfologa de los linfocitos es diferente en estos tres procesos, la histologa y/o
citogentica/estudios moleculares son pruebas esenciales para la confirmacin del diagnstico
91
de uno u otro tipo de linfoma mientras que el inmunofenotipo permite distinguir la LLC del
linfoma centrofolicular.
Como su nombre indica, este linfoma se caracteriza por la presencia en sangre perifrica de una
cifra variable de linfocitos con un citoplasma irregular que muestra mltiples vellosidades finas.
La cromatina nuclear es densa e incluso en algunos casos cuarteada como la de los linfocitos de
la LLC y el nuclolo raramente puede observarse al microscopio ptico. A diferencia de la
tricoleucemia o su variante, el citoplasma de las clulas en este linfoma es menos abundante as
como el tamao celular es menor. En algunos pacientes, junto a los linfocitos vellosos, pueden
apreciarse clulas con rasgos de linfoplasmocitos y de hecho, en aproximadamente el 20% de
casos, se documenta una pequea banda monoclonal, generalmente lgG. El diagnstico
diferencial se plantea con la LLC o con los otros procesos que cursan con clulas vellosas,
tricoleucemia y su variante, y ello es importante por cuanto pacientes con un linfoma de clulas
vellosas responden bien a la esplenectoma o bien a la fludarabina mientras que suelen mostrar
resistencia a los agentes alquilantes. Adems de la morfologa, los marcadores inmunolgicos
son importantes para distinguir este linfoma de la LLC y, la histologa del bazo y de la mdula
sea para diferenciarlo de la tricoleucemia y su variante. En un 5% de los casos el linfoma de
clulas vellosas puede sufrir transformacin a un linfoma de clulas grandes, bien a nivel
ganglionar o incluso en sangre perifrica. En tal situacin, se observan clulas pequeas de
citoplasma velloso junto a clulas grandes con ncleo de cromatina reticular y nuclolo
prominente.
Linfoma linfoplasmoctico
Es sta una entidad clnico-biolgica cuya definicin ha sido establecida durante la ltima
dcada. La frecuencia de un cuadro leucmico en este tipo de linfoma, bien al diagnstico o
durante su evolucin, se desconoce, ya que una proporcin substancial de casos se diagnostican
de LLC atpicas. El cuadro morfolgico en sangre perifrica en el linfoma del manto se
caracteriza por su marcado pleomorfismo en lo que se refiere a tamao celular e irregularidad
del contorno nuclear. La clula ms tpica es un linfocito de tamao medio con un ncleo de
cromatina punteada, una o dos hendiduras de corta longitud y visibles al microscopio ptico y
un citoplasma escaso o mediano; el nuclolo no es visible o en caso de visualizarse es pequeo
y no prominente. Actualmente se considera que el linfoma de clulas del manto puede
transformarse a formas blsticas y/o anaplsicas lo que le confiere un peor pronstico a un
linfoma que, de por s, es de difcil manejo clnico por su resistencia a tratamiento o respuesta
corta al mismo. El diagnstico diferencial del linfoma del manto leucemizado se plantea con la
LLC/PL ya que sta suele manifestar un cierto pleomorfismo, la LP-B, especialmente en casos
asociados a la t(11;14) y con otros linfomas leucemizados, en particular el folicular y el
esplnico de clulas vellosas. Adems de la citologa, la histologa es un pilar esencial para el
diagnstico diferencial entre estas entidades y, los marcadores inmunolgicos y la citogentica
92
son asimismo de gran valor siempre que se tenga presente que la t(11;1 4) no es estrictamente
especfica de linfoma de manto.
Linfocitosis B policlonal
Si bien este cuadro no puede considerarse como un SLO, lo describiremos aqu por los
problemas de diagnstico que ofrece con linfomas leucemizados. El grado de linfocitosis en
estos pacientes, que suelen ser mujeres de mediana edad y con una historia marcada de
tabaquismo, no suele ser muy marcado, alrededor de 5 a 10x109/l. Los linfocitos muestran una
morfologa muy peculiar. Estos poseen un tamao grande y citoplasma abundante, un ncleo
hendido o bien bilobulado y algunas clulas poseen nuclolo. Formas con ciertos rasgos
linfoplasmocitoides pueden tambin hallarse presentes. Aunque esta morfologa e incluso la
histologa de mdula sea con presencia de agregados linfoides sugieren un linfoma, el
inmunofenotipo es esencial ya que si bien muestra la naturaleza B de la clula, no evidencia
restriccin clonal. Ello se confirma mediante anlisis de ADN de las cadenas pesada y ligeras de
la inmunoglobulina.
SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS T
PRIMARIAMENTE LEUCMICOS
Es sta una entidad bien definida en cuanto a sus caractersticas clnicas y de laboratorio. Desde
un punto de vista morfolgico, las clulas circulantes corresponden a prolinfocitos. Es decir son
clulas de tamao mediano con un ncleo de cromatina densa y contorno regular o irregular
con un nuclolo nico; el citoplasma muestra irregularidades o protusiones y suele ser
intensamente basfilo. No existen diferencias marcadas entre el prolinfocito B y el T en las
formas de leucemia prolinfoctica T tpica excepto por el hecho de que los prolinfocitos T
poseen un tamao inferior, el ncleo puede mostrar irregularidades en su contorno y el
citoplasma es ms basfilo que el del prolinfocito B. Junto a la forma tpica, existe una variante
de LP-T, designada de clulas pequeas, la cual se caracteriza porque las clulas tienen un
tamao inferior a la forma tpica y el nuclolo solo es visible por microscopa ptica en una
proporcin de clulas si bien se identifica mediante estudios ultraestructurales. Esta variante de
clulas pequeas representa el 20% de casos de LP-T y se ha descrito en la literatura bajo el
trmino de LLC-T, designacin que da lugar a confusin ya que la enfermedad no suele
comportarse como una leucemia crnica sino que tiene un curso agresivo y, por el hecho de que
la designacin LLC-T se haba empleado en las dcadas de los 70 y 80 para describir la
leucemia de linfocitos granulares. Debido a que no existen diferencias entre la forma de LP-T
tpica y la variante de clulas pequeas en cuanto a clnica, marcadores inmunolgicos y
93
citogentica es justificado que se incluya como variante de LP-T ya que ambas, la LP-T tpica y
la variante, representan una nica entidad clnico biolgica. El diagnstico diferencial de la LP-
T se plantea con la LP-B en aquellos casos con morfologa tpica mientras que la variante de
clulas pequeas de LP-T puede errneamente diagnosticarse de LLC. Los marcadores
inmunolgicos permiten la distincin entre la LP-T y LP-B as como de la LP-T con la LLC.
sta representa una entidad definida y tal vez una de las primeras en las que se demostr el
origen T de los linfocitos circulantes. La sangre perifrica se halla afectada en la mayora de los
casos, aunque en unos pocos, la enfermedad se manifiesta en forma tumoral, ej. esplenomegalia,
y la sangre perifrica solo se halla involucrada durante la evolucin clnica y, en especial,
despus de una esplenectoma que, en estos pacientes, suele realizarse con fines diagnsticos.
Las citopenias, particularmente neutropenia y anemia, son comunes. El grado de linfocitosis es
muy variable y generalmente no suele ser muy marcado e inferior a 20x109 /l. El cuadro
morfolgico es homogneo y la clula predominante es un linfocito de tamao mediano o
grande con un ncleo de cromatina madura, generalmente excntrico, de cromatina densa y
nuclolo no visible; el citoplasma es abundante, claro y posee varios grnulos azurfilos, de ah
la denominacin de leucemia de linfocitos granulares. Dicha granulacin contiene enzimas tales
como la fosfatasa cida as como otras citocinas (por ejemplo granzimas) que desarrollan un
papel importante en la funcin citotxica/killer o "natural killer" de estos linfocitos. Estudios
ultraestructurales demuestran que algunos de estos grnulos poseen en su interior una estructura
peculiar integrada por haces de microtbulos dispuestos en posicin paralela y que por ello se
designan: haces de tbulos paralelos o PTA. De acuerdo al fenotipo, existen dos variantes de
leucemias de linfocitos granulares: la variante T-citotxica y la de clulas "natural killer". No
existen grandes diferencias entre ambas excepto por: 1- su incidencia, la variante de clulas
natural killer es mas frecuente en pases orientales, 2- curso clnico, que suele ser ms agresivo
en la leucemia de clulas natural killer y 3- la morfologa, ya que la granulacin citoplasmtica
es ms marcada en la variante de clulas T. Los rasgos morfolgicos de los linfocitos en la
leucemia de linfocitos granulares son idnticos o muy similares a los que muestran la pequea
proporcin (5-10%) de linfocitos granulares presentes en sangre perifrica de individuos
normales. Raramente la leucemia de linfocitos granulares sufre transformacin a un linfoma de
alto grado T; en algunos casos descritos, las clulas blsticas poseen unas caractersticas
citoplasmticas similares a las de los linfocitos granulares incluyendo granulacin
citoplasmtica. El diagnstico diferencial de la leucemia de linfocitos granulares se plantea
esencialmente con cuadros de linfocitosis reactivos a procesos virales o post-esplenectoma y
con la tricoleucemia. La leucemia de linfocitos granulares se diferencia de linfocitosis reactivas,
no clonales, mediante estudios citogenticos o de anlisis molecular investigando la
configuracin de los genes que codifican las cadenas del receptor de clulas T (RCT) que
demuestra la presencia de una clona solamente en procesos leucmicos. Si bien, cuando no se
dispone de estas tcnicas, datos que apoyan el diagnstico de un cuadro leucmico no reactivo
son: una morfologa y fenotipo uniformes (por ejemplo >90% de linfocitos CD8+>,
inmunofenotipos atpicos o muy infrecuentes en linfocitos normales (por ejemplo
CD4+CD16+CD56+) y una linfocitosis superior a 5x109/I que persista durante o ms de 6
meses. El diagnstico diferencial con la tricoleucemia se presenta en aquellos casos en los que
la enfermedad se manifiesta con marcada esplenomegalia y la linfocitosis no es obvia. La
histologa del bazo en estos pacientes puede remedar la de la tricoleucemia ya que como sta, la
leucemia de linfocitos granulares afecta primordialmente la pulpa roja del bazo. El
inmunofenotipo, particularmente en cortes del bazo permite distinguir entre ambos procesos.
sta es una entidad muy infrecuente que se caracteriza por la presencia de linfocitos circulantes
con una morfologa similar o idntica a la de las clulas de Szary pero que, a diferencia del
94
sndrome de Szary, la afectacin cutnea es inexistente. La enfermedad tiene un curso
agresivo, similar al de la LP-T. Desde un punto de vista morfolgico, las clulas circulantes son
idnticas a las de la variante pequea o de clulas grandes del sndrome de Szary; el ncleo es
cerebriforme y el nuclolo no puede visualizarse por microscopa ptica o ultraestructural,
mientras que el ltimo anlisis permite confirmar la configuracin cerebriforme del ncleo de
estas clulas. Recientes estudios citogenticos en una minora de casos han demostrado la
presencia de anomalas caractersticas de la LP-T, tales como inv(14)(qll;q32) as como
anomalas que se observan con una frecuencia relativa en el sndrome de Szary, como aquellas
que afectan a 17q. Por consiguiente, es incierto s este tipo de leucemia puede clasificarse como
una entidad definida, con rasgos intermedios entre la LP-T y el sndrome de Szary, o bien
encuadrarse como una variante cerebriforme de la LP-T.
LINFOMAS T LEUCEMIZADOS
Sndrome de Szary
El sndrome de Szary es un linfoma cutneo T que por definicin afecta la sangre perifrica.
Los recuentos linfocitarios en estos pacientes no suelen ser muy elevados, generalmente
inferiores a 50x109 /l pero en la extensin de sangre perifrica destacan siempre linfocitos
atpicos. En base al tamao celular se distinguen dos variantes de sndrome de Szary: la de
clulas pequeas y la de clulas grandes, si bien no es infrecuente hallar los dos tipos celulares
en un mismo paciente. La clula de Szary posee unos rasgos nucleares muy caractersticos. En
las clulas de mayor tamao, el ncleo es altamente convoluto con irregularidades que asemejan
las circunvoluciones del cerebro y por ello se designa ncleo cerebriforme. Este aspecto no
siempre se objetiva en las clulas de Szary pequeas, las cuales suelen exhibir un ncleo
hipercromtico. El citoplasma en estas ltimas es escaso, mientras que puede ser algo ms
abundante en las de tamao grande y contener o no vacuolas. El estudio ultraestructural permite
documentar de forma ms precisa las irregularidades nucleares y demostrar un ncleo
serpentino con dos o ms indentaciones de escasa amplitud. En general, no existen problemas
de diagnstico diferencial entre el sndrome de Szary y otros procesos T cuando se dispone de
los datos clnicos y de inmunofenotipo, excepto con la LLTA, en especial en pases endmicos
para el HTLV-l. Como hemos mencionado antes, estudios serolgicos o moleculares de este
retrovirus son esenciales junto con los otros datos clnicos y de laboratorio para distinguir el
sndrome de Szary u otros linfomas cutneos leucemizados de la LLTA.
95
Otros linfomas T con expresin leucmica
Los linfomas de clulas grandes T pueden manifestarse o evolucionar con un cuadro leucmico
como ocurre con los de origen B, si bien con una frecuencia menor. Desde un punto de vista
morfolgico las clulas circulantes son de tamao grande y no poseen rasgos que permitan
diferenciarlas de aquellas que se observan en los linfomas B de clulas grandes. El
inmunofenotipo, por consiguiente, es necesario para tal diferenciacin. Los linfomas
pleomrficos T, anaplsicos y linfomas / raramente se leucemizan y el cuadro morfolgico
es altamente variable.
LLC LPL B
96
LEUCEMIA PROLINFOCITICA T LEUCEMIA LGG
SINDROME DE SEZARY
97
Philadelphia (Ph) y/o el gen de fusin BCR-ABL1 mientras que los subtipos de NMP BCR-
ABL1 negativos eran diagnosticados de acuerdo a caractersticas clnicas y de laboratorio y
sustentado en mnimas contribuciones histopatolgicas.
Hoy se reconoce que en las NMP la proliferacin anormal es debida a rearreglos
clonales o mutaciones de genes que codifican protenas tirosinquinasa.
Dos factores han influido para generar los cambios producidos en la revisin de
los criterios WHO para NMP:
1) el descubrimiento de anormalidades genticas que pueden ser utilizadas como
marcadores diagnsticos en las NMP con transcripto gentico BCR-ABL1 negativas y
2) y una mejor caracterizacin de figuras histolgicas en estas neoplasias. El descubrimiento en
2005 de la mutacin JAK2 V617F (gen Janus cinasa 2) fue un hecho relevante para la
comprensin de la fisiopatogenia en las NMP y ha generado una revolucin en el diagnostico y
clasificacion de este grupo de enfermedades, y especialmente de la Policitemia Vera (PV).
Anormalidades, como el JAK2 o KIT mutado, no son especficas de un NMP especfica, pero
proveen una prueba de que la proliferacin es clonal permitiendo as eliminar la posibilidad de
un proceso reactivo. Hasta el presente la mutacin ms comn reconocida en las NMP BCR-
ABL1 negativas es JAK2 V617F. Esta mutacin se detecta en mas del 90% de pacientes con PV
y en casi la mitad de aquellos con mielofibrosis primaria (MFP) o trombocitemia esencial (TE).
De esta manera, JAK2 V617F no es especfica de una NMP exclusiva, ni su ausencia excluye
una NMP.
Clasificacion WHO
-Neoplasias Mieloproliferativas (NMP)
Leucemia mieloide crnica, BCR-ABL1positiva
Leucemia neutroflica crnica
Policitemia vera
Mielofibrosis Primaria
Trombocitemia Esencial
Leucemia eosinoflica crnica, sin otra especificacin
Mastocitosis
Neoplasias mieloproliferativas, inclasificables
-Neoplasias Mieloides y Linfoides con Eosinofilia asociada con anormalidades del
PDGFRA, PDGFRB, o FGFR1
La LMC tiene una huella gentica (el cromosoma Ph formado por la translocacin entre los
cromosomas 9 y 22) y un correlato molecular (el gen de fusin BCR/ABL).
Caractersticas de la LMC
98
Examen clnico
Al momento del diagnostico, >80% de los pacientes estn en fase crnica, que en muchos
pacientes se presenta asintomtica.
El hallazgo mas comn del examen fsico en el momento del diagnostico es la esplenomegalia.
El bazo puede ocupar gran parte del abdomen, o puede presentarse solo un aumento mnimo. En
alrededor del 10% de los pacientes, el bazo no se palpa durante una exploracin esplnica.
En aquellos pacientes que experimentan sntomas, estos son generalmente secundarios a
esplenomegalia, e incluyen dolor, plenitud abdominal, y perdida de peso.
Fases de la Enfermedad
La enfermedad suele presentar un curso evolutivo bifsico, con un periodo inicial o fase
crnica, fcil de controlar con distintas teraputicas, y otro final o crisis blstica, muy similar
desde el punto de vista clnico y hematolgico a una leucemia aguda, aunque de peor
pronstico.
En algunos pacientes se intercala entre ambos un tercer periodo, la denominada fase de
aceleracin.
1. Fase crnica (FC):
Durante esta fase la LMC es una enfermedad poco agresiva y fcil de controlar, y permite a los
pacientes una vida prcticamente normal. Al cabo de un periodo variable, cuyo promedio es de
unos 3,5 aos, la enfermedad entra en una fase terminal muy agresiva y resistente al tratamiento.
2. Fase de aceleracin (FA):
Se observa en alrededor de un tercio de los pacientes. En ella cambian las caractersticas de la
enfermedad y puede aparecer: fiebre y/o sudoracin nocturna, esplenomegalia progresiva y
resistente al tratamiento.
Las celulas diferenciadas persisten, aunque a menudo muestran mayores anomalas
morfolgicas.
Pueden presentar anemia o trombocitopenia no atribuibles a la quimioterapia, leucocitosis
resistente al tratamiento, trombocitosis (superior a 1.000 109/l), blastos del 10-15% en SP o
MO. Aparicin de anomalas citogenticas adicionales al cromosoma Ph. Algunos enfermos
fallecen en esta fase por infeccin o hemorragia, pero la mayora acaban por presentar en pocos
meses los criterios de crisis blstica.
3. Crisis blstica (FB):
Consiste en el paso sin solucin de continuidad de la FC a un cuadro superponible al de LA, con
la invasin mas o menos rpida de la MO, la SP y a veces otros rganos por blastos. Este patrn
evolutivo (sin fase de aceleracin previa) es el ms frecuente, ya que se da en el 60% de los
pacientes.
Fase crnica
- Alteraciones citogenticas (ver mas adelante)
- < 10% de blastos y promielocitos en SP y MO
Fase acelerada (FA)
- Blastos 10-19% en SP o MO,
- Basfilos en SP 20%,
- Trombocitopenia o trombocitosis persistente que no responde a la Terapia (<100.109/l o
>1000.109/l respectivamente)
-Aumento del tamao del bazo y aumento del recuento de leucocitos que no responde a la
terapia
-Evidencia citogentica de evolucin clonal
-Una proliferacin megacarioctica importante en clusters , asociada con marcada fibrosis
de reticulina o colgeno, y/o severa displasia granuloctica, debera ser considerada como
sugestiva de FA.
Estos hallazgos aun no han sido analizados en grandes estudios clnicos, as que no esta claro si
son criterios independientes para la FA. Ellos frecuentemente ocurren simultneamente con una
o ms de las caractersticas enumeradas.
Fase blstica (FB)
99
- Blastos >20% en SP o MO,
- Proliferacin extramedular de blastos,
- Grandes focos o clusters de blastos en biopsia de MO
Algunos estudios han indicado que ciertas caractersticas a la presentacin tienen importancia
pronostica.
La transicin de FC a FA y posteriormente a FB puede ocurrir gradualmente durante un periodo
de un ano o mas, o aparecer bruscamente (crisis blstica). La tasa de evolucin anual de FC a
crisis blstica es de 5% a 10% los primeros dos anos y de 20% en los anos subsiguientes.
Exmen de MO y SP
La MO es hipercelular, y los recuentos diferenciales tanto de MO como SP muestran un
espectro de granulocitos maduros e inmaduros similares a los que se encuentran en una MO
normal.
A menudo se observan cantidades mayores de eosinfilos o basfilos, y a veces se observa
monocitosis. Con frecuencia se encuentra un aumento de megacariocitos en la MO, y en
ocasiones se observa en SP fragmentos de ncleos megacariocticos, especialmente cuando el
recuento de plaquetas es muy alto.
El porcentaje de linfocitos es menor, tanto en MO como en SP, en comparacin con sujetos
normales, y la proporcin mieloide/eritroide en la MO es generalmente muy elevada.
El examen histopatolgico del aspirado de MO demuestra un cambio en las series mieloides a
formas inmaduras que aumentan en numero a medida que el paciente progresa a la FB de la
enfermedad.
SP:
_ presenta recuento de leucocitos >10 x 109/l
_ con neutrfilos, metamielocitos y mielocitos,
_ generalmente < 5% mieloblastos en SP y MO;
_ se observa eosinofilia y basofilia;
_ 50% de los casos trombocitosis.
MO:
_ hipercelular (hasta 100% celular)
_ con precursores granulociticos aumentados, basfilos, eosinfilos y
ocasionalmente monocitos;
_ serie eritroide normal,
_ megacariocitos con disposicin en clusters en nmero normal o aumentado,
_ presencia variable sea-blue histiocitos;
_ aumento de fibras de reticulina,
100
_ sin embargo la fibrosis medular es rara a la presentacin y esta asociada con el n de
megacariocitos CD61+.
101
LEUCEMIA NEUTROFLICA CRNICA (LNC)
Un poco de historia
La PV, TE y MFI son tres condiciones que comparten varias caractersticas, incluyendo
hipercelularidad de MO, predisposicin a la trombosis y hemorragia, y riesgo de transformacin
leucmica en el largo plazo.
La PV es una condicin de hipercelularidad persistente y excesiva acompaada por cianosis
que fue reconocida por primera vez por Vazquez en 1892. La MFP fue descripta casi al mismo
tiempo y la TE reconocida en los 1930s.
Dameshek, en 1951, fue el primero en observar la considerable superposicin de
caractersticas clnicas y de laboratorio en estas condiciones y propuso que, junto con la LMC y
otros desordenes constituan un espectro de desordenes relacionados. Uso el trmino de
desordenes mieloproliferativos.
En 1974, un experimento critico mostr que los progenitores eritroides de MO de
pacientes con PV eran capaces de crecer in vitro en ausencia de eritropoyetina (EPO).
Se determino que estas enfermedades se originan en un clon de stem cells
hematopoyticas. Con el tiempo, se fueron encontrando otras claves del mecanismo responsable
de los desordenes mieloproliferativos. Estas incluyen la asociacin de varias neoplasias
mieloides crnicas con tirosinquinasas activadas y el reconocimiento de pasos de sealizacin
aumentada a travs de Janus cinasas y traductores de seales y activadores de transcripcin
(JAKSTAT) y fosfatidil inositol 3-cinasa (PI3K) en celulas mieloides y eritroides.
El descubrimiento de la mutacin JAK2V617F en PV, TE y MFP y de las mutaciones en el
exn 12 en PV y de MPLW515L/K en MFP y TE, ha ocasionado tal impacto en el diagnostico
de estas entidades que no solo se ha impuesto como prueba diagnostica esencial en la clnica
cotidiana, sino que ha obligado a efectuar la revisin de los criterios diagnsticos de la WHO
vigentes desde 2001 y ha llevado, en 2007, al grupo de expertos en estas enfermedades, a
publicar una nueva propuesta para las tres NMP Ph negativas clsicas.
.
Criterios para PV
Requiere la presencia de los 2 criterios mayores y uno de los criterios menores, o la
102
presencia del primer criterio mayor junto con 2 criterios menores.
Criterio Mayor
1- Hb >18.5g/dl en varones, > 16.5 g/dl en mujeres u otra evidencia de aumento de
la masa de celulas rojas*
2- Presencia de JAK2 V617F u otra mutacin tal como la mutacin del exn 12 de
JAK2
Criterio Menor
1- Biopsia de MO mostrando hipercelularidad para la edad con crecimiento de los 3
linajes (panmielosis) con prominente proliferacin eritroide, granuloctica y
megacarioctica
2- Nivel de eritropoyetina srica inferior al rango de referencia
3- Formacin de colonias eritroides endgenas in Vitro
103
tambin hay pacientes jvenes.
Esta caracterizada por panmielopatia con maduracin intacta, fibrosis medular progresiva,
hematopoyesis extramedular en bazo, hgado y ndulos linfticos, y marcada esplenomegalia
(hasta 4 Kg.). Tambin anemia, otras citopenias, sntomas B (fiebre, perdida de peso >10%,
sudoracin nocturna), gota, infecciones, episodios tromboticos, sangrado.
Cambios en MO
Presencia de proliferacin megacarioctica con atipa (megacariocitos pequeos a
grandes con relacin ncleo/citoplasma aberrante y ncleos hipercromticos, con
mameln, o irregularmente plegados y agrupamiento denso), generalmente esta
acompaada de fibrosis de colgeno o reticulina o, en ausencia de fibrosis
significativa, los cambios en megacariocitos deben estar acompaados por
aumento en la celularidad medular caracterizada por proliferacin granuloctica y
frecuentemente disminucin de la eritropoyesis.
104
Cuando se mencionan cambios en MO compatibles con TE refieren a una biopsia de MO que
muestra proliferacin principalmente del linaje megacarioctico con numero aumentado de
megacariocitos grandes, maduros; sin aumento significativo o desviacin a la izquierda en la
granulopoyesis neutrfila o de la eritropoyesis.
Es importante destacar que la mutacin JAK2V617F, aunque muy caracterstica, no es
especifica de las NMP Ph negativas clsicas, ya que se puede detectar tambin en otras
patologas mieloides: en el 50% de las anemias refractarias con sideroblastos en anillo y
trombocitosis (ARSA-T), en el 20% de los SMD atpicos y en el 3% de los SMD o LMA de
novo. De modo que, ante la sospecha de TE, la deteccin de la mutacin JAK2V617F no
descartara un SMD o MFP si bien conviene resaltar que no se detecta en patologa tumoral no
mieloide ni en LMC. plaquetaria disminuida.
La decisin de incluir LEC y SHE juntos no significa que la WHO considere que todos los
casos de SHE sean enfermedades mieloproliferativas clonales. Mas bien seala el problema de
que en la prctica es virtualmente imposible distinguir entre eosinofilia clonal y eosinofilia
secundaria a produccin anormal de citosina para la cual no se reconocen bases etiolgicas.
El diagnostico de LEC o SHE puede ser hecho solo tras la exclusin de un nmero
de enfermedades infecciosas, inflamatorias y neoplsicas con asociacin conocida a eosinofilia
(incluyendo LMC, LMA con inv(16), otros desordenes mieloproliferativos crnicos, linfoma de
clula T, linfoma Hodgkin, y otros).
Entonces, si no hay evidencia de clonalidad, se prefiere establecer el diagnstico
de SHE, mientras que el hallazgo de una anormalidad clonal mieloide soportara el diagnostico
de LEC.
Caractersticas
exclusin de causas reactivas, infecciosas y neoplsicas
Eosinofilia persistente >1.5 x 109/L en SP
Aumento de eosinfilos en MO
Mieloblastos <20% en SP o MO
Los casos con eosinofilia que carecen de evidencia de clonalidad pueden ser diagnosticados
como SHE idioptico tras descartar todas las causas de eosinofilia reactiva.
105
LMC SP FASE CRNICA LMC MO FASE CRNICA
106
TRABAJO PRCTICO N 12:
HEMOSTASIA PRIMARIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
CATEDRA DE ANALISIS CLINICOS I (HEMATOLOGIA)
Fundamento
Materiales y reactivos
Tubos plsticos.
Cpsula de Petri.
Algodn.
Anticoagulante EDTA (0,342 mol/L).
Diluyente: Oxalato de amonio 1% en agua destilada.
Procedimiento
1. Se obtiene sangre por puncin venosa en anticoagulante EDTA (0,342 mol/L), en tubos
plsticos.
2. Se homogeiniza bien la muestra y se toman 100 l que se colocan en otro tubo plstico que
contenga 1,9 ml de oxalato de amonio 1%.
3. Incubar 10-15 min , para provocar la hemlisis.
4. Cargar la cmara de Neubauer con el hemolizado y dejar que sedimenten las plaquetas en
ambiente hmedo: se recomienda colocar la cmara dentro de una cpsula de Petri
conteniendo un trozo de algodn humedecido.
5. Dejar 10-15 min en atmsfera hmeda.
6. Efectuar el recuento en microscopio (40 X) en el reticulado central de la cmara (dividido
en 400 cuadrados pequeos comprendidos en 1 mm2). El recuento de plaquetas se realiza en
el cuadrado central (al igual que el recuento de hemates), se eligen 5 de los cuadrados que
se encuentran subdivididos en 16 cuadraditos, como se muestra a continuacin .
Recuadro central
La superficie de este cuadrado central es de 1 mm2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1
mm.
107
7. Contar los 4 cuadrados de los extremos y el cuadrado central (por ende, sern 5 cuadrados
con 16 cuadraditos c/u, o sea 80 cuadraditos).
8. Clculo: sumar las plaquetas contadas en los 5 cuadrados y multiplicar por 1000 para
obtener el nmero de plaquetas por mm3. El factor 1000 surge del producto:
20 x 400
= 1000/mm3
80 x 0,1 mm3
Donde 20 es el factor de dilucin, 400 son los cuadraditos totales y 80 los cuadraditos
contados. El volumen total del cuadrante es de 0,1 mm3 .
Observaciones
2. TIEMPO DE SANGRIA
Fundamento
Esta prueba valora la capacidad hemosttica global in vivo y consiste en medir el tiempo
transcurrido desde la realizacin de una pequea incisin cutnea hasta que cesa la hemorragia.
La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tapn hemosttico eficaz y, por ende,
representa una valoracin global y simultnea de la funcin plaquetaria (nmero, adhesin,
agregacin y degranulacin plaquetaria) y de la funcin vascular. Respecto al factor vascular, la
prueba depende de la integridad de la pared vascular y de su capacidad constrictora.
El mtodo original del corte en el lbulo de la oreja, introducido por Duke en 1910, es poco
sensible y menos reproducible, por lo que no es aconsejable continuar utilizndolo hoy en da.
En 1935, Ivy introdujo la aplicacin de un manguito de presin en el brazo y la prctica de la
incisin en la cara anterior del antebrazo. Este mtodo, con la modificacin introducida por
Borchgrevink, que sustituye la puncin con lanceta por un corte realizado con hoja de bistur, ha
demostrado una alta sensibilidad. Por ltimo, la introduccin de plantillas o dispositivos
automticos para la realizacin de la incisin ha venido a uniformar y aumentar la
reproducibilidad.
Materiales y reactivos
108
Procedimiento
Valores de referencia
Hasta 6-8 minutos. Los tiempos superiores a 10 minutos son claramente patolgicos.
Fundamento
El mtodo original de Duke es, como dijimos antes, poco sensible y menos reproducible, pero
se contina aplicando.
Procedimiento
Interpretacin de resultados
La prueba se prolonga por reduccin del nmero de plaquetas o por alteraciones funcionales
plaquetarias o plasmticas (enfermedad de von Willebrand) relacionadas con los procesos de
adhesin, agregacin o degranulacin plaquetarias.
3. TIEMPO DE COAGULACION
Fundamento
El tiempo de coagulacin de sangre total es una de las pruebas llamadas globales y abarca la
activacin intrnseca de la protrombina y el fibringeno.
109
La sangre, al ser extrada sin mayor contaminacin con tromboplastina tisular, es capaz de
coagular cuando se la deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso est en
relacin con el sistema de procoagulantes e inhibidores fisiolgicos o adquiridos, que influyen
en la formacin de dicho cogulo.
Este tiempo de coagulacin in vitro reflejar mejor la eficacia del sistema in vivo, cuanto menos
se modifique esta sangre (contacto con el vidrio, burbujas de aire, detergentes, etc.).
Materiales y reactivos
Procedimiento
1. Obtener 3 ml de sangre por puncin venosa, de primera intencin y con jeringa plstica.
2. Disparar el cronmetro en el instante en que la sangre venosa se introduce en la jeringa.
3. Desconectar la aguja y vaciar ordenadamente 1 ml de sangre en el primero de los tres tubos
de vidrio perfectamente limpios, previamente colocados en gradilla de bao a 37C.
4. Inclinar el primer tubo cada 30 seg. por la misma cara hasta que la sangre se coagule (deja
de escurrirse por las paredes del tubo).
5. De inmediato, inclinar el segundo tubo hasta que se coagule; luego, proceder de la misma
forma con el tercer tubo.
6. Se toma como tiempo de coagulacin el valor obtenido en el tercer tubo.
Interpretacin de resultados
El rango normal debe establecerse en cada laboratorio, con un grupo suficiente de controles (20
como mnimo). Conviene repetir un paciente normal semanalmente, para determinar cualquier
variabilidad de los valores previamente obtenidos.
Se considera alargado un tiempo de coagulacin que difiere en ms de 2 min del lmite superior
del rango normal, establecido en cada laboratorio (media + 2 SD).
Se trata de un mtodo poco sensible, pues se prolonga slo en aquellos casos de dficit graves.
Un tiempo de coagulacin normal no descarta la existencia de un trastorno de la coagulacin,
pero un tiempo prolongado es siempre ndice de un defecto severo de la misma, que puede
deberse a una deficiencia de cualquiera de los factores que intervienen en la formacin del
cogulo de fibrina, con excepcin de una deficiencia pura de los factores VII y XIII; pero el
mtodo es mucho ms sensible a los defectos de los factores que intervienen en la activacin por
contacto y en la formacin del activador intrnseco de la protrombina.
Fundamento
La retraccin del cogulo depende de la actividad trombodinmica de las plaquetas, por lo que
se requiere un nmero mnimo de plaquetas normales y adecuados niveles de Ca++.
Procedimiento
110
1. Los tres tubos utilizados para determinar el tiempo de coagulacin deben dejarse en bao a
37C durante por lo menos 3 Hs. Al cabo de este tiempo, observaremos la mejor retraccin
de los tres tubos, graduando de acuerdo a la magnitud de la retraccin por apreciacin visual
del tamao del cogulo retrado y el suero libre en:
a) Normal o completa
b) Incompleta
c) No retrae
d) Hiperretrctil
Interpretacin de resultados
111
TRABAJO PRCTICO N 13
HEMOSTASIA SECUNDARIA
OBTENCIN DE MUESTRAS
112
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Plasma citratado rico en plaquetas (prp): la sangre obtenida de acuerdo a las condiciones ya
sealadas es centrifugada a 1000 r.p.m durante 5 minutos. Trasvasar el plasma rico a un tubo de
plstico con pipeta plstica. Mantener a T ambiente hasta su uso (no mas de 2h). El plasma as
obtenido es el plasma rico en plaquetas.
Se utiliza fundamentalmente para el estudio de la funcin plaquetaria y para el tiempo de
plasma recalcificado (Tiempo de Howell)
Plasma citratado: Se obtiene centrifugando la sangre durante al menos 10 min. a 3000 r.p.m.
El plasma as obtenido es relativamente pobre en plaquetas (menor de 10000/mm3 ). Se utiliza
dentro de las 4 h de extraccin para los estudios pre- quirrgicos, control de anticoagulacin en
los pacientes sin antecedentes de sangrado o trombosis.
Plasma pobre en plaquetas: Se obtiene por doble centrifugacin (primero de sangre entera y
luego el plasma citratado y separado) de 15 minutos a 4000 rpm (idealmente en centrfuga
refrigerada a 4C). El plasma as obtenido es pobre en plaquetas (menor de 5000/mm3) rene
las condiciones para realizar todos los estudios. Puede ser fraccionado y congelado para estudios
posteriores. En este caso se aconseja procesar de igual forma muestras normales.
Pool de plasmas normales: Se debe extraer sangre de sujetos normales, sin historia previa de
manifestaciones hemorrgicas, ni trombticas, ni hepticas, que no estn recibiendo ninguna
medicacin. Se prepara plasma pobre en plaquetas de por lo menos 10 sujetos que tengan las
pruebas bsicas de coagulacin normal. Se puede fraccionar y congelar a-70C mximo 6 meses
y 1 mes si se conserva a -20C
Fundamento
El APTT, es la prueba ms sensible para evaluar la va intrnseca de la coagulacin. Consiste en
activar el plasma por contacto con superficies cargadas negativamente (caoln, slica, etc.). En
esta prueba se fija la concentracin de fosfolpidos presentes en la reaccin, mediante el
agregado de cefalina (tromboplastina parcial). La activacin por contacto se ve favorecida por el
agregado de caoln (sustancia inerte, con cargas negativas) que aumenta la superficie de
contacto.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan en segundos.
Interpretacin de resultados
Valor normal: segn el reactivo utilizado y el mtodo de deteccin: 37-48 seg.
Valores menores a 37 seg indican concentracin aumentada de factores o muestra activada.
Valores prolongados revelan un defecto en la va intrnseca.
El APTT es ms sensible al defecto de los factores VIII, IX, XI, XII o fase de contacto como
precalicrena (PK), quiningenos de alto peso molecular (HMWK). Es menos sensible al
defecto de factores de la va comn (X, V o II). En casos de deficiencias de fibringeno, el
APTT se prolonga a partir de concentraciones menores a 100 mg/dL.
Presencia de inhibidores, ya sean especficos contra un factor (neutralizantes) o inespecficos
(interferencia) afectan la prueba del APTT (dependiendo de la sensibilidad del reactivo), que no
corrige por el agregado de plasma normal. La heparina no fraccionada (UFH), que potencia la
accin inhibitoria de la antitrombina frente a la trombina, puede afectar el resultado del APTT.
113
FACTORES DE VIA INTRINSECA (VIII, IX, XI, XII, PK, HMWK)
Fundamento
Este mtodo mide la formacin de fibrina por accin de la trombina generada en un sistema
coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulacin
del sistema es dependiente de la concentracin del factor presente en la muestra problema.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan en por ciento de actividad.
Para la construccin de la curva de calibracin, en papel doble logartmico, se transportan las
concentraciones de factor (%) sobre la abscisa y los tiempos de coagulacin (seg) sobre la
ordenada. Se interpola la concentracin del factor en el plasma problema en la curva obtenida.
Interpretacin de resultados
Valores normales: 50-150 %
El descenso de los niveles plasmticos de cualquiera de estos factores puede deberse a un dficit
congnito (cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores.
Fundamento
Se utiliza como reactivo tromboplastina clcica (comercial) que, en contacto con el plasma
citratado, genera la activacin del mecanismo extrnseco y la produccin de fibrina. El tiempo
de coagulacin de la prueba depende de la concentracin de los factores plasmticos que
participan en el mecanismo extrnseco de la coagulacin.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan en por ciento de actividad y/o tiempo en segundos. Se realiza el
tiempo de protrombina y se interpola el tiempo en la curva de Quick o curva de tasa de
protrombina (VER INSERTO).
Interpretacin de resultados
Valor normal: 70-100%
Resultados de tiempo de protrombina menores a 70% evidencian una anormalidad del
mecanismo extrnseco debida a un defecto o a la inhibicin de uno o ms de los factores
intervinientes en la va extrnseca. Se deber corregir la prueba con plasma normal para
descartar un efecto inhibitorio y realizar la determinacin individual de cada uno de los factores
para identificar el o los factores deficientes.
El general, tiempo de Quick es ms sensible al defecto de los factores VII, X y V que a la
deficiencia de protrombina. No detecta disminuciones moderadas de fibringeno, pero se ve
afectado por concentraciones menores a 100 mg/dL.
Fundamento
El mtodo mide la formacin de fibrina por accin de la trombina generada en un sistema
coagulante que aporta todos los factores excepto el factor en estudio. El tiempo de coagulacin
del sistema es dependiente de la concentracin del factor presente en la muestra problema.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan en por ciento de actividad.
114
Curva de calibracin: graficar en papel doble logartmico la concentracin del factor sobre la
abscisa y los tiempos de coagulacin (seg) sobre la ordenada. De la recta resultante, se interpola
la concentracin del factor presente en el plasma problema.
Interpretacin de resultados
Valores normales: 70-120 %
El descenso de los niveles plasmticos de los factores puede deberse a un dficit congnito
(cuali o cuantitativo), adquirido, o a la presencia de inhibidores. Las deficiencias adquiridas
pueden ser causadas por consumo, alteraciones en la funcin heptica, aumento en la actividad
fibrinoltica o presencia de inhibidores.
Transformacin fibringeno-fibrina
Fundamento
Esta prueba mide el tiempo de coagulacin del plasma citratado en presencia de trombina.
Permite evaluar la transformacin de fibringeno a fibrina.
Expresin de resultados
Se informa el tiempo de coagulacin de la muestra (TT) expresado en segundos, junto con el
tiempo de trombina del plasma normal.
Interpretacin de resultados
Valores prolongados del TT pueden deberse a:
-Baja concentracin de fibringeno (menor 200 mg/dL.), o ausencia del mismo (hipo o
afibrinogenemia). Puede ser de origen congnito o adquirido. Los niveles de fibringeno
plasmtico pueden disminuir en hepatopatas severas, CID, por efecto del tratamiento con
estreptoquinasa, r-tPA o L-asparaginasa, o tambin en respuesta a la actividad fsica.
-Presencia de un fibringeno anmalo (disfibrinogenemias congnitas o adquiridas)
-Inhibidores de la polimerizacin de los monmeros de fibrina, productos de degradacin del
fibringeno/fibrina o protenas plasmticas anormales.
-Tratamiento o contaminacin con heparina
-Prolongaciones inespecficas (hiperbilirrubinemia, hipoalbuminemia, hemlisis)
-Aumento muy marcado de fibringeno (>800-1000mg/dl)*
Introduccin
Las pruebas de laboratorio fundadas en la medida del tiempo de coagulacin no detectan los
defectos o alteraciones del FXIII, dado que no participa en las reacciones que llevan a la
formacin de fibrina soluble. El FXIIIa acta en una fase posterior, estableciendo uniones
115
covalentes entre las molculas de fibrina, transformndola en insoluble. La deficiencia severa
de FXIII puede ser detectada por la disolucin temprana del cogulo de fibrina en medio
hidrofbico (urea, cido monocloroactico) (prueba de solubilidad del cogulo).
Fundamento
La prueba consiste en evaluar la presencia de un cogulo de fibrina insoluble (estable); el
plasma del paciente, en presencia de iones calcio coagula, dicho cogulo de coloca en un medio
hidrofbico y se observa si se disuelve o no el cogulo. En pacientes con deficiencias severas
del FXIII (1-5 U/dl) se produce un cogulo, que se disuelve tempranamente, comparado con
los controles normales.
Expresin de resultados
Los resultados se expresan como normal (cogulo insoluble) o anormal (cogulo soluble).
Interpretacin de resultados
En ausencia de FXIII o en presencia de concentraciones menores a 1-5U/dl (depende del
mtodo), el cogulo de fibrina se disuelve en el trmino de pocos minutos u horas. A pesar de su
escasa sensibilidad, la tcnica es til para detectar defectos clnicamente importantes. Se
requiere muy baja concentracin de FXIII para obtener una hemostasia adecuada (valor
hemosttico: 1-5 U/dl).
Las alteraciones del FXIII pueden deberse a defectos cualitativos o cuantitativos, ya sean
congnitos o adquiridos. La prueba de solubilidad puede dar anormal por la presencia de
inhibidores especficos del FXIII.
COAGULMETRO AUTOMATIZADO
Son equipos utilizados para determinar cualquiera de las pruebas de hemostasia que utilicen
mtodo coagulomtrico (TP, APTT, TT, Fibringeno, factores, etc.). Desde el punto de vista
prctico ahorran tiempo para procesar muchas muestras (ms de 30 en una maana por Ej.) pero
fundamentalmente logran altos grados de reproducibilidad.
Bsicamente su funcionamiento se basa en dos mtodos de deteccin: ptico
(turbodensitometra) y/o magntico. Los que utilizan el mtodo magntico toman el tiempo que
tarda en formarse el cogulo desde el momento de mezcla hasta que una varillita de metal deja
de girar. Los basados en mtodos pticos utilizan medidas de transmitancia para dar el tiempo
de formacin del cogulo.
Dentro de las funciones que pueden brindar estos equipos est la incubacin de muestras por
medio de fuentes secas, sta se realiza por el tiempo estipulado para cada prueba que debe ser
determinado por el operador o bien ya viene estandarizado en el equipo.
Cabe aclarar que en estos equipos se trabaja de modo muy similar al mtodo manual en lo que
se refiere a preparacin de diluciones y curvas de actividad, la ventaja de estos equipos radica
en agilizar el trabajo en caso de elevado nmero de muestras y la de permitir mayor
reproducibilidad.
116
APTTest
Reactivos para la determinacin del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada
SIGNIFICACION CLINICA
El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de
factores procoagulantes del plasma as como a la presencia de ciertos inhibidotes de la
coagulacin.
Sirve para detectar anormalidades en la va intrnseca de la coagulacin, como son los factores
necesarios para la formacin del activador intrnseco de la protrombina, o sea los factores VIII,
IX, XI y XII.
Tambin detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibringeno, no siendo as con
los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas
vasculares.
La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de
la teraputica anticoagulante por heparina. Tambin permite la identificacin rpida de
hemoflicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirrgicos y
evitar problemas hemorrgicos.
REACTIVOS PROVISTOS
Reactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador
particulado.
Cloruro de Calcio: solucin de cloruro de calcio 0,025 mol/l.
REACTIVOS NO PROVISTOS
Agua bidestilada o desionizada.
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro".
MUESTRA
Plasma
a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un
tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de
117
Anticoagulante TP de Wiener lab.). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes
de los 30 minutos. Es recomendable efectuar la extraccin con jeringas plsticas.
b) Aditivos: para obtener el plasma debe emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato
de sodio 0,130 mol/l.
c) Sustancias interferentes conocidas:
- Las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados.
- No debe emplearse EDTA o heparina para obtener plasma. Referirse a la bibliografa de
Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en refrigerador
(2-10C) hasta el momento de efectuar la prueba. Este perodo no debe prolongarse ms de 4
horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20C. Este
procedimiento al igual que el descongelado debe realizarse con rapidez (sumergiendo en bao a
37C) previo a la determinacin. La muestra debe conservarse hasta el momento de su anlisis
en tubos plsticos para minimizar los efectos de activacin por contacto que pueden ocurrir con
los tubos de vidrio.
PROCEDIMIENTO
Precalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en bao de agua a 37C.
En un tubo de hemlisis colocar:
Muestra (plasma desconocido o control) 100 ul
Reactivo APTT (homogeneizado) 100 ul
Mezclar e incubar de 3 a 5 minutos a 37C, luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37C) 100 ul
Disparar simultneamente un cronmetro. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido,
mantener en el bao unos 25 segundos. Luego sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una
vez por segundo y detener el cronmetro en el momento de la formacin del cogulo. Tomar
nota del tiempo de coagulacin.
VALORES DE REFERENCIA
El intervalo de valores observados en individuos normales
oscila entre 33-48 segundos.
Se considera fuera de lo normal valores que difieran en ms de 6 segundos de un plasma
control.
Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos
empleado y que correlacione los valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma,
haciendo constar estos resultados en el informe.
CURVA DE CALIBRACION
Este mtodo es til como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este
anticoagulante.
La tcnica empleada es la siguiente:
118
1) Preparar una Solucin de Trabajo de heparina en solucin fisiolgica cuya concentracin sea
10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente.
2) Preparar diluciones de esta Solucin de Trabajo utilizando un pool de plasmas frescos
normales o Plasma Control normal como diluyente. Se debern obtener diluciones de 0,8; 0,6;
0,4; 0,2; y 0,1 Unidades/ml.
3) Determinar el tiempo de tromboplastina parcial para cada una de estas soluciones as como
para el pool de plasmas y graficar en papel semilogartmico APTT vs. Concentracin de
heparina.
El valor obtenido para el paciente debe correlacionarse con los valores de la grfica, para
obtener la concentracin actual de heparina circulante.
PERFORMANCE
Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se
obtuvieron los siguientes resultados:
PRESENTACION
Equipo para 150 determinaciones (6 x 2,5 ml) (Cd. 1705002).
BIBLIOGRAFIA
- Bell, W.N.; Alton, H.G. - Nature 174:880 (1954).
- Dacie, J.B.; Lewis, S.M. - Hematologa Prctica Ediciones Toray, 2 Edicin (1970).
- Wintrobe, M.M. - Hematologa Clnica 3 Edicin Intermdica (1969).
- Bragos, I; Rodrguez Pcora, S; Lorenzo, L; Capriotti, G. -
Evaluacin de un nuevo Reactivo de Tiempo Parcial de
Tromboplastina Activada - 53 Triduo Bioqumico Cientfico Anual; Baha Blanca (1988).
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
Soluplastin
Tromboplastina clcica para la determinacin del Tiempo
de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa
SIGNIFICACION CLINICA
El fenmeno de la coagulacin puede desencadenarse por una va extrnseca (lesin tisular) o
por una va intrnseca contacto de la sangre con epitelios distintos del vascular normal).
La determinacin del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick es una prueba global para
evaluar la coagulacin extrnseca, siendo sensible a: factor II o protrombina, factor V o
proacelerina, factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower.
Por lo tanto la determinacin se aplica a:
119
- estudios de rutina en los anlisis prequirrgicos;
- deteccin de alteraciones en los niveles de uno o ms factores involucrados en la va
extrnseca;
- control de la teraputica con anticoagulantes orales.
REACTIVO PROVISTO
Soluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro de calcio para una
concentracin final de 0,0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentracin final de 0,1 mol/l.
REACTIVO NO PROVISTO
Agua bidestilada o deionizada.
PRECAUCIONES
El reactivo es para uso diagnstico "in vitro".
MUESTRA
Plasma
a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un
tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de
anticoagulante). Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab., se requerirn 7 gotas para 4,5
ml de sangre). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos.
b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato
de sodio 0,130 mol/l.
c) Sustancias interferentes conocidas:
- las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados;
- la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados;
- hemlisis visibles dificultan la medicin foto-ptica de los resultados.
Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:
el plasma debe mantenerse en el refrigerador (2-10C) hasta el momento de efectuar el ensayo.
En caso de no procesarse dentro de las 4 horas contadas desde la obtencin, la muestra se debe
congelar (a -20C); de tal forma, puede conservarse durante un mes. Este ltimo procedimiento
debe ser realizado con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en bao a 37C)
previo a la determinacin.
120
- Tubos de hemlisis.
- Pipetas y micropipetas para medir los volmenes indicados.
- Bao de agua a 37C.
- Cronmetro.
- Fuente luminosa para la observacin del cogulo.
PROCEDIMIENTO
1- Colocar el plasma (desconocido o control) en bao de agua a 37C durante 2-3 minutos (no
ms de 10 minutos).
2- En un tubo de hemlisis, colocar 0,2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37 C
durante 2-3 minutos (no ms de 10 minutos).
3- Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rpidamente al tubo conteniendo 0,2 ml de
Soluplastin, disparando simultneamente el cronmetro.
4- Mantener el tubo dentro del bao y cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de
coagulacin, sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener
el cronmetro en el momento de la aparicin del cogulo.
5- Calcular el tiempo promedio de coagulacin de la determinacin por duplicado para cada
plasma (desconocido o control). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es
mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. En caso
de emplear un instrumento de medicin, deben seguirse las instrucciones del fabricante del
mismo.
121
Plasma Control normal - patolgico.
VALORES DE REFERENCIA
El rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila entre:
- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 - 14 seg
- Porcentaje de Actividad Protrombnica: 70 - 100%
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia.
Para pacientes bajo tratamiento con antivitaminas K se ha establecido un rango teraputico que
se puede expresar como:
- Porcentaje de Actividad Protrombnica: 25 - 35%
- R.I.N.: 2,4 - 2,5
PERFORMANCE
a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da, se
obtuvieron los siguientes datos:
PRESENTACION
- Equipo para 100 determinaciones (10 x 2 ml) (Cd. 1705001).
- Equipo para 10 x 20 determinaciones (10 x 4 ml) (Cd. 1705005).
- Equipo para 320 determinaciones (8 x 8 ml) (Cd. 1705003).
BIBLIOGRAFIA
- Quick, A.J. - Fisiologa y Patologa de la Hemostasis - Ed. El Ateneo, Buenos Aires (1952).
- Araldi, H.T., et al. - Primer Reactivo Nacional Argentino de Referencia de Tromboplastina de
Cerebro Humano Acta Bioqum. Cln. Latinoam. XVI/1:131 (1982).
- Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 28: Normalizacin de la
Vigilancia del Tratamiento Anticoagulante (oral) - Serv. Inf. Tec. N 610:49-56 (1977).
122
- Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 31: Requerimientos para
Tromboplastinas y Plasmas usados en la terapia anticoagulante oral - Serv. Inf. Tc. N
658:202-223 (1981).
- Suer Casadevall, F. - Nuevas Normas Internacionales para la Expresin del Tiempo de
Quick - Anlisis Clnicos X/40:240-245 (1985).
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Tc.: Viviana E. Ctola
Bioqumica
Producto Inscripto M.S.
Disp. N: 1589/89 - 255/99
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