Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Genetica PDF
Genetica PDF
Captulo 1
Bases Moleculares de la vida
Consuelo Gmez Garca1, D. Guillermo Prez Ishiwara1 y Esther
Orozco Orozco2.
1
Email: consuelogg22@hotmail.com
PALABRAS CLAVE: genes, replicacin, reparacin, transcripcin, ciclo celular,
enfermedades genticas.
NDICE
1. Introduccin
2. Objetivos del Captulo
3. Organizacin del material gentico
4. Replicacin del DNA
5. Reparacin del material gentico
6. Transcripcin
6.1 Regulacin de la transcripcin
7. Modificaciones postranscripcionales
8. Traduccin de la informacin gentica
9. Ciclo celular
9.1 Alteraciones del ciclo celular
9.2 Enfermedades genticas
Clonacin
10.1.1Clulas madre
10.2
Terapia gnica
10.3
Genoma humano
10.4
11. Conclusiones
Agradecimientos
Abreviaturas
Bibliografa
1. INTRODUCCIN
unen los factores Cdc6 Cdc8 y MCM, este ltimo tiene actividad de helicasa
(Fig.3). La unin de estas protenas provoca una distorsin del DNA en este
punto, as como una estabilizacin en la separacin de las cadenas. Se une
entonces la ciclina Cdc7-Dbf4 para fosforilar a la helicasa MCM y activarla.
Finalmente, se une Cdc45 a MCM, de tal manera que ORC estabiliza un
complejo que mantiene separadas a las cadenas de DNA. En el ltimo paso, una
vez abierta la doble hlice se recluta a la DNA polimerasa (DNA pol) y entonces
una horquilla de replicacin es formada (Fig. 3). Se postula que tanto Cdc45
como MCM se desplazan junto con la horquilla de replicacin.
Una vez formada la horquilla de replicacin, puede iniciarse la sntesis del
DNA. Debido a que la DNA pol slo puede incorporar los nucletidos en
direccin 5 3, y a que la doble hlice tiene cadenas antiparalelas, durante la
replicacin del DNA podemos detectar la sntesis continua de una de las
cadenas y la sntesis discontinua (porque se da por fragmentos) de la llamada
cadena retardada (Lewin, 2000). La sntesis de la cadena retardada requiere
primero de la sntesis de los iniciadores de RNA por las primasas en diferentes
puntos del DNA, los cuales son complementarios a la cadena templado con
polaridad 3 5. De tal manera que los iniciadores tienen en su extremo 3 un
grupo OH libre al cual la DNA pol puede unir los nucletidos complementarios en
sentido 5 3 y sintetizar los fragmentos de DNA, llamados fragmentos de
Okazaki. Estos fragmentos son sintetizados hasta encontrar otro iniciador de
RNA. Posteriormente, la DNA pol I, la cual tiene actividad de exonucleasa en
sentido 5 3, es la encargada de eliminar los iniciadores de RNA y de
Como hemos visto, los cromosomas no son estructuras inertes y estables que
almacenan la informacin gentica de modo esttico, ya que se encuentran en
una conformacin dinmica y constantemente experimentan cambios diversos.
Algunas de estas modificaciones son accidentales y se reparan con facilidad; por
ejemplo, durante la replicacin del DNA pueden producirse rupturas ocasionales
en una de sus hebras, cuando el DNA dplex se separa y se desenrolla. Estas
rupturas son reparadas por la accin de la DNA polimerasa I y de la DNA ligasa.
Sin embargo, cuando el DNA es daado por un agente mutagnico, sea este
qumico o fsico, o por un error inherente a los propios mecanismos celulares, se
activa un elaborado sistema de mecanismos de reparacin con la finalidad de
reparar el dao (Modrich y Lahue, 1996). La importancia biolgica de dichos
mecanismos se refleja en el hecho de que an la simple sustitucin de una base
en un gen, puede modificar la funcin de la protena correspondiente causando
alteraciones que pueden ser incluso letales. Las repercusiones fenotpicas y
genotpicas de las modificaciones que ocurren en el DNA, dependern de qu
tan efectivos sean los sistemas de reparacin. Si el dao en el DNA es muy
severo y la actividad de los sistemas de reparacin no es capaz de mantener la
10
11
12
13
6. TRANSCRIPCIN
Para que una protena sea generada, el gen que especfica su composicin
debe ser transcrito en una cadena de RNA mensajero, que posteriormente
servir como templado para la traduccin de la protena por los ribosomas. Los
eucariotes tienen tres tipos de RNA pol, cada una de ellas es responsable de la
transcripcin de las diferentes clases de genes. La RNA pol I se encuentra en el
nuclelo y es la encargada de transcribir los genes que codifican los RNA
ribosomales (RNAr). La RNA pol II est en el nucleoplasma y es la responsable
de transcribir los RNA mensajeros (RNAm) y algunos RNAs nucleares pequeos
(RNAsn), y la RNA pol III, localizada en el nucleoplasma, es la responsable de
transcribir los genes que codifican los RNAt, RNAr 5S y algunas especies de
RNAsn.
Las RNA pol I, II y III son ms complejas que la RNA pol bacteriana, todas
tienen altos pesos moleculares (>500 000 Da) y estn constituidas tpicamente
por 8 a 14 subunidades. Una de las subunidades se une al DNA, otra une los
nucletidos y la tercera participa en el ensamble de la enzima. El resto de las
subunidades son comunes para todas las RNA pol. La subunidad mayor de la
pol II tiene dos caractersticas importantes: i) un segmento altamente bsico de
30 aminocidos, localizado aproximadamente a 350 residuos del extremo amino
14
15
Los promotores para la RNA pol II contienen ro arriba del sitio de inicio
de la transcripcin, mltiples sitios de unin para activadores y represores que
son reconocidos por protenas nucleares y que permiten al gen responder a
diversos estmulos y ser apagado o encendido por interacciones con protenas
especficas denominadas factores de transcripcin (Fig. 6). El nmero de
factores que actan en colaboracin con la RNA pol II es grande y se dividen en
dos grupos: i) factores basales, que se requieren para el inicio de la transcripcin
de todos los promotores y su funcin es precisar el sitio de inicio de la
transcripcin, as como darle estabilidad a la RNA pol, y ii) factores especficos o
reguladores (activadores o represores), los cuales se unen a las secuencias
consenso del promotor y son los responsables de la transcripcin en tiempo y
espacio. Este tipo de promotores poseen adems una caja TATA que se
localiza en la posicin -30 a -25 del sitio de inicio de la transcripcin, cuya
funcin es unir a la protena de unin a la caja TATA (TBP) y determinar el sitio
de inicio de la transcripcin (Nikolov y Burley, 1997) (Fig. 6).
El complejo de iniciacin que se requiere para la transcripcin por la RNA
pol II requiere del ensamblaje ordenado y especfico de varios factores de
transcripcin. Primero se une la TBP a la caja TATA que, junto con otras
protenas constituyen el complejo TFIID. Una vez unido TFIID, se le asocia el
factor TFIIA, el cual contribuye al reclutamiento de factores basales.
Posteriormente se asocia el factor TFIIB, cuya funcin es "medir" la distancia de
la caja TATA al sitio de inicio de la transcripcin, la cual est restringida a 25-30
pb en los promotores de mamferos y a 50-100 pb en los promotores de S.
16
17
18
19
20
21
factores positivos, ya que previenen las interacciones DNA-protena o protenaprotena a travs de sus propios dominios de unin y activacin.
7. MODIFICACIONES POSTRANSCRIPCIONALES
22
23
sntesis de todas la protenas inicia con el residuo metionina, por lo que la seal
de inicio de la traduccin la proporciona el codn AUG, aunque en bacterias
tambin pueden ser usados los codones GUG y UUG. Existen dos tipos de RNAt
que acarrean a la metionina, uno es usado en el inicio de la traduccin, mientras
que el otro es utilizado durante el alargamiento. En bacterias y en organelos
eucariticos, la primera metionina es modificada a N-formil-metionina.
Cuando la subunidad mayor se une al complejo de iniciacin, el RNAt
iniciador se localiza en el sitio P del ribosoma y el sitio A se encuentra disponible
para la entrada del aminoacil-RNAt complementario al segundo codn.
Una vez que se ha formado el complejo de inicio, se realizan ciclos de
incorporacin de los aminoacil-RNAt al sitio A del ribosoma, mientras que el sitio
P es ocupado por un peptidil-RNAt (Fig. 7). La unin peptdica se lleva a cabo
por la transferencia del polipptido del peptidil-RNAt del sitio P, al aminoacilRNAt localizado en el sitio A. Esta reaccin se realiza por una actividad de
peptidil transferasa llevada a cabo por la subunidad mayor del ribosoma.
Posteriormente, el ribosoma avanza tres nucletidos en el RNAm, lo que
ocasiona que se libere el RNAt no cargado del sitio P, que ste sea ocupado por
el peptidil-RNAt y que el sitio A est libre para la entrada del siguiente aminoacilRNAt correspondiente al siguiente codn. Esta translocacin requiere GTP y el
factor de alargamiento eEF-2. Una vez que el ribosoma llega a un codn de paro
(UAG, UAA o UGA), se termina la sntesis de la protena. Ninguno de los tres
codones de terminacin tiene un correspondiente RNAt, sino que son
reconocidos por factores de terminacin. Los factores actan a nivel del sitio A
24
9. CICLO CELULAR
25
clula y su divisin en dos clulas hijas. Los detalles de cada ciclo celular
eucariote varan entre los organismos; sin embargo, los puntos esenciales son
comunes. En un ciclo celular general, para producir dos clulas hijas idnticas, el
DNA se duplica (por el mecanismo que hemos descrito anteriormente), se
segrega y finalmente la clula original se divide para dar lugar a dos clulas hijas
idnticas independientes, cada una con una dotacin gentica idntica a la de su
hermana (Fig. 8). Sin embargo, las clulas no slo duplican su material gentico,
si no que tambin dividen su masa y sus organelos. Por lo tanto, el ciclo celular
es una compleja combinacin de procesos citoplsmicos y nucleares muy bien
coordinados entre s (Mercer, 1998). El ciclo bsicamente est dividido en cuatro
fases, denominadas G1, S, G2 y M, las cuales se encuentran ilustradas en la
figura 10. La fase G1 es el periodo comprendido entre la mitosis y la iniciacin
de la replicacin del DNA, en organismos vertebrados las clulas en fase G1
tienen un nmero diploide de cromosomas (2n), uno heredado de cada padre.
Esta fase se caracteriza porque es realmente la nica parte del ciclo que est
regulada principalmente por estmulos extracelulares (mitgenos, nutrientes,
hormonas, etc.). La fase G1 es por tanto uno de los principales puntos de control
del ciclo celular, ya que es precisamente en donde la clula decide iniciar o no el
ciclo, por lo que tambin es llamada INICIO. Asimismo, es la fase que ocupa la
mayor parte del ciclo, variando de 6 h en las clulas que tienen un crecimiento
relativamente rpido, a 12 h en las clulas que tienen un crecimiento ms lento
(Mercer, 1998; Tansey, 1999).
26
Una vez que la clula inicia el ciclo, sta se prepara para entrar en la fase
S, esto es, se activan los factores de transcripcin que permiten la expresin de
enzimas requeridas para la sntesis del DNA y de los genes que codifican para
los complejos de protenas-cinasas heterodimricas llamadas ciclinas. Las
subunidades catalticas de las ciclinas son llamadas cinasas dependientes de
ciclinas (Cdks), porque ellas no tienen actividad de cinasa hasta que no se
asocian con una ciclina. Cada Cdk puede asociarse con diferentes ciclinas y a
su vez cada complejo Cdk-ciclina determinar qu protenas sern fosforiladas
(Maity y col., 1997). En esta fase, las Cdks fosforilan a las protenas que forman
los complejos de pre-replicacin, los cuales son ensamblados en los orgenes de
replicacin (ORI), permitiendo de esta manera la iniciacin de la sntesis del
DNA (Fig. 9). Una vez replicado completamente el DNA del organismo, la clula
ahora tiene dos genomas completos, lo cual parece ser la seal para que la
clula entre en la siguiente fase llamada G2, que tiene un tiempo de duracin de
aproximadamente 4.5 h. En este punto, la clula adquiere energa, crece y
sintetiza protenas suficientes para dos clulas. Una vez completado este
evento, la clula entra a la fase final del ciclo celular llamada M (mitosis).
En esta fase, la divisin citoplsmica (citocinesis) y nuclear (separacin de los
cromosomas) ocurre y la clula utiliza la energa adquirida durante la fase G2
para dividirse en dos clulas hijas, en donde cada una contendr una copia
completa del DNA. Una vez completado el ciclo, las clulas tienen dos opciones:
i) comenzar nuevamente el ciclo entrando entonces a la fase G1, o bien ii) entrar
27
28
29
An cuando cambios tan pequeos en genes que codifican para protenas clave
en la regulacin del ciclo celular, originan eventos tan dramticos como la
transformacin maligna de las clulas, las enfermedades cancerosas no son las
nicas que son el producto de alteraciones de los genes. Existen diferentes
enfermedades genticas causadas por mutaciones, deleciones, duplicaciones,
amplificaciones, cambios en los patrones de expresin de algunos de los genes,
los cuales se traducen en defectos fsicos con diferentes grados de severidad.
Por ejemplo, existen ms de 6,000 enfermedades genticas conocidas, aunque
30
31
10.1 Clonacin
32
Las clulas madre son las clulas progenitoras a partir de las cuales los
diferentes tipos celulares de cada tejido se generan. Las clulas madre
embrionales pueden transformarse por ellas mismas en casi todos los tipos de
tejidos, mientras que en los adultos pueden solamente ser transformadas en
ciertos tipos de tejidos. El gran inters mostrado en estas clulas viene del
hecho de que si son correctamente estimuladas, ellas podran ser capaces de
regenerar tejidos daados y en teora podran ser usadas en la creacin de
rganos de repuesto.
33
34
35
36
37
38
2.
3.
4.
5.
6.
7.
AGRADECIMIENTOS
Al tcnico Alfredo Padilla Barberi por su apoyo en el diseo y elaboracin de las
figuras de este captulo.
39
ABREVIATURAS
DNA
Acido desoxirribonucleico
ORC
Sitio AP
Sitio apurnico-apirimdico
CTD
Carboxi-terminal domain
Cdks
BIBLIOGRAFA
Arents, G. y Moundrianakis, E.N. 1993. Topography of histone octamer surface:
repeating structural motifs utilized in the docking of nucleosomal DNA.
Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10489-10493.
Fischer, A. 2001. Gene therapy:some results, many problems to solve. Cell. Mol.
Biol. (Noisy-le-grand) 47:1277-1294.
Graziano, V., Gerchman, D., Schneider, K. y Ramakrishnan, V. 1994. Histone H1
is located in the interior of the chomatin 30-nm filament. Nature 368:351354.
Greenblatt, J. 1991. Roles of TFIID in transcriptional initiation by RNA
polymerase II. Cell 66:1067-1070.
40
Hofmann, E. 2001. What can medicine learn from the human DNA sequence?.
Biochemistry 66: 1144-1152.
International Human Genome Sequencing Consortium. 2001. Initial sequencing
and analysis of the human genome. Nature 409: 860-921.
Jimnez-Snchez, G., Childs, B. and Valle, D. 2001. Human disease genes.
Nature 409:853-855.
Kramer, A. 1996. The structure and function of proteins involved in mammalian
pre-mRNA splicing. Ann. Rev. Biochem. 65:367-409.
Lewin, B. 2000. Genes VII, Oxford University Press., New York.
Maity, A., McKenna, E.G. and Muschel, R.J. 1997. Cyclin A message stability
varies with the cell cycle. Cell Growth Differ. 8: 311-318.
Makalowski, W. 2001. The human genome structure and organization. Acta
Biochim. Pol. 48: 587-598.
Mercer, W.E. 1998. Checking on the cell cycle. J. Cell. Biochem. 30:50-54.
Meyer, F. and Finner, M. 2001. Gene Therapy: progress and challenges. Cell.
Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 47:1277-1294.
Modrich, P.y Lahue, R. 1996. Mismatch repair in replication fidelity, genetic
recombination and cancer biology. Ann. Rev. Biochem. 65:101-133.
41
Morishita, T., Aoki, M., Kaneda, Y. and Ogihara, T. 2001. Gene therapy in
vascular medicine: recent advances and future perspectives. Pharmacol.
Ther. 91: 105 -114
Nelson, H.C.M. 1995. Structure and Function of DNA-binding proteins. Curr. Op.
Gen. Develop. 5:180-189.
Nikolov, D. B. and Burley, S. K. 1997. RNA polymerase II transcription initiation:
a structural view. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 15- 22.
Nuez, R. 200). DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.
Curr. Issues Mol. Biol. 3:67-70.
Pecsi, G. 2000. Genetics associations and immunopathogenesis of celiac
disease. Acta Physiol. Hung. 87: 339-353.
Prakash, S. 1993. DNA repair genes and proteins of Saccharomyces cerevsiae.
Ann. Rev. Genet. 27:33-70.
Sauer, F., y Tijan, R. 1997. Mechanism of transcriptional activation: differences
and similarities between yeast, Drosophila and man. Curr. Op. Gen.
Develop. 7:176-181.
Tansey, W.P. 1999. How cells use proteolysis to control their growth. Mol. Med.
5:773-782.
Triezenberg, S.J. 1995. Structure and function of transcriptional activation
domains. Curr. Op. Gen. Develop. 5:190-196.
42
Venter, J.C. 2001. The sequence of the human genome. Science 291:13041351.
Wang, D. 1995. Discontinuous movements of DNA and RNA in RNA polymerase
accompany formation of a paused transcription complex. Cell 81:341-350.
PIES DE FIGURA
43
44
Fig. 8. Esquema del ciclo celular mostrando los principales eventos que
suceden durante el ciclo.
Fig. 9. Organizacin del ciclo celular. Se muestran las diferentes fases que
suceden durante el ciclo. El punto de restriccin indica el momento en el que la
clula puede entrar a la fase GO o bien continuar con el ciclo.
Captulo 2
Bases tericas de los mtodos experimentales ms
comunes en Biologa y Gentica Molecular
Mario Alberto Rodrguez1, Rima Gharaibeh2, Laurence Marchat2
y Csar Lpez Camarillo2.
1
Email: marodri@enigma.red.cinvestav.mx
PALABRAS CLAVE:DNA, RNA, protenas, mtodos, complejos DNA-protenas, Southern,
Northern, Western, expresin.
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivo del captulo.
3. Estado actual del arte.
4. Aislamiento y anlisis del DNA.
4.1 Aislamiento del DNA.
4.1.1 Lisis de la pared celular y de las membranas.
4.1.2 Disociacin de los complejos DNA-protenas.
4.1.3 Separacin del DNA de otras macromolculas.
4.2 Anlisis del DNA.
4.2.1. Manipulacin enzimtica del DNA.
Abreviaturas
Bibliografa.
1. INTRODUCCIN
protocolos a seguir (Harris y Angel, 1989; Sambrook y col., 1989; Watson y col.,
1992; Ausubel y col., 1994; Kaufman y col., 1995).
El DNA no existe como una molcula libre en las clulas, sino que forma parte de
los cromosomas, donde est asociado a protenas que le permiten una
organizacin definida. Adems, el DNA se replica y se transcribe por lo que
frecuentemente est asociado con RNA y protenas involucradas en la regulacin
de la expresin gentica, como la DNA polimerasa, la RNA polimerasa y otros
factores especficos de la replicacin y de la transcripcin.
Existen varios protocolos para extraer el DNA celular total, pero todos ellos
incluyen las siguientes etapas bsicas: lisis de la clula, disociacin de los
complejos DNA-protena, separacin del DNA de otras macromolculas y
evaluacin de la cantidad y la calidad del DNA aislado.
Para la liberacin del DNA total, se usa una solucin de lisis que destruye las
membranas presentes en la clula (membrana plasmtica, membrana nuclear y
membranas de diferentes organelos). La lisis de clulas con una pared celular
Los plsmidos son molculas circulares de DNA de doble cadena, las cuales se
replican en forma independiente del cromosoma bacteriano (Lewin, 2000). Debido
a su conformacin, los plsmidos pueden separarse del DNA cromosomal por
varios mtodos, los ms comunes son la lisis alcalina y el gradiente en CsCl
(Sambrook y col.,1989).
En la purificacin por lisis alcalina, la exposicin del lisado bacteriano a un
alto pH, seguido de un rpido cambio a condiciones de renaturalizacin, causa la
separacin (desnaturalizacin) de las cadenas de DNA lineal y de los crculos
abiertos, pero no de los crculos superenrrollados. Esto causa la formacin de
agregados insolubles de cadenas sencillas, las cuales se pueden eliminar por
centrifugacin. Los crculos superenrollados presentes en el sobrenadante se
purifican eliminando los contaminantes residuales. Este mtodo se usa
mientras que los posibles contaminantes, como las protenas, el fenol o los
carbohidratos, presentan una absorbencia mxima a 280, 270 y 230 nm,
respectivamente. El DNA en solucin est considerado puro si la relacin A260
nm/A280 nm est
relacin lineal entre la concentracin del DNA y la absorbencia a 260 nm. Una
unidad de absorbencia a 260 nm corresponde a 50 g/ml de DNA de doble
cadena, y 40 g/ml si es de cadena sencilla. Estas concentraciones son exactas
para cidos nucleicos con 50% de contenido de G+C. Por lo tanto, la
concentracin real de una preparacin de DNA puede ser un poco diferente de la
concentracin as estimada, dependiendo de su contenido en G+C.
Otro mtodo para analizar el DNA lo constituye la electroforesis en geles de
agarosa o poliacrilamida. En un campo elctrico fijo, las molculas de DNA, que
tienen una carga elctrica negativa, migran en el gel hacia el nodo y se separan
de acuerdo a su tamao y conformacin (Sambrook y col., 1989). El DNA se tie
con un colorante fluorescente y se visualiza en luz UV.
En un gel, el DNA plasmdico se separa generalmente en tres bandas, que
corresponden a los diferentes grados de enrollamiento de las molculas circulares.
El DNA genmico migra como una sola banda de alto peso molecular, mientras
que un barrido por debajo de esta banda generalmente indica un DNA degradado.
Adems, es posible detectar si existe contaminacin por RNA, el cual se visualiza
como una banda difusa de bajo tamao molecular.
En el caso de las molculas lineales, la migracin es inversamente
proporcional al log10 del nmero de bases, en un intervalo dado de tamaos
10
11
Estas enzimas representan una herramienta esencial para estudiar los cidos
nucleicos, ya que permiten: i) sintetizar nuevas cadenas de DNA (DNA
polimerasas) o de RNA (RNA polimerasas), ii) ligar fragmentos (ligasas), lo que
permite unir dos fragmentos de DNA de diferente origen, iii) agregar y eliminar
grupos fosfato (cinasas y fosfatasas respectivamente), lo cual puede servir para la
clonacin de fragmentos de DNA o para marcarlos qumica o radioactivamente, iv)
introducir grupos metilo (metilasas) para protegerlos de la digestin por
endonucleasas de restriccin, y v) digerir cadenas de DNA (exonucleasas) para
producir fragmentos de DNA de diferentes tamaos (Watson y col.,1992).
4.2.2. Anlisis del DNA por hibridacin (Southern blot e hibridacin en gota)
12
4.2.3. Secuenciacin
13
14
15
16
las secuencias desconocidas que flanquean una regin conocida, y iii) el tamizaje
diferencial (differential display en ingls), que permite identificar genes que se
expresan de manera diferencial sin conocer su secuencia. Esta tcnica utiliza
como iniciadores un oligo dT, un oligonucletido arbitrario y como molde el DNAc
obtenido a partir de RNAm de clulas crecidas bajo diferentes condiciones.
La importancia de estudiar el RNA radica en que todas las funciones celulares son
gobernadas en ltima instancia por la expresin gentica (Lewin,2000). La
abundancia relativa (o nivel estacionario) de un transcrito de RNA celular puede
ser determinada de forma cualitativa o cuantitativa y constituye uno de los
parmetros fundamentales a evaluar durante el estudio de la expresin gentica
de un organismo.
En general, el aislamiento del RNA requiere mucha destreza tcnica, debido a que
las molculas de RNA son mucho ms lbiles que las de DNA. Adems, existe el
problema constante de la actividad de las ribonucleasas (RNAsas) celulares y
ambientales que pueden degradar el RNA durante el proceso de aislamiento. Por
estas razones, para la manipulacin del RNA es importante utilizar guantes
17
18
una matriz (Fig. 3). El RNA poli (A+) puede ser aislado por este mtodo a partir de
una muestra de RNA total o bien directamente a partir de un lisado celular
(Sambrook y col.,1989).
19
20
21
22
mecnica, el tratamiento por calor, la aplicacin de alta presin, la congelacindescongelacin, o bien, la ultrasonicacin, y ii) los mtodos no fsicos que incluyen
la agitacin con abrasivos, el choque osmtico, las enzimas lticas, la lisis alcalina,
o el uso de detergentes y solventes, entre otros. Despus de la lisis se realiza una
centrifugacin para eliminar clulas intactas y fracciones no solubles.
La preparacin de un extracto de protenas localizadas en un organelo
especfico requiere el aislamiento previo de dicho organelo. Una vez obtenidos los
organelos deseados, se rompen por mtodos mecnicos o qumicos para liberar
las protenas.
23
24
25
26
27
7. INTERACCIONES DNA-PROTENAS
28
29
8. AISLAMIENTO DE GENES
30
31
al vector con el inserto de inters (Fig. 5). Las clonas positivas se recuperan a
partir de la caja maestra.
Las sondas utilizadas para el escrutinio de genotecas pueden ser obtenidas
de diferentes formas: i) si se conoce una secuencia parcial de la protena
codificada por el gen de inters, es posible sintetizar un oligonucletido sinttico
(de aproximadamente 20 bases) con los codones que pueden codificar la
secuencia de los aminocidos conocida. Debido a que la mayora de los
aminocidos son codificados por dos o ms codones, se recomienda sintetizar una
mezcla de todas las posibles secuencias de DNA (oligonucletidos degenerados),
para garantizar la presencia de la secuencia correcta. ii) En el caso de que se
conozcan dos o ms secuencias cortas de aminocidos (< 6 aa) de la protena de
inters o que se conozca la secuencia de dicha protena en otros organismos, la
sonda puede ser un fragmento de DNA amplificado por PCR utilizando como
molde DNA del organismo o tejido estudiado y oligonucletidos diseados a partir
de las secuencias de aminocidos conocidas o conservadas en la escala
evolutiva. iii) En el caso de que se conozca el gen en otro organismo
evolutivamente relacionado, ste se puede utilizar como sonda (sonda
heterloga).
32
33
34
10. CONCLUSIONES
35
ABREVIATURAS
ddNTPs
Didesoxirribonucletidos trifosfatados.
dNTPs
Desoxirribonucletidos trifosfatados.
HPLC
LPLC
MPLC
PCR
Ribonucleasas.
RT-PCR
BIBLIOGRAFA
36
Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Smith, J.A., Seidman, J.G.
and Struhl, K. 1994. Current protocols in molecular biology. John Wiley &
Sons, New York.
Harris, E.L.V, and Angel, S. 1989. Protein purification methods, a practical
approach. IRL Press, Oxford.
Kaufman, P.B., Wu, W., Kim, D. and Cseke, L. 1995. Hanbook of molecular and
cellular methods in biology and medicine. CRC Press, Boca Raton.
Lewin, B. 2000. Genes VII. Oxford University Press, Oxford.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning, a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Watson, J.D., Witkowski. J., Gilman, M. and Zoller, M. 1992. Recombinant DNA.
Scientific American Books, New York.
PIES DE FIGURAS
37
Captulo 3
Conceptos bsicos de gentica
Juan Pedro Luna Arias 1 and Esther Orozco2
1
Email: jpluna@mail.cinvestav.mx
PALABRAS CLAVE: Leyes de Mendel, extensiones mendelianas, teora cromosmica,
herencia, ligamiento, recombinacin, gen-una enzima, estructura del DNA, proyecto
genoma humano, clonacin de organismos multicelulares.
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivos del captulo.
3. Estado actual del arte.
4. Leyes de Mendel.
5. Extensiones Medelianas.
5.1 Dominancia incompleta y codominancia.
5.2 Alelos mltiples o serie allica.
5.3 Genes letales.
5.4 Epistasis.
5.5 Otro tipo de interacciones.
6. Teora cromosmica de la herencia.
6.1 Evidencias citolgicas.
6.2 Evidencias gentica.
7. Descubrimiento del DNA como material gentico.
2
8. Los genes estn arreglados linealmente en los cromosomas.
(descubrimiento del ligamiento y la recombinacin).
9. Hiptesis de un gen-una enzima (los genes codifican protenas).
10. Colinearidad entre el gen y la protena.
11. Determinacin de la estructura del cido desoxirribonucleico.
12. Fronteras de la gentica contempornea.
12.1 Proyecto genoma humano.
12.2 Clonacin de organismos completos.
13. Conclusiones.
Abreviaturas.
Bibliografa.
1. INTRODUCCIN
3
recientemente se public su terminacin, y que ser la clave para conocer los
genes que participan en las mltiples enfermedades, y evidentemente,
favorecer los mtodos de diagnstico y el establecimiento de terapias
especficas para cada individuo. Adicionalmente, con el desarrollo de la
hibridacin en biochips, ha sido posible determinar los encendidos y apagados
de todos los genes contenidos en genomas completos como el de S.
cerevisiae, a travs del ciclo celular, o estudiar el efecto de mutaciones en
genes especficos, sobre la expresin del resto de los genes celulares. Esto
permitir establecer los patrones de expresin en la diferenciacin celular, y
conocer cules genes son controlados por microorganismos patgenos o por
virus.
4
3. ESTADO ACTUAL DEL ARTE
5
Adicionalmente, el descubrimiento del papel que juegan algunos genes en las
enfermedades ha permitido desarrollar tcnicas de diagnstico moleculares,
que son mucho ms precisas y rpidas como por ejemplo, la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) o la transcripcin reversa acoplada a PCR (RTPCR), por mencionar slo algunas.
Por ltimo, estn los avances logrados en la clonacin de mamferos
como la oveja Dolly, y que en la actualidad, se dirigen a la produccin de
clulas madre (stem), las cuales podran reemplazar las clulas daadas de un
tejido, mediante su transplante. Estos desarrollos biotecnolgicos parece que
harn posible los sueos reflejados en las historias de ciencia ficcin. Sin duda,
el presente siglo nos depara un sinnmero de descubrimientos excitantes e
increbles, que cambiarn para siempre, la situacin actual de la biologa y de
nuestra vida.
4. LEYES DE MENDEL
6
fecundado cuando el polen, localizado en el estigma, emite un tubo
germinativo. El guisante tiene como ventajas la autopolinizacin (que consiste
en la fecundacin de los vulos de una flor con su mismo polen) y la
polinizacin cruzada (fecundacin de los vulos de una flor con polen
proveniente de otra flor). Mendel realiz sus experimentos con lneas puras, es
decir, con plantas cuya descendencia siempre presentaba la misma
caracterstica, independientemente de si realizaba autopolinizacin o
fertilizacin cruzada.
En uno de sus primeros experimentos, Mendel poliniz una planta de
flores prpuras con polen de una planta de flores blancas y obtuvo en la
primera generacin filial F1 slo plantas con flores prpuras. Este mismo
resultado lo obtuvo en la cruza recproca, es decir, en la polinizacin de una
planta de flores blancas con polen de una planta de flores prpuras. Cuando
autopoliniz las plantas F1 obtuvo en la generacin F2, una relacin 3:1 de
plantas de flores prpuras a plantas de flores blancas (Fig. 1). Lo que Mendel
interpret del hecho de que en F1, uno de los fenotipos desapareca, pero que
en un cuarto de la generacin F2 volva a aparecer, era que aunque todas las
plantas F1 tenan el fenotipo dominante (color prpura), un porcentaje de la
poblacin tena el potencial de producir progenie con el fenotipo recesivo (color
blanco). Estas mismas proporciones las obtuvo al realizar sus experimentos
con otros seis pares de caractersticas del guisante que tena perfectamente
estudiadas (Griffiths y col., 1996).
En otros experimentos, al cruzar plantas de semillas verdes con plantas
de semillas amarillas, Mendel obtuvo en F1, slo plantas de semillas amarillas.
Cuando autocruz plantas F1, encontr que 3/4 de las plantas F2 tenan
7
semillas amarillas y 1/4 semillas verdes. Al autocruzar plantas F2 de semillas
amarillas encontr una mezcla de plantas genticamente diferentes: 1/3
producan semillas amarillas y 2/3 semillas amarillas y verdes, mientras que la
autocruza de plantas F2 de semillas verdes slo produjeron semillas verdes. En
otras palabras, las plantas F2 produjeron una relacin fenotpica de 1:2:1.
Con estas observaciones, Mendel propuso un modelo que postulaba
que: i) existen determinantes hereditarios (que ahora los conocemos como
genes) que son de naturaleza particulada. ii) Cada planta posee dos tipos de
genes: uno dominante y el otro recesivo. iii) Los miembros de un par gnico se
segregan con la misma probabilidad en los gametos. iv) Cada gameto contiene
slo un miembro del par gnico. v) Los gametos se unen al azar sin importar su
constitucin gentica. Como sucede con cualquier modelo, Mendel procedi a
determinar si era correcto. Para ello, realiz cruzas de prueba, esto es, la
cruza de un organismo F1 con un organismo que siempre produce un fenotipo
recesivo. En todos los casos que analiz, encontr una relacin fenotpica de
1:1 (dominante a recesivo), la cual era la relacin esperada si es que su
modelo era el correcto (Griffiths y col., 1996).
Todas las observaciones realizadas por Mendel se han constituido en lo
que se conocen como las Leyes de Mendel. La Primera Ley establece que los
miembros de un par gnico se segregan o separan en los gametos, de tal
suerte que una mitad de los gametos contiene un miembro del par gnico,
mientras que la otra mitad contiene el segundo miembro del par. As, Mendel
identific dos formas alternativas o alelos para las caractersticas estudiadas
(fenotipos): Y, alelo dominante, y, alelo recesivo. Por consiguiente, pueden
existir tres genotipos: YY, Yy o yy. Aquellos individuos que presentan un slo
8
tipo de alelo se denominan homocigotos (YY, yy), en tanto que los que
contienen ambos alelos son heterocigotos (Yy). A nivel molecular, estas
formas del mismo gen son muy semejantes en su secuencia, pero difieren slo
en unos cuantos nucletidos.
Pero, qu sucede cundo se analiza ms de una caracterstica? Para
averiguarlo, Mendel realiz cruzas de plantas con diferentes pares de
fenotipos, por ejemplo el color de las semillas (amarilla o verde) y la apariencia
de la superificie de las mismas (lisa o rugosa). Encontr que las autocruzas de
un doble heterocigoto del tipo F1 generaron una relacin fenotpica 9:3:3:1 (Fig.
2). Pero al analizar cada uno de los fenotipos por separado, encontr
nuevamente la relacin 3:1. Estas observaciones fueron validadas mediante un
cruza de prueba entre una planta F1 (Rr Yy) y un doble homocigoto recesivo (rr
yy). En este caso obtuvo una relacin fenotpica 1:1:1:1. Estas observaciones
se conocen como La Segunda Ley de Mendel o Ley de la segregacin
independiente que establece que la segregacin de los alelos de un gen es
independiente de la segregacin de los alelos de otro gen, durante la formacin
de los gametos (Griffiths y col., 1996).
Sin embargo, los hallazgos de Mendel no recibieron ninguna atencin
por parte de la comunidad cientfica, hasta que en 1900, sus leyes fueron
redescubiertas por Hugo de Vries en Holanda, Erich von Tschermack en
Austria y por Carl Correns en Alemania, cada uno de ellos trabajando de
manera independiente.
5. EXTENSIONES MENDELIANAS
9
Hasta el momento, se han descrito condiciones de dominancia y recesividad
para un par de alelos. Pero no son las nicas formas de interaccin gentica en
los organismos. Estas interacciones traen como consecuencia que las
relaciones mendelianas se alteren. A continuacin, se describirn otros tipos de
interacciones genticas que en conjunto se conocen como extensiones
Mendelianas.
10
11
negro llamado Himalaya; por ltimo, c no produce color, causando que el
conejo sea albino en condicin homocigtica. De esta manera, la serie allica
mostrada en orden de dominancia descendente es C > cch > ch > c. Por tanto,
los genotipos posibles que causan coloracin completa son: CC, Ccch, Cch, Cc.
Los conejos color chinchilla son de genotipo cchcch; los conejos de color gris
claro son cchch, cchc; los conejos de color Himalaya son chch, chc; en tanto que
los que no producen color (albinos) son cc. Otro ejemplo de serie allica lo
constituyen los alelos correspondientes a los antgenos de histocompatibilidad
de clase I (HLA I) o de clase II (HLA II) en el humano.
Con base en estas y otras series allicas, el nmero de genotipos
posibles para organismos diploides es [n(n+1)]/2, donde n es el nmero de
alelos presentes en la serie. As, para el sistema AB0 existen tres alelos y el
nmero de genotipos posibles es seis; para el color del pelo de los conejos, el
nmero de alelos es cuatro, y por consiguiente, el nmero de genotipos es
diez.
12
El ejemplo clsico de gen letal es el gen AY en ratones. El gen silvestre
produce ratones con pelo oscuro, mientras que el alelo mutante AY es
dominante y produce un color amarillo en condicin heterocigtica. Si existe en
homocigosis, los ratones mueren. Por tanto, el efecto de la expresin de este
alelo se dice que es pleiotrpico porque produce ms de un fenotipo: color
amarillo en heterocigosis y letalidad en homocigosis. Un ejemplo en humanos
es la fibrosis qustica, que para el caso del alelo F508 es recesivo y en
homocigosis se expresa en la niez, muriendo los infantes en edades
tempranas .
5.4 Epistasis
13
cualquiera de los intermediarios B, C, D o el producto final E. Por consiguiente,
la mutacin del gen que codifica para , estara enmascarando la accin de los
genes restantes involucrados en la va, produciendo lo que se conoce como
epistasis. Si el gen episttico acta slo en homocigosis, entonces se trata de
epistasis recesiva, si lo hace en heterocigosis, se trata de una epistasis
dominante. Si los alelos recesivos de dos genes diferentes, producen en
homocigosis el mismo fenotipo, entonces estamos hablando de genes
duplicados (Griffiths y col., 1996).
14
6. TEORA CROMOSMICA DE LA HERENCIA
15
durante la meiosis y al que denomin cuerpo X. Posteriormente, Edmond
Wilson (1905) encontr que las hembras de Protenor (otro hemptero)
contenan siete pares de cromosomas, de los cuales un par era XX, en tanto
que los machos posean seis pares ms un cromosoma X no apareado. Nettie
Stevens (1905) determin que las hembras del escarabajo Tenebrio contenan
un par XX, mientras que los machos posean un par heteromrfico constituido
por un cromosoma X y otro, al que llam Y, que nunca se encontraba en las
hembras. Ella tambin encontr en Drosophila una situacin anloga: cuatro
pares de cromosomas, donde las hembras poseen un par XX mientras que los
machos poseen el par heteromrfico XY. Elinor Carothers en 1913, determin
que en los testculos de ciertas especies de saltamontes existan un par
heteromrfico y otro cromosoma que careca de contraparte con el cual
aparearse. De igual manera, Alfred Blakeslee (1922) encontr 12 cepas
diferentes de plantas de Datura stramonium, las cuales contenan 12 pares de
cromosomas ms un cromosoma extra diferente en cada cepa, al cual se
asociaba el fenotipo diferente observado en cada cepa (Griffiths y col., 1996).
16
Mendel, quien haba establecido que en cruzas recprocas el fenotipo de la
progenie siempre debe ser el mismo. De forma anloga, William Bateson
obtuvo resultados similares con pollos. Los resultados de ambos grupos
sealaron que el fenotipo de la progenie corresponde al fenotipo del parental
de sexo opuesto, slo cuando el macho lleva el alelo recesivo.
Thomas Hunt Morgan (1909), realizando cruzas con Drosophila
melanogaster, fue quien pudo explicar claramente estas observaciones. En una
primera cruza entre hembras de ojos rojos con machos de ojos blancos, obtuvo
toda la progenie F1 con ojos rojos. Cuando realiz la cruza entre dos individuos
F1, ambos con ojos rojos, encontr una relacin de individuos de ojos rojos a
blancos de 3:1. Sin embargo, de los individuos con ojos rojos de esta cruza,
2/3 eran hembras y 1/3 eran machos, es decir, la relacin hembras a machos
era de 2:1! Al realizar la cruza entre una hembra F1 de ojos rojos de la primera
cruza con un macho tambin de ojos rojos encontr una relacin fenotpica de
1:1:1:1 para machos y hembras de ojos rojos y machos y hembras de ojos
blancos, la cual s es una relacin mendeliana. Pero cuando realiz la cruza
recproca de la cruza 1, es decir, la cruza de una hembra de ojos blancos con
un macho de ojos rojos, encontr una relacin de hembras de ojos rojos a
machos de ojos blancos de 1:1. Morgan encontr entonces que el fenotipo de
la progenie era el de los parentales de sexo opuesto, slo si la hembra parental
contena el alelo recesivo, observacin contraria a la de Doncaster-Raynor y
Bateson.
Para explicar estos hallazgos, Morgan, basndose en los resultados de
Nettie Stevens seal que: i) los cromosomas X y Y determinan el sexo, de tal
suerte que las hembras son XX, mientras que los machos son XY, y ii) los
17
alelos responsables del color de los ojos (W, color rojo, dominante; w, color
blanco, recesivo) estn localizados en el cromosoma X, sin que haya
contraparte en el Y. As, habra dos tipos de cromosomas X: XW y Xw. Morgan
concluy que el gen del color de los ojos est ligado al sexo, es decir, al
cromosoma X. Esta explicacin no fue til para entender los resultados con la
polilla y los pollos. Sin embargo, Richard Goldchmidt usando la idea general, a
sugerencia de Morgan, supuso que los machos seran ZZ y las hembras WZ,
localizando los alelos estudiados en el cromosoma Z.
La prueba definitiva de que los genes estn en los cromosomas vino de
Calvin Bridges en 1916, un estudiante de Morgan, quien al realizar un anlisis
poblacional mayor en la progenie resultante de la cruza de Drosophila entre
una hembra de ojos blancos (Xw Xw) y un macho de ojos rojos (Xw+ Y), donde
los alelos silvestres tienen el signo +, encontr una progenie excepcional
primaria que consista de hembras de ojos blancos o machos de ojos rojos en
una proporcin de 1/2,000 (o 0.05%). Estos machos siempre fueron estriles.
Cuando cruz la hembra de ojos blancos de la progenie excepcional primaria,
con un macho normal de ojos rojos, es decir, un macho frtil con ojos rojos,
obtuvo un 4% de progenie excepcional secundaria, pero ahora los machos
fueron frtiles. Para explicar la progenie excepcional primaria, Bridges propuso
una no-disyuncin de los cromosomas X, la cual consista en la no separacin
de los cromosomas Xw Xw durante la meiosis. Bridges propuso que los
individuos Xw Xw Xw+ y Y0 moran, los Xw Xw Y eran hembras frtiles y los Xw+ 0
eran machos estriles. En otras palabras, si no est presente el cromosoma X,
los individuos mueren, al igual que si estn ms de dos cromosomas X,
mientras que el cromosoma Y est asociado con la fertilidad. Para explicar la
18
progenie excepcional secundaria, los individuos Xw Xw Xw+ y YY mueren,
mientras que el resto son frtiles (la mitad son machos Xw+ Y y la otra mitad
son hembras Xw Xw Y).
Bridges asumi que los alelos w y w+, como lo haba sugerido Morgan,
estaban en el cromosoma X y que se produca una no-disyuncin.
Posteriormente, las predicciones de individuos Xw Xw Y, Xw+ 0, Xw Xw+ Y y Xw
YY se comprobaron citolgicamente, quedando completamente demostrado
que los genes estn en los cromosomas.
Hasta aqu hemos revisado que los genes son las unidades particuladas que se
transmiten sin cambios, de los padres a su descendencia, y estn localizados
en los cromosomas. Pero, de qu material estn constituidos los genes?. Los
primeros experimentos que permitieron establecer que el material gentico es
el cido desoxirribonucleico (DNA) fueron publicados por Frederick Griffith en
1928, quien trabajaba con Pneumococcus. l tena dos cepas, una que
produca colonias rugosas (R), la cual era avirulenta, y una que produca
colonias lisas (S) y que produca la enfermedad. La virulencia del
Pneumococcus est dada por la presencia del polisacrido de la cpsula, el
cual vara de cepa a cepa (as, existen cepas de tipo I, II y III). Cuando no se
produce este polisacrido, la colonia se vuelve rugosa (R). Las bacterias de la
cepa R, que eran derivadas del tipo II, cuando fueron inoculadas en ratones no
produjeron la enfermedad, a diferencia de las bacterias de la cepa S, la cual
era de tipo III, que s la ocasionaron. Al inocular en ratones bacterias de la cepa
19
S, previamente muertas por calor a 65C, tampoco eran capaces de producir la
enfermedad. Sin embargo, cuando inocularon conjuntamente bacterias vivas R
y bacterias inactivadas por calor del tipo S, observaron que se produca la
enfermedad y que las bacterias que se aislaban del animal muerto eran S, del
tipo III. Esto lo llev a concluir que las bacterias muertas por calor podan
transformar a la cepa IIR y convertirlas en S tipo III (IIIS) (Griffith, 1928). El
material responsable de esta transformacin se denomin principio
transformante, el cual fue aislado posteriormente por Oswald Avery, Colin
MacLeod y Maclyn McCarty en 1944, quienes determinaron que se trataba de
DNA (Fig. 4). Esto lo realizaron al aadir DNA purificado a partir de la cepa IIIS,
a un cultivo de bacterias IIR aglutinadas por antisuero, observando que las
clulas IIR eran capaces de producir el polisacrido IIIS. Sin embargo, no se
atrevieron a afirmar que el DNA era el material gentico (Avery y col., 1944).
La prueba definitiva de que el DNA es el material gentico la realizaron
Alfred D. Hershey y Martha Chase en 1952 (Fig. 5). Ellos infectaron bacterias
con bacterifagos T2, marcados previamente con 35S (en sus protenas) o con
32
20
las bacterias y que era parte de la progenie de los fagos, y por tanto, que el
DNA era el material gentico (Hershey y Chase, 1952).
Hasta el momento hemos descrito i) las relaciones de Mendel, ii) que los genes
son DNA y iii) que estn localizados en los cromosomas. Pero, cmo estn
arreglados estos genes? Los experimentos con el guisante, realizados por
Bateson y Punnett en los primeros aos del siglo XX, quienes analizaban la
herencia del gen que afecta el color de las flores (P, flores prpuras; p, flores
rojas) y del que influye en la forma del grano de polen (L, granos de polen
alargados; l, granos de polen redondos), pusieron de manifiesto la alteracin de
la proporcin fenotpica Mendeliana 9:3:3:1 (PL:Pl:pL:pl) a 13.5:1:1:2.6. La
explicacin dada por estos investigadores fue que se produjeron ms gametos
P L que aquellos con genotipo p l, sugiriendo la existencia de algn tipo de
acoplamiento entre los alelos P y L, y p y l.
Thomas Morgan, estudiando los genes que afectan al color de los ojos
(pr+, ojos rojos; pr, ojos prpura) y a la longitud de las alas (vg+, tamao normal;
vg, vestigios de alas) en Drosophila, encontr tambin una desviacin de las
proporciones Mendelianas. Primero realiz la cruza pr+ pr+ vg+ vg+ X pr pr vg
vg resultando la progenie F1 con genotipo pr+ pr vg+ vg. Las hembras F1 fueron
entonces sometidas a una cruza de prueba con un macho homocigoto recesivo
y encontr los siguientes fenotipos: pr+ vg+ (1339), pr vg (1195), pr+ vg (151) y
21
pr vg+ (154). La relacin Mendeliana esperada era 1:1:1:1, pero no la encontr
(se observ la relacin 8.9:7.9:1:1). Lo notado por Morgan fue un
acoplamiento entre los dos alelos silvestres (pr+ y vg+) y los dos mutantes (pr
y vg). Sin embargo, al realizar la cruza pr+ pr+ vg vg X pr pr vg+ vg+, y
someter a las hembras F1 (con genotipo pr+ pr vg+ vg) a una cruza de prueba
con machos doble homocigotos recesivos, obtuvo las siguientes proporciones
fenotpicas en la progenie: pr+ vg+ (157), pr vg (146), pr+ vg (965) y pr vg+
(1067). Ahora, parece que existe una repulsin entre pr+ y vg+ y, pr y vg, ya
que stas fueron las clases minoritarias en la progenie. Para explicar el
acoplamiento, Morgan propuso que los alelos pr+ y vg+ estn localizados en
un cromosoma, mientras que los alelos pr y vg estn en el otro cromosoma
homlogo. La aparicin de los individuos con fenotipos pr+ vg y pr vg+, Morgan
la explic sugiriendo que los cromosomas homlogos al aparearse durante
la meiosis, intercambian ocasionalmente segmentos de DNA. A este
proceso se le llam entrecruzamiento, recombinacin o crossing-over en
ingls. Las evidencias citolgicas que apoyan la hiptesis de Morgan son los
denominados quiasmas.
El descubrimiento del ligamiento entre alelos de diferentes loci, fue clave
porque permiti establecer que los genes estn arreglados de manera lineal en
los cromosomas, y por consiguiente, es factible establecer el orden de los
mismos. Alfred Sturtevant, otro estudiante de Morgan, estableci el mtodo
para determinar las distancias de mapa entre alelos. Para ello, propuso utilizar
la frecuencia de recombinacin como una medida cuantitativa de la distancia
lineal entre dos loci, sealando que a mayor distancia entre dos genes ligados,
aumenta la posibilidad de que ocurran entrecruzamientos en la regin
22
comprendida entre ellos. As, una unidad de mapa (um) o centiMorgan (cM) se
define como la distancia entre genes que genera el 1% de recombinantes. Por
consiguiente, con las frecuencias de recombinacin es factible construir mapas
de ligamiento. Una de las consecuencias ms importantes de los estudios de
Bateson y Punnett , Morgan y Sturtevant fue que los genes estn arreglados
en forma lineal. As, ha sido posible mapear cromosomas enteros como los de
Drosophila y el X del humano. En la actualidad sabemos que para el humano,
alrededor de un milln de bases es el valor aproximado de un cM.
Las primeras evidencias sobre la funcin de los genes derivan de los estudios
realizados con humanos por Archibald Garrod en 1902. l not que varios
defectos humanos de carcter hereditario son producidos por mutaciones
recesivas, las cuales se traducen en defectos metablicos que afectan la
qumica bsica del organismo y que se conocen como errores innatos del
metabolismo. Un ejemplo clsico lo constituye la fenilcetonuria, la cual es
causada por un alelo autosmico recesivo que afecta a la enzima fenilalanina
hidroxilasa, que impide que la fenilalanina sea metabolizada a tirosina, con la
consecuente acumulacin de fenilalanina, la cual es transformada a cido
fenilpirvico, un compuesto altamente txico.
Pero fue hasta los aos 1940s que George W. Beadle y Edward L.
Tatum, lograron establecer una correlacin directa entre un gen y su funcin.
Ellos irradiaron con rayos X esporas del hongo haploide Neurospora crassa
23
para generar mutantes, y determinaron el defecto que causaban en el
requerimiento de nutrientes (Fig. 6A). Estas mutantes se conocen como
auxtrofas porque requieren de algn compuesto exgeno (aadido
externamente al caldo de cultivo) para que puedan crecer. Cuando cruzaron
sus mutantes con la cepa silvestre (conocida como prottrofa) produjeron una
progenie haploide con una relacin fenotpica de segregacin silvestre a
mutante de 1:1.
Un juego de mutantes requeran de arginina para crecer en medio
mnimo, el cual se define como un medio de cultivo de composicin conocida y
que contiene un azcar, algunas sales y cidos inorgnicos, una fuente de
nitrgeno (generalmente una sal de amonio) y biotina. Las mutaciones que
ellos encontraron mapeaban en diferentes sitios de tres cromosomas, y fueron
designadas como arg-1, arg-2 y arg-3. Tambin encontraron que estas
mutantes tenan diferente respuesta a ornitina y citrulina, compuestos muy
relacionados a la arginina. As la mutante arg-1 creca en medio mnimo
suplementado con arginina, ornitina o citrulina; la mutante arg-2 creca en
medio mnimo suplementado con arginina o citrulina, pero no con ornitina,
mientras que la mutante arg-3 creca solamente en medio mnimo
suplementado con arginina (Fig. 6B). En esa poca, ya se saba que las
enzimas podan interconvertir compuestos relacionados como los mencionados
anteriormente.
Con estas observaciones, ellos propusieron el modelo de la Fig. 6C,
donde la mutante arg-1 est afectada en la enzima X, de tal suerte que un
precursor hipottico no puede ser transformado en ornitina, pero las enzimas Y
y Z s son funcionales, por lo que si se sumplementa el medio mnimo con
24
ornitina, citrulina o arginina, puede crecer. De igual manera, la mutante arg-2,
estara afectada en la enzima Y, lo que significa que requerira citrulina o
arginina para su crecimiento. Por ltimo, la mutante arg-3 estara afectada en la
enzima Z, y por lo tanto, slo podra crecer en presencia de arginina. Beadle y
Tatum supusieron entonces que una mutacin en un gen determinado afecta la
produccin de un tipo de molcula enzimtica, alterando por consiguiente una
ruta biosinttica determinada, y este bloqueo puede evitarse mediante el
suplemento de un compuesto que generalmente se utiliza despus del sitio del
bloqueo en la ruta biosinttica. El modelo propuesto por estos investigadores
fue conocido como la teora de un gen una enzima (Beadle y Tatum, 1941).
Del trabajo de Beadle y Tatum se deriva con firmeza que un gen codifica una
enzima. Pero, cul es la naturaleza de la relacin entre un gen y una protena
especfica? La respuesta parcial a esta pregunta se consigui gracias a los
trabajos de Vernom M. Ingram en 1957, quien compar la hemoglobina normal
A (HbA) con la hemoglobina S (HbS), cuya presencia causa la anemia
falciforme. Ingram encontr que la huella cromatogrfica en dos dimensiones
de la HbS (que consiste en una cromatografa bidimensional en capa fina de un
hidrolizado con una enzima proteoltica de la protena en cuestin), difiere de la
huella de la HbA en una sola mancha (Fig. 7). La secuenciacin de esta
mancha de la HbS y la equivalente de la HbA, mostr que este pptido difera
slo en un aminocido: la hemoglobina normal contena cido glutmico,
mientras que la hemoglobina alterada tena substituido este aminocido por
25
valina. Por consiguiente, se concluy que los genes deben especificar de
alguna forma la secuencia de aminocidos de las protenas.
La prueba de esta hiptesis viene de los trabajos realizados por Charles
Yanofsky y col. (1964), quienes determinaron una relacin directa de la
secuencia del DNA y la secuencia de una protena. Utilizaron la enzima
triptfano sintetasa de E. coli, la cual realiza la conversin del indol-glicerol
fosfato en triptfano. Esta enzima est codificada por los genes trpA y trpB, que
codifican para los polipptidos A y B, respectivamente. Yanofsky y col. (1964)
analizaron las mutaciones en el gen trpA, las cuales produjeron alteraciones en
la subunidad A de la triptfano sintetasa, determinando una estrecha
correlacin entre los sitios mutados en el mapa del gen trpA y la ubicacin de
los aminocidos alterados en este polipptido (Fig. 8). A mayor distancia entre
dos sitios mutados en el mapa gentico de trpA, mayor distancia en las
substituciones de los aminocidos correspondientes en el polipptido A
(Yanofsky y col., 1964). Esto demostr una colinearidad entre la secuencia de
un gen y la de un polipptido.
26
Guanaina (G) a Citosina (C) tambin de 1:1, en los DNA aislados de varios
organismos. Estas relaciones se conocen como las Reglas de Chargaff. Por
otra parte, Rosalind Franklin, quien trabajaba en el laboratorio de Maurice
Wilkins, obtuvo los patrones de difraccin de rayos X para el DNA. Watson y
Crick, utilizando estos datos propusieron el modelo de la doble hlice, que
consista en que el DNA est formado por dos cadenas antiparalelas, una que
corre en la direccin 5-3, mientras que la otra lo hace en la direccin opuesta
(3-5). Estas cadenas tienen una estructura de -hlice y se hayan unidas por
dos y tres puentes de hidrgeno entre las bases A-T y G-C, respectivamente,
mientras que hacia la parte externa de la cadena, se localizan las
desoxirribosas unidas por los enlaces fosfodister, formando una especie de
barandal o pasamanos de una escalera. La determinacin de la estructura del
DNA trajo como consecuencia inmediata el establecimiento del modelo de
replicacin semiconservativa de esta macromolcula (Watson y Crick, 1953b) y
que fue posteriormente comprobada por Matthew Meselson y Franklin Stahl en
1958 en su clsico experimento de centrifugacin en gradientes de CsCl,
marcando el DNA primeramente con 15N, y posteriormente con 14N.
Con el paso de los aos, se han ido desentraando los secretos de las
clulas relacionados con los procesos de transmisin de la informacin
codificada en el DNA a los RNAs mensajeros (proceso conocido como
transcripcin), y de stos a las protenas mediante el proceso de traduccin.
Las maquinarias involucradas en estos procesos se conocen con bastante
profundidad. Tambin se han decifrado en parte, los mecanismos involucrados
en la modificacin postraduccional de las protenas, las vas de transporte
intracelulares, los mecanismos de transduccin de seales que permiten a la
27
clulas responder adecuadamente a las seales extracelulares, y muchos otros
procesos celulares.
28
donaron esperma y las mujeres sangre, para aislar el DNA, fraccionarlos y
clonarlos en vectores para su amplificacin y secuenciacin.
Tambin la compaa Celera Genomics emprendi la tarea de
secuenciar el genoma del humano. El 6 de abril del ao 2001 anunci la
secuenciacin completa del genoma, invirtiendo tan slo 7 meses para
conseguirlo. La estrategia que utilizaron fue la tcnica denominada en ings
shotgun approach, que involucra el fraccionamiento del DNA en fragmentos
pequeos y su secuenciacin al azar, para el posterior ensamble del
rompecabezas.
El reto siguiente ser determinar cul es la funcin de cada uno de los
genes, tanto en el funcionamiento normal del organismo como en los diferentes
estados patolgicos. Sin duda, un gran nmero de enfermedades de carcter
gentico que an no se les determina los genes involucrados en la patologa,
estarn perfectamente definidas en el prximo siglo.
29
Desde entonces, el hombre ha sido capaz de obtener clonas de chivos, vacas y
otros animales, a partir de clulas de embriones en estadios tempranos de
desarrollo.
Posteriormente, se procedi a clonar animales a partir de animales
adultos. As, a partir de una oveja hembra adulta se produjo a Dolly en febrero
de 1997 (Wilmut y col., 1997), tambin en el Instituto Roslin. La tcnica
empleada fue la transferencia nuclear (Fig. 9). Esta tcnica consiste en lo
siguiente: se tienen dos tipos de clulas, la clula donadora y la clula
receptora. Generalmente se utiliza como clula receptora un huevo no
fertilizado que se aisla del animal, una vez ocurrida la ovulacin. Con la ayuda
de un microscopio, se sujeta el huevo con una pipeta fina y se extrae el ncleo
con los cromosomas mediante la succin con una micropipeta extremadamente
fina. Posteriormente, la clula donadora (en este caso clulas de la ubre), que
ser la clula a copiar, con su ncleo intacto, se fusiona con la clula receptora
mediante una corriente elctrica. Algunas clulas fusionadas comienzan a
desarrollarse como si se trataran de un embrin normal y son capaces de
desarrollar un organismo completo si se implantan en el tero de una madre
postiza. Tambin se han utilizado fibroblastos para generar clonas de
animales adultos. En otros laboratorios ha sido posible clonar vacas y ratones.
Con esta tcnica, slo del 1 al 2% de los embriones sobrevive, y algunas
clonas que logran nacer, mueren tiempo despus, sin que se conozca la causa.
Esto debe ser un reflejo de la extrema complejidad en la reprogramacin
gentica.
Posteriormente, se ha aplicado esta tcnica de transferencia nuclear
para la generacin de animales transgnicos como Polly, una chiva que secreta
30
en la leche el factor IX humano, un factor de coagulacin utilizado en el
tratamiento de la hemofilia B. En este caso, la clula donadora contiene una
construccin de DNA conteniendo el gen que codifica para el factor IX humano,
previa seleccin con neomicina, ya que el vector usado en la construccin
contiene el gen de resistencia a este antibitico.
Cules pueden ser las posibles aplicaciones de los animales clonados?
Como ejemplos tenemos las siguientes: i) La obtencin de rganos animales
modificados para realizar transplantes de rganos, como por ejemplo los de
cerdo, que tengan modificada la enzima -galactosil transferasa. Esta enzima
modifica las protenas en las clulas porcinas, lo que podra originar una
reaccin inmune hiperaguda si un rgano normal porcino se transplanta a un
humano. La afectacin de esta actividad podra ser til para la realizacin de
transplantes de rganos del cerdo. ii) Puede ser la produccin de animales que
tengan defectos genticos que produzcan enfermedades parecidas a la del
humano, como por ejemplo la fibrosis qustica, con el objeto de estudiar la
evolucin de la misma y las posibles terapias. iii) La obtencin de clulas
pluripotenciales (stem cells) utilizando la tcnica de transferencia nuclear, a
partir de individuos afectados en algn tejido u rgano, para su posterior
transplante con el objeto de adquirir las funciones normales del tejido, sin que
se presenten los problemas de rechazo inmunolgico. Seguramente, nuevas
aplicaciones se desarrollarn en el futuro.
13. CONCLUSIONES
31
Durante el siglo XX, el desarrollo de la gentica mendeliana permiti establecer
los patrones involucrados en la transmisin gentica de los padres a los hijos,
as como mejorar con fines econmicos, un gran nmero de organismos.
Tambin se han generado colecciones de mutantes relacionadas con un
proceso biolgico determinado, como la secrecin, la glicosilacin, el ciclo
celular, etc., que han sido fundamentales para conocer paso a paso, cmo se
llevan a cabo. Con el desarrollo de nuevos procesos tecnolgicos de carcter
multidisciplinario en la biologa molecular, biologa celular y gentica
molecular, el siglo XXI depara una revolucin biotecnolgica como nunca antes
vista en la historia de la humanidad, que harn que muchas de las historias de
ciencia ficcin se vuelvan una realidad. Sin embargo, a partir de este momento,
es fundamental que todos, gobernantes, cientficos y sociedad en general,
pongamos especial atencin y cuidado en los nuevos desarrollos para evitar
que se atente contra la naturaleza, y se pretenda utilizar el conocimiento del
genoma humano, como una mercanca.
AGRADECIMIENTOS
ABREVIATURAS
PCR
32
HbA
Homoglobina normal.
HbS
Hemoglobina S.
BIBLIOGRAFA
Avery, O.T., MacLeod, C.M. and McCarty, M. 1944. Studies on the chemical
nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types.
I. Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated
from Pneumococcus. J. Exp. Med. 79:137-158.
Ayala, F.J. y Kiger, J.A. Jr. 1984. Gentica moderna. Fondo Educativo
Interamericano. Barcelona, Espaa.
Bateson, W. and Saunders, E.R. 1902. Experimental studies in the physiology
of heredity. From reports to the Evolution Committee of the Royal
Society. 1:1-160.
Bateson, W., Saunders, E.R. and Punnett, R.C. 1904. Experimental studies in
the physiology of heredity. From reports to the Evolution Committee of
the Royal Society. 2:1-53.
Bateson, W. and Punnett, R.C. 1911. On gametic series involving reduplication
of certain terms. J. Genetics 1:239-302.
Beadle, G.W. and Tatum, E.L. 1941. Genetic control of biochemical reactions in
Neurospora. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 27:499-506.
Boveri, T. 1902. Ueber Mehrpolige Mitosen als Mittel zur Analyse des Zellkerns.
Verb. d. Phys.- Med. Ges. zu Wrzburg, N.F. Bd. 35:67.
Bridges, C. 1914. Direct proof through nondisjunction that the sex-linked genes
of Drosophila are borne by the X chromosome. Science 40:107-109.
33
Bridges, C. 1916. Nondisjunction as proof of the chromosome theory of
heredity. Genetics 1:1-52, 107-163.
Chargaff, E. 1950. Chemical specificity of nucleic acids and mechanisms for
their enzymatic degradation. Experientia 6:201-209.
Correns, C. 1900. G. Mendels Regel ber das Verhalten der
Nachkommenschaft der Rassenbastarde. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 18:158168.
de Vries, H. 1900. Sur le loi de disjonction des hybrides. C.R. Acad. Sci., Par.
130:845-847.
Franklin, R.E. and Gosling, R.G. 1953. Molecular configuration in sodium
thymonucleate. Nature 171:740-741.
Garrod, A.E. 1902. The incidence of alkaptonuria: a study in chemical
inividuality. Lancet 2:1616-1620.
Garrod, A.E. 1909. Inborn error of metabolism. Oxford University Press. Oxford,
England.
Griffith, F. 1928. The significance of pneumococcal types. J. Hyg. 27:113-159.
Griffiths, A.J.F., Miller, J.H., Suzuki, D.T., Lewontin, R.C. and Gelbart, W.M.
1996. An introduction to genetic analysis. Fith Edition. W. H. Freeman
and Company. New York, U.S.A.
Hershey, A.D. and Chase, M. 1952. Independent functions of viral protein and
nucleic acid in growth of bacteriophage. J. Gen. Physiol. 36:39-56.
Mendel, G.J. 1865. Versuche ber pflanzen-hybriden (Experiments on plant
hybrids). Verh. natur. Vers. in Brnn. 4.
Meselson, M. and Stahl, F.W. 1958. The replication of DNA in E. coli.. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 44, 671-682.
34
Morgan, T.H. 1910a. Chromosomes and heredity. Am. Nat. 44:449-496.
Morgan, T.H. 1910b. Sex-limited inheritance in Drosophila. Science 32:120-122.
Morgan, T.H. 1922. Non criss-cross inheritance in Drosophila melanogaster.
Biol. Bull. 42:267-274.
Stevens, N.M. 1905. Studies in spermatogenesis with especial reference to the
accesory chromosome. Carn. Inst. Wash. Publ. 36:1-33.
Sturtevant, A.H. 1913. The linear arrangement of six sex-linked factors in
Drosophila, as shown by their mode of association. J. Exp. Zool. 14:4359.
Sutton, W.S. 1902. On the morphology of the chromosome gropus in
Brachystola magna. Biol. Bull. 4:1.
Sutton, W.S. 1903. The chromosomes in heredity. Biol. Bull. 4:231-251.
Tschermack, E. 1900. ber kunstliche Kreuzung bei Pisum sativum. Ber. Dtsch.
Bot. Ges. 18:232-239.
Watson, J.D. and Crick, F.H.C. 1953a. Molecular structure of nucleic acids: A
structure for deozyribose nucleic acids. Nature 171:737-738.
Watson, J.D. and Crick, F.H.C. 1953b. Genetic implications of the structure of
deoxyribose nucleic acid. Nature 171:964-967.
Wilmut, I., Schnieke, A.E., McWhir, J., Kind, A.J., Campbell, K.H. 1977. Viable
offspring from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-813.
Wilson, E.B. 1909. Recent researches un the determination and heredity of sex.
Science, N.S. 29:53-70.
Yanofsky, C., Carlton, B.C., Guest, J.R., Helinski, D.R. and Henning, U. 1964.
On the colinearity of gene structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51:
266-272.
35
PIES DE FIGURAS
36
37
falciforme, en una cromatografa bidimensional en capa fina, mostr una sola
diferencia (sealada en la figura). Posteriormente se determin que estos dos
pptidos slo difereran en un aminocido.
Captulo 4
Tuberculosis
Blanca Rivera1 y Francisco Solis2.
1
NDICE
1. Introduccin.
1.1 Tuberculosis: una enfermedad reemergente.
1.2 Asociacin entre VIH y tuberculosis.
1.3 Multirresistencia de Mycobacterium tuberculosis.
2. Objetivos del captulo.
3. Panorama actual de la tuberculosis en Mxico.
4. Clasificacin de las micobacterias.
4.1 Biologa celular de las micobacterias.
4.2 Biologa molecular de Mycobacterium tuberculosis.
4.3 Caractersticas clnicas de las micobacterias y su interaccin con el
sistema inmunolgico.
4.4 Factores de virulencia en las micobacterias.
5. Deteccin e identificacin de micobacterias.
5.1 Microscopa directa.
5.2 Cultivo.
1. INTRODUCCIN
como base estos datos, se puede considerar que a pesar de conocer el agente
causal de la tuberculosis desde 1882 y disponer de frmacos antituberculosos
altamente eficaces y de un programa de control de la tuberculosis, este
padecimiento constituye un problema de salud pblica serio (Sistema Nacional de
Vigilancia Epidemiolgica, 1999).
ii)
iii)
Las micobacterias son bacilos aerobios que no se tien fcilmente con los
colorantes de Gram. Estos microorganismos son bacilos cido alcohol resistentes,
y son los nicos organismos, junto con Nocardia asteroides, en poseer esta
caracterstica. Este comportamiento tintorial se debe a la capacidad de estos
microorganismos en retener la carbolfuchina aun bajo tratamientos tan drsticos
como el uso de una solucin de etanol-HCl. La capacidad retentiva del colorante
se debe a la alta concentracin de lpidos (60%) en la pared celular del bacilo,
aunado a la presencia del cido miclico tambin en su pared celular (Fig. 1).
M. tuberculosis es un aerobio obligado. Su pared celular contiene varios
lpidos complejos: los cidos miclicos, que son cidos grasos de cadenas largas
(de 78 a 90 tomos de carbono), los fosftidos y la llamada cera D. Esta ltima,
combinada con ciertas protenas, tiene una alta antigenicidad que es utilizada para
la prueba drmica del PPD (Protein Purified Derivative).
M. tuberculosis es ligeramente resistente a cidos y bases, as como a la
deshidratacin. Estas caractersticas son sumamente importantes en la
propagacin de este pernicioso patgeno.
10
11
12
13
14
15
16
5.2 Cultivo
17
18
19
son: i) el crecimiento a distintas temperaturas (25, 30, 33, 37, 42 y 45C), ii)
pigmentacin por la produccin de niacina (Runyon y col., 1959), iii) reduccin de
nitratos (Virtanen, 1960), iv) tolerancia del NaCl al 5% (Kubica, 1973), v)
desaminacin de la pirazinamida (Wayne y col., 1976), vi) produccin de ureasa,
vii) crecimiento en agar MacConkey sin cristal violeta, viii) inhibicin por la
hidracida del cido tiofeno-2-carboxlico (o TCH) 2 g/ml (Vestal y Kubica, 1967),
ix) inhibicin por el cido paraminobenzoico (500 mg/ml), x) utilizacin de la
arilsulfatasa (Kubica y Vestal, 1961), xi) hidrlisis de Tween 80 (Wayne y col.,
1964) y xii) produccin de catalasa.
20
21
22
23
6. TRATAMIENTO
24
25
26
8. CONCLUSIONES
27
ABREVIATURAS
BACTEC
BCG
Bacilo calmette-Gurin.
IL
Interleucina.
IFN
Interfern.
IMC
LAM
Lipoarabinomanana.
LPS
Lipopolisacridos fosforilados.
PCR
PPD
RFLP
PANTA
TAES
TNF
VIH
BIBLIOGRAFA
Anagyros, P., Astill, D.S.J. and Lim, I.S.L. 1990. Comparison of improved BACTEC
and Lwestein-Jensen media for the culture of mycobacteria from clinical
specimens. J. Clin. Microbiol. 28:1288-1291.
28
29
Cave, M.D., Eisenach, K.D., Templeton, G., Salfinger, M., Mazurek, G., Bates, J.H.
and Crawford, J.T. 1991.Stability of DNA fingerprint pattern produced with
IS6110 in strain Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 32:262-266.
Clifton, E.B.III. and Schroeder, B.G. 2000. DNA microarrays: translational tools for
understanding the biology of Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol.
8:209-210.
Cole, S.T., Brosch, R., Parkhill, J., Garnier, T., Churcher, C., Harris, D., Gordon,
S.V., Eiglmeier, K., Gas, S., Barry, C.E. 3rd, Tekaia, F. et al.,
1998.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the
complete genome sequence. Nature 393:537-544.
Cohn, D.L., Waggoner, R.F. and McClatchy, J.K. 1986.The 7H11 medium for the
cultivation of mycobacteria. Amer. Rev. Respir. Dis. 98:295-2966.
Coletsos, J.P. 1960. Miliev et modalits de culture adapts a la ranimation et la
multiplication in vitro de M. tuberculosis de vitalit rduite, de viabilit
phmre ou en tat de quiescence. Ann. Inst. Past. 99:475-479.
Collins, C.H. and Grange, J.M. 1983. The bovine tubercle bacillus. J. J. Appl.
Bacteriol. 55:13-29.
Collins, D.M., Gabric, D.M. and De Lisle, G.W. 1988.Typing of Mycobacterium
bovis isolates from cattle and other animals in the same locality. N.Z. Vet. J.
36:45-46.
Cousinis, D.V., Francis, B.R. and Gow, B.L. 1989. Advantages of a new agar
medium in the primary isolation of Mycobacterium bovis. Vet. Microbiol.
20:89-95.
30
Cummings, D.M., Ristroph, D., Camargo, E.E., Larson, S.M. and Wagner, H.N.J.
1995. Radiometric detection of the metabolic activity of Mycobacterium
tuberculosis. J. Nucl.Med. 16:1189-1191.
Cheville, N.F. 1988. Introduction to Veterinary Pathology. Iowa State University
Press/AMES: 303-308.
Christopher, K.W., Sheng Ho., Christopher H.S., Joseph Ch., Dominic, Ch.,
Roland, L. and Kar-neng, L. 1997. Cytokine gene expression profile of
circulating CD4+ T cells in active pulmonary tuberculosis. Chest 111: 60611. David, H.L.1973. Response of mycobacteria to ultra violet light radiation.
Amer. Rev. Respir. Dis. 108:1175-1185.
David, H.L., Jahan, M.T., Jumin, A., Grandry, J. and Lehman, E.H. 1978.
Numerical taxonomy analysis of Mycobacterium africanum. Int. Syst.
Bacteriol. 28:467-472.
Di Perry, G., Cruciani, M., Danzi, M.C., Luzzati, R., De Checchi, G. and Malena, M.
1989. Nosocomial epidemic of active tuberculosis among HIV-infected
patients. Lancet 2:1502-1504.
Doodley, S.W., Villarino, E. and Lawrence, M. 1992. Nosocomial transmission of
tuberculosis in a hospital unit for HIV infected patients. The American
Journal of Medical Asociation. 267:2632.
Ellner, J.J., Hinman, A.R., Dooley, S.W., Fischl, M.A., Sepkowitz, K.A., Goldberger,
M.J., Shinnick, T.M., Iseman, M.D., Jacobs, W.R. Jr. 1993.Tuberculosis
symposium. Emering problems and promise. J. Infect: Dis. 168:537-551.
Farga, V. 1992. Cap 1 y 2, Tuberculosis, Ed. Mediterrneo, Santiago de Chile:1734.
31
Fox, J.L. 1992. Coalition reacts to surge of drug-resistans tuberculosis. ASM News
58:135-139.
Frothingham, R., Hills, H.G. and Wilson, K.H. 1994. Extensive DNA sequence
conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin.
Microbiol. 32: 16639-1643.
Goren, M.B., Brokl, O., Roller, P., Fales, H.M. and Das, B.C. 1976. Sulfatides of
Mycobacterium tuberculosis: the structure of the principle sulfetide (SL-1).
Biochem. 15:2728-2734.
Goto, M., Oka, S., Okazum, I. K., Kimura, S. and Shimada, K. 1991. Evaluation of
acridium-ester-labeled DNA probes for identification of Mycobacterium
tuberculosis and M. avium. M. intracellulare complex in culture. J.
Clin.Microbiol. 29:2473-2476.
Greene, C.E. 1984. Clinical Microbiology and infections. Diseases of the dog and
cat. W.B. Saunders Company. Philadelphia (USA):633-645.
Grosskinsky, C. M., Jacobs, W.R., Clark-Curtiss, J.E. and Bloom, B. R. 1989.
Genetic relationships among Mycobacterium leprae, Mycobacterium
tuberculosis and candidate leprosy vaccine strains determined by DNA
hybridization: identification of a M. leprae-specific repetitive sequence.
Infect. Immun. 57:1535-1541.
Heersman, H.F., Kremer, K. and Van Embden, J.D.A. 1998. Computer Analysis of
IS6110 RFLP Patterns of Mycobacterium tuberculosis. En Mycobacteria
Protocols. Parish T and Stoker N., ed. 395-422. Humana Press. New
Jersey.
32
Hubner, R.E., Good, R.C. and Tokards, J.I. 1993. Current practices in
mycobacteriology: results of a survey of public health laboratories. J. Clin.
Microbiol. 31:771-775.
Hunter, S. and Breanan, P. 1990. Evidence for the presence of a
phosphotidylinositol anchor on the lipoarabinomannan and lipomannan of
Mycobacterium tuberculosis. J. Biol. Chem. 265:9272-9279.
Jensen, K.A. 1932. Reinzchtung und typenbestimmung von
tuberkelbazillenstammen. Zbl. Bakt. Abt: 125-132.
Jubb, K.V.F. and Kennedy, P.C. 1980. Patologa de los animales domsticos.
Editorial Hemisferio Sur Academic Press, Inc, I-II.
Kaplan, G., Freedman, V.H., Rusell, D. and Colston, J. 1998. Tuberculosis
research comes of age. Mol. Med. Today 4:330-333.
Kaufmann, S.H.E. 1990. Immunity to mycobacteria. Res. Microbiol. 141:765-768.
Kirihara, J.M., Hillier, S.L. and Coyle, M.B. 1985. Improved detection times
for M. avium complex and M. tuberculosis with the BACTEC radiometric
system. J. Clin. Microbiol. 22:841-845.
Krahenbuhl, J.L. 1995. Role of mycobacterial constituents in regulation of
macrophage affect function. En: virulence mechanisms of bacterial
pathogens. (2ed). Roth, J.A. (Ed). American Society for Microbiology,
Washington D.C. NSA 9:97-114.
Kramer, F., Modilevsky, T., Waliany, A.R. and Barnes, P.FJ. 1990. Delayed
diagnosis of tuberculosis in patients with immunodeficiency virus infection.
Amer. J. Med. 89:451-456.
33
Kubica, G.P. 1973. Differential identification of mycobacteria. VII Key feactures for
identification of clinically significant mycobacteria. Amer. Rev. Resp. Dis.
107:9-21.
Kubica, G.P. and Vestal, A.L. 1961. The arylsulfatase activity of acid-fast bacilli I.
Investigation of stock cultures of acid-fast bacilli. Amer. Rev. Resp. Dis.
83:728-732.
Lebrun, L., Espinasse, F., Proveda, J.D. and Vicent-Levy-Frbault. 1992.
Evaluation of nonradioactive DNA probes for identification of mycobacteria.
J. Clin. Microbiol. 30:2476-2478.
Libana, E., Aranaz, A., Francis, B. and Cousins, D. 1996. Assessment of genetic
markers for species differentiation within the Mycobacterium tuberculosis
complex. J. Clin. Microbiol. 34: 933-938.
Lwenstein. 1931. Die Zchtung und typenbestimmung von
tuberkelbazillenstemmen. Zbl. Bakt. Abt. 125-132.
Lungu, O., Latta, P.D., Wertzman, I. and Silverstein, S. 1994. Differentiation of
Nocardia from rapidly growing Mycobacterium species by PCR-RFLP
analysis. Diag. Microbiol. Infect. Dis. 18: 13-18.
Mangura, B.T. and Reichman, L.B. 1994. Prevention and treatment of
Mycobacterium avium complex infection. Res. Microbiol. 145:181-187.
Mendiola, M.V., Martin, C., Ota, I. and Gicquel, B. 1992. Analysis of regions
responsible for IS6110 RFLP in a single Mycobacterium tuberculosis. Strain
Res. Microbiol. 143:767-772.
34
35
Phillipp, W.J. and et.al. 1996. An integrated map of the genome of tubercle
bacillus, Mycobacterium tuberculosis H37Rv, and comparison with
Mycobacterium Leprae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3132-3137.
Quinn, P.J., Carter, M.E., Markey, B. and Carter, G.R. 1994. Clinical Veterinary
Microbiology. Wolfe Publishing 156:169.
Riley, LW., Ceballos, BSO., Trabulsi, M.R., Fernndez-Toledo and Blake, P.A.
1984. The significance of hospitals as reservoirs for endemic multiresistant
Salmonella thyphimurium causing infection in urban Brazilian children.
J.Infect Dis. 150:236.
Runyon, E.H., Solin, M.J. and Harris, H.W. 1959. Distinguishing mycobacteria by
the niacin test. Amer. Rev. Tuberc. 79:663-665.
Saiki, R.K., Schart, S. and Faloona, F. 1985. Enzymatic amplification of globin
genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell
anemia. Science 230:1350-1354.
Saliers, A.A. and Whitt, D.D. 1994. Bacterial pathogenesis a molecular aproach.
American Society of Microbiology Press:307-321.
Siddiqui, M. and Hawangho, C.C. 1986. A new antimicrobial mixture (PANTA) for
effective supresion of non-mycobacterial contamination during primary
isolation of mycobacteria. Abstracts of. Amer. Soc. Microb 1986:135
Sinclair, K., Challans, J.A., Kazwala, R.R., Hewinson, R.G. and Sharp, J.M. 1995.
A multiplex polymerase chain reaction for distinguishing Mycobacterium
tuberculosis from mycobacterium complex. Mol. Cell. Probes. 9:291-295.
Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiolgica. 1999. "Epidemiologa" Sistema
nico de informacin. 51: Mxico D.F p 19.
36
Small, P.M. and Van Embden, D.A. 1991. Molecular epidemiology of tuberculosis.
En Tuberculosis: pathogenesis, protection and control. Bloom B.R. (Ed.).
American Society for Microbiology. Washington D.C. (USA) pages:569-582.
Sreevatsan, S., Pan, X., Stockbauer, K.E., Connell, N.D., Kreiswirth, B.N.,
Whittam, T.S., Musser, J.M. 1997.Restricted structural gene polymorphism
in the Mycobacterium tuberculosis complex indicates evolutionarily recent
global dissemination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:9869-9874.
Stager, C.E., Libonati, J.P. and Siddiqui, S.H. 1991. Role of solid media when used
in conjunction with the BACTEC system for mycobacterial isolation and
identification. J. Clin. Microbiol. 29:154-157.
Stanford, J.L. and Grange, J.M. 1974. The meaning and structure of species as
applied to mycobacteria. Tubercle 55:143-152.
Steingrube, V.A., Gibson, J.L., Brown, B.A., Zhang, V., Wilson, R.W., Rajagopalan,
M. and Wallance R.J. 1995. PCR amplification and restriction endonuclease
analysis of a 65 kilodalton heat shock protein-gene sequence for taxonomic
separation of rapidly growing mycobacteria. J. Clin. Microbiol. 33:149-1153.
Stonebrink, B. 1958. The use a pyruvate containing egg medium in the culture of
isoniazid resistant strains of Mycobacterium tuberculosis var hominis. Acta.
Tuberc. Scand. 35:67-80.
Sudre, P.G. and Kochi, A. 1992. Tuberculoisis: a global overview of the situation
today. Bull. WHO. 70:149-159.
Thoen, C.O. and Himes, E.M. 1986. Mycobacterium. En: Pathogenesis of bacterial
infections in animals. Thoen, C.O. (Ed.). Ames: Iowa State University
Press:26-37.
37
Truant, J.P., Brett, W.A. and Thomas, W., Jr. 1962. Fluorescence microscopy of
tubercle bacilli stained with auramine and rhodamine. Henry Ford Hosp.
Med. Bull. 10: 287-296.
Van Embden, J.D.A., Van Soolingen, D., Small, P.M. and Hermans, P.W.D. 1992.
Genetic markers for the epidemiology of tuberculosis. Res. Microbiol.
143:385-391.
Van Embden, J.D.E., Cave, M.D., Crawford, J.T., Dale, J.W., Eisenach, K.D. and
Gicquel, V. 1993. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by
DNA fingerprinting: recomendations for standarized methodology. J. Clin.
Microbiol. 31:406-409.
Van Soolingen, D., De Haas, P.E.W., Haagsma, J., Eger, T., Hermans, P.W.M.,
Ritacco, V., Alito, A. and Van Embden, J.D.A. 1994. Use of various genetic
markers in differentiation of Mycobacterium bovis strain from animals and
humans and for studying epidemiology of bovine tuberculosis. J. Clin.
Microbiol. 32:24-25.
Vannechoutte, M., Debeenhouwer, H., Claeys, G., Verschraegen, G., Derouck, A.,
Paepe, N., Elaichouni, A. and Portaels, F. 1993. Identification of
mycobacteria species by using amplifed ribosomal DNA restriction analysis.
J. Clin. Microbiol. 318:2061-2065.
Vestal, A.L. and Kubica, G.P. 1967. Differential identification of mycobacteria. III.
Use of thiacetazone, thiofen-2-carboxylic acid hidrazine and
triphenyltetrazolium. Scand J. Respir. Dis. 48:142-148.
Virtanen, S. 1960. A study of nitrate reduction by mycobacteria. Acta. Tuber.
Scand. Suppl. 48:1-119.
38
Wayne, L.G., Doubek, J.R.,and Russell, R.L, 1964. Classification and identification
of mycobacteria. I. Tests employing Tween 80 as substrate. Amer. Rev.
Resp. Dis. 90:588-597.
Wayne, L.G., Nel, E.E., Pattyn, S.R., Richards, P.A., Showalter, S., Slosarek, M.,
Szabo, I., Tarnok, Tsukamtua M., Vergmann, B., and Wolinslry, E.1976.
Highly reproducible techniques for use in systematic bacteriology in the
genus Mycobacterium: tests for niacin and catalase and for resistance to
isoniazid, thiohene-2-carboxilic acid hydrazine, hydroxylamine, and pnitrobenzoate. International J. Syst. Bacteriol. 266:311-318.
Yeager H.J., Lacy J., Smith L.-R., and LeMaistre C.A. 1976. Quantitative studies of
mycobacterial populations in sputum and saliva. Amer. Rev. Resp. Dis.
95:998-1004.
PIES DE FIGURAS
Captulo 5
Es posible obtener una vacuna contra
la amibiasis humana?
Esther Orozco1, Guillermina Garca-Rivera1, Mario A. Rodrguez1,
Francisco Sols2, Carolina Martnez3, Ramn Ocadiz3 y Juan Pedro
Luna Arias4
1
Email: esther@mail.cinvestav.mx
PALABRAS CLAVE: Entamoeba histolytica, vacunas, adhesina de 112 kDa, EhADH112,
EhCP112, mutantes en adhesin.
NDICE
1. Introduccin
1.1 La amibiasis humana y su epidemiologa
2. Objetivos del captulo
3. El quiste: la fase infectiva de Entamoeba histolytica
4. El trofozoto es la fase invasiva de E. histolytica
5. Las fases del mecanismo de agresin de los trofozotos de E. histoltyica
5.1 La adhesin de la amiba a la clula blanco
2
5.2 La participacin de toxinas y proteasas en el mecanismo de agresin de la
amiba
5.3 Papel de la fagocitosis en el mecanismo de agresin de la amiba
5.4 La digestin de las clulas fagocitadas por la amiba
6. Estrategias en el diseo de vacunas contra la amiba
6.1 Generacin de mutantes de E. histolytica deficientes en adhesin y en
virulencia
6.2 Genes y polipptidos que forman la adhesina de 112 kDa
7. CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
1. INTRODUCCIN
3
enfermedades infecciosas producidas por protozoarios, al igual que la mayora de
las producidas por bacterias y virus, son enfermedades propias de la pobreza. Un
gran nmero de ellas han sido prcticamente erradicadas de los pases con niveles
de vida ms altos, pero persisten en pases como el nuestro, en los que, las
condiciones sanitarias no son las ms adecuadas. Entre estas enfermedades se
encuentran, adems de la amibiasis y la malaria, la tuberculosis, el clera, la tifoidea,
entre otras. El sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se presenta cada vez
ms en los pases pobres, con menor nivel de educacin y desarrollo.
Para evitar estas infecciones y erradicarlas en forma definitiva, es necesario
establecer medidas de prevencin, las cuales radican en hbitos de higiene
aparentemente simples, como lavarse las manos despus de ir al bao y antes de
tocar los alimentos, lavar las frutas y verduras con agua limpia y evitar comer
alimentos que pudieran estar contaminados. Un aspecto fundamental en la lucha
contra las enfermedades parasitarias es lograr una educacin en salud que les
permita a todos los habitantes de un pas conocer la forma de evitar adquirir y
propagar las infecciones. Desafortunadamente existen grandes ncleos de poblacin
que carecen de agua potable y de drenaje y su nivel de educacin es muy bajo, lo
que dificulta la prctica de estos hbitos de salud. Es suficiente que unos cuantos
individuos sean portadores de los parsito para que las infecciones se diseminen,
convirtindose en enfermedades endmicas, con eventuales brotes epidmicos.
Mxico se encuentra entre los pases que tiene un menor gasto de salud por
habitante en Amrica Latina. Por otra parte, las campaas de educacin para la
salud han sido hasta ahora pocas y poco efectivas. El nivel de educacin de la
poblacin apenas excede los seis aos y existen ncleos de poblacin con
4
analfabetismo hasta del 7%. Enfermedades como la malaria y la amibiasis siguen
siendo problemas de salud en Mxico.
La investigacin sobre los protozoarios ha sido fundamental para entender la
biologa de estos microorganismos y desarrollar formas efectivas para combatirlos.
Sin embargo, a pesar de los millones de dlares invertidos en el mundo para
desarrollar vacunas en contra de protozoarios, no existe todava ninguna que haya
mostrado utilidad real. Los protozoarios son microorganismos que todava guardan
muchos secretos sobre su biologa y eso ha complicado el diseo de vacunas
eficientes contra ellos. La malaria es uno de los ejemplos ms dramticos. Existen
decenas de laboratorios en el mundo estudiando a las distintas especies de
Plasmodium, el agente causal de la malaria, y haciendo esfuerzos muy serios para
obtener una vacuna contra este protozoario. Los resultados han proporcionado una
gran cantidad de conocimiento sobre el microorganismo, pero la vacuna no se ve
cerca todava.
La amiba, como otros protozoarios, presenta gran variabilidad fenotpica y
genotpica. Los factores y mecanismos que determinan esta variabilidad han sido
muy poco estudiados. Al no conocerse a fondo la biologa del parsito, ni saber los
mecanismos que participan en la virulencia de los trofozotos, ni tener claro cmo es
que los trofozotos cambian su fenotipo e incluso su genotipo, es difcil bloquear su
accin por medio de la elaboracin de una vacuna eficiente contra esta parasitosis.
Por tanto, el control de la amibiasis se realiza todava por medio del tratamiento con
diferentes frmacos. Esto conlleva la amenaza del surgimiento de lneas de E.
histolytica resistentes a las drogas, las cuales, como ha sido demostrado, presentan
el fenotipo de multirresistencia a drogas (MDR por sus siglas en ingls: multidrug
5
resistance). Algunos grupos de investigacin propusieron hace algunos aos, que
E. histolytica estaba compuesta por dos especies, una patgena y otra no patgena
a la que han llamado Entamoeba dispar. Sin embargo, cada da hay evidencias
nuevas que demuestran que E. histolytica es un organismo que puede expresar su
virulencia o aparecer inocuo dependiendo de las condiciones del medio en que se
encuentre. Todava no se ha descubierto la forma de manipular reproduciblemente la
expresin de la virulencia de la amiba, aunque, al pasarla por hgado de hmsteres
se recuperan trofozotos altamente virulentos que van perdiendo su agresividad a
travs del tiempo de cultivo in vitro. Es por estas razones y por otras algunas otras
que no discutimos en este captulo por falta de espacio, que es indispensable seguir
estudiando al parsito para conocerlo a fondo y poderlo combatir eficientemente.
Este captulo tiene como objetivo, mostrar y discutir los esfuerzos que nuestro grupo
ha realizado para disear el camino hacia una vacuna contra la amibiasis. Con la
advertencia de que ste es un camino largo y para llegar a la meta se requiere
todava de mucho trabajo, y recursos humanos y materiales.
6
cuatro ncleos y una gruesa cubierta de quitina, que lo protege de los cambios
ambientales. No se adhiere al epitelio intestinal, por lo que sale con las heces
fecales. Debido principalmente a su cubierta protectora, puede vivir fuera del
hospedero en el medio ambiente, a veces por meses, dependiendo de las
condiciones de temperatura y humedad en que encuentre. Es resistente a altas
concentraciones de cloro, pero puede eliminarse por filtracin y destruirse por
ebullicin, por contacto con iodo (200 ppm) y cido actico (5-10%). Cuando los
quistes han salido con las heces fecales, contaminan las manos, el agua, las
verduras, las frutas y los alimentos en general, hasta encontrar otro al cual infecta,
por lo que es importante eliminar los quistes tanto del agua y de los alimentos
contaminados, as como del intestino de los portadores y diseminadores de la
enfermedad. El quiste es la fase infectiva de E. histolytica.
7
reto fundamental es bloquear su accin patgena contra las clulas. El trofozoto es
la fase invasiva de E. histolytica.
Para evitar la expulsin del trofozoto del intestino humano con las heces fecales es
necesario que se adhiera al epitelio intestinal. Este proceso es especfico y tiene la
8
fuerza suficiente para que el movimiento peristltico no lo desprenda y lo arrastre
hacia afuera. Dado que el trofozoto es una clula muy sensible a los cambios de
temperatura, humedad y presin osmtica, si este sale con las heces, muere
inmediatamente en el medio ambiente. Sin embargo, si el trofozoto resiste la fuerza
del flujo intestinal, podr dividirse y colonizar el intestino, para despus invadir la
mucosa y en algunos casos, penetrar el epitelio. En el proceso de adhesin del
trofozoto a la clula blanco, las molculas de superficie de la amiba juegan un papel
fundamental. Entre los cientos de molculas que conforman la membrana
plasmtica, hay unas cuantas que participan especficamente en la adhesin de los
trofozotos. Estas molculas se conocen con el nombre genrico de adhesinas.
Identificar y caracterizar a las adhesinas permitir estudiar uno de los primeros
pasos en la citopatogenicidad de la amiba. Pero no slo eso, sino que al conocer su
estructura se podrn bloquear y por tanto, evitar la adhesin a la clula blanco, lo
que traer como consecuencia la inhibicin de la destruccin celular por parte de la
amiba.
Una adhesina celular debe tener varias caractersticas: i) En primer lugar,
debe de estar en la superficie para poder contactar a la clula blanco. ii) Adems,
debe ser capaz de unirse a molculas de la superficie de la clula blanco. iii) Los
anticuerpos dirigidos en contra de ella debern inhibir la adhesin del trofozoto a la
clula blanco; si estos anticuerpos son monoclonales, la inhibicin de la funcin de la
adhesina ser ms especfica. Sin embargo, puede suceder que el anticuerpo
reconozca molculas en la vecindad de la supuesta adhesina e interfiera con ella por
razones de tamao. En este caso, los resultados de la inhibicin de la adhesin por
los anticuerpos en contra de la supuesta adhesina, nos estarn dando pistas
9
equivocadas. iv) La adhesina purificada deber pegarse a la clula blanco, evitando
su contacto con el trofozoto, lo que traer como consecuencia la inhibicin de la
adhesin. iv) Las mutantes amibianas incapaces de adherirse a la clula blanco
debern presentar alteraciones en la adhesina, o en ocasiones podrn mostrar
ausencia de la molcula. v) Al revertir la alteracin en las mutantes, la adhesina ser
funcional y por tanto, se deber reestablecer la adhesin. La tecnologa del DNA
recombinante permite probar la funcin de la molcula candidato a ser adhesina, la
cual puede ser sintetizada por organismos heterlogos, como bacterias y levaduras.
Tambin pueden sintetizarse adhesinas con una serie de alteraciones en su
secuencia de nucletidos, lo que dar lugar a molculas no funcionales.
Por su funcin, las adhesinas participan en uno de los primeros eventos de la
agresin de la amiba, por tanto, son molculas que deben tomarse en cuenta en el
diseo de vacunas.
Durante el proceso de invasin, los trofozotos se abren paso por los tejidos. Esto lo
realizan daando a las clulas y digiriendo la matriz extracelular. Se han detectado
varias molculas que pudieran participar en el dao producido a la clula. La que
llama ms la atencin es una protena amibiana, pequea, llamada amebaporo, que
se inserta en la membrana de la clula blanco y le produce agujeros (Lynch y col.,
1982). Han sido propuestas otras molculas de la amiba con actividades txicas
para la clula blanco, pero no se han identificado ms all de su actividad
10
(Lundbland y col., 1985; Udezulu y Leitch, 1987). Para pasar a travs de la matriz
extracelular, la amiba se vale de colagenasas (Moz y col., 1982) y otras
proteasas. Entre estas ltimas, las ms importantes son las llamadas cistena
proteinasas, que se caracterizan porque el grupo sulfhidrilo de la cistena est
involucrado en su actividad cataltica. En la amiba se han descubierto ya siete
diferentes cistena-proteasas (Bruchhaus y Tanich, 1996; Garca-Rivera y col, 1999).
Estas enzimas participan en procesos celulares importantes, se encuentran en todas
las clulas y por tanto, pudieran no estar relacionados con la virulencia del parsito.
Sin embargo, si son secretadas, son potentes disolventes de la matriz extracelular y
producen dao a las clulas con las cuales entran en contacto.
11
introduce la clula a su citoplasma. En este proceso intervienen activamente el
citoesqueleto, la actina que se polimeriza y forma microfilamentos por debajo de la
membrana y alrededor de todo canal fagoctico (Bailey y col., 1985). Estn presentes
tambin la miosina (Voigt y col, 1999) y otras molculas citoplsmicas y de la parte
interna de la membrana plasmtica (Vargas y col., 1996; Ghosh y Samuelson, 1997).
12
inmune adecuada del hospedero en contra del parsito. Por adecuada queremos
decir una respuesta capaz de neutralizar al parsito. Desde el descubrimiento de las
vacunas por Jenner y despus confirmado por Pasteur, quienes lograron inmunizar
contra la viruela y la rabia inoculando al microorganismo completo pero inactivado,
se ha repetido el esquema de vacunacin para varios microorganismos. Para
obtener una vacuna contra amibas se ha intentado utilizar tambin al parsito
completo o partes del mismo para inmunizar animales. Sin embargo, esta tcnica
eficiente en algunas bacterias, ya prob ser poco eficaz en la amiba (para revisin
ver Meerovitch y Chadee, 1988). Por tanto requerimos conocer con la mayor
profundidad posible, los mecanismos de agresin del parsito y las molculas que
participan en l. Esto permitir bloquear especficamente alguna de las molculas
importantes en la virulencia y detener el dao causado por la amiba. Para garantizar
el xito hay que tener en cuenta la reaccin del hospedero ante el parsito. Sin
embargo, se sabe muy poco sobre cmo responde el ser humano ante el ataque de
los trofozotos amibianos. Se requieren por tanto, ms estudios inmunolgicos,
celulares y moleculares. Aunado a lo anterior, existe otra traba difcil de superar: no
hay un hospedero animal que sirva como modelo de estudio para reproducir el ciclo
de E. histolytica y la infeccin por este parsito, gran limitante en los avances para
obtener una vacuna. Lo que se ha hecho hasta ahora es utilizar animales de
experimentacin en los cuales se provoca el absceso heptico amibiano por medio
de la inoculacin de los trofozotos (Jarumilinta, 1966; Chadee y Meerovitch, 1984).
Tambin se ha logrado producir lesiones en los intestinos de algunos animales
(Chadee y Meerovitch, 1984). Sin embargo, no se ha logrado producir, en forma
13
reproducible, la infeccin amibiana en un animal, dndole de comer los quistes y
logrando que el animal presente diarrea y absceso heptico.
Dos molculas de superficie e involucradas en el contacto del trofozoto con la
clula blanco han sido usadas para intentar obtener una vacuna: una lectina con
afinidad por los azcares galactosa y N-acetil-galactosamina, y una molcula de
superficie rica en serinas (Soong y col., 1995; Zhang y col., 1994). Hay resultados
alentadores con ambas, pero la vacuna no se vislumbra todava. Por otra parte, el
papel especfico de estas molculas en el mecanismo de agresin de las amibas
virulentas todava guarda muchos secretos. Sin embargo, dado que la adhesin
especfica del trofozoto a la clula blanco es un paso indispensable, aunque no es
suficiente, para que se produzca el mecanismo de agresin de la amiba; las
adhesinas son buenos candidatos vacunales. Si la adhesin se bloquea, se inhibe la
virulencia. Con base en esta premisa, desde hace ms de diez aos nuestro grupo
inici la bsqueda de adhesinas amibianas bona fide, como candidatos para
vacunas.
14
clulas hijas, muy parecidas a la clula que les dio origen, a la cual se le llama
silvestre. Las mutantes difieren de la clulas silvestres en que son deficientes
precisamente en la funcin que nos interesa estudiar.
Nosotros utilizamos la estrategia de generar mutantes de E. histolytica,
deficientes en adhesin y en virulencia para identificar y clonar las molculas
involucradas en estas funciones. Hace ms de diez aos, mutagenizamos con etil
metano sulfonato (una sustancia que produce alteraciones al azar en el DNA) a los
trofozotos de la clona A, proveniente de la cepa HM1:IMSS, para generar trofozotos
deficientes en adhesin. Dado que este agente alquilante produce, como se dijo,
mutaciones al azar en el DNA, fue necesario disear un mtodo de seleccin que
nos permitiera separar y cultivar a los trofozotos que tuvieran deficiencias para
adherirse y destruir a las clulas blanco (Rodrguez y Orozco, 1986).
De hecho, el proceso de seleccin en la mutagnesis qumica es la parte ms
difcil de los experimentos. Equivale a encontrar entre millones de amibas
mutagenizadas, las que tengan la alteracin en la funcin de adhesin. Esto es
parecido a buscar una aguja en un pajar. As pues, para separar a las clulas
mutagenizadas en la funcin que nos interesa, es necesario tener un imn que las
atraiga. El imn es, precisamente, el mtodo de seleccin. Para construir este imn
partimos del conocimiento de que la adhesin precede a la fagocitosis. Por tanto, si
matamos a todas las amibas fagocticas, nos quedaremos con aquellas que no
pueden fagocitar. Entre las clulas incapaces de fagocitar habr algunas que tengan
alterado el citoesqueleto, otras, que sean incapaces de fusionar sus membranas y
otras ms con alteraciones en protenas que participan en la fagocitosis. De stas,
unas cuantas no fagocitarn porque tienen alteradas molculas de superficie que les
15
permiten adherirse a la clula blanco. Esas son las que necesitamos para
nuestros estudios. Para matar a las amibas fagocticas elegimos un veneno con tres
caractersticas: i) tena que ser particulado para que los trofozotos lo fagocitaran, ii)
tena que ser digerible por los trofozotos para que hiciera su efecto de matarlos y iii)
no debera ser soluble para evitar que se envenenaran los trofozotos que no lo
fagocitaron. Elegimos bacterias crecidas en presencia de bromo-desoxiuridina, la
cual se inserta en el DNA en el lugar de la timidina y lo vuelve altamente sensible a
la luz ultravioleta. Los trofozotos se incubaron con estas bacterias y al digerirlas
incorporaron la bromo-desoxiuridina en su propio DNA. rradiamos a los trofozotos
con luz ultravioleta y los que comieron muchas bacterias sufrieron muchas rupturas
en su DNA, y por tanto, murieron (Rodrguez y Orozco, 1986). Los otros trofozotos
que quedaron vivos, resultaron ser deficientes en fagocitosis y algunos de ellos en
adhesin. Todos fueron deficientes en destruir clulas epiteliales, es decir, en
virulencia. Mediante el uso de anticuerpos monoclonales, comparamos las
molculas de la superficie de la cepa silvestre con las mutantes deficientes en
adhesin obtenidas con la tcnica descrita. Encontramos que las mutantes carecan
de una protena de superficie de 112 kDa presente en los trofozotos que s se
adheran a la clula blanco y s eran virulentos (Arroyo y Orozco, 1987) (Fig. 2).
La protena de 112 kDa cumple con los requisitos que debe tener una
adhesina: i) est en la superficie de los trofozotos, ii) se pega a la clula blanco, iii)
est alterada en mutantes deficientes en adhesin y iii) anticuerpos contra esta
molcula inhiben la adhesin, la fagocitosis y la virulencia (Arroyo y Orozco, 1987;
Rodrguez y col, 1989)
16
6.2 Genes y polipptidos que forman la adhesina de 112 kDa
Detectar las molculas que participan en alguna de las fases del mecanismo de
agresin del trofozoto a la clula blanco, es un gran paso en el estudio de las
funciones de virulencia de la amiba y desde luego, en el desarrollo de una vacuna.
Para que los trofozotos permanezcan en el intestino y lo invadan, es necesario que
se adhieran fuertemente a las clulas epiteliales. Si se logra evitar la adhesin, los
trofozotos sern arrojados del intestino y morirn inmediatamente. Usando las
mutantes y los anticuerpos monoclonales detectamos la adhesina de 112 kDa. Los
anticuerpos contra ella inhiben la adhesin, la fagocitosis y la destruccin de
monocapas celulares en cultivo (Fig. 3).
Sin embargo, para poder realizar estudios de proteccin en un nmero grande
de animales, es necesario producir la adhesina de 112 kDa en grandes cantidades.
Una forma eficiente es clonar el gen en un vector adecuado. Esto es, aislarlo y
pegarlo a un fragmento de DNA con un origen de replicacin, para que, en
condiciones adecuadas, produzca miles de copias del gen de la adhesina. Se
introduce a una bacteria que proporcione esas condiciones e idealmente exprese la
protena de 112 kDa en grandes cantidades. Logramos clonar el gen y al estudiarlo
descubrimos que la adhesina de 112 kDa est formada por dos protenas,
codificadas por dos genes adyacentes en el DNA (Garca-Rivera y col, 1999) (Fig.
4). Una de las protenas tiene actividad de proteasa, le llamamos EhCP112. Muy
probablemente, EhCP112 le sirve a la amiba para digerir los epitelios y abrirse paso
en los tejidos, durante el proceso de invasin. La otra protena, llamada EhADH112,
tiene capacidad de unirse a eritrocitos y a clulas epiteliales. As, la amiba pudiera
17
adherirse a la clula que va a atacar por medio de EhADH112 y llevar a cabo el
proceso destructivo por medio de EhCP112. Si incubamos a la clula blanco con el
polipptido recombinante EhADH112 (el que hizo la bacteria, a partir de los genes de
la amiba), ste se pegar a la membrana de aquella, ocupando los sitios que el
trofozoto necesita para adherirse y evitando as que la amiba se una y las destruya
(Fig. 5). El otro polipptido recombinante, EhCP112, es capaz de digerir protenas
(Fig. 5) (Garca-Rivera y col, 1999). Actualmente, estamos probando el efecto
protector de estas molculas en animales de experimentacin.
7. CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
18
162:546-558.
Bruchhaus, I., Jacobs, T., Leippe, M. and Tannich, E. 1996. Entamoeba histolytica
and Entamoeba dispar: differences in numbers and expression of
cysteine proteinases genes. Mol. Microbiol. 22: 255-263.
Chadee, K. and Meerovitch, E. 1984. The Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus)
as experimental host for Entamoeba histolytica. Am. J. Trop. Med. Hyg. 33:4754.
Garca-Rivera, G., Rodrguez, M.A., Ocdiz, R., Martnez-Lpez, M.C., Arroyo, R.,
Gonzlez-Robles, A. and Orozco, E. 1999. Entamoeba histolytica: a novel
cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol.
Microbiol. 33: 556-568.
Ghosh, S.K. and Samuelson, J. 1997. Involvement of p21racA, phophoinositide 3
-kinase, and vacuolar ATPase in phagocytosis of bacteria and
erythrocytes by Entamoeba histolytica: suggestive evidence for
coincidental evolution of amebic invasiveness. Infect. Immun. 65:4243
-4249.
Jarumilinta, R. 1966. A simple method of inducing amoebic liver abscess in
hamsters. Ann. Trop. Med. Parasitol. 60:139-145.
Lundbland, G., Huldt, G., Elander, M., Lind, J. and Slettergreen, K. 1981. N
-acetylglucosaminidase from Entamoeba histolytica. Comp. Biochem.
Physiol. 68:71-76.
Lynch, E.C., Rosenberg, M.I. and Gitler, C. 1982. An ion-channel forming protein
produced by Entamoeba histolytica. EMBO J. 1:801-804.
Meervitch, E. and Chadee, K. 1988. In vivo models of immunity in amebiasis. En:
19
Amebiasis. Human Infection by Entamoeba histolytica. Ravdin, J.I. (ed).
John Wiley & Sons, New York. Pg. 425-437.
Muoz, M.L., Calderon, J., Rojkind, M. 1982. The collagenase of Entamoeba
histolytica. J. Exp. Med. 155:42-51.
Rodrguez, M.A. and Orozco, E. 1986. Isolation and characterization of phagocytosis
and virulence deficient mutants of Entamoeba histolytica. J. Infect. Dis. 154:
27-32.
Rodrguez, M.A., Hernndez, F., Santos, L., Valdez, A. and Orozco, E. 1989.
Entamoeba histolytica: molecules involved in the target cell-parasite
relationship. Mol. Biochem. Parasitol. 37: 87-99.
Soong, C.G., Kain, K.C., Abd-Alla, M., Jackson, T.F.G.H. and Ravdin, J.I. 1995. A
recombinant cysteine-rich section of the Entamoeba histolytica galactoseinhibitable lectin is efficacious as a subunit vaccine in the gerbil model of
amebic liver abscess. J. Infect. Dis. 171:645-651.
Udezulu, I.A. and Leitch, G.J.1987. A membrane-associated neuraminidase in
Entamoeba histolytica trophozoites. Infect. Immun. 55:181-186.
Vargas, M.A., Sansonetti, P. and Guillen, N. 1996. Identification and cellular
localization of the actin-binding protein ABP-120 from Entamoeba histolytica.
Mol. Microbiol. 22:849-857.
Voigt, H,, Olivo, J.C., Sansonetti, P. and Guillen, N. 1999. Myosin IB from
Entamoeba histolytica is involved in phagocytosis of human erythrocytes. J.
Cell Sci. 112:1191-1201.
Walsh, J.A. 1986. Problems in recognition and diagnosis of amebiasis: estimation of
the global magnitude of morbidity and mortality. Rev. Infect. Dis. 8:228-238.
20
WHO. 1997. Amoebiasis. WHO Weekly Epidemiol. Record 72: 97-100.
Zhang, T., Cieslak, P.R. and Stanley, S.L. 1994. Protection of gerbils from amebic
liver abscess by immunization with a recombinant Entamoeba histolytica
antigen. Infect. Immun. 62:1166-1170.
PIES DE FIGURAS
Fig. 1. El quiste entra al ser humano por la boca con los alimentos o agua
contaminada por heces fecales de individuos con amibiasis. En el intestino, el
quiste se deshace de su cubierta protectora y da origen a 8 trofozotos, muy mviles,
capaces de adherirse al epitelio intestinal, por medio de molculas de superficie.
Puede traspasar el epitelio e invadir el hgado y otros tejidos.
21
efecto sobre diversas actividades. Solamente los anticuerpos contra la adhesina
de 112 kDa inhibieron significativamente la adhesin (Adh), la fagocitosis (Fag) y la
destruccin de monocapas celulares en cultivo por los trofozotos vivos (CP) o por
sus extractos (CT). La adhesin, la fagocitosis y la destruccin de clulas en
ausencia de anticuerpos se tom como 100%.
Fig. 4. La adhesina de 112 kDa est codificada por dos genes adyacentes
separados por una regin de DNA no codificante de 188 pares de bases. El
primer gen codifica para una cistena proteasa (EhCP112) y el segundo codifica para
una protena que se adhiere a la clula blanco (EhADH112).
) y la fagocitosis (
Captulo 6
Mecanismos de patognesis de la Trichomonosis: La enfermedad de
transmisin sexual no viral nmero uno causada por Trichomonas
vaginalis
John F. Alderete1, Marie-Laure Crouch1 y Rossana Arroyo2
1
Department of Microbiology, University of Texas Health Science Center (UTHSC) San Antonio Texas,
EUA.
2
1. INTRODUCCIN
rpido, sensible y seguro de uso generalizado, acoplado con la confiabilidad del cultivo
para la deteccin del organismo en la poblacin. Los datos aqu presentados muestran
que el grado de morbilidad entre las mujeres de todos los niveles sociales es alto.
Adase a esto una complicacin mayor, el aumento en el nmero de casos de
trichomonosis resistentes al tratamiento (Sobel y col., 1999).
Los factores que predisponen a la infeccin por T. vaginalis incluyen la edad del
inicio de las relaciones sexuales, el nmero de parejas sexuales, la historia de
infecciones gonocccicas y el hbito de fumar (Coth y col., 1991; 1998). El humo del
tabaco es un txico del tracto reproductor que puede desencadenar cambios en el
tracto urogenital de la mujer predisponindola a la infeccin por T. vaginalis, ya que
podra alterar las condiciones reductoras de la vagina. Estudios epidemiolgicos
realizados en EU han mostrado una mayor predisposicin a la trichomonosis en
mujeres afroamericanas, por lo que en algn momento se propuso que este grupo
pudiera presentar una predisposicin mayor a esta enfermedad que el grupo caucsico.
Las mujeres afroamericanas al parecer no estn ms predispuestas a la trichomonosis,
sino que su mayor incidencia puede deberse al comportamiento sexual particular, lo
cual explicara el aumento en la incidencia de esta enfermedad y de otras ETS en este
grupo (Aral, 1999; Laumann y Youm, 1999).
Las consecuencias de la infeccin por T. vaginalis en la salud de las pacientes
con trichomonosis pueden ser graves por las siguientes razones: i) Las mujeres
infectadas presentan un mayor riesgo para la infeccin por VIH (Wasserheit, 1992;
Laga y col., 1993). Aunque se desconocen las causas, es posible que la respuesta
inflamatoria a T. vaginalis reclute a las clulas inmunes en las secreciones vaginales,
predisponiendo a la mujer a la infeccin durante el contacto con el semen que contiene
el VIH. ii) Mujeres embarazadas con trichomonosis pueden tener problemas al trmino
del embarazo, los cuales se pueden manifestar por la ruptura prematura de las
membranas, el parto prematuro, y el nacimiento de infantes de bajo peso (Cotch y col.,
1997; Sutton y col., 1999). iii) Adems, se ha establecido una relacin entre la infeccin
por T. vaginalis y el cncer crvico-uterino (Zhang y Begg, 1994; Zhang y col., 1995;
Zhang, 1996).
El epitelio vaginal es el sitio principal de la infeccin. Las trichomonas se
adhieren primeramente a la mucina y despus disuelven el moco (Lehker y Sweeney,
1999), lo cual hace posible que los parsitos puedan penetrar el tapn del moco
cervical hacia el tracto urogenital superior. Esto podra explicar el dolor abdominal
agudo y el posible desarrollo de linfoadenopatas y salpingitis entre algunas mujeres
que sufren la infeccin (Krieger, 1981). Hay una gran variabilidad en la sintomatologa
de las mujeres infectadas con T. vaginalis. Algunas mujeres, aunque presenten
cambios en la fisiologa del tracto genitourinario, no los consideran graves como para
buscar ayuda mdica, debido en parte, a la falta de informacin adecuada respecto a la
biologa del aparato reproductor femenino. Otras mujeres presentan sntomas
exacerbados, como descargas vaginales malolientes, dolor abdominal agudo, irritacin
y malestar (Wolner-Hanssen, 1989). Adems, la erosin del epitelio cervical que rodea
al canal vaginal por la inflamacin, puede originar a la colpitis macularis o crvix de
fresa, un signo tpico de la trichomonosis (Krieger, 1981). La sintomatologa por la
trichomonosis es distinta a la de las vaginitis ocasionadas por infecciones por levaduras
o bacterias.
Los hombres tambin se pueden infectar durante el contacto sexual con una
pareja con trichomonosis (Gardner y col., 1986; Krieger, 1995; Joyner y col., 1999). A
eritrocitos y fragmentos celulares, los cuales pueden ser observados en las vacuolas
fagocticas o pinocticas (Rendcn-Maldonado y col., 1998).
La tricomona se caracteriza adems, por tener una alta dependencia de hierro
para un metabolismo adecuado. Mientras las bacterias requieren de 0.2 M, las
trichomonas necesitan hasta 250 M (Gorrell, 1985). El microorganismo tiene un buen
sistema de captura de hierro, utiliza como fuentes de hierro molculas receptoras o de
almacn de hierro presentes en las secreciones vaginales como el citocromo c, la
ferritina, la lactoferrina, la hemoglobina, e incluso eritrocitos y clulas HeLa. Cuando se
elimina el hierro del medio del cultivo, el parsito no crece o lo hace muy lentamente.
A pesar de ser uno de los protistas ms primitivos, carente de enzimas de las vas
biosintticas involucradas en la sntesis de macromolculas esenciales, T. vaginalis ha
desarrollado mecanismos mediados por receptores para unir protenas del husped
(Peterson y Alderete, 1982; 1983), algunas de las cuales le son relevantes para la
adquisicin de nutrientes. En estos mecanismos, las cistena proteinasas juegan un
papel importante como veremos posteriormente. Estas proteinasas participan tambin
en la virulencia del parsito y en su mecanismo de evasin de la respuesta inmune del
husped. T. vaginalis es capaz de crecer y reproducirse en uno de los sitios ms
cambiantes del cuerpo humano, la regin urogenital/vaginal de la mujer. Este hecho
sugiere la idea de la adaptacin coevolutiva entre el parsito y el humano.
10
T. vaginalis obtiene los lpidos, como el colesterol y los cidos grasos, por medio
de la unin de la apoprotena C3 al receptor para lipoprotenas (Peterson y Alderete,
1984b) y a travs de la hemaglutinacin, seguida por la hemlisis de los eritrocitos por
las cistena proteinasas de T. vaginalis (Dailey y col., 1990; Lehker y col., 1990). El
parsito incorpora los lpidos obtenidos de estas fuentes directamente en sus
membranas (Lehker y col., 1990; Peterson y Alderete, 1984c). Este proceso de
acumulacin de lpidos es especfico, dado que los lpidos de la membrana de las
clulas hospederas no son utilizados ni para el crecimiento ni para la multiplicacin de
las trichomonas (Peterson y Alderete, 1984c). Entre otras molculas que ocasionan
dao a la clula husped, las cistena proteinasas del parsito participan en la
obtencin de nuclesidos, nucletidos, glucgeno y otras fuentes de carbono y energa,
as como diversas molculas que contienen o unen hierro. Las cistena proteinasas
degradan las clulas y la matriz extracelular para que el parsito pueda obtener sus
nutrientes, indispensables para su mantenimiento en el microambiente del tracto
urogenital de la mujer, el cual es escaso en nutrientes (Muller, 1990).
Los aislados del T. vaginalis crecidos in vitro requieren de muy altas
concentraciones de hierro (250 M) para un crecimiento y multiplicacin ptimos. En
estas condiciones, el tiempo de generacin es entre 4 y 6 horas (Gorrel, 1985). Sin
embargo, estudios sobre el crecimiento del parsito en cultivo continuo, usando un
quimiostato, han demostrado que los parsitos pueden sobrevivir a tiempos de
generacin de hasta 150 horas, bajo condiciones controladas de pH, temperatura y
nutrientes (Lehker y Alderete, 1990).
El parsito posee receptores para protenas unidoras de hierro (lactoferrina y
ferritina) y para protenas que contienen hierro (citocromos y hemoglobina) (Peterson y
11
12
13
14
15
16
ii)
iii)
iv)
v)
17
18
alteraciones en el virus que infecta al parsito. Por otra parte, el hecho de que los
segmentos de dsRNA no hibriden entre s, an en condiciones suaves (Koshnan y
Alderete, 1993) es problemtico, dado que estos virus en teora, poseen protenas de la
cpside y polimerasas muy semejantes. Por lo tanto, se esperara que sus secuencias
nucleotdicas tuvieran regiones idnticas, las cuales daran reactividad cruzada en los
ensayos de hibridacin.
Por otro lado, aislados de T. vaginalis infectados por el virus dsRNA (llamados
arbitrariamente aislados Tipo II) (Alderete y col., 1987) presentan variacin fenotpica
(Alderete y col., 1986a). Esta propiedad se manifiesta como la expresin alternada en
la membrana o en el citoplasma de un repertorio de inmungenos, incluyendo a la
protena llamada p270. Los aislados Tipo I son aquellos que carecen del virus dsRNA y
no sufren una variacin fenotpica. Como dato interesante podemos mencionar que la
progenie obtenida a partir de una aislado parental de trichomonas infectadas con virus,
perdi la capacidad de presentar variacin fenotpica al perder el virus (Alderete y col.,
1987; Wang y col., 1987; Khoshnan y Alderete, 1994). Posteriormente, se ha
encontrado que el hierro modula la variacin fenotpica y la fosforilacin de la p270
entre las trichomonas infectadas con virus (Alderete, 1999a). Los parsitos crecidos en
condiciones de bajo hierro expresan en su superficie la p270, mientras que aquellos
crecidos en concentraciones elevadas de hierro expresan la p270 en el citoplasma, la
cual se encuentra fosforilada. Esto podra explicarse porque los aislados de T. vaginalis
Tipo II estn constituidos por poblaciones heterogneas, las cuales pueden o no
expresar la p270. La relacin entre estas poblaciones vara dependiendo de las
condiciones de cultivo y de la fase de crecimiento del parsito (Alderete y col., 1986).
Curiosamente, in vivo, 10% de los parsitos de Tipo II expresan en su superficie a la
19
p270, lo cual puede deberse a que en el sitio de la infeccin son pocos los organismos
que poseen en su interior bajas concentraciones de hierro, la mayora de ellos son ricos
en hierro.
Anticuerpos contra la p270 son trichomonicidas de manera independiente del
complemento (Alderete y col., 1986b). Dado que todos los pacientes con trichomonosis
poseen anticuerpos anti-p270 en su suero (Alderete y col., 1987), la ausencia de la
p270 en la superficie del parsito le confiere una ventaja, ya que le permite evadir la
respuesta inmune humoral del husped.
Por otro lado, si el virus de dsRNA es no segmentado y est constituido por un
solo segmento como se ha sugerido (Tai y col., 1993; Tai e Ip, 1995), pudiera ser que
las protenas codificadas por el virus influyeran en la transcripcin del gen de la p270
(Khoshnan y Alderete, 1994). Si as fuera, los dsRNA satlites, participaran
directamente en funciones de regulacin celular ms de lo que se ha considerado. Sin
embargo, se necesitaran ms experimentos para probar esta hiptesis.
Finalmente, el anlisis comparativo entre los microorganismos de aislados
infectados con virus, en comparacin con los que no lo poseen, revel la presencia de
hasta 40 protenas en los parsitos infectados, las cuales no fueron detectadas en los
no infectados. Por el contrario, la prdida del virus de los organismos infectados mostr
la expresin de un gran nmero de protenas que no se haban observado en las
trichomonas infectadas con el virus (Provenzano y col., 1997). Tales alteraciones
mayores en la composicin global de protenas de T. vaginalis, provocada por la
presencia o ausencia del virus dsRNA, podra tener consecuencias para la expresin
de factores de virulencia del parsito.
20
21
22
23
6. CONCLUSIONES
24
AGRADECIMIENTOS
ABREVIATURAS
ETS
VECs
LM
Laminina.
FN
Fibronectina.
BIBLIOGRAFA
25
26
Alderete, J. F., E. Newton, C. Dennis, and K. A. Neale. 1991c. The vagina of women
infected with Trichomonas vaginalis has numerous proteinases and antibody to
trichomonad proteinases. Genitourin. Med. 67:469-474.
Alderete, J. F., J. L. O'Brien, R. Arroyo, J. A. Engbring, O. Musatovova, O. Lopez, C.
Lauriano, and J. Nguyen. 1995a. Cloning and molecular characterization of two
genes encoding adhesion proteins involved in Trichomonas vaginalis
cytoadherence. Mol. Microbiol. 17:69-83.
Alderete, J. F., D. Provenzano, and M. W. Lehker. 1995b. Iron mediates Trichomonas
vaginalis resistance to complement lysis. Micro. Pathogen. 19:93-103.
Alderete, J. F., and D. Provenzano. 1997. The vagina has reducing environment
sufficient for activation of Trichomonas vaginalis cysteine proteinases.
Genitourin. Med. 73:291-296.
Alderete, J. F., J. Engbring, C. M. Lauriano, and J. L. O'Brien. 1998. Only two of the
Trichomonas vaginalis triplet AP51 adhesins are regulated by iron. Micro.
Pathogen. 24:1-16.
Alderete, J. F. 1999a. Iron modulates phenotypic variation and phosphorylation of P270
in double-stranded RNA virus-infected Trichomonas vaginalis. Infect. Immun.
67:4298-4302.
Alderete, J. F. 1999b. Trichomonas vaginalis, a model mucosal parasite. Rev. Med.
Microbiol. 10:165-173.
Alvarez-Snchez, M.E., Avila-Gonzalez, L., Becerril-Garca, C., Fattel-Facenda, L.V.
Ortega-Lpez, J. & Arroyo, R. 2000. A novel cysteine proteinase (CP65) of
Trichomonas vaginalis involved in cytotoxicity. Microb. Path. 28:193-202.
27
Alvarez-Snchez, M.E., and Arroyo, R. 2001. Effect of Zinc on the activity of the CP65
proteinase involved in cytotoxicity. Microb. Path. (En revisin).
Alvarez-Snchez, M.E., Fattel-Facenda, L.V. and Arroyo R. 2000. Iron down-regulates
cytotoxicity, surface expression and proteolytic activity of the CP65 a cysteine
proteinase of Trichomonas vaginalis, involved in cellular damage. Mol. Biochem.
Parasitol. (Enviado).
Aral, S. O. 1999. Sexual network patterns as determinants of STD rates: paradigm shift
in the behavioral epidemiology of STDs made visible. Sex. Trans. Dis. 26:262262.
Arroyo, R., and J. F. Alderete. 1989. Trichomonas vaginalis surface proteinase activity
is necessary for parasite adherence to epithelial cells. Infect. Immun. 57:29912997.
Arroyo, R., J. Engbring, and J. F. Alderete. 1992. Molecular basis of host epithelial cell
recognition by Trichomonas vaginalis. Mol Microbiol. 6:853-862.
Arroyo, R., A. Gonzlez-Robles, A. Martnez-Palomo, and J.F. Alderete. 1993.
Signalling of Trichomonas vaginalis for amoeboid transformation and adhesin
synthesis follows cytoadherence. Molec. Microbiol. 7:299-310.
Arroyo, R., J. Engbring, J. Nguyen, O. Musatovova, O. Lopez, C. Lauriano, and J. F.
Alderete. 1995. Characterization of cDNAs encoding adhesin proteins involved in
Trichomonas vaginalis cytoadherence. Arch. Med. Res. 26:361-369.
Arroyo, R., and J. F. Alderete. 1995. Two Trichomonas vaginalis surface proteinases
bind to host epithelial cells and are related to levels of cytoadherence and
cytotoxicity. Arch. Med. Res. 26:279-285.
28
29
30
Fattel-Facenda L.V., Len-Felix J., and Arroyo R. 2000. Iron down-regulates surface
expression and proteolytic activity of the CP30, a cysteine proteinase involved in
cytoadherence of Trichomonas vaginalis. Mol. Biochem. Parasitol. (Enviado).
Gardner, W. A., D. E. Culberson, and B. D. Bennett. 1986. Trichomonas vaginalis in the
prostate gland. Arch. Pathol. Lab. Med. 110:430-432.
Gorrell, T. E. 1985. Effect of culture medium iron content on the biochemical
composition and metabolism of Trichomonas vaginalis. J. Bacteriol. 161:12281230.
Hobbs, M. M., P. Kazembe, A. W. Reed, W. C. Miller, E. Nkata, D. Zimba, C. C. Daly,
H. Chakraborty, M. S. Cohen, and I. Hoffman. 1999. Trichomonas vaginalis as a
cause of urethritis in Malawian men. Sex. Transm. Dis. 26:381-387.
Joyner, J. L., J. M. Douglas, S. Ragsdale, M. Foster, and F. N. Judson. 1999.
Comparative prevalence of infection with Trichomonas vaginalis among men
attending a sexually transmitted diseases clinic. Sex. Trans. Dis. 27:236-240.
Khoshnan, A., and J. F. Alderete. 1993. Multiple double-stranded RNA segments are
associated with virus particles infecting Trichomonas vaginalis. J. Virol. 67:69506955.
Khoshnan, A., and J. F. Alderete. 1994. Trichomonas vaginalis with a double-stranded
RNA virus has upregulated levels of phenotypically variable immunogen mRNA.
J. Virol. 68:4035-8.
Khoshnan, A., and J. F. Alderete. 1995. Characterization of double-stranded RNA
satellites associated with the Trichomonas vaginalis virus. J. Virol. 69:6892-6897.
31
32
Laumann, E. O., and Y. Youm. 1999. Racial/ethnic group differences in the prevalence
of sexually transmitted diseases in the United States: a network explanation. Sex.
Transm. Dis. 26:250-261.
Lehker, M. W., and J. F. Alderete. 1992. Iron regulates growth of Trichomonas vaginalis
and the expression of immunogenic trichomonad proteins. Mol. Microbiol. 6:123132.
Lehker, M. W., T. H. Chang, D. C. Dailey, and J. F. Alderete. 1990. Specific erythrocyte
binding is an additional nutrient acquisition system for Trichomonas vaginalis. J.
Exp. Med. 171:2165-2170.
Lehker, M. W., and J. F. Alderete. 1990. Properties of Trichomonas vaginalis grown
under chemostat controlled growth conditions. Genitourin. Med. 66:193-199.
Lehker, M. W., R. Arroyo, and J. F. Alderete. 1991. The regulation by iron of the
synthesis of adhesins and cytoadherence levels in the protozoan Trichomonas
vaginalis. J. Exp. Med. 174:311-318.
Lehker, M. W., and D. Sweeney. 1999. Trichomonad invasion of the mucous layer
requires adhesins, mucinases, and motility. Sex. Transm. Infect. 75:231-238.
Mendoza-Lpez, MR, Becerril-Garca, C, Fattel-Facenda, LV, Avila-Gonzlez, L, RuizTachiqun, ME, Ortega-Lpez, J & Arroyo, R. 2000. CP30: A cysteine
proteinase Involved in Trichomonas vaginalis cytoadherence. Infect. Immun. 68
(9):(en prensa).
Muller, M. 1990. Biochemistry of Trichomonas vaginalis. In B. M. Honigberg (ed.),
Trichomonads parasitic in humans. Springer-Verlag, New York. p. 53-83.
33
34
35
Tai, J. H., and C. F. Ip. 1995. The cDNA sequence of Trichomonas vaginalis virus-T1
double-stranded RNA. Virol. 206:773-776.
Wang, A., C. C. Wang, and J. F. Alderete. 1987. Trichomonas vaginalis phenotypic
variation occurs only among trichomonads infected with the double-stranded
RNA virus. J. Exp. Med. 166:142-150.
Wasserheit, J. N. 1992. Epidemiological synergy. Interrelationships between human
immunodeficiency virus infection and other sexually transmitted diseases. Sex.
Transm. Dis. 19:61-77.
Weston, T. E., and C. S. Nicol. 1963. Natural history of trichomonal infection in males.
Br. J. Vener. Dis. 39:251-255.
Wolner-Hanssen, P., J. N. Krieger, C. E. Stevens, N. B. Kiviat, L. Koutsky, C. Critchlow,
T. DeRouen, S. Hillier, and K. K. Holmes. 1989. Clinical manifestations of vaginal
trichomoniasis. J. Amer. Med. Assoc. 261:571-576.
Yaez-Gomez and Arroyo R. 2000. A protein of 120 kDa inducible by high iron
concentrations, a new adhesin of Trichomonas vaginalis. Infect. Immun
(Enviado).
Zhang, Z. F., and C. B. Begg. 1994. Is Trichomonas vaginalis a cause of cervical
neoplasia? Results from a combined analysis of 24 studies. Int. J. Epidemiol.
23:682-690.
Zhang, Z. F., S. Graham, S. Z. Yu, J. Marshall, M. Zielezny, Y. X. Chen, M. Sun, S. L.
Tang, C. S. Liao, J. L. Xu. 1995. Trichomonas vaginalis and cervical cancer. A
prospective study in China. Ann. Epidemiol. 5:325-332.
Zhang, Z. F. 1996. Epidemiology of Trichomonas vaginalis. A prospective study in
China. Sex. Transm. Dis. 23:415-424.
36
PIES DE FIGURAS
37
38
colgena IV (Coll IV) 400 g, 3) fibronectina (Fn) 400 g, 4) laminina-1 (Lam-1) 400 g
y hemoglobina (Hb) al 0.2% (Alvarez y col., 2000; Mendoza y col., 2000).
39
Captulo 7
VIH/SIDA
Carmen Soler Claudn 1,2.
1
Email: csoler@servidor.unam.mx
PALABRAS CLAVE: VIH, SIDA
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivos del captulo.
3. Transmisin y riesgo de infeccin.
4. Infeccin primaria o aguda.
5. Respuesta del hospedero a la infeccin .
6. Diversidad viral.
7. Caractersticas del VIH.
8. Variabilidad gentica en los VIH.
9. Protenas virales.
10. Ciclo de replicacin viral.
11. Actividad de algunas protenas reguladoras virales.
12. Regulacin de expresin viral por factores celulares.
13. Conclusiones.
Abreviaturas.
Bibliografa.
1. INTRODUCCIN
La respuesta inmune humoral produce anticuerpos contra el virus entre uno a tres
meses despus de la infeccin, pero en casos raros, la produccin de anticuerpos
tarda varios meses o hasta aos. Estos anticuerpos se pueden detectar en
plasma, orina y saliva, predominando los de la clase IgG1.
Poco tiempo despus de la presencia de anticuerpos antivirales, se inducen
anticuerpos neutralizantes efectivos contra la cepa viral especfica que ocasion la
infeccin, aunque tambin se han demostrado anticuerpos ayudadores de la
infeccin (Fig. 2). No se ha encontrado correlacin entre la presencia de
anticuerpos con el estado clnico del paciente. Se ha demostrado que las
mutaciones en el virus lo hacen resistente a la neutralizacin y sensibles a los
anticuerpos ayudadores de la infeccin. Se ha demostrado tambin que el
complemento puede jugar un papel en la respuesta antiviral (Levy, 1998).
El VIH se asocia a una variedad de desrdenes auto-inmunes como
resultado de la proliferacin de clulas B y del mimetismo molecular de algunas
protenas virales con protenas celulares del husped. En los pacientes infectados
6. DIVERSIDAD VIRAL
Los virus deben infectar las clulas de su hospedero para replicar su genoma y
producir la progenie viral que infectar nuevas clulas blanco. Los virus dependen
de factores especficos del hospedero para reconocer a las clulas blanco y para
incluir algunos factores celulares en sus partculas. La poblacin viral en un punto
del tiempo es una mezcla compleja de cepas que difieren en sus propiedades
antignicas y fenotpicas y compiten entre ellas. Subsecuentemente, se da un
sobrecrecimiento de una cierta cepa viral de acuerdo con su adaptacin en el
hospedero.
Se ha demostrado que la poblacin del VIH en individuos recin infectados
es bastante homognea, lo cual sugiere que pudiera haber una seleccin viral
durante la transmisin. Los factores que pueden participar en la seleccin de una
poblacin viral homognea incluyen: i) que el inculo original sea pequeo y por lo
tanto, slo represente una muestra de la poblacin viral presente en el donador, ii)
que exista compartamentalizacin viral, es decir, que en el fluido transmisor, por
ejemplo el semen o las secreciones vaginales, solamente se encuentre una
poblacin determinada de la total presente en el individuo donador del virus, iii)
que se presente un crecimiento inicial de una poblacin viral especfica
relacionada con la va de entrada y iv) a que haya diferencias en la
transmisibilidad de las distintas cepas virales (Poss y col., 1995).
El VIH, que se descubri en 1983, es un lentivirus de la familia Retroviridae (BarreSinoussi y col., 1983). Hay dos tipos de VIH: el VIH1 y VIH2, los cuales se
distinguen por las glicoprotenas de la envoltura. Los VIH se pueden clasificar por
sus caractersticas biolgicas, inmunolgicas y moleculares (como tropismo
celular, cintica de replicacin, niveles de produccin de nuevas partculas,
capacidad de modulacin del receptor CD4, citopaticidad, latencia, estructura
gentica y sensibilidad a anticuerpos).
Tambin podemos clasificar al VIH por su fenotipo o por su genotipo.
Fenotpicamente hay tres sistemas de clasificacin que se sobrelapan, pero no
son equivalentes. El primero se basa en sus caractersticas de crecimiento y divide
a los virus en dos grandes grupos: los rpidos/altos y los lentos/bajos (Fenyo y
col., 1988). El segundo se basa en el tropismo celular y tambin hay dos grupos,
los M-trpicos y los T-trpicos, dependiendo de si son capaces de infectar clulas
monocticas o linfocticas, respectivamente. El tropismo viral se ha relacionado con
la conformacin de la membrana viral. El macro o linfo tropismo se define por
diferencias muy pequeas, de 2 3 aminocidos en la regin conocida como V3,
la cual se encuentra en la glicoprotena externa gp120. V3 es un determinante
mayor de la infeccin (VonBriesen y col., 1990). El tercer sistema clasifica a los
VIH de acuerdo con su capacidad citoptica y los divide en virus inductores de
sincicios (SI) o virus no inductores de sincicios (NSI). El fenotipo SI est asociado
a la presencia de amino cidos cargados positivamente en las posiciones 306 y
320 de la regin V3 de la glicoprotena externa gp120 (Tersmette y col., 1989).
Otro sistema de clasificacin, aadido despus, es el uso preferencial de
receptores secundarios, dividindose los virus en aquellos que utilizan el receptor
CCR5 el CXCR4 (Berger y col., 1998).
Generalmente los virus rpidos/altos son T-trpicos y SI, mientras que los
virus lentos/bajos son M-trpicos y NSI. Se ha demostrado que aunque la
transmisin es de una poblacin fenotpicamente mezclada, en las etapas
tempranas de la infeccin se encuentran virus M-trpicos y NSI, pudindose aislar
en etapas ms avanzadas los virus T-trpicos y SI.
El genoma del VIH tiene aproximadamente 9700 pb. (Fig. 3). En la replicacin de
su genoma llevada a cabo por la transcriptasa reversa viral, se introduce un error
10
en cada 2,000-5,000 bases replicadas, debido a que esta enzima carece de factor
de correcin, lo que significa entre dos y cinco errores cada vez que el genoma se
copia. El VIH tiene una vida media en la sangre de aproximadamente dos horas y
las clulas infectadas producen aproximadamente 1010 viriones al da. Esto
significa que en cada individuo infectado, el VIH sufre un proceso evolutivo
continuo, ya que se replica a velocidades enormes. La evolucin del VIH es un
milln de veces ms rpida que la del genoma humano (Perelson y col., 1996).
Esta variacin no se distribuye por igual a lo largo de todo el genoma, sino
que existen regiones, como los genes env y nef, que acumulan la mayora de las
mutaciones. Sin embargo, en estos genes hay regiones que codifican para partes
estructurales o funcionales de las protenas que no son muy conservadas, como
son las cistenas presentes en la glicoprotena gp120 que se mantienen en todos
los aislados reportados hasta ahora.
Cada aislado realizado de un paciente est formado por un gran nmero de
clonas. Tomando como parmetros los sitios de corte por enzimas de restriccin,
las cepas de un individuo varan entre s de un 3 a un 28% (variabilidad intraindividuo). Cuando comparamos la variacin en los sitios de corte entre aislados
de distintos individuos, sta llega hasta 70% (variabilidad inter-individuos). A este
fenmeno se le ha denominado microheterogeneidad intracepa.
La variabilidad entre aislados tiene impacto sobre algunas propiedades muy
importantes de los VIH como i) la especificidad que el virus muestra por ciertos
tejidos y clulas blanco y ii) la patogenicidad. Por lo tanto, esta variacin afecta el
espectro de sndromes clnicos. Sin embargo, todava no hay claridad repecto a la
relacin entre la variacin biolgica de los aislados de VIH y la variacin en la
11
12
9. PROTENAS VIRALES
Los genomas de todos los retrovirus tienen en comn tres genes que codifican
protenas estructurales: gag, pol y env. Su estructura es anloga a la de los RNA
mensajeros de las clulas eucarinticas. Siempre se encuentran en el virin dos
copias idnticas unidas no covalentemente, lo cual asemeja a un genoma diploide,
permitiendo la formacin de heterozigotes y la recombinacin gentica. En los
extremos del genoma se encuentran secuencias reguladoras que durante la
13
14
15
16
de todo el genoma (9kb) y otro subgenmico de 4.5 kb. Los tres tipos de RNAm
formados (9, 4.5 y 2 kb) comparten los extremos 5 y 3 entre s y junto con el RNA
genmico. Al ser transportados al citoplasma, los transcritos de largo completo (9
kb) se usan como RNA genmico, o para ser traducidos a las poliprotenas de Gag
y Pol mencionadas anteriormente, y los transcritos de 4.5 kb se traducen en el
retculo endoplsmico, formando el precursor de las glicoprotenas virales (gp160).
Una vez sintetizadas todas las protenas y el RNA genmico, el virus es
ensamblado en un proceso dependiente de las protenas Gag para finalmente ser
liberado por gemacin. En este momento se cortan proteolticamente los
precursores de las protenas Gag y Pol, permitiendo la maduracin de la partcula
viral (Michael y col., 1999; Wyatt y col., 1998; Levy, 1998).
17
18
La regulacin de la expresin viral por factores celulares ha sido uno de los retos
mayores para los investigadores que trabajan con retrovirus. Hay muchas teoras
que tratan de explicar la forma en que un retrovirus puede interaccionar con su
clula hospedera. Por ejemplo, el virus puede inducir la sntesis de algunas
protenas celulares que funcionen como moduladoras de la expresin de los genes
virales, como es el caso de la gp120, que altera la concentracin de calcio
intracelular y estimula las seales especficas de transduccin. Una estrategia
diferente sera que el virus, despus de integrar su genoma, espere a que la clula
exprese protenas que regulan la sntesis viral. La regin LTR (Fig. 8) funciona
como un sitio de control y regulacin de la transcripcin viral. Aunque ambos LTR
son idnticos en secuencia, el 5LTR est involucrado en los procesos de inicio y
19
13. CONCLUSIONES
Los estudios biolgicos y moleculares de los VIH estn permitiendo entender las
propiedades importantes, en trminos de patogenia, evasin de respuesta inmune,
latencia, etc. En algn momento cercano del futuro, la informacin ser suficiente
para sentar las bases del desarrollo de medicamentos antivirales o de vacunas
que sean eficientes para combatir esta epidemia.
ABREVIATURAS
20
CRF
LTR
MHC
NK
NSI
SI
SIDA
VIH
BIBLIOGRAFA
21
Delwart, E.L. and et al. 1994. Human Immunodeficiency Virus Type 1 Evolution in
Vivo Tracked by DNA Heteroduplex Mobility Assays. J. Virol.0 68:66726683.
Emerman, M. and et al. 1998. HIV-1 Regulatory/Accessory Genes: Keys to
Unraveling Viral and Host Cell Biology. Science 280: 1880-1884.
Fenyo, E.M. and et al. 1988. Distinct replicative and cytophatic characteristics of
human immunodeficiency virus isolates. J. Virol. 62:4414-4419.
Garnier, L. and et al. 1998. Recent Advances and Remaining problems in HIV
Assembly. AIDS 13 (suppl A):S5-S16.
Gmez-Romn, R and Soler, C. 2000. La Importancia de la Secuencia Terminal
Repetida Larga (LTR) en la Patogenia del Virus de la Inmunodeficiencia
Humana. Rev. Biomed. 11:61-71.
Gmez-Romn, V.R. and et al. 2000. nef/Long Terminal Repeat Quasispecies
from HIV Type 1 Infected Mexican Patients with Different Progresin
Patterns and Their Pathogenesis in hu-PBL-SCID Mice. AIDS Research
Hum. Retrov. 5:441-452.
Johnson, R.P. and et al. 1998. Cellular immune responses to HIV-1. AIDS (suppl
A):S113-S120.
Kuritzkes, D. 2000. Viral Pathogenesis: Update and Clinical Implications.
Medscape HIV/AIDS Annual Update 2000. (www.medscape.com)
Kurizkes, D. 2000. Insights Into HIV Pathogenesis and Immune Responses.7th
Conf. on Retroviruses and Opport. Infec. Day 3 Summaries.
Levy, J. 1998. Features of HIV Transmission. Chapter 2. In: HIV and the
Pathogenesis of AIDS. 2nd. Ed. ASM:15-41
22
Levy, J. 1998. Humoral Immune Responses to HIV Infection. Chapter 10. In: HIV
and the Pathogenesis of AIDS. 2nd. Ed. ASM. Press. pp 229-251.
Levy, J. 1998. Discovery and Origin of HIV . Chapter 1. In: HIV and the
Pathogenesis of AIDS. 2nd. Ed. ASM Press. pp 1-14.
Levy, J. 1998. Steps Involved in HIV: Cell Interaction and Virus Entry. Chapter 3.
In: HIV and the Pathogenesis of AIDS. 2nd. Ed. ASM. Press. pp 43-74.
Levy, J. 1998. Intracellular Control of HIV Replication. Chapter 5. HIV and the
Pathogenesis of AIDS. 2nd. Ed. ASM. Press. pp. 97-120.
Michael, N.L. and et al. 1999. HIV-1 entry inhibitors: Evading the issue. Nature
Medicine 5:740-742.
Parren, PW. and et al. 1999. The neutralizing antibody response to HIV-1: viral
evasion and escape from humoral immunity. AIDS 13(suppl A):S137-162.
Perelson, A.S and et al. 1996. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate,
infected cell life-span, and viral generation time. Science 271:1582-1586.
Poss, M. and et al. 1995. Diversity in virus populations from genital secretions and
peripheral blood from women recently infected with human
immunodeficiency virus type 1. J Virol 69: 8118-8122.
Ray, S.C. and Quinn T.C. 2000. Sex and the genetic diversity of HIV-1. Nature
Med 6:23-25.
Robertson D.L. and et al. 1999. HIV-1 Nomenclature Proposal. In Human
Retroviruses and AIDS 1999. A Compilation and Analysis of Nucleic Acid
and Amino Acid Sequences. Los Alamos National Laboratory:492-505.
Royce, R.A. and et al. 1997. Sexual Transmission of HIV. N. Engl. J. Med.
336:1072-1078.
23
PIES DE FIGURAS
Fig. 4. rbol filogentico que muestra la relacin entre los subtipos del virus
del VIH.
24
Fig. 5. Subtipos del virus VIH y sus variaciones mostradas dentro del
genoma viral.
Fig. 6. Estructura del virus del VIH. Se muestran los genes, sus productos y su
localizacin en la partcula viral.
Captulo 8
Apoptosis y Cncer Humano
Patricio Gariglio1 y Luz Ma. Rangel R1.
1
Email: vidal@lambda.gene.cinvestav.mx
PALABRAS CLAVE: Cncer, oncogenes, apoptosis, antioncogenes, HPV.
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivos del captulo.
3. Estado actual del arte.
4. Apoptosis y cncer humano.
3.1 Protooncogenes, oncogenes y apoptosis.
3.2 Apoptosis y genes supresores de tumores.
3.3 Mecanismos de apoptosis.
3.4 Carcinognesis en etapas mltiples e inhibicin de la apoptosis.
3.5 HPV, apoptosis y cncer.
3.6 Sistema inmune, apoptosis y neoplasia.
4. Conclusiones.
Agradecimientos.
Abreviaturas.
Bibliografa.
1. INTRODUCCIN
10
11
12
13
14
incluso PKB, pueden fosforilar y activar a NF-kB (Sizemore y col., 1999). Estos
datos definen una va por la cual actan diversas cinasas a travs de Ras
para controlar el crecimiento y la diferenciacin celular, as como la apoptosis
y su conocimiento estn permitiendo el desarrollo de formas ms efectivas de
terapias contra el cncer.
iii) Gen bcl-2. La familia de protenas Bcl-2, que est formada por
miembros antiapoptticos (como Bcl-2 y Bcl-XL) y proapoptticos (como Bax),
determina la vida o la muerte de una clula al controlar la liberacin de factores
apoptognicos de la mitocondria (Rsujimoto y Shimizu, 2000), tales como
citocromo c y el factor inductor de la apoptosis o AIF (del ingls, apoptosisinducing factor). Estos factores activan una serie de proteasas llamadas
caspasas, las cuales son molculas efectoras claves en apoptosis y existen
como precursoras inactivos en nuestras clulas. La activacin de las caspasas
puede ser regulada por molculas tales como los miembros de la familia Bcl-2,
FADD, APAF-1, FLIP e IAPs (Ekert y col., 1999). Con relacin a la liberacin
del citocromo c de la mitocondria, se han propuesto varios modelos que
incluyen la ruptura de la membrana mitocondrial externa o la formacin de un
canal especfico. Una sobreexpresin del gen bcl-2, que codifica la protena
citoplasmtica Bcl-2 de 26 kDa, confiere resistencia a la apoptosis en diversos
tipos celulares. El mecanismo relacionado con dicha resistencia incluye, al
parecer, un cambio en el potencial redox de la clula hacia un estado ms
reducido. Este mecanismo est de acuerdo con los estudios que relacionan las
etapas iniciales de la apoptosis con la exposicin de las clulas a especies
reactivas de oxgeno. Las observaciones anteriores pueden tener gran utilidad
en terapia, usando precursores de drogas citotxicas que requieren
15
16
que la protena p53 activa la expresin del gen bax al unirse a su regin
promotora, con lo cual se favorece la apoptosis dependiente de p53.
17
18
19
20
Existen varias vas que pueden conducir a la apoptosis y en cada una de ellas
se han estudiado protenas tanto comunes como especficas. La va apopttica
ms estudiada es la que involucra a los "receptores de muerte" e incluye al
receptor del factor de necrosis tumoral o TNFR (del ingls tumor necrosis
factor receptor) y a Fas/CD95 (Ashkenazi y Dixit, 1998). Despus de unirse con
el ligando TNF- (tumor necrosis alpha factor), el TNFR se trimeriza,
formndose un complejo con molculas tales como TRADD, que favorecen la
transduccin de seales. A su vez TRADD favorece la unin de FADD, lo que
lleva a apoptosis al activarse la proteasa caspasa-8 (Ashkenazi y Dixit, 1998).
La caspasa-8 activada inicia una cascada proteoltica que incrementa la
apoptosis. Tambin TRADD puede asociarse con RIP y con TRAF-2, lo que
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
5. CONCLUSIONES
AGRADECIMIENTOS
31
ABREVIATURAS
HPV
LTC
Linfocitos T citotxicos.
BIBLIOGRAFA
Agarwal, M.L., Taylor, W.R., Chernov, M.V., Chernova, O.B. and Stark, G.R.
1998. The p53 network. J. Biol. Chem..273: 1-4.
Aranda, A., Orozco, F., Garcia, E. and Gariglio, P. 1999. p53 is a rate-limiting
factor in the repair of higher-order DNA structure. Biochim. Biophys. Acta
1446:181-192.
Arrowsmith, CH., 1999. Structure and function in the p53 family. Cell Death
Differ. 6: 1169-1173.
Ashkenazi A. and Dixit V.M., 1998. Death receptors: signaling and modulation.
Science 281: 1305-1308.
Bennett, M., Macdonald, K., Chan, S.W., Luzio, J.P., Simari, R. and Weissberg,
32
P. 1998. Cell surface trafficking of FAS: a rapid mechanism of p53mediated apoptosis. Science 282: 290-293.
Bennett, M.W., O'Connell. J., O'Sullivan, G.C., Brady, C., Roche, D., Collins,
J.K. and Shanahan, F. 1998. The Fas counterattack in vivo: apoptotic
depletion of tumor-infiltrating lymphocytes associated with Fas
expression by humanesophageal carcinoma. J. Immunol. 160:56695675.
Bishop, J.M. and Weinberg, R. A., 1996. Molecular Oncology. New York
Scientific American, Inc.
Blasco, M.A., Funk, W., Villeponteau, B. and Greider, C.W. 1995. Functional
characterization and developmental regulation of mouse telomerase
RNA. Science 269:1267-1270.
Brown, K. and Balmain, A., 1995. Transgenic mice and squamous multistage
skin carcinogenesis. Cancer Metastasis Rev. 14:113-124
Cardone, M.H., Roy, N., Stennicke, H.R., Salvesen, G.S., Franke, T.F.,
Stanbridge, E., Frisch, S. and Reed, J.C. 1998. Regulation of cell death
protease caspase-9 by phosphorylation. Science 282: 1318-1321.
Claassen, G.F. and Hann S.R., 1999. Myc-mediated transformation: the
repression connection. Oncogene 18: 2925-2933.
Cordon-Cardo, C., 1995. Mutations of cell cycle regulators. Biological and
clinical implications for human neoplasia. Am. J. Pathol. 147: 545-560.
Cortazzo, M. and Schor N.F., 1996. Potentiation of enediyne-induced apoptosis
and differentiation by Bcl-2. Cancer Res. 56: 1199-1203.
Cox, L.S. and Lane, D.P., 1995. Tumour suppressors, kinases and clamps: how
p53 regulates the cell cycle in response to DNA damage. Bioessays
33
17:501-508.
Chao, D.T. and Korsmeyer, S.J., 1998. BCL-2 family: regulators of cell death.
Annu. Rev. Immunol. 16: 395-419.
Dameron, K.M., Volpert, O.V., Tainsky, M.A. and Bouck, N. 1994. Control of
angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1.
Science 265:1582-1586.
Dang, C. V. and Lee, A., 1995. c-Myc Function in Neoplasia. Medical
Intelligence Unit. Texas, R.G. Landes Co.
DeGregori, J., Leone, G., Miron, A., Jakoi, L. and Nevins, J.R. 1997. Distinct
roles for E2F proteins in cell growth control and apoptosis. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94: 7245-7250.
Del Peso, L., Gonzalez-Garcia, M., Page, C., Herrera, R. and Nez, G. 1997.
Interleukin-3-induced phosphorylation of BAD through the protein kinase
Akt. Science 278:687-689.
Ekert, P.G., Silke, J. and Vaux, D.L., 1999. Caspase inhibitors. Cell Death
Differ. 6:1081-1086.
Evan, G. and Littlewood T., 1998. A matter of life and cell death. Science
281:1317- 1322.
Folkman, J. and Shing, Y., 1992. Angiogenesis. J. Biol. Chem. 267:1093110934.
Frame, S. and Balmain A., 2000. Integration of positive and negative growth
Signals during ras pathway activation in vivo. Curr. Op. Genet. Dev. 10:
106-113.
Gariglio, P., and Rangel, L.M. 1992. Virus y cncer. Salud Pblica Mex. 34:308317.
34
Grana, X. and Reddy, E.P. 1995. Cell cycle control in mammalian cells: role of
cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs), growth suppressor genes and
cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). Oncogene 11:211-219.
Grugel, S., et al. 1995. Both v-H-ras and v-raf stimulate expression of the
vascular endothelial growth factor in NIH 3T3 Cells. J. Biol. Chem.
270:25915-25919,
Guido M., Zamorano, R., Garrido, E., Gariglio, P. and Garca, A. 1992. Early
promoters of genital and cutaneous human papillomaviruses are
differentially regulated by the bovine papillomavirus type 1E2 gene
product. J. Gen. Virol. 73:1395-1400.
Guo, M. and Hay, B., 1999. Cell proliferation and apoptosis. Curr. Op. in Cell
Biol. 11:745-752.
Hahn W. Counter, C.M., Lundberg, A.S., Beijersbergen, R.L., Brooks, M.W. and
Weinberg, R.A. 1999a. Creation of human tumor cells with defined
genetic elements. Nature 400:468-472.
Hahn, W., Stewart, S.A., Brooks, M.W., York, S.G., Eaton, E., Kurachi, A.,
Beijersbergen, R.L., Knoll, J.H., Meyerson, M. and Weinberg, R.A..
1999b. Inhibition of telomerase limits the growth of human cancer cells.
Nature Medicine 5:1164-1168.
Harley, C.B. and Villeponteau, B., 1995. Telomeres and telomerase in aging
and cancer. Curr. Opin. Genet. Dev. 5:249-255.
Harrington, E.A., Fanidi, A., and Evan, G.l., 1994. Oncogenes and cell death.
Curr. Opin. Genet. Dev. 4:120-129.
Hidalgo, A., Schewe, C., Petersen, S., Salcedo, M., Gariglio, P., Schluns, K.,
Dietel, M. and Petersen, I. 2000. Human papilloma virus status and
35
36
37
Muller, M., Wilder, S., Bannasch, D., Israeli, D., Lehlbach, K., Li-Weber, M.,
Friedman, S.L., Galle, P.R., Stremmel, W., Oren, M. and Krammer, P.H.
1998. p53 activates the CD95 (APO-1/Fas) gene in response to DNA
damage by anticancer drugs. J. Exp. Med. 188:2033-2045.
Murray, A.W. and Hunt, T., 1993. The Cell Cycle: An Introduction. (New York
WH Freeman).
Muzio, M., Stockwell, B.R., Stennicke, H.R., Salvesen, G.S. and Dixit, V.M.
1998. An induced proximity model for caspase-8 activation. J. Biol.
Chem. 273: 2926-2930.
Nr, J.E., Christensen, J., Mooney, D.J. and Polverini, P.J.. 1999. Vascular
endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis is associated
with enhanced endothelial cell survival and induction of Bcl-2 expression.
Am. J. Pathol 154:375-384.
O'Connell, J., Bennett, M.W., O'Sullivan, G.C., Roche, D., Kelly, J., Collins, J.K.
and Shanahan, F. 1998. Fas ligand expression in primary colon
adenocarcinomas: evidence that the Fas counterattack is a prevalent
mechanism of immune evasion in human colon cancer. J. Pathol.
186:240-246.
Owen-Schaub, L.B., Zhang, W., Cusack, J.C., Angelo, L.S., Santee, S.M.,
Fujiwara, T., Roth, J.A., Deisseroth, A.B., Zhang, W.W. and Kruzel, E.
1995. Wild-type human p53 and a temperature-sensitive mutant induce
Fas/APO-1 expression. Mol. Cell. Biol. 15:3032-3040.
Ozes, O.N., Mayo, L.D., Gustin, J.A., Pfeffer, S.R. and Pfeffer, L.M. 1999. NFkB
activation by tumor necrosis factor requires the Akt serine-threonine
kinase. Nature 401:82-85.
38
Pelengaris, S., Rudolph B. and Littlewood T., 2000. Action of Myc in vivo
proliferation and apoptosis. Curr Opin Genet Dev 10:100-105.
Perez, D. and Rebollo A., 1999. Novel aspects of Ras protein biology:
regulation and implications. Cell Death Differ. 6: 722-728.
Pike, M.C. and Forman, D., 1991. Epidemiology of cancer. Introduction to the
Cellular and Molecular Biology of Cancer. In L.M. Franks, N.M. Geich,
eds.(New York, Oxford University Press), p.49.
Prendergast, G.C. 1999. Mechanisms of apoptosis by c-Myc. Oncogene
18:2967-2987.
Rak, J.N., et al. 1995. Consequences of angiogenesis for tumor progression,
metastasis and cancer therapy. Anticancer Drugs 6: 3-18.
Rassoulzadegan, M., Cowie, A., Carr, A., Glaichenhaus, N., Kamen, R. and
Cuzin, F. 1982. The roles of individual polyoma virus early proteins in
oncogenic transformation. Nature 300:713-718.
Rebollo A. and Martinez C. 1999. Ras proteins: Recent advances and new
functions. Blood 94:2971-2980.
Reed, J. 1998. Bcl-2 family proteins. Oncogene 17:3225-3236.
Reisman, D., Elkind, N.B., Roy, B., Beamon, J. and Rotter, V. 1993. c-Myc
transactivates the p53 promoter through a required downstream
CACGTG motif. Cell Growth Differ. 4:57-65.
Rsujimoto Y. and Shimizu S. 2000. Bcl-2 family: life-or-death switch. FEBS Lett.
466:6-10.
Sancar, A. 1994. Mechanisms of DNA excision repair. Science 266:1954-1956.
Scaffidi, C., Fulda, S., Srinivasan, A., Friesen, C., Li, F., Tomaselli, K.J.,
Debatin, K.M., Krammer, P.H. and Peter, M.E. 1998. Two CD95 (APO-
39
40
Res.19:4759-4771.
Wani, M., et al. 2000. Enhanced sensitivity to anti-benzo(a)pyrene-diol-epoxide
DNA damage correlates with decreased global genomic repair
attributable to abrogated p53 functions in human cells. Cancer Res. 15:
2273-2280.
Xu, H.-J., Zhou, Y., Seigne, J., Perng, G.S., Mixon, M., Zhang, C., Li, J.,
Benedict, W.F. and Hu, S.X. 1996. Enhanced tumor suppressor gene
therapy via replication-deficient adenovirus vectors expressing an NTerminal truncated retinoblastoma protein. Cancer Res. 56:2245-2249.
Yap, D.B., HsieH, J.K., Chan, F.S. and Lu, X. 1999. mdm2: a bridge over the
two tumour suppressors, p53 and Rb. Oncogene 18: 7681-7689.
Yu, K., Ravera, C.P., Chen, Y.N. and McMahon, G. 1997. Regulation of Mycdependent apoptosis by p53, c-Jun N-terminal kinases/stress-activated
protein kinases, and Mdm-2. Cell Growth Differ. 8:731-742.
Zindy, F., Eischen, C.M., Randle, D.H., Kamijo, T., Cleveland, J.L., Sherr, C.J.
and Roussel, M.F. 1998. Myc signaling via the ARF tumor suppressor
regulates p53-dependent apoptosis and immortalization. Genes Dev. 12:
2424-2433.
Zur Hausen, H. 1991. Viruses in human cancers. Science 254:1167-1173.
41
42
1999
Total
myc
788
902
11,320
ras
998
1,918
17,770
bcl-2
61
1,564
6,348
p53
226
3,385
17,605
rb
375
615
9,320
> 60,000
HPV
480
826
8,036
Captulo 9
Vacunas contra virus de papiloma humano
Alejandro Garca Carranc 1,2.
1
Email: carranca@servidor.unam.mx
PALABRAS CLAVE: virus, papiloma humano, vacunas, VLP's y E2.
NDICE
1. El cncer crvico uterino y los virus de papiloma humano.
1.1 Generalidades.
1.2 Diversidad de los HPV.
1.3 Organizacin general del genoma viral.
1.4 Los genes L1 y L2 y las protenas de la cpside.
1.5 Los oncogenes E6 y E7.
1.6 El regulador transcripcional E2.
2. Objetivos del captulo
3. Vacunas contra virus de papiloma humano.
3.1 Vacunas profilcticas.
3.1.1 Las partculas pseudo-virales (VLPs).
3.1.2 Las partculas pseudo-virales quimricas (cVLPs).
3.2 Vacunas teraputicas.
3.2.1 Modulacin de la respuesta inmune.
3.2.2 Inhibicin de oncogenes virales e induccin de apoptosis.
1.1 Generalidades
Los HPV constituyen un grupo diverso de virus que infecta los epitelios de
la piel y las mucosas de los humanos. Pertenecen a la familia de los virus de
Papiloma o Papiloma virus (PV), cuyos miembros afectan e inducen la
proliferacin especfica de diversos tipos de lesiones en los epitelios de muchos
animales, desde peces y aves hasta mamferos, incluyendo adems de los
humanos, a los bovinos, venados, alces, orcas, delfines, monos, conejos y perros,
entre otros.
Los HPV pueden ser divididos de manera general en dos grandes grupos:
aquellos que infectan la piel y aquellos que infectan las mucosas orales y
genitales. De los aproximadamente 100 tipos distintos de HPV identificados a la
fecha, cerca de 80 ya han sido clasificados. Slo alrededor de una tercera parte de
ellos se asocia con lesiones de las mucosas anales y genitales (zur Hausen,
1996).
De todos los HPV identificados hasta ahora, slo algunos de ellos se
encuentran presentes de manera consistente en los tumores malignos y las
lesiones precursoras de stos. En particular, los tipos virales 16, 18, 31, 33, 35, 45
y 58 se han encontrado en la mayora de los tumores analizados a la fecha (Bosch
y col., 1995). Estos virus y todos aquellos que se encuentran con cierta frecuencia
En el caso de los HPV, se han desarrollado hasta ahora bsicamente dos tipos
distintos de vacunas: i) las tradicionales, que pretenden impedir las infecciones
virales mediante la neutralizacin de las partculas virales y ii) las llamadas
10
11
12
Los esfuerzos que ofrecen alternativas para la teraputica del CaCU han llevado a
diversos grupos a proponer y desarrollar estrategias para controlar el crecimiento
de los tumores. Estas alternativas se han basado hasta ahora en dos propuestas o
concepciones distintas. Por un lado, en tratar de modular la respuesta inmune del
husped, de manera local principalmente, y por el otro, en controlar la expresin
de los oncogenes E6 y E7, responsables del crecimiento anormal de las clulas
tumorales.
13
El hecho de que los tumores del cuello uterino expresen dos protenas de origen
viral (las oncoprotenas E6 y E7) aunado al conocimiento de la respuesta inmune
del huesped, ha permitido disear estrategias para tratar de inducir la regresin de
los tumores mediante el uso de pptidos derivados de estas dos molculas. En
principio, se ha pretendido identificar a los epitopos virales que son presentados
por las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I. En uno de los
primeros ensayos clnicos que se realizaron, se utiliz como vector viral al virus de
la vaccinia y a los oncogenes E6 y E7 de los HPV tipo 16 y 18 de manera
simultnea. En este trabajo, la vacuna se inocul en un grupo de 8 mujeres con
cncer crvico uterino en estadios avanzados. Las pacientes fueron inoculadas
con una sola dosis de la vaccinia recombinante. Mientras que todas las mujeres
desarrollaron anticuerpos contra antgenos de la vaccinia, solo tres de ellas
desarrollaron anticuerpos contra las protenas de HPV. Slo en una de las
pacientes se pudieron detectar linfocitos T citotxicos especficos contra las
protenas del HPV, que pudieran ser de utilidad terapetica (Borysiewics y col.,
1996).
En otras estrategias se ha pretendido inducir la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos, la cual se logra mediante la administracin a los
pacientes de anticuerpos o de antgenos tumorales solubles, ya sea en forma de
protenas, pptidos, e incluso, de los genes que codifiquen estos pptidos y que
han sido llamados por algunos autores minigenes.
14
15
tercera generacin, han mostrado su eficacia en diversos ensayos, pues han sido
capaces de inducir una respuesta inmune protectora en un nmero de modelos
preclnicos de la enfermedad. Las vacunas de ADN llevan diversos genes que
codifican para protenas antignicas de patgenos o de tumores, en lugar de usar
las propias protenas. En general, estas vacunas consisten en plsmidos
bacterianos que llevan un promotor fuerte para inducir la expresin del gen de
inters, adems de una seal para la poliadenilacin de los transcritos de ARN y
seales de terminacin de la transcripcin.
Los plsmidos se crecen generalmente en bacterias, se purifican por
mtodos convencionales y se disuelven en solucin salina o fisiolgica, para
despus ser inyectados en el husped. El ADN inyectado es "tomado" por las
clulas del organismo en el cual se inyecta y se produce la protena de inters.
Generalmente, los plsmidos slo llevan un origen de replicacin que es funcional
en bacterias, por lo cual no existe la posibilidad de que ste se amplifique y/o
replique en las clulas inyectadas, as como tampoco existe, por lo general, el
riesgo de que se integren al genoma celular.
Las observaciones iniciales en este campo mostraron la eficacia de una
"vacuna" de ADN para proteger animales contra un reto de virus de la influenza.
Los animales fueron inmunizados con el gen que codifica para una protena
interna y muy conservada del virus de la influenza A; la nucleoprotena (NP). Los
animales desarrollaron anticuerpos especficos contra la NP, as como una
respuesta citotxica de clase tipo I. Este hecho mostr el enorme potencial de esta
tecnologa para inducir una respuesta CTL restringida para las molculas MHC
16
4. PERSPECTIVAS
El cncer crvico uterino es una de las neoplasias que puede ser curada
totalmente si es detectada de manera temprana. Adems, es una neoplasia que
podra ser eliminada completamente si las infecciones por ciertos HPV de alto
riesgo que colonizan las mucosas genitales pudieran ser eliminadas. En la
actualidad se estn realizando esfuerzos enormes a nivel mundial por desarrollar
vacunas contra HVP. Estas son bsicamente de dos tipos, las que pretenden
impedir las infecciones virales mediante el desarrollo de una inmunidad humoral y
celular (vacunas profilcticas) y aquellas que pretenden detener e inducir la
regresin de lesiones preexistentes e incluso de tumores (vacunas teraputicas).
Las estrategias modernas para el desarrollo de vacunas en contra de HPV
contemplan principalmente la utilizacin de las llamadas VLPs (por las siglas en
ingls virus-like-particles), las cuales en realidad estn formadas por cpsides
17
18
AGRADECIMIENTOS
ABREVIATURAS
CaCU
HPV
19
LCR
Regin reguladora.
VLPs
Partculas pseudo-virales.
PCR
RIA
Radioinmuno-ensayo.
NP
Nucleoprotena.
BIBLIOGRAFA
Bernard, H.-U., Chan, S.Y., Manos, M.M., Ong, C.K., Villa, L.L., Delius, H., Peyton
C.L., Bauer, H.M. and Wheeler, C.M., 1994. Identification and assessment
of known and novel human papillomaviruses by polymerase chain reaction
amplification, restriction fragment length polymorphisms, nucleotide
sequence, and phylogenetic algorithms. J. Infect. Dis. 170:1077-85.
Bontkes, H.J., De Gruijl, T.D., Walboomers, J.M., Schiller, J.T., Dillner, J.,
Helmerhorst, T.J., Verheijen, R.H., Scheper, R.J. and Meijer, C.J., 1999.
Immune responses against human papillomavirus (HPV) type 16 virus-like
particles in a cohort study of women with cervical intraepithelial neoplasia. II.
Systemic but not local IgA responses correlate with clearance of HPV-16. J.
Gen. Virol. 80:409-417.
Borysiewics, L.K., Fiander, A., Nimako, M., et al., 1996. A recombinant vaccinia
virus encoding human papillomavirus types 16 and 18, E6 and E7 proteins
as immunotherapy for cervical cancer. The Lancet 347:1523-1527.
Bosch, F.X., Manos, M.M., Muoz, N., Sherman, M., Jensen, A.M., Peto, J.,
20
Schiffman, M., Moreno, V., Kurman, R. and Shah, K.V., 1995. Prevalence of
human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. IBSCC
Study Group. J. Natl. Cancer Inst. 87:796-802.
Boullaga, I., Massicard, S., Yaniv, M. and Thierry, F., 2000. An enhanceosome
containing the JunB/Fra-2 heterodimer and the HMG-I(Y) architectural
protein controls HPV18 transcription. EMBO Rep. 1:422-7.
Breitburd, F., Kirnabauer, R., Hubbert, N.L., Nonnenmacher, B., Trin-DinhDesmarquet, C., Orth, G., Schiller, J.T. and Lowy, D.R., 1995 Immunization
with viruslike particles from cottontail rabbit papillomavirus (CRPV) can
protect against experimental CRPV infection. J. Virol. 69:3959-3963.
Chen, L., Thomas, E.K., Hu, S., Hellstrom, I. and Hellstrom. K.E., 1991. Human
papillomavirus type 16 nucleoprotein E7 is a tumor rejection antigen. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:110-114.
Desaintes, C., Hallez, S., VanAlphen, P. and Burny, A., 1992. Transcriptional
activation of several heterologous promoters by the E6 protein of human
papillomavirus type 16. J. Virol. 66:325-333.
Desaintes, C., Demeret, C., Goyat, S., Yaniv, M. and Thierry, F.,1997. Expression
of the papillomavirus E2 protein in HeLa cells leads to apoptosis. EMBO J.
3:504-514.
Ho, L., Chan, S.Y., Burk, R.D et al., 1993. The genetic drift of human
papillomavirus type 16 is a means of reconstructing prehistoric viral spread
and the movement of ancient human populations. J. Virol. 67:6413-6423.
Lowy, D.R. and Schiller, J.T., 1999. Papillomaviruses: prophylactic vaccine
prospects. Biochim. Biophys. Acta 29:M1-M8.
21
Nieland, J.D., Da Silva, D.M., Velders, M.P., De Visser, K.E., Schiller, J.T., Muller,
M. and Kast, WM., 1999. Chimeric papillomavirus virus-like particles induce
a murine self-antigen-specific protective and therapeutic antitumor immune
response. J. Cell Biochem. 73:145-152.
Parkin, D.M., Laara, E. and Muir, C.S., 1985. Estimates of the world-wide
frequency of sixteen major cancers in 1980. In. J. Cancer 41:184-197.
Rocha-Zavaleta, L., Alejandre, J.E. and Garca-Carranc, A., 2001. Parenteral and
oral immunization with a plasmid DNA expressing the Human
Papillomavirus 16-L1 gene induces systemic and mucosal antibodies and
CTL responses. J. Med. Virol. In press.
Suzich, J.A., Ghim, S.J., Palmer-Hill, F.J., White, W.I., Tamura, J.K., Bell, J.A.,
Newsome, J.A., Jenson, A.B. and Schlegel, R., 1995. Systemic
immunization with papillomavirus L1 protein completely prevents
development of viral mucosal papillomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:11553-11557.
Thierry, F. and Yaniv, M., 1987. The BPV1-E2 trans-acting protein can be either an
activator or a repressor of the HPV18 regulatory region. EMBO J. 6:33913397.
von Knebel-Doeberitz, M., Rittmuller, C., zur Hausen, H. and Drst, M., 1992.
Inhibition of tumorigenicity of cervical cancer cells in nude mice by HPV E6E7 anti-sense RNA. Int. J. Cancer 51:831-834.
Zhou, J., Doorbar, J., Sun, X-Y, Crawford, L.V., McLean, C.S. and Frazer, I.H.,
1991. Identification of the nuclear localization signal of human
papillomavirus type 16 L1 protein. Virology 185:625-632.
22
Captulo 10
Diagnstico molecular de las enfermedades hereditarias
Lorena Orozco 1, Miguel Angel Alcntara 1,2 y Ariadna
Gonzlez-del Angel 1.
1
Email: lorozco@mailer.main.conacyt.mx
PALABRAS CLAVE: Diagnstico molecular, enfermedades mendelianas, patologa
hereditaria.
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivo del captulo.
3. Concepto de herencia mendeliana.
3.1 Herencia autosmica dominante.
3.2 Herencia autosmica recesiva.
3.3 Herencia recesiva ligada al cromosoma X.
3.4 Herencia dominante ligada al cromosoma X.
4. Mutaciones responsables de las enfermedades hereditarias.
4.1 Principales clases de mutaciones.
4.2 Localizacin de la mutacin.
4.3 Mutaciones frecuentes causantes de la enfermedad (aleatorias, puntos
calientes, mutaciones fundadoras).
4.4 Efecto de las mutaciones sobre la funcin.
4.5 Modificacin epigentica.
5. Diagnstico molecular.
5.1 Anlisis de DNA.
5.1.1 Diagnstico molecular directo (DD).
5.1.2 Diagnstico molecular indirecto (DI).
5.2 Anlisis de RNA y producto gnico.
6. Ventajas y desventajas del diagnstico molecular.
6.1 Ventajas.
6.2 Desventajas.
7. Terapia gnica.
8. Conclusiones.
Abreviaturas.
Bibliografa
Informacin complementaria en internet (links).
1. INTRODUCCIN
Este captulo tiene como objetivo explicar los conceptos bsicos del diagnstico
molecular de los padecimientos hereditarios, especialmente de aquellos que
siguen un patrn de herencia mendeliano o monognico.
ii)
iii)
iv)
ii)
iii)
iv)
ii)
iii)
iv)
v)
10
ii)
iii)
iv)
v)
11
i)
ii)
iii)
Mutaciones puntuales: son el cambio de una sola base por otra. Estas
mutaciones se pueden clasificar en:
- Mutaciones con sentido errneo: reemplazan un aminocido por otro
en el producto gnico.
- Mutaciones sin sentido: reemplazan cualquiera de los codones por un
codn de terminacin.
- Mutaciones en sitios de splicing (corte de algunas secuencias y
ensamble de los fragmentos de DNA) crean o destruyen sitios para el
splicing de los exones.
iv)
12
v)
13
con sndrome de X frgil (De Vries y col., 1998); cuando la naturaleza del gen
es tal que un tipo de mutacin particular ocurre repetidamente, como en la
distrofia muscular de Duchenne (DMD) donde el gran tamao del gen y la
frecuencia de recombinacin condicionan la alta frecuencia de deleciones en
dos puntos calientes del gen DMD; o cuando los individuos afectados llevan la
misma mutacin ancestral como en el caso de la fibrosis qustica donde existe
una mutacin altamente prevalente conocida como F508 que fue generada en
las primeras poblaciones noreuropeas (mutacin fundadora). Esta mutacin
esta presente en el 70% de los cromosomas de pacientes caucsicos con
fibrosis qustica y en alrededor del 40% de los cromosomas de los pacientes
mexicanos (Orozco y col., 1993).
Los efectos principales que pueden tener las mutaciones son la prdida o
ganancia de la funcin. En este sentido, el producto puede presentar una
reduccin (hipomorfo) o la prdida total (amorfo) de la funcin, pero tambin
puede ganar alguna funcin por el incremento en su cantidad o en su actividad
(hipermorfo), adquirir una funcin nueva (neomorfo) o antagonizar la actividad
del producto normal (antimorfo). Mientras que las mutaciones que ganan
funcin usualmente causan fenotipos dominantes, las mutaciones que la
pierden generalmente conducen a fenotipos recesivos, como en la mayora de
los errores innatos del metabolismo (Glick y col., 1998).
Cuando un fenotipo clnico es causado por prdida de la funcin de un
gen, cualquier tipo de mutacin que inactive el producto gnico conduce al
14
15
iii)
16
5. DIAGNSTICO MOLECULAR
17
18
19
El diagnstico molecular a travs del anlisis del RNA puede tener ventajas
sobre el que utiliza DNA, en el sentido de que facilita el estudio de genes de
gran tamao, sin embargo el RNA es ms difcil de obtener y trabajar, debido a
que se degrada con facilidad. Las muestras de RNA deben ser manipuladas
con cuidados extremos y ser procesadas rpidamente para evitar la
degradacin, adems se requiere que el gen de inters sea expresado en los
tejidos accesibles. Por otro lado, muchas mutaciones conducen a la
inestabilidad del RNA, por lo que en una persona heterocigota pudiera
detectarse slo el alelo normal (Strachan y Read, 1999).
20
21
6.1 Ventajas
6.2 Desventajas
22
23
24
Talasemias (anemia).
7. TERAPIA GNICA
25
8. CONCLUSIONES
26
27
el derecho que tiene cada individuo para decidir si desea o no ser analizado y
la potencial invasin a la privacidad del ser humano. Los aspectos sociales,
psicolgicos y ticos del tamizaje gentico sern ms complejos a medida que
nuevas metodologas sean accesibles para este tipo de diagnstico. Por
ejemplo, an cuando el diagnstico presintomtico es posible en la enfermedad
de Huntington, nicamente alrededor del 20% de las personas con riesgo de
presentarla solicitan este tipo de diagnstico, lo cual se debe principalmente al
hecho de que a la fecha no se cuenta con un tratamiento efectivo.
Una de las aplicaciones de la Biologa Molecular que cada da toma ms
importancia es el diagnstico prenatal. Con el conocimiento de los genes
responsables de algunas patologas desde hace varios aos es posible realizar
el diagnstico en etapa prenatal de estos padecimientos y ms an,
actualmente es posible realizar el diagnstico preimplantacin, que se basa en
el anlisis de una clula en etapa de blastocisto o bien del cuerpo polar y tiene
como objetivo implantar en el tero slo embriones sanos, evitando as la
interrupcin de un embarazo en etapas avanzadas de la gestacin.
La meta de esta avalancha de conocimientos es sin duda la terapia
gnica, en la cual aunque existen resultados prometedores an se requiere un
mayor esfuerzo para lograr tratamientos efectivos y seguros. Estos
conocimientos adquieren mayor relevancia si se considera que patologas
complejas y altamente frecuentes en la poblacin como la diabetes,
hipertensin, cncer y las enfermedades autoinmunes tienen un componente
gentico y aunque los estudios moleculares para definir los factores genticos
en este grupo de enfermedades tienen mayores limitaciones que en las
enfermedades monognicas. Evidentemente, en un futuro los conocimientos
28
ABREVIATURAS
PGH
HDLCX
DMD
DUP
Disoma uniparental
DD
DI
SSCP
AS
Anlisis de heterodplex.
FQ
Fibrosis qustica.
BIBLIOGRAFA
Alcntara, M. A., Villarreal, M. T., Del Castillo, V., Gutirrez, G., Saldaa, Y.,
Maulen, I., Lee, R., Macas, M. and Orozco, L. 1998. High frequency of
de novo deletions in Mexican Duchenne and Becker muscular dystrophy
patients. Implications for genetic counseling. Clin. Genet 55:376-380.
Austin, K. D. and Hall, J. G. 1992. Non traditional inheritance. Pediatr Clin North
Am 39: 335-348.
Cooper, D.N., Krawczak, M. and Atonarakis, S. E. 1995. The nature and
29
30
31
Pgina elaborada por el Crown Human Genome Center & Bioinformatics Unit,
del Weizmann Institute of Science. Es un banco muy completo de datos sobre
genes humanos, sus productos y las enfermedades hereditarias que
condicionan. Provee informacin concisa sobre las secuencias gnicas
humanas hasta ahora descritas, las secuencias de los mRNA, cDNA,
polimorfismos, enfermedad relacionada, posicin en el mapa citogentico,
fsico y gentico. Menciona las mutaciones ms frecuentes en las
enfermedades descritas.
http://bisance.citi2.fr/GENATLAS/
Sitio creado por diversas instituciones francesas, como el INSERM. En esta
pgina se encontrarn las caractersticas principales de ms de 20,000
marcadores hasta ahora descritos, as como 9,396 genes y 1970
padecimientos hereditarios actualizados mensualmente.
http://www.gene.ucl.ac.uk/cgi-bin/nomenclature/searchgenes.pl
http://www.esquilax.com/nifty/
Pginas web que contienen informacin sobre ms de 10,300 genes,
incluyendo marcadores asociados.
http://www.cephb.fr/bio/ceph-genethon-map.htlm
Pgina auspiciada por el CEPH-Gnthon de Francia. Contiene informacin
sobre genes y marcadores en el humano.
http://www.ocml.gov/hgmis/project/info.htlm
Pgina oficial del Proyecto del Genoma Humano. En ella se encuentra toda la
informacin obtenida da a da. Incluye la historia, los objetivos, logros y
consideraciones ticas del PGH.
32
Mtodo
Observaciones
Digestin con endonucleasas de Solamente cuando la mutacin crea o elimina
productos de
un sitio de restriccin.
PCR
Hibridacin alelo especifica con Mtodo general para mutaciones puntuales.
oligonucletidos (ASO)
Southern blot
Grandes deleciones, inserciones, mutaciones
en sitios de restriccin, mutaciones completas
en expansin de tripletas.
Polimorfismos conformacionales en Pequeas mutaciones, tamizaje de mutaciones
cadenas sencillas de DNA (SSCP), desconocidas
heterodplex
RT-PCR
Anlisis de RNA, mutaciones que afectan sitios
de splicing.
Anlisis de protenas truncadas (PTT) Mutaciones que producen codones de
terminacin prematuros
Hibridacin in situ con sondas Rearreglos cromosmicos: translocaciones,
fluorescentes (FISH)
deleciones, cromosomas marcadores, etc.
33
PIES DE FIGURAS
34
6 muestran una dosis gnica similar a la del CF por lo que no son portadoras
del padecimiento. Este estudio bajo condiciones experimentales
cuidadosamente controladas brinda un 100% de certeza en el diagnstico de
portadoras de deleciones en el gen DMD y es aplicable a otros padecimientos
que cursen con deleciones o duplicaciones gnicas. MP, marcadores de
tamao molecular.
35
Captulo 11
La Gentica de las enfermedades complejas
Vicente Baca 1 y Lorena Orozco2
1
Email: v_baca_ruiz@ncifcrf.gov
PALABRAS CLAVE: Enfermedades complejas, herencia multifactorial, SNPs, asociacin,
ligamiento, prueba de TDT.
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivos del captulo.
3. Herencia multifactorial.
4 Estudios que evidencian la participacin de los factores genticos en las
enfermedades complejas.
4.1 Estudios en familias.
4.2 Estudios en gemelos.
4.3 Estudios en individuos dados en adopcin.
5. Mapeo gentico de enfermedades complejas.
5.1 Anlisis de ligamiento.
5.2 Estudios de asociacin.
5.2.1 Causas de asociacin.
i) Efecto directo del marcador allico en estudio.
1. INTRODUCCIN
3. HERENCIA MULTIFACTORIAL
aunque pocas entidades son influenciados slo por los genes o por el ambiente,
en la mayora participan ambos.
Este tipo de estudios pueden proporcionar alguna informacin acerca de la
participacin gentica en diferentes enfermedades, aunque no permiten
discriminar con certeza la influencia de los factores genticos y ambientales.
Determinar la influencia de los factores genticos y/o ambientales en el desarrollo
de las enfermedades permite entender mejor su etiologa y as, establecer
medidas preventivas. Por ejemplo, en enfermedades en las cuales la influencia
gentica es relativamente baja como en el cncer de pulmn, se pueden
establecer medidas preventivas eficaces, como evitar el tabaquismo.
gemelos DC. Por ejemplo, en las enfermedades donde existe una gran influencia
de los factores genticos, se espera que la concordancia entre gemelos MC sea
mayor que en gemelos DC; sin embargo, en las enfermedades multifactoriales la
interpretacin de estos resultados puede ser poco confiable. Por otro lado, los
valores absolutos de concordancia son dependientes de la prevalencia de la
enfermedad en la poblacin, es decir, la concordancia entre gemelos aumenta
conforme la prevalencia de la enfermedad se incrementa, independientemente de
la contribucin gentica. Por lo tanto, los datos aislados de la concordancia entre
gemelos slo proporcionan una estimacin limitada de la contribucin gentica en
el desarrollo de la enfermedad. Por ejemplo, se ha observado que en la artritis
reumatoide (AR) la concordancia entre gemelos MC es aproximadamente del
15%. Esta observacin parecera indicar que la contribucin gentica en el
desarrollo de AR es baja, sin embargo, el anlisis de heredabilidad demuestra que
los factores genticos tienen una contribucin de aproximadamente el 60% en el
desarrollo de la AR. Heredabilidad es un concepto estadstico que se refiere a la
proporcin de la varianza total que es causada genticamente en una enfermedad
y es una forma ms confiable de medir la contribucin relativa de los factores
genticos y ambientales en el desarrollo de las enfermedades multifactoriales.
Este tipo de estudios tambin son utilizados para estimar la contribucin de los
factores genticos en las enfermedades complejas. Para este anlisis se incluyen
nios nacidos de padres que padecen alguna enfermedad y que son adoptados
por padres que no la padecen. La frecuencia con la que estos nios desarrollan la
enfermedad se compara con la de nios dados en adopcin nacidos de padres sin
la enfermedad. Es importante hacer nfasis de que los nios adoptados que
presentan la enfermedad no comparten el mismo ambiente que sus padres
biolgicos. La aplicacin ms comn de este mtodo ha sido en algunos
padecimientos psiquitricos como la esquizofrenia. Por ejemplo, entre el 8 y el
10% de los nios nacidos de padres con esta enfermedad y que son dados en
adopcin, desarrollan el padecimiento, mientras que ste slo se presenta en el
1% de los nios adoptados nacidos de padres sin esquizofrenia. As, estos datos
sugieren que existen factores genticos involucrados en el desarrollo de esta
patologa.
10
11
12
13
14
15
16
6. CONCLUSIONES
17
Aunque el 82% de los SNPs se han encontrado con una frecuencia mayor
al 10% en el ser humano, an es necesario conocer su frecuencia en
poblaciones individuales. Es importante sealar que se espera una
frecuencia menor de aquellos polimorfismos con un efecto potencial en la
18
iii)
iv)
19
ABREVIATURAS
HLA
SNPs
MC
Gemelos monocigticos.
DC
Gemelos dicigticos.
AR
Artritis reumatoide.
RFLPs
STRs
TDT
BIBLIOGRAFA
20
21
Immunol 53:1-11.
Thomson, G. 1997. Strategies involved in mapping diabetes genes: an overview.
Diabetes Rev. 5:106-115.
Venter, J.C. and et. al. 2001. The sequence of the human genome. Science 291:
1304-1351.
Xiong, M. and Jin, L. 1999. Comparison of the power and accuracy of biallelic and
microsatellite markers in population-based gene-mapping methods. Am. J.
Hum. Genet. 64:629-640.
PIES DE FIGURA
22
Captulo 12
Enfermedades Neurodegenerativas: participacin de la
neurotransmisin glutamatrgica
Roque Galaz-Vega1 y Arturo Ortega1.
1
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivos del captulo.
3. Estado actual del campo.
4. Conceptos generales.
5. Memoria.
6. Hipoxia.
7. Neurodegeneracin.
8. Parkinsonismo.
9. Esclerosis lateral amiotrpica.
10. Perspectivas.
Abreviaturas.
Bibliografa.
1. INTRODUCCIN
Los objetivos de este captulo son destacar la participacin del Glu en algunos
neurotransmisores, as como una introduccin a los eventos moleculares que se
conocen actualmente en el campo de la neurobiologa cognitiva y su implicacin
en el rea de la salud.
Por ser el neurotransmisor utilizado por casi la mitad de las sinapsis, la relevancia
de Glu es enorme, convirtindolo en el principal neurotransmisor excitador en el
sistema nervioso central. Las vas glutamatrgicas cubren desde las regiones
asociadas con integracin de estmulos como mdula espinal, hasta zonas que
determinan patrones conductuales complejos, como el hipocampo, pasando por
4. CONCEPTOS GENERALES
Una sinpsis, definida como elemento anatmico, est integrada por una cavidad
real (hendidura) cuyas paredes son las membranas celulares de dos neuronas y
un nmero variables de clulas gliales (Fig. 1). Funcionalmente, se compone de
una membrana presinptica, que es la membrana axonal de la neurona que libera
el neurotransmisor, una membrana postsinptica, donde el neurotransmisor
interacta con receptores especficos, y un entorno que rodea al espacio
compuesto por glia, que sirve como modulador de la neurotransmisin. Al ser
compuesta por membranas, su funcin obedece a la fisiologa de stas,
bsicamente regulada por su contenido en protenas transmembranales y
gradientes inicos.
Este diseo es altamente eficiente. Para que la neurotransmisin se
efecte, se requiere de factores con un alto grado de regulacin. Primero, es
necesario mantener la ubicacin de la sinapsis a travs de protenas del
citoesqueleto que anclan la membrana presinptica con la postsinptica, como la
neuroligina. En la cara presinptica de la sinapsis, el Glu es liberado por un
mecanismo dependiente de Ca2+ y energa a travs de vesculas, en una
concentracin que asegura que los receptores sean activados, alcanzando al
momento de su liberacin concentraciones txicas para la neurona
5. MEMORIA
10
6. HIPOXIA
11
7. NEURODEGENERACIN
12
13
8. PARKINSONISMO
La sobrestimulacin de los receptores para Glu junto con el estrs oxidativo han
sido propuestas como la causa del Parkinsonismo. Ambos actuaran de forma
sinrgica en la destruccin de las neuronas dopaminrgicas, el hallazgo
anatomopatolgico diagnstico de este grupo de enfermedades. En enfermos de
Parkinson, en su variante clsica, se han observado defectos en las enzimas
mitocondriales de las neuronas de la sustantia nigra. Estos defectos se encuentran
presentes tambin en las plaquetas de los enfermos, y al parecer son indicativos
de la enfermedad. En ellas se han encontrado niveles elevados de Glu, lo cual
contrasta con la disminucin que se presenta en la captura de Glu. La causa
posible de estos eventos es la deprivacin energtica, ya que en cultivos de
plaquetas en ausencia de glucosa se observa un fenmeno semejante. Otra causa
probable sera la conjuncin de diferentes alteraciones en el metabolismo
mitocondrial cuya consecuencia sera la prdida de la sntesis de glutamina,
dependiente de energa. Ambas hiptesis no son excluyentes, y debido a la
complejidad de la enfermedad, bien pueden ser elementos tempranos de una
cadena fisiopatolgica, cuyo final sera la perdida de la funcin integradora de
coordinacin motora.
14
10. PERSPECTIVAS
15
ABREVIATURAS
NOS
KA
cido Kanico.
Glu
Acido Glutmico.
EAAR
NMDA
cido N-metil-D-asprtico.
GluR
GLAST
PKC
ROS
Radicales libres.
ALS
BIBLIOGRAFA
16
Bosley, T.M. et al. 1983. Effects of anoxia on the stimulated release of amino acid
neurtotransmitters in the cerebellum in vitro. J. Neurochem. 40:189.
Crick, F. 1994. The Astonishing Hypothesis. Limpergraf Editors, Barcelona.
Fanh, S. and Cohen. G. 1992. Oxidative stress hypothesis in Parkinsons disease:
evidence supporting it. Ann. Neurol. 40:119-122.
Ito, M. 1983. Evidence of synaptic plasticity in the cerebellar cortex. Acta Morphol.
Hung. 31(1-3):213-218.
Ito, M. 1983. 1982. Experimental verification of Marr-Albus plasticity assumption
for the cerebellum. Acta Biol. 33:189-199.
Kandel, E. et al. 1999. Principles of Neural Science 4th edition. McGraw-Hill
Plubishers, New York.
Neurodegenerative diseases. Plenum Press, New York 1996.
OBrien, et al. 1998. Molecular mechanisms of glutamate receptor clustering at
excitatory synapses. Curr. Op. Neurobiol. 8:364-369.
Olney, J.W. and De Gubareff, T. 1978. Glutamate neurotoxicity and Huntingtons
Chorea Nature 271:557-559.
Reynolds, I.J. and Hastings, T.G. 1995.Glutamate induces the production of ROS
in cultured forebrain neurons following NMDA receptor activation. J.
Neurosci. 15:3318-3327.
Rothstein, J.D. et al. 1993. Chronic inhibition of glutamate uptake produces a
model of slow neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:659-659.
Rothstein, J.D., Martn, L.J., Levey, A.I., Dykes-Hoberg, M., Jin, L., Wu, D., Nash
N. and RW Kunkl RW. 1994. Localization of neuronal and glial glutamate
transporters. Neuron 13:713.
17
Rothstein, J.D. et al. 1995. Selective loss of glial glutamate transporter GLT-1 in
amyotrophic lateral sclerosis. Ann. Neurol. 38: 73-84.
Snchez-Prieto, J. and Gonzlez, P. 1988. Ocurrence of a large Ca2+
independent release of glutamate during anoxia in isolated nerve terminals
(synaptosomes). J. Neurochem 50:1322-1322.
18
Familia
Tipo de
Receptor
Subunidades
Ensamblaje
mGluR1
mGluR2
Propiedades Funcionales
mGluR3
Metabotrpicos
NMDA
NMDAR1a..h
NMDAR2A
NR-2
NMDAR2B
NMDAR2C
NMDAR2D
NMDA like
Canales Inicos
AMPA (KA)
GBP
Gly TCP-BP
desconocida de 36 kDa
GluR1
GluR2
GluR3
GluR2
GluR4
GluR5
GluR6
KA
Rpida desensibilizacin
GluR7
KA 1
KA 2
Hurfano
Otros
Ligadoras de
KA
NMDARL
Desconocida
KBP pollo
Subunidades nicas
KBP rana
No es funcional
No funcionales
Xen U1
Hurfano
Desconocida
No funcionales
19
PIES DE FIGURAS
de
calcio;
MAP:
cinasa
activada
por
mitgenos;
GLAST:
20
Captulo 13
Factores involucrados en la enfermedad autoinmune
Kristine M. Garza1, Linh T. Nguyen2, Russell G. Jones2 y Pamela
S. Ohashi2.
1
Email: kgarza@oci.utoronto.ca
PALABRAS CLAVE: respuesta inmune, autoinmunidad, citocinas, clulas T.
NDICE
1 Introduccin.
2 Objetivos del captulo.
3 Papel de las clulas presentadoras de antgeno en la autoinmunidad.
4. Papel de los receptores de muerte cd95 y tnfr1 en la tolerancia perifrica de
las clulas T.
5. Papel de las molculas de sobrevivencia en la autoinmunidad.
6. Conclusiones.
Abreviaturas
Bibliografa.
1. INTRODUCCIN
2
contra el agente invasor. Los linfocitos T juegan un papel clave en la respuesta
inmune. Reconocen y responden a componentes muy especficos del agente
extrao conocidos como antgenos, y ejecutan una serie de funciones que
terminan con la eliminacin del agente invasor. Las clulas T tambin pueden
reconocer como extraos a los auotantgenos, es decir, componentes de un
tejido del propio individuo. En estas condiciones, la activacin de las clulas T
resulta en una destruccin progresiva del tejido, la cual se manifiesta como una
enfermedad autoinmune clnicamente detectable.
Tpicamente, las clulas T que emigran del timo hacia los tejidos en
donde se encuentran sus autoantgenos, enfrentan uno de dos destinos: i) Si
encuentran concentraciones suficientes de su ligando especfico (en el
antgeno), las clulas T autorreactivas son sometidas a tolerancia perifrica. ii)
Si no encuentran a su ligando especfico o si no detectan la presencia de los
ligandos, los linfocitos T autorreactivos permanecen en el repertorio de la
periferia. La autoinmunidad patolgica puede generarse cuando cualquiera de
estos dos procesos, o ambos, se ramifican.
La autoinmunidad puede ser inducida a travs de la activacin de las
clulas T autorreactivas "ignorantes", es decir aquellas clulas T que no se
percatan o que ignoran la presencia de sus ligandos, debido a una serie de
eventos que son promovidos por la inflamacin. Tales eventos incluyen: i) la
elevacin de la concentracin del antgeno estimulante a un nivel umbral o
suficiente para su deteccin, ii) la presentacin del antgeno en clulas con
habilidades coestimulatorias, iii) la migracin de las clulas T "ignorantes" a las
reas de la presentacin de los antgenos, y/o iv) la migracin de clulas
presentadoras de antgenos o APC (de sus siglas en ingls Antigen Presenting
3
Cells) cargadas con el antgeno a las reas de las clulas T de los rganos
linfoides. Este es un proceso con muchos componentes que requiere de la
coordinacin de varios eventos para proveer un ambiente activador.
La autoinmunidad tambin puede ser inducida por la inhibicin de la
induccin de la tolerancia perifrica de las clulas T, delecin o anergia. El
efecto que tiene la prevencin de la delecin de las clulas T autorreactivas
est aumentado en los pacientes con el sdrome de linfoproliferacin
autoinmune o ALPS (del ingls Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome)
(Lenardo y col., 1999). En los pacientes con ALPS, la apoptosis inducida por el
receptor de las clulas T o TCR (del ingls T Cell Receptor) es deficiente y est
asociada con una linfoproliferacin no maligna y con autoinmunidad. El
sndrome de linfoproliferacin autoinmune es un desorden autosmico
dominante; sin embargo, no todos aquellos individuos que tienen este alelo lo
padecen. La implicacin es que existen tambin otros parmetros que afectan
la induccin de esta enfermedad autoinmune.
Ya se han identificado varios de los factores que parecen afectar la
induccin de las enfermedades autoinmunes. Algunos estudios han
demostrado que esta enfermedad es ms comn en personas que poseen
cierto tipo de complejos de histocompatibilidad mayor o MHC (del ingls Major
Histocompatibility Complex) (Nepom y Erlich, 1991; Wicker, 1997). Se piensa
que la asociacin de las enfermedades autoinmunes con ciertos alelos de MHC
se debe a la habilidad del complejo de histocompatibilidad de unir y presentar
autoantgenos, adems de la habilidad del MHC para seleccionar las clulas T
autorreactivas. Sin embargo, no todos los individuos desarrollan la enfermedad,
aunque tengan los mencionados alelos MHC de susceptibilidad a la
4
enfermedad. Tambin se ha propuesto que los agentes ambientales influyen en
la induccin de la autoinmunidad por medio de un nmero de mecanismos que
incluyen: i) el mimetismo molecular (Ohteki y col., 1999; Bachmaier y col.,
1999), ii) la induccin del dao al tejido, el cual a su vez origina la liberacin de
autoantgenos crpticos de origen peptdico (Gammon y col., 1991; Lehmann y
col., 1993), o iii) la regulacin positiva o ectpica de la expresin de molculas
coestimulatorias (Von Herrath y col., 1995; Harlan y col., 1994), las cuales han
mostrado que originan respuestas inmunes autodirigidas. La induccin de la
autoinmunidad tambin se ve altamente influenciada por la presencia de
citocinas (Falcone y Sarvetnick 1999; Singh y col., 1999). Tanto las citocinas
proinflamatorias como las antiinflamatorias, pueden promover o prevenir la
induccin de una enfermedad en general, dependiendo del momento, el nivel y
la localizacin de la produccin de las mismas. Por ltimo, los linfocitos
reguladores tambin pueden influenciar la induccin de la enfermedad
autoinmune. La presencia de linfocitos reguladores se ha demostrado en un
nmero de sistemas experimentales en los cuales, el repertorio de clulas T
est restringido, lo que resulta en una induccin espontnea de la enfermedad
autoinmune. Esto sugiere que la poblacin linfocitaria faltante tiene la
responsabilidad de mantener a las clulas T autorreactivas en constante
monitoreo (Gleeson y col., 1996; Mason y Powrie, 1998; Seddon y Mason,
2000). As, la prdida de las clulas reguladoras puede promover tambin la
autoinmunidad. Sin embargo, no se ha identificado con claridad a ningn factor
como el componente clave para la induccin de la autoinmunidad. Lo ms
probable es que existe una combinacin de diferentes factores que conducen a
la enfermedad.
5
2. OBJETIVOS DEL CAPTULO
6
sugieren que diferentes poblaciones de APC definen el resultado de la
interaccin de la clula T con su ligando, donde una poblacin induce
tolerancia y otra induce la activacin de las clulas T (Shortman y col., 1997;
Fazekas de St. Groth, 1998; Banchereau y Steinman, 1998 ). Estudios
recientes han sugerido que el "estado de activacin" de las APC puede incidir
en las respuestas de las clulas T. Se ha demostrado que la presentacin de
antgenos por las clulas B no activadas, sin que afecten a las clulas T, induce
tolerancia de las clulas T (Eynon y Parker, 1992; Fuchs y Matzinger, 1992). En
contraste, se ha mostrado que la presentacin de un antgeno en un ambiente
proinflamatorio induce inmunidad o autoinmunidad (Rocken y col., 1992; Ehl y
col., 1998).
Para valorar el papel de las APC en la induccin de autoinmunidad,
tratamos por va intravenosa al ratn doble trangnico RIP-gp/P14 con el
pptido p33 obtenido del LCMV y con el anticuerpo anti-CD40 que activa a las
APC (Schoenberger y col., 1998). En los ratones no tratados, las clulas T
CD8+ especficas de la glicoprotenas de LCMV no se vuelven tolerantes, sino
que permanecen inmunolgicamente ajenas a la presencia del antgeno,
aunque bajo ciertas condiciones son capaces de responder a ste y pueden
inducir insulitis y diabetes (Ohashi y col., 1991). Cuando los ratones fueron
tratados con el pptido LCMV-gp y con el anticuerpo anti-CD40, todos los
ratones transgnicos se volvieron diabticos (Tabla 1) (Garza y col., 2000). Los
ratones control que recibieron tanto el pptido como el anticuerpo, no se
volvieron diabticos. As, la administracin del pptido y la activacin de las
APC in vivo son factores crticos para la induccin de la autoinmunidad.
7
Tambin se investig el estado de la actividad de las clulas T en los
bazos de los animales a los que se les administraron el pptido y el anticuerpo
control. La actividad de las clulas T se determin mediante el incremento de
los marcadores de activacin de las clulas T, la induccin de la funcin
efectora, la produccin de interfern gama (IFN) y la infiltracin del pncreas.
La induccin de los marcadores de activacin, as como de los de actividad
citotxica fue indntica en ambos grupos. El tratamiento silmultneo con el
pptido LCMV-gp y el anticuerpo control no indujo la produccin de IFN
detectable, pero s una infiltracin pancretica suave (Tabla 1). En contraste, la
combinacin del pptido LCMV-gp y el anticuerpo anti-CD40 indujo la
produccin de niveles medibles de IFN, as como de una insulitis severa
(Tabla 1). El tratamiento con anti-CD40 condujo a la activacin de las APC in
vivo, con un aumento en la produccin de IFN estimulada por la expresin del
MHC clase I en los islotes pancreticos. Esto puede atribuirse al aumento de la
infiltracin de los CTLs al pncreas y al estado de diabetes.
La activacin de las APC mediada por el CD40 tambin regula
positivamente las molculas coestimulatorias B7-1 y B7-2, y por consiguiente
tambin estimula la funcin de las clulas T (Grewal y col., 1996). Con el objeto
de determinar si la induccin de la autoinmunidad, va la activacin de las APC,
era dependiente del uso de ligandos coestimuladores, los genes codificantes
para P14 y RIP-gp se introdujeron en un ratn CD28 deficiente. La
inmunizacin de ratones RIP-gp/P14/CD28-negativos con el pptido LCMV-gp
y el anticuerpo anti-CD40 indujo diabetes, con la misma incidencia y cintica
que se observ con los ratones competentes en CD28 (Tabla 1). As, las
8
interacciones CD28/B7 no fueron cruciales para la induccin de autoinmunidad
mediada por CD8 en este modelo.
Las infecciones bacterianas o virales promueven inmunidad, pero
adems, tambin existen reportes de que pueden inhibir la induccin de la
tolerancia perifrica (Rocken y col., 1992; Ehl y col., 1998). Con el objeto de
examinar si la activacin de las clulas presentadoras de antgeno podan
influir en la tolerancia celular, se realiz el tratamiento de ratones transgnicos
P14 TCR con el pptido LCMV-gp por va intravenosa para inducir la
eliminacin de las clulas T transgnicas, y con anticuerpos anti-CD40 o el
antisuero control del mismo isotipo. Como se muestra en la Tabla 2, el
tratamiento con el anticuerpo activante anti-CD40 inhibi dramticamente la
eliminacin especfica de las clulas T CD8+V2+ transgnicas especficas del
LMCV. As, las APC no slo promueven la induccin de autoinmunidad, sino
que pueden prevenir tambin la induccin de la tolerancia.
Este estudio aroj evidencias que confirman que las interacciones de las
clulas T con pptidos presentados en un ambiente "en descanso" o "sin
afectacin" no es suficiente para que se produzca autoinmunidad. Sin embargo,
la activacin de las APCs, va anti-CD40, conduce a un aumento en la
produccin de citocinas, lo cual contribuye a la formacin de un ambiente
proinflamatorio y a la induccin de la diabetes autoinmune. Adems, las APC
activadas pueden prevenir la induccin de la tolerancia de las clulas T, Por
consiguiente, un factor que conduce o predispone a un individuo a una
enfermedad autoinmune puede ser la activacin crnica de las APCs. El
reconocimiento del autoantgeno por las clulas T autorreactivas, en la
presencia de APCs activadas crnicamente, podra predisponer las
9
interacciones de las clulas T y conducirlas, de un estado "de ignorancia" o de
tolerancia, a la inmunidad.
10
Estos ratones se cruzaron con los ratones P14, los cuales son ratones
transgnicos TCR, especficos para LCMV. La tolerancia perifrica se indujo en
los ratones P14 mediante la administracin intraperitoneal de 500 g del
pptido LCMV-gp emulsificado en adyuvante incompleto de Freund o IFA (del
ingls Incomplete Freund Adjuvant) cada tres das. Este protocolo refleja la
exposicin crnica o prolongada a autoantgenos expresados perifricamente.
La induccin de la tolerancia est marcada por una expansin transitoria
seguida de una rpida delecin de las clulas T LCMV transgnicas. Los
ratones P14, deficientes tanto en TNFR1 como en CD95 mostraron cinticas de
delecin normales para las clulas T transgnicas despus del tratamiento con
el pptido. La induccin de la tolerancia se confirm mediante la incapacidad
de proliferacin in vitro, de las clulas del bazo de los animales tratados
despus de 17 das del tratamiento inicial con el pptido LCMV-gp. En
conclusin, en la ausencia de los receptores TNFR1 y CD95, la delecin de las
clulas T transgnicas, despus de la exposicin crnica al antgeno, procede
normalmente.
Posteriormente, se evalu la delecin de las clulas T mediante la
determinacin de cinticas de respuesta citoltica o CTL (del ingls Cytotoxic T
Lymphocites), despus de la administracin de LCMV en los ratones. La
actividad CTL declin normalmente en los ratones deficientes en CD95/TNFR1.
Tambin se determin la cintica de la expansin y delecin de las clulas T
especficas para el pptido del LCMV en los ratones receptores de las clulas T
P14 infectadas con LCMV. El nmero total de las clulas transgnicas para
TCR en el bazo fue similar en la primera y en las sptima semanas despus de
11
la infeccin. Esto es, en la ausencia de TNFR1 y de CD95, y despus del reto
viral, la progresin de la delecin se realiz normalmente.
Tambin se evalu la tolerancia inducida por el pptido en la ausencia
de TNFR1 y de CD95, en los ratones transgnicos sin TCR, los cuales
contienen una proporcin ms fisiolgica de clulas T especficas al pptido, en
contraste con los ratones P14. El tratamiento de los ratones, heterocigotos para
TNFR1 y CD95, con el pptido LCMV-gp emulsificado con IFA indujo una
tolerancia de las clulas T especficas al pptido LCMV-gp, como se determin
por la carencia de actividad citotxica especfica al pptido en respuesta al reto
subsecuente con LCMV. En contraste, la tolerancia no se indujo en los ratones
deficientes en TNFR1/CD95 tratados con el pptido. Por consiguiente, estos
datos demuestran que TNFR1 y CD95 cooperan para mediar la delecin de las
clulas T por altas dosis de pptido en IFA.
Todos estos datos sugieren que la delecin de las clulas T puede
presentarse, dependiente o independientemente de la presencia de los
receptores de muerte celular CD95 y TNFR1. Cuando el antgeno est
presente en cantidades limitadas, como sucede cuando un virus ha sido
eliminado completamente, la independencia de CD95/TNFR1 es consistente
con el modelo que seala que la delecin ocurre cuando se retiran las
linfocinas y que no es debido a la presencia de los receptores de muerte celular
(Lenardo y col., 1999; Zimmermann y col., 1999; Ehl y col., 1996; Reich y col.,
2000). Cuando la exposicin al antgeno es prolongada y ocurre en la
presencia de cuentas fisiolgicas de clulas T especficas al antgeno, la
delecin de las clulas T es dependiente de CD95 y TNFR1. Esto sugiere que,
en la ausencia de este esfuerzo cooperativo, las clulas CD8+ autorreactivas
12
pueden no ser delecionadas apropiadamente, predisponiendo a un individuo a
una enfermedad autoinmune.
13
se est revelando como una molcula clave en la regulacin de la
sobrevivencia en un nmero de modelos (Coffer y col., 1998). Se ha
demostrado que la PKB activada juega un papel importante en la sobrevivencia
mediada por factores de crecimiento y citocinas, y adems, protege a las
clulas de la apoptosis inducida por una variedad de estmulos (Datta y col.,
1997).
Con el objeto de determinar si PKB era un blanco relevante en la
sealizacin de las clulas T, se procedi a investigar si ocurra una activacin
de PKB en las clulas T perifricas despus de la unin al TCR (Jones y col.,
2000). La activacin de las clulas T perifricas con anti-CD3 o con anti-CD3
ms anti-CD28, condujo a un incremento substancial en la activacin de PKB
en relacin con las clulas no tratadas. Adems, el hecho de que estos
anticuerpos estimulatorios no tuvieran efecto sobre la activacin de PKB en
clulas pretratadas con un inhibidor de PI3K, muestra claramente que la
activacin de PKB era dependiente de la actividad de PI3K. Estos resultados
establecieron que PKB es un blanco fisiolgico relevante posterior de TCR en
las clulas T primarias.
Tambin se investig el papel de PKB en la sobrevivencia de las clulas
T mediante la generacin de ratones que expresaran constitutivamente una
forma de PKB (gag-PKB) solamente en el linaje de las clulas T (Jones y col.,
2000). Para ello, se purificaron clulas T de ratones no transgncios y
transgnicos para gag-PKB, y se les determin la expresin de las protenas
antiapoptticas Bcl-2 y Bcl-XL. La expresin de estas molculas est
fuertemente regulada en las clulas T maduras. Bcl-2 se expresa en niveles
altos en las clulas T perifricas y permanece as despus de la activacin
14
(Veis y col., 1993), mientras que Bcl-XL est sobreexpresada solamente
despus de la activacin, por lo que se ha propuesto que confiere
sobrevivencia transitoria a las clulas T activadas (Boise y col., 1995). Los
ratones transgnicos mostraron niveles de Bcl-XL endgenos aumentados, en
comparacin con los ratones no transgnicos, pero no hubo diferencia en los
niveles de expresin de la protena Bcl-2, sugieriendo que PKB no afecta la
expresin de Bcl-2 en las clulas T maduras. Estos resultados sugirien que las
clulas T de los ratones transgnicos en PKB, pueden tener aumentadas sus
capacidades de sobrevivencia.
Con el objeto de investigar las consecuencias funcionales de la
activacin de PKB como un evento posterior a TCR, los ratones trangnicos en
PKB se cruzaron con los ratones transgnicos P14. Las clulas del bazo de los
ratones P14 trangnicos en TCR y de los dobles transgnicos P14/gag-PKB se
cultivaron en la presencia de clulas presentadoras de antgeno preincubadas
con el pptido LCMV-gp y se les determin su proliferacin en funcin del
tiempo. Mientras que los niveles de proliferacin permanecieron similares en
ambos grupos hasta las 48 horas, las clulas T que expresan el transgn gagPKB mostraron una proliferacin aumentada relativa al control de los linfocitos
P14 hasta 120 horas despus de la infeccin (Tabla 3). La proliferacin contra
un pptido control irrelevante fue inferior al 4% de la mxima proliferacin para
todos los tiempos en los que se midi, sin importar la expresin del trangn
gag-PKB. Estos datos sugieren que la actividad de PKB puede alterar la
proliferacin de las clulas T especficas para un antgeno.
En este momento se estn realizando estudios para determinar si las
clulas T de los ratones P14/gag-PKB pueden influir en la induccin de la
15
enfermedad autoinmune mediante la cruza entre stos y los ratones RIP-gp. Un
estudio reciente que utiliz ratones heterlogos con una deficiencia en PTEN
ha sugerido que las molculas de sobrevivencia pueden promover la
autoinmunidad. PTEN es un gen supresor de tumores que codifica para una
fosfatasa. Un substrato para PTEN es el fosfatidil-inisitol trifosfato (PIP-3), un
segundo mensajero lipdico producido por PI3K. En la ausencia de la actividad
PTEN, las concentraciones de PIP-3 se incrementan conduciendo a una
fosforilacin aumentada y a la activacin de PKB (Stambolic y col., 1998).
Ratones heterocigotos para una mutacin en PTEN, que la inactiva,
presentaron un desroden autoinmune (Di Cristofano y col., 1999). Las clulas
del bazo de estos ratones estaban marcados por la presencia de la PKB
activada constitutivamente y respuestas aumentadas en la proliferacin de las
clulas T. La autoinmunidad se atribuy a la incapacidad para delecionar los
linfocitos autorreactivos debido al defecto en la muerte mediada por CD95. Las
cruzas entre ratones transgnicos sobreexpresando Bcl-2 y ratones lpr han
sugerido tambin un papel de las molculas de sobrevivencia en la
autoinmunidad, en la cual tambin se observ un incremento en
linfoadenopata (Strasser y col., 1995; Reap y col., 1995). As, el efecto de la
induccin de una enfermedad autoinmune por molculas de sobrevivencia
puede deberse a dos procesos simultneos: i) la inhibicin del proceso de
delecin perifrico normal y ii) las respuestas aumentadas en la sobrevivencia y
proliferacin despus del reconocimiento del antgeno, que posiblemente
conduce a una destruccin aumentada del tejido.
7. CONCLUSIONES
16
Resulta evidente que la induccin de autoinmunidad no es un proceso sencillo,
sino que ms bien, es el resultado de una serie de eventos que promueven la
sobrevivencia y activacin de las clulas T autorreactivas. En este trabajo
hemos identificado algunos factores que pueden inhibir la induccin de la
tolerancia y promover la activacin de clulas T autorreactivas como las clulas
presentadoras de antgeno activadas, la prdida de los receptores de muerte
celular y la adquisicin de molculas de prosobrevivencia. Cada uno, sin
embargo, es insuficiente para la induccin de autoinmunidad, por lo que se
requiere de la coordinacin de un nmero de eventos para inducir
productivamente las respuestas de las clulas T patognicas. Una clave para la
investigacin futura de las enfermedades autoinmunes es el discernir los
requerimientos para la activacin de las clulas T, la sobrevivencia y la muerte
celular, tambin como los requerimientos para el mantenimiento de una
respuesta inflamatoria inmune, la cual promueva las respuestas de las clulas
T, y cmo estos factores funcionan cooperativamente para promover la
autoinmunidad patognica.
ABREVIATURAS
Cytotoxic T lymphocites.
IFA
17
TCR T Cell Receptor.
PTEN gen supresor de tumores que coficia para una fosfatasa
BIBLIOGRAFA
Bachmaier, K., Neu, N., De la Maza, L.M., Pal, S., Hessel, A. and Penninger, J.
1999. Chlamydia infections and heart disease linked through antigenic
mimicry. Science 26:1238-1239.
Banchereau, J. and Steinman, R.M. 1998. Dendritic cells and the control of
immunity. Nature 392:245-252.
Boise, L.H., Minn, A.J., Noel, P.J and et al: 1995. CD28 costimulation can
promote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-xL. Immunity
3:87-98.
Coffer, P.J., Jin, J. and Woodgett, J.R. 1998. Protein kinase B (c-Akt): a
multifunctional mediator of phosphatidylinositol 3-kinase activation.
Biochem J. 335:1-13.
Datta, S.R., Dudek, H., Tao, X. and et al. 1997. Akt phosphorylation of BAD
couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery. Cell
91:231-241.
Di Cristofano, A., Kotsi, P., Peng, Y.F., Cordon-Cardo, C., Elkon, K.B. and
Pandolfi, P.P. 1999. Impaired Fas response and autoimmunity in Pten+/mice. Science 285:2122-2125.
Ehl, S., Hoffmann-Rohrer, U., Nagata, S., Hengartner, H. and Zinkernagel, R.
18
1996. Different susceptibility of cytotoxic T cells to CD95 (Fas/Apo-1)
ligand-mediated cell death after activation in vitro versus in vivo. J
Immunol 156:2357-2360.
Ehl, S., Hombach, J., Aichele, P, and et al: 1998. Viral and bacterial infections
interfere with peripheral tolerance induction and activate CD8+ T cells to
cause inmunopathology. J. Exp. Med. 187:763-774.
Eynon, E.E. and Parker, D.C. 1992. Small B cells as antigen-presenting cells in
the induction of tolerance to soluble protein antigens. J. Exp. Med.
175:131-138.
Falcone, M. and Sarvetnick, N. 1999. Cytokines that regulate autoimmune
responses. Curr. Opin. Immunol. 11:670-676.
Fazekas de St. Groth, B. 1998. The evolution of self-tolerance: a new cell arises
to meet the challenge of self-reactivity. Immunol. Today 19: 448-454.
Fuchs, E. and Matzinger, P.B. 1992. Cells turn off virgin butn ot memory T cells.
Science 258:1156-1159.
Gammon, G., Sercarz, E.E. and Benichou, G. 1991. The dominant self and the
cryptic self: shaping the autoreactive T cell repertoire. Immunol. Today
12: 193-195.
Garza, K.M, Chan, S.M, Suri, R, and et al: 2000. Role of antigen presenting
cells in mediating tolerance and autoimmunity. J Exp Med 191:20212027.
Gill, R.G., Coulombe, M. and Lafferty, K.J. 1996. Pancreatic islet allograft
immunity and tolerance: the two-signal hypothesis revisited. Immunol.
Rev. 149:75-96.
Gleeson, P.A., Toh, B.H. and Van Driel, I.R. 1996. Organ-specific autoimmunity
19
induced by lymphopenia. Immunol. Rev. 149:97-125.
Green, D.R. and Scott, D.W. 1994 .Activation-induced apoptosis in
lymphocytes. Curr.Opin.Immunol. 6:476-487.
Grewal, I.S., Foellmer, H.G., Grewal, K.D, and et al: 1996. Requirement for
CD40
ligand
in
costimulation
induction,
cell
activation,
and
Apoptosis
-immune
regulation
in
dynamic
and
20
cells. Curr. Opin. Immunol. 10: 649-655.
Nagata, S. and Suda, T. 1995. Fas and Fas ligand: lpr and gld mutations.
Immunol. Today 16:39-43.
Nepom, G.T. and Erlich, H. 1991. MHC class II molecules and autoimmunity.
Annu. Rev. Immunol. 9:493-525.
Nguyen, L.T., McKall-Faienza, K., Zakarian, A., Speiser De, Mak, T.W., and
Ohashi, P.S. 2000. TNF receptor 1 (TNFR1) and CD95 are not required
for T cell deletion after virus infection but contribute to peptide-induced
deletion under limited conditions. Eur. J. Immunol. 30:683-688.
Ohashi, P.S., Oehen, S., Brki, K. and et al. 1991. Ablation of "tolerance" and
induction of diabetes by virus infection in viral antigen transgenic mice.
Cell 65:305-317.
Ohteki, T., Hessel, A., Bachmann, M.F.and et al. 1999. Identification of a crossreactive self ligand in virus-mediated autoimmunity. Eur. J. Immunol.
29:2886-2896.
Radvanyi, L., Shi, Y., Vaziri, H. and et al. 1996. CD28 costimulation inhibits
TCR- induced apoptosis during a primary T cell response. J. Immunol.
156:1788-1798.
Reap, E.A., Felix, N.J., Wolthuse, A., Kotzin, B.L., Cohen, P.L. and Eisenberg,
R.A. 1995. Bcl-2 transgenic lpr mice show profound enhancement of
lymphadenopathy. J. Immunol. 155:5455-5462.
Reich, A., Korner, H., Sedgwick, J.D. and Pircher, H. 2000. Immune downregulation and peripheral deletion of CD8 T cells does not require TNF
receptor-ligand interactions nor CD95. Eur. J. Immunol. 30:678-682.
Rocken, M., Urban, J.F. and Shevach, E.M. 1992. Infection breaks T-cell
21
tolerance. Nature 359:79-82.
Russell, J.H., Rush, B., Weaver, C. and Wang, R. 1993. Mature T cells of
autoimmune lpr/lpr mice have a defect in antigen-stimulated suicide.
Proc Natl Acad Sci USA 90:4409-4413.
Scott, De., Kisch, W.J. and Steinberg, A.D. 1993. Studies of T cell deletion and
T cell anergy following in vivo administration of SEB to normal and lupusprone mice. J. Immunol 150:664-672.
Schoenberger, S.P., Toes, REM., Van der Voort, EIH., Offringa, R. and Melief,
C.J.M. 1998. T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by
CD40-CD40L interactions. Nature 393:480-483.
Seddon, B. and Mason, D. 2000. The third function of the thymus. Immunol.
Today 21:95-99.
Shortman, K., Wu, L., Sss, G. and et al., 1997. Dendritic cells and T
lymphocytes: developmental and functional interactions. Ciba Foundation
Symposium 204:130-141.
Singer, G.G. and Abbas, A.K. 1994. The Fas antigen is involved in peripheral
but not thymic deletion of T lymphocytes in T cell receptor transgenic
mice. Immunity 1:365-371.
Singh, V.K., Mehrotra, S. and Agarwal, S.S. 1999. The paradigm of Th1 and
Th2 cytokines: its relevance to autoimmunity and allergy. Immunol. Res.
20:147-161.
Speiser, De., Sebzda, E., Ohteki, T. and et al. 1996 Tumor necrosis factor
receptor p55 mediates deletion of peripheral cytotoxic T lymphocytes in
vivo. Eur J Immunol 26:3055-3060.
Stambolic, V., Suzuki, A., De la Pompa, J.L, and et al. 1998. Negative
22
regulation of PKB/Akt-dependent cell survival by the tumor suppressor
PTEN. Cell 95:29-39.
Strasser, A., Harris, A.W,, Huang, D.C.S., Krammer, P.H. and Cory, S. 1995
Bcl-2 and Fas/APO-1 regulate distinct pathways to lymphocyte
apoptosis. EMBO J 14:6136-6147.
Sytwu, H.-K., Liblau, R.L. and McDevitt, H.O. 1996. The roles of Fas/APO-1
(CD95) and TNF in antigen-induced programmed cell death in T cell
receptor transgenic mice. Immunity 5:17-30.
Veis, D.J., Sentman, C.L., Bach, E.A. and Korsmeyer, S.J. 1993. Expression of
the bcl-2 protein in murine and human thymocytes and in peripheral T
lymphocytes. J. Immunol. 151:2546-2554.
Vella, A.T., Mitchell, T., Groth, B. and et al. 1997. CD28 engagement and
proinflammatory cytokines contribute to T cell expansion and long-term
survival in vivo. J. Immunol. 158:4714-4720.
Von Herrath, M.G., Guerder, S., Lewicki, H., Flavell, R.A, and Oldstone, M.B.A.
1995. Coexpression of B7-1 and viral ("self") transgenes in pancreatic
cells can break peripheral ignorance and lead to spontaneous
autoimmune diabetes. Immunity 3:727-738.
Watanabe-Fukunaga, R., Brannan, C.I., Copeland, N.G., Jenkins, N.A. and
Nagata, S. 1992. Lymphoproliferation disorder in mice explained by
defects in Fas antigen that mediates apoptosis. Nature 356:314-317.
Wicker, L.S. 1997. Major histocompatability complex-linked control of
autoimmunity. J. Exp. Med. 186:973-975.
Zheng, L., Fisher, G., Miller, R.E,, Peschon, J., Lynch, D.H. and Lenardo, M.J.
23
1995. Induction of apoptosis in mature T cells by tumor necrosis factor.
Nature 377:348-351.
Zhou, T., Edwards III, C.K., Yang, P., Wang, Z., Bluethmann, H. and Mountz,
J.D. 1996. Greatly accelerated lymphadenopathy and autoimmune
disease in lpr mice lacking tumor necrosis factor receptor I. J. Immunol.
156:2661-2665.
Zimmermann, C., Rawiel, M., Blaser, C., Kaufmann, M. and Pircher, H. 1996.
Homeostatic regulation of CD8+ T cells after antigen challenge in the
absence of Fas (CD95). Eur. J. Immunol. 26:2903-2910.
24
Tabla 1. Induccin de diabetes, insulitis y produccin de INF en ratones
RIP-gp/P14 tratados con pptido y anticuerpo anti-CD401.
Grupo
En ratones RIP-gp/14:
Pptido LCMV+anti-CD40
Pptido LCMV+anticuerpo
control
Pptido control+anti-CD40
En ratones RIPgp/P14/CD28:
Pptido LCMV+anti-CD40
1
DIABETES2
Incidencia
Inicio
(%)
promedio
(da)
INSULITIS3
Incidencia Severidad
(%)
promedio4
INF5
(pg/ml)
100
(20/20)
0 (0/20)
83
3.0
250+40
22
1.7
0 (0/10)
100 (8/8)
Los ratones fueron tratados con 5 g de pptido por va intravenosa a los das 0 y 2, y con 100 g en el
da 2.
2
Los niveles de glucosa en sangre fueron monitoreados; diabetes => 14 mm/l.
3
La infiltracin de las clulas CD8+ en los islotes pancreticos se determin en el da 3. Se analizaron
tres secciones no seriadas por ratn y la severidad de la infiltracin (n = 5 animales/grupo, 10-20
islotes/ratn).
4
Severidad promedio de los islotes infiltrados, donde una severidad de 1 = peri-insulitis/insulitis suave, 2 =
insulitis partial y 3 = insulitis completa.
5
Los niveles de IFN srico se determinaron en el da 3 por ELISA; lmite de deteccin = 65 pg/ml.
25
Tabla 2.
GRUPO
Da 0
Da 3
Da 6
Da 9
Da 12
p33 + anti-CD40
20.1 5.40
21.5 0.85
43.7 7.30
67.5 5.50
132.7 24.13
p33 + anticuerpo
19.2 3.60
33.6 4.0
4.0 0.30
2.27 2.30
3.14 0.15
control
1
Los ratones transgnicos P14 se trataron 3 veces, con intervalos de 3 das, empezando en el da 0, con
5 g de p33 intravenoso. Dos das despus de cada tratamiento, a los ratones se les administraron,
despus de cada tratamiento con pptido, 100 g de anticuerpo.
2
El nmero de clulas T transgnicas de bazo se determin en los difetentes grupos de ratones mediante
citometra de flujo (n = 2-3 ratones/grupo/determinado tiempo).
26
Tabla 3.
GRUPO
48 h
P14
P14/gag-PKB
100.0 5.30
99.0 1.5
% de la PROLIFERACIN MXIMA2
72 h
96 h
75.0 12.9
96.0 10.0
29.0 9.6
55.0 9.7
120 h
2.0 0.87
12.0 4.3
-5
Las clulas del bazo de los ratones se cultivaron en la presencia de APCs preincubadas con 10 M de
3
p33, y posteriormente se incubaron con [ H]-timidina en los puntos de tiempo sealados.
2
3
Para estandarizar los diferentes experimentos, las cuentas por minuto de [ H] incorporado se
normalizaron y se expresaron como un porcentaje de la proliferacin mxima (mx = 100%).
Captulo 14
Fisiopatologa molecular de la cirrosis heptica
Terapia Gnica como tratamiento
Juan Armendariz Borunda 1.
1
Director del Instituto de Biologa Molecular en Medicina y Terapia Gnica, Centro Universitario de
Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara, Guadalajara, Jal.
Email: armendbo@koch.mb.udg.mx
PALABRAS CLAVE: cirrosis heptica y terapia gnica.
NDICE
1. Introduccin.
1.1 Mecanismos patomoleculares en la cirrosis heptica.
1.1.1 Heterogeneidad celular en el microambiente heptico.
1.2 Diagnstico de laboratorio.
1.1.2 Diagnstico no invasivo: no siempre el mejor.
1.3 Terapias para la fibrosis heptica.
1.3.1 Inhibicin de biosntesis de colgena.
1.3.2 Induccin de la degradacin del exceso de matriz extracelular.
1.3.3 Antagonismo de citocinas como una ruta de terapia antifibrtica.
2. Objetivos del captulo.
3. Estado actual del arte.
3.1 Terapia gnica en cirrosis heptica.
3.1.1 La sobreexpresin del gen huPA en el hgado induce la reversin de
la fibrosis.
1. INTRODUCCIN
nos han permitido demostrar la participacin de las HSC como la principal fuente
de MEC en el hgado daado (Fig. 2). Las molculas de la matriz producidas por
estas clulas incluyen al menos cinco tipos de colgena, heparn, dermatn y
condroitina sulfato, laminina, fibronectina, tenascina y decorina (Franklin, 1995;
Friedman, 1993).
Con base en su comportamiento en cultivo e in situ, se ha observado que
las HSC se activan primero por: i) iniciacin, caracterizada por eventos
tempranos en los cuales las clulas aumentan su tamao y responden a las
citocinas proliferativas y fibrognicas, y ii) perpetuacin, la cual refleja la
respuesta celular a estas citocinas y resulta en cambios en el medio extracelular
que las rodea, los cuales tambin modulan la activacin de las mismas HSC
(Friedman, 1993).
En el microambiente heptico se presentan diversos cambios ante el
exceso de protenas colagnicas en el espacio subendotelial. Entre stos se
cuentan la prdida de las vellosidades del hepatocito, la aparicin de una
membrana basal y finalmente, la prdida de las fenestraciones de las clulas
endoteliales, un proceso conocido tambin como capilarizacin de sinusoides. As,
se impide el libre intercambio de nutrientes entre la sangre sinusoidal y el
hepatocito. De igual manera se ven impedidas la destoxificacin de diversas
sustancias por el hepatocito y la incorporacin de metabolitos producidos por el
hgado al torrente sanguneo. Estos fenmenos explican algunas de las
caractersticas clnicas de la cirrosis heptica como la hipoalbuminemia, la
disminucin en la sangre de algunos factores de coagulacin, como los que dan
10
Las terapias actuales para la fibrosis heptica incluyen la eliminacin del agente
causante del padecimiento, la reduccin de la inflamacin heptica y del dao
celular (Franklin, 1995; Friedman, 1993; Kim y col., 1997; Salgado y col., 2000) Sin
embargo, en casos extremos se pueden requerir procedimientos quirrgicos, tales
como el transplante de hgado. La discontinuacin de los agentes etiolgicos tales
como el alcohol y algunas drogas hepatotxicas, previene la progresin de la
fibrosis. En la hepatitis viral, la progresin hacia la infeccin crnica siempre
precede a la fibrosis, implicando con ello que la depuracin viral eliminar el
estmulo de la fibrognesis. Ha habido xito relativo en la eliminacin de los virus
de la hepatitis B y C con interfern-alfa (IFN-), pero hasta el momento, no se
11
12
13
14
terapia antifibrtica. Puesto que la activacin de las clulas HSC se acompaa por
la proliferacin celular y del incremento de la sntesis de matriz, los anticuerpos
dirigidos hacia citocinas como PDGF y TGF- pueden inhibir la fibrognesis.
Las estrategias teraputicas futuras incluyen la posibilidad de la terapia de
genes en clulas somticas, para lo cual se requiere una mejor comprensin de
los elementos regulatorios de la expresin in vivo de los genes que codifican para
protenas de la matriz extracelular (Armendariz y col., 1992; Armendariz y col.,
1994). Esta alternativa parece haber sido exitosa para algunos desrdenes
metablicos como la deficiencia de 1-antitripsina o para la fibrosis qustica, en los
cuales ya se ha caracterizado el defecto molecular responsable de su expresin.
Adems, en el desarrollo de las futuras terapias in vivo se ha procurado dirigir a
los agentes farmacuticos o productos gnicos, especficamente al hgado (Fig.
3B, 4 y 5), para as prevenir las alteraciones en el metabolismo de la colgena o la
aparicin de efectos laterales no deseados en otros rganos.
En resumen, basados en el creciente conocimiento del metabolismo del
tejido conectivo, se han abierto nuevas perspectivas para una posible terapia
antifibrtica especfica en la fibrosis heptica. Otras estrategias potenciales para la
intervencin teraputica en la fibrosis heptica se basan en la inhibicin de la
sntesis de la matriz extracelular, en la induccin del aumento de su degradacin,
en la inactivacin de las citocinas por anticuerpos neutralizantes y en la terapia
somtica de genes (ver ms adelante). Todava no se ha establecido el
diagnstico no invasivo especfico para la fibrosis heptica que pueda sustituir a la
evaluacin histomorfolgica. La histologa es el estndar de oro en este sentido.
15
16
17
Los objetivos de este captulo son revisar el conocimiento que existe sobre los
mecanismos patomoleculares que se presentan en la cirrosis heptica as como
las perspectivas de curar este padecimiento por medio de la terapia gnica.
18
19
20
nuestra hiptesis de trabajo es que la terapia gnica se puede utilizar para revertir
la fibrosis exacerbada, caracterstica cardinal de los hgados cirrticos. A su vez,
con la induccin de los genes que promueven la proliferacin de las clulas del
hgado se puede favorecer el rpido restablecimiento de la masa funcional
heptica. Para esto, hemos usado el cDNA humano del activador de
plasmingeno derivado de urokinasa (huPA), modificado y clonado en un vector
adenoviral de segunda generacin (Salgado y col., 2000; Siller y col., 2000) para
obtener Ad-huPA de grado clnico, el cual fue preparado usando las condiciones
descritas como GMP( por sus siglas en ingls Good Manufacturing Practices). El
smbolo delta significa que el cDNA silvestre fue modificado genticamente en las
regiones que codifican para el amino y el carboxilo terminal de la protena. La
huPA promueve una cascada de eventos (Fig. 3B) en donde por un lado, activa a
las MMPs latentes en el hgado. Con esta activacin se promueve la degradacin
in situ del exceso de ECM en el espacio de Disse o espacio perisinusoidal. El
exceso de ECM depositada bloquea el intercambio de nutrientes entre los
hepatocitos y la sangre circulante. Concomitantemente, la huPA restablece la
masa heptica funcional, al inducir a los hepatocitos remanentes para que entren
en replicacin y as repoblar el parnquima heptico (Fig. 3B). La razn para usar
este vector adenoviral reside en la ventaja de que la huPA no se secreta
significativamente, y por lo tanto, no causa hipocoagulacin ni sangrado
espontneo, que constituye la principal desventaja en animales cirrticos.
21
22
23
4. CONCLUSIONES
24
Las principales razones para aclarar la terapia gnica en pacientes con cirrosis
heptica son: i) no existe cura satisfactoria, ii) la cirrosis heptica es la cuarta
causa de muerte en edad productiva en Mxico, iii) en el ao de 1999, en nuestro
pas fallecieron a consecuencia de esta enfermedad, aproximadamente 23 mil
personas, iv) se presentan prdidas por miles de millones de pesos como
consecuencia de ausentismo laboral, v) se invierten miles de millones de pesos en
nuestro pas por hospitalizacin de pacientes cirrticos y vi) de los 425 protocolos
en fase clnica que involucran a mas de tres mil pacientes tratados con Terapia
Gnica en el mundo, ninguno est relacionado con cirrosis heptica.
ABREVIATURAS
MEC
Matriz extracelular.
MMPs
Metaloproteasas de la matriz.
TIMPs
FGFs
Fibroblastos.
EGF
PGDF
HSC
25
PIIINP
BIBLIOGRAFA
Aguilar, LK., Aguilar-Cordova, E., Ando, D., Armendariz-Borunda, J., Burd, PR.,
Butler, E.B. and Glorioso, J.C. 2000. A prescription for gene therapy.
Molecular Therapy 1:385-388.
Armendariz-Borunda, J., Seyer, J.M., Kang, A.H and Raghow, R. 1990. Regulation
of TGF gene expression in rat liver intoxicated with carbon tetrachloride.
FASEB J. 4:215-221.
Armendariz-Borunda, J., Katayama, K. and Seyer, J.M. 1992. Transcriptional
mechanisms of type I collagen gene expression are differentially regulated
by IL-, TNF, and TGF in Ito cells. J. Biol. Chem. 267:14316-14321.
Armendariz-Borunda, J., Simkevich, C.P., Roy, N., Raghow, R., Kang, A.H and
Seyer J.M. 1994. Activation of Ito cells involves regulation of AP-1 binding
proteins and induction of type I collagen gene expression. Biochem J.
304:817-824.
Arthur, M.J.P. 1998. Collagenases and liver fibrosis. Journal of Hepatology 22:4348.
Franklin, T.J. 1995. Current aproaches to the therapy of fibrotic diseases. Biochem.
Pharmacol. 49:267-273.
Friedman, S.L. 1993. The cellular basis of hepatic fibrosis. Mechanisms and
treatment strategies. New Engl. J. Med. 328:1828-1835.
26
PIES DE FIGURAS
27
28
29
30
Captulo 15
Direccionamiento especfico de farmacobiticos a los vasos
sanguneos de tumores
Rafael Cabeza1 y Eppie D. Rael1.
1
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivos del captulo
3. Estado actual del arte.
4. El uso de toxinas de serpientes.
5. Problemas posibles y conclusiones.
Agradecimientos
Abreviaturas.
Bibliografa.
1. INTRODUCCIN
fisiolgicas especficas de los tumores que puedan servir como blancos para el
desarrollo de nuevas terapias. Los farmacobiticos interactan con estas
molculas e interfieren con las vas fisiolgicas particulares de los tumores,
afectando su metabolismo. Las protenas o farmacobiticos peptdicos que se
pretendan usar contra los tumores, necesitan ser no inmunognicas y tener la
capacidad de atravesar los vasos sanguneos que irrigan a los tumores.
Un blanco potencial de ataque en contra de los tumores son sus vasos
sanguneos (Fig. 1). Los tumores, vistos como injertos extraos, necesitan de un
abasto sanguneo para poder mantenerse viables. Si se interfiere con el aporte
sanguneo, se producir una deficiencia en el suministro de nutrientes y en el
intercambio de gases causando, eventualmente, la muerte del tumor. Algunos
posibles farmacobiticos en contra de los tumores incluyen a i) las toxinas no
inmunognicas y ii) las protenas que han sido expresadas a partir del DNA que
codifica para la regin variable de las inmunoglobulinas (Fv), cuya caracterstica
primordial es el reconocimiento de las molculas especficas del tumor. Tambin
pueden utilizarse compuestos txicos que estn unidos a una molcula que
reconozca y se una a las molculas de los tumores. Las toxinas que destruyen los
vasos sanguneos o que forman cogulos, como ciertas metaloproteinasas
presentes en los venenos de ciertas vboras pueden ser agentes muy tiles en
contra de los tumores si se logra dirigir su actividad especficamente hacia los
vasos sanguneos de stos.
3. INTRODUCCIN
Las toxinas y los anticuerpos utilizados en estas terapias han sido diseados
genticamente para obtener polipeptidos recombinantes de un tamao mnimo
esencial para mantener la funcin.
Se han producido protenas de fusin usando construcciones de DNA en las
cuales, el cDNA de la cadena Fv de hibridomas se combina con fragmentos cortos
o alterados de los genes de las toxinas (Kreitman y Pastan, 1995; Benhar y
Pastan, 1994; Benhar y col., 1994a; Benhar y col., 1994b; Vallera y col., 1996).
Tambin se han aadido a estas construcciones, secuencias que codifican para
ligadores artificiales, con el fin de estabilizar las cadenas ligera (L) y pesada (H)
del anticuerpo y as, asegurar una mejor interaccin entre el antgeno y el
anticuerpo (Reiter y col., 1996; Benhar y col., 1995; Pastan y col., 1992; Murphy y
col.,1987). Los antgenos especficos de tumores, o los encontrados en
cantidades muy abundantes, como el receptor para el factor de crecimiento
epidrmico erbB2r, CD40 y el receptor de la interleucina-2, se han usado en este
tipo de construcciones (Kuan y Pastan, 1996a; Kuan y Pastan, 1996b; Francisco y
col., 1995; Kreitman y col., 1994). Como resultado de estas estrategias, ciertos
tipos de cncer, como los mielomas y las leucemias, se han curado usando
anticuerpos manufacturados.
Un reto ms grande todava para la inmunoterapia contra el cncer es la
erradicacin de tumores slidos, especialmente los que invaden a los tejidos
vecinos o adyacentes (Molema y col., 1997). En estos casos el estudio de
molculas dirigidas contra los tumores empieza a ser promisorio. Un buen blanco
de ataque son los vasos sanguneos que los irrigan, ya que tanto stos como los
injertos de tejido exgeno y los tejidos normales necesitan de un abasto
10
11
componentes de los vasos sanguneos (Patel y col., 1997; Baramova y col., 1991;
Bjarnason y Fox, 1994), lo que hace a estas toxinas excelentes candidatos para
destruir a los vasos sanguneos del tumor. Sin embargo, estas toxinas tambin
atacan a los vasos sanguneos normales, por lo que es muy importante que sean
dirigidas especficamente a los vasos sanguneos que irrigan el tejido maligno.
Por ms de veinte aos se han buscado molculas especficas de los vasos
sanguneos con cierto xito. Una tecnologa relativamente nueva ha resultado
excelente en la bsqueda de estas molculas y su uso promete ayudar
eficientemente a encontrar blancos potenciales (Pasqualini y col., 1997; Arap y
col., 1998). En esta tecnologa se incluye el uso de genotecas con secuencias de
nucletidos clonadas en fagos, las cuales codifican para polipptidos muy
pequeos. Esta tecnologa se ha denominado phage display en ingls, o
presentacin de antgenos en fagos, la cual ha sido usada con buenos resultados.
El anlisis comparativo de clulas normales y tumorales, usando esta estrategia,
demuestra que existen molculas especficas en los vasos sanguneos de los
tumores. La tecnologa de phage display es una tecnologa muy poderosa y
permite estudiar la interaccin entre los blancos y otras molculas (Fig. 3) (Scott y
Smith, 1990; Smith y Scott, 1993). En este sistema, cientos de millones de
pptidos al azar son expresados en la superficie del bacterifago, como si se
tratara de un banco de protenas de fusin y de ligandos, a partir de la cual se
pueden seleccionar aqullas de inters (Fig. 3). Por ejemplo, Pasqualini y col.,
(1996) crearon una genoteca en el sistema de phage display para aislar
secuencias mnimas de receptores que pudieran interactuar con fibronectina y con
fragmentos de fibronectina conteniendo el motivo RGD o Arg-Gly-Asp, que es un
12
13
14
Molina y col., 1990). Todas estas metaloproteinasas requieren del zinc para su
actividad.
Estudios de comparacin de sequencias de DNA y de polipptidos han
mostrado que las metaloproteinasas de los venenos de vboras tienen una
identidad muy alta entre s (Bjarnson y Fox, 1994; Chung y col., 1996; Tu y col.,
1996). Por eso se han clasificado como miembros de la subfamilia reprolisina, de
la familia M12 de las metaloproteinasas (Bjarnason y Fox, 1994; Hite y col., 1994;
Rawlings y Barrett, 1995). La comparacin del tamao y la secuencia de las
metaloproteinasas de venenos de vboras ha permitido clasificarlas en cuatro
clases de protenas relacionadas estructuralmente: P-I, P-II, P-III y P-IV (Hite y
col., 1994). La diferencia entre estas cuatro clases es la presencia de secuencias
adicionales en los dominios carboxilo terminales de las metaloproteinasas en las
clases P-II, P-III y P-IV. Cada clase tiene una desintegrina, las cuales son
inhibidores no enzimticos de las integrinas humanas, o un dominio parecido al de
las desintegrinas. Las clases P-III y P-IV tienen un dominio adicional con una
cistena y la P-IV contiene adems, otro dominio que interacta con las lectinas.
La secuencia nucleotdica de estas protenas estn muy conservadas (Hite y col.,
1994). Las metaloproteinasas P-III se relacionan con el grupo ADAM de las
protenas integrales de membrana del tipo I, las cuales son metaloproteinasas
miembros de la subfamilia de las reprolisinas.
Se piensa que las metaloproteinasas se sintetizan en las glndulas
venenosas de las vboras como zimgenos que despus son procesados para
producir las formas activas de las toxinas (Kini y Evans, 1992; Hite y col., 1994;
Paine y col., 1994; Tsai y col., 1994; Bjarnason y Fox, 1995; Shimokawa y col.,
15
1996; Kini y col., 1997). Kini y col., (1997) han sugerido un modelo estructural del
precursor de las toxinas que consiste en la presencia de regiones ricas en lectinacistena-regin activadora-sitio cataltico de la metaloproteinasa- desintegrinacistena. Adems, tambin han sugerido que este precursor se procesa
postraduccionalmente, dando lugar a las diferentes actividades de las
metaloproteinasas de venenos de vbora. Esta idea es tambin apoyada por otros
estudios (para una revisin del tema, vase Jia y col., 1996). Las diferencias en
las conformaciones entre las metaloproteinasas tambin determinan, en forma
significativa, su funcin, la cual es tambin influenciada por el tamao de las
proteinasas maduras. Las metaloproteinasas hemorrgicas, que contienen
dominios ricos en cistena y dominios similares a las desintegrinas, son
significativamente ms potentes que las toxinas que solamente contienen el
dominio de las metaloproteinasas (Jia y col., 1997). En nuestros estudios hemos
encontrado que M4, una metaloproteinasa del tipo P-I que se encuentra en el
veneno de C. m. molossus, puede disolver los cogulos de fibrina pero no causa
hemorragia ni provoca la inactivacin del sistema del complemento (Rael y col.
1992). Sin embargo, las metaloproteinasas M5, M6 y M7, tambin pertenecientes
al grupo P-I, son toxinas hemorrgicas muy potentes (Tabla 1) (Chen y Rael, 1997
y resultados nuestros no publicados). Nuestras investigaciones sobre la
secuencia del cDNA y DNA genmico de la toxina de C. m. molossus han
demostrado que las secuencias requeridas para la formacin del complejo
metaloproteinasas-integrina, tienen el mismo arreglo que el sugerido por otros
autores para venenos de otras especies de vboras de cascabel (Kini y Evans,
1992; Hite y col., 1994; Paine y col., 1994; Tsai y col., 1994; Bjarnason y Fox,
16
1995; Shimokawa y col., 1996; Kini y col., 1997). Tambin se han producido
metaloproteinasas venenosas a partir de DNA recombinante (Loayza y col., 1994;
Shimokawa y col., 1996; Jia y col., 1997).
Las metaloproteinasas hemorrgicas de los venenos de vboras de
cascabel son un grupo de protenas potencialmente muy importante en la
estrategia del diseo de frmacos contra los vasos sanguneos de los tumores. Su
capacidad de destruir proteolticamente las membranas basales de los capilares,
de activar el sistema del complemento y de causar la formacin de cogulos,
puede ser usada en el tratamiento de los tumores si las toxinas se ligan a los
pptidos RGD o NGR, discutidos previamente en este captulo, para dirigirlas
hasta los vasos sanguneos de los tumores.
Por tanto, el enfoque que proponemos consiste en ligar las
metaloproteinasas de venenos de vboras a los pptidos RGD y NGR e investigar
sus actividades contra los tumores cancerosos. Los pptidos sintticos que llevan
la secuencia RGD-4C (CDCRGDCFC) y la secuencia NGR (CNGRCVSGCAGRC)
(Arap y col. 1998) se pueden usar como agentes guiadores. La actividad de estos
compuestos proteicos puede ser probada contra los tumores humanos generados
en ratones SCID. Posteriormente se pueden producir toxinas recombinantes y
comparar su efecto con el de los complejos toxina-RGD o toxina-NGR.
17
AGRADECIMIENTOS
Queremos reconocer y agradecer la ayuda de Cesar Moreno con las figuras que
se encuentran en este captulo. Tambin queremos reconocer el apoyo de los
donativos NIH-NGMS 5G12RR08124 y NIH-NGMS SO6GM08012, del National
Institute of Health, USA.
18
ABREVIATURAS
VEGF
RGD
Arg-Gli-Asp.
NGR
Asn-Gli-Arg.
TF
BIBLIOGRAFA
Anaya, M., Rael, E. D., Lieb, C. S., Perez, J. C. and Salo, R. J. 1992. Antibody
detection of venom protein variation within a population of the rattlesnake
Crotalus v. viridis. J. Herpt. 26:473-482.
Arap, W., Pasqualini, R. and Ruoslahti, E. 1998. Cancer treatment by targeted
drug delivery to tumor vasculature in a mouse model. Science 279:377-380.
Baillie, C. T., Winslet, M. C. and Bradly, N. J., 1995. Tumour vasculature - a
potential therapeutic target. Br. J. Cancer. 72:257-267.
Baker, B. J., Wongvibulsin, S., Nyborg, J. and Tu, A. T. 1995. Nucleotide sequence
encoding the snake venom fibrinolytic enzyme Atroxase obtained from a
Crotalus atrox venom gland cDNA library. Arch. Biochem. Biophys.
317:357-364.
Baramova, E. N., Shannon, J. D., Fox, J. W. and Bjarnason, J. B. 1991.
Proteolytic digestion of non-collagenous basement proteins by the
hemorrhagic metalloproteinase Ht-e from Crotalus atrox venom. Biomed.
Biochi. Acta 50:763-768.
Benedict, C. A., MacKrell, A. J. and Anderson, W. F. 1997. Determination of the
binding affinity of an anti-CD34 single-chain antibody using a novel, flow
cytometry based assay. J. Immunol. Methods 201:223-231.
19
20
Chung, M. C. M., Ponnudurai, G., Kataoka, M., Shimizu, S. and Tan, N.-H. 1996.
Structural studies of a major hemorrhagin (Rhodostoxin) from the venom of
Calloselasma rhodostoma (Malayan pit viper). Arch. Biochem. Biophys.
325:199-208.
Dewhirst, M. W., Tso, C. Y., Oliver, R., Gustafson, C. S., Secomb, T. W. and
Gross, J. F. 1989. Morphological and hemodynamic comparison of tumor
and healing normal tissue microvasculature. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.
17:91-99.
Dvorak, H. F., Nagy, J. A. and Dvorak, A. M. 1991. Structure of solid tumors and
their vasculature: implications for therapy with monoclonal antibodies.
Cancer Cells 3:77-85.
Epstein, A. L., Khawli, L. A., Hornick, J. L. and Taylor, C. R. 1995. Identification of
a monoclonal antibody, TV-1, directed against the basement membrane of
tumor vessels, and its use to enhance the delivery of macromolecules to
tumors after conjugation with inteleukin 2. Cancer Res. 55:2673-2680.
Folkman, J. 1995. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other
disease. Nature Med. 1:27-31.
Folkman, J. 1997. Addressing tumor blood vessels. Nature Biotechnol. 15:510.
Francisco, J. A., Gilliland, L. K., Stebbins, M. R., Norris, N. A., Ledbetter, J. A. and
Siegall, C. B. 1995. Activity of a single-chain immunotoxin that selectively
kills lymphoma and other B-lineage cells expressing the CD40 antigen.
Cancer Res. 55:3099-3104.
Gasanov, S. E., Rael, E.D., Gasanov, N. E. and Vernon, L .P. 1995. In vitro
evaluation of Pyrularia thionin-anti-CD5 immunotoxin. Cancer Immunol.
Immunother. 41: 122.
Gasanov, S. E., Alsarraj M.A., Gasanov, N. E. and Rael, E. D. 1997. Cobra venom
cytotoxin free of phospholipase A2 and its effect on model membranes and T
cell leukemia. J. Membrane Biol. 150:133-142.
Gomis-Rth, F.X., Kress, L. F. and Bode, W. 1993. First structure of a snake
venom metalloproteinase: a prototype for matrix
metalloproteinases/collagenases. EMBO J. 12:4151-4157.
21
22
23
Murphy, J. R., Bisha, W., Williams, D., Borowski, M., Parker, K., Boyd, J., Waters,
C. and Strom, T. B. 1987. Genetic assembly and selective toxicity of
diphtheria-toxin-related polysaccharide hormone fusion proteins. Biochem.
Soc. Symp. 53:9-23.
Ownby, C. L., Bjarnason, J. B. and Tu, A. T. 1978. Hemorrhagic toxins from
rattlesnake (Crotalus atrox) venom. Am. J. Pathol. 93:201-218.
Paine, M. J. I., Moura-de-Silva, A. M., Theakston, R. D. G. and Compton, J. M.
1994. Cloning of metalloproteinase genes in the carpet viper (Echis
pyramidum leakeyi). Further members of the metalloproteinase/disintegrin
gene family. Eur. J. Biochem. 224:483-488.
Pasqualini, R. and Ruoslahti, E. 1996. Organ targeting in vivo using phage display
peptide libraries. Nature 380:364-366.
Pasqualini, R., Koivunen, E. and Ruoslahti, E. 1997. v integrins as receptors for
tumor targeting by circulating ligands. Nature Biotechnol. 15:542-546.
Pastan, I., Chaudhary, V. and FitzGerald, D. J. 1992. Recombinant toxins as novel
therapeutic agents. Annu, Rev. Biochem. 61:331-334.
Patel, H. V., Vyas, A. A., Vyas, K. A., Liu, Y.-S., Chiang, C.-M., Chi, L.-M. and Wu,
W.G. 1997. Keparin and heparan sulfate bind to snake cardiotoxin. Sulfated
ologosaccharides as a potential target for cardiotoxin action. J. Biol. Chem.
272:1484-1492.
Poblet, E., Jimenez-Acosta, F. and Rocamora, A. 1994. QBEND/10 (anti-CD34
antibody) in external root sheath cells and follicular tumors. J. Cutan. Pathol.
21:224-228.
Rael, E.. D., Martinez, M. and Molina, M. 1992. Isolation of a fibrinolytic protease,
M4, from venom of Crotalus molossus molossus (northern blacktail
rattlesnake). Haemostasis 22:41-49.
Rael, E. D., Lieb, C. S., Maddux, N., Varela-Ramirez, A. and Perez, J. 1993.
Hemorrhagic and Mojave toxins in the venoms of the offspring of two
Mojave rattlesnakes (Crotalus scutulatus scutulatus). Comp. Biochem.
Physiol. 106B:595-600.
24
Rael, E. D., Rivas, J. Z., Chen, T., Maddux, N., Huizar, E. and Lieb, C. S. 1997.
Differences in fibrinolysis and complement inactivation by venom from
different northern blacktailed rattlesnakes (Crotalus molossus molossus).
Toxicon 35:505-513.
Rawlings, N. D. and Barrett, A. J. 1995. Evolutionary families of metallopeptidases.
Methods Enzymol. 248:183-228.
Reiter, Y., Wright, A. F., Tonge, D. W. and Pastan, I. 1996. Recombinant singlechain and disulfide-stabilized Fv-immunotoxins that cause complete
regression of a human colon cancer xenograft in nude mice. Int. J. Cancer.
67:113-123.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY.
Schlingemann, R. O., Rietveld, F. J., De Wall, R. M., Bradley, N. J., Skene, A. I.,
Davies, A. J., Greaves, M. F., Denekamp, J. and Ruiter, D. J. 1990.
Leukocyte antigen CD34 is expressed by a subset of cultured endothelial
cells and on endothelial abluminal microprocesses in the tumor stroma. Lab.
Invest. 62:690-696.
Scott, J. K. and Smith, G. P. 1990. Searching for peptide ligands with an epitope
library. Science 249:228-257.
Shimokawa, K., Jia, L.-G., Wang, X.-M. and Fox, J. W. 1996. Expresssion,
activation, and processing of the recombinant snake venom
metalloproteinase, Pro-Atrolysin E. Arch. Biochem. Biophys. 335:283-294.
Smith, G. P. and Scott, J. K. 1993. Libraries of of peptide and proteins displayed on
filamentous phage. Methods Enzymol. 217:228-257.
Tanigawa, N., Matsumura, M., Kitaoka, Amaya, H., Kitaoka, A., Shimomatsuya, T.,
Lu, C., Muraoka, R. and Tanaka, T. 1997. Tumor vascularity correlates with
the prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer
79:220-225.
Theuer, C. P. and Pastan, I. 1993. Immunotoxins and recombinant toxins in the
treatment of solid tumors. Am. J. Surgery. 166:284-288.
25
PIES DE FIGURAS
26
PM (Da)
pI
Fibrinoltica
Fibrinogenoltica*
Complemento
Hemorrgica
M1
26,000
3.6
M2
26,500
4.4
M4
27,000
9.6
M5
25,000
7.0
M6
26,000
7.6
* son dos de los pptidos del fibringeno. Los pptidos y fueron digeridos por las
metaloproteinasas, pero el pptido fue resistente a la hidrlisis por las enzimas.
Captulo 16
Identificacin de individuos mediante el anlisis del DNA
Jaime Berumen Campos1, Eligia Jurez Torres1 y Roco Gmez Ortega1.
1
Email: lamili@mail.internet.com.mx
PALABRAS CLAVE: DNA recombinante, identificacin de individuos, huella gentica, marcadores.
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivos del captulo.
3. Estado actual del arte.
4. Bases genticas para la identificacin de personas con la huella digital del DNA.
5. Estrategia para la identificacin de individuos y mtodos de DNA recombinante.
6. Probabilidad de coincidencia al azar (PCA) en la huella digital de DNA entre dos individuos
no relacionados genticamente.
7. Gentica de poblacin de marcadores genticos utilizados en la identificacin de individuos.
8. Ejemplos de casos reales realizados en Mxico.
8.1 Un caso de paternidad resuelto con marcadores minisatlites.
8.2 Un caso de paternidad resuelto con loci de variacin de secuencia, minisatlites y
microsatlites.
8.3 La madre no sabe quin es el padre de su hijo en gestacin.
8.4 Violacin resuelta con microsatlites y marcadores para determinar el sexo.
8.5 Asesinato resuelto con marcadores de variacin de secuencia y macrosatlites.
9. Conclusiones.
Agradecimientos.
Abreviaturas.
Bibliografa.
1. INTRODUCCIN
i)
Analizar los principios bsicos de gentica en los que se basan las pruebas de DNA para
identificar individuos.
ii)
Analizar las tcnicas de DNA recombinante que se utilizan en los estudios de DNA para
identificar individuos.
iii)
iv)
Analizar algunos casos reales en los que se ha aplicado la huella digital de DNA para
identificar individuos en Mxico.
cual es laborioso y poco sensible. Aunque los microsatlites son menos polimrficos, existe una
gran cantidad de ellos en el genoma humano y se pueden usar en cantidades pequeas an
cuando la muestra est muy degradada, por lo que actualmente se utilizan en la mayora de los
casos de identificacin de individuos. Adems, tienen la ventaja de que se pueden amplificar
mediante la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), lo que ha permitido que
sean de utilidad para la identificacin en muestras pequeas de DNA (Cynthia y col., 1996).
Durante los primeros aos del desarrollo de esta tecnologa, en los sistemas de deteccin de
DNA se utilizaban marcadores radiactivos, lo que dificult su utilizacin en una forma ms
amplia. Actualmente existen mtodos colorimtricos (Lins y col., 1996; Bassam y col., 1991) o
fluorescentes (Fregeau y Fourney, 1993; Holgersson y col., 1994) para el marcaje y deteccin
de los cidos nucleicos, lo que ha facilitado su utilizacin en laboratorios clnicos y privados.
Adems, en los ltimos aos se han desarrollado analizadores automticos de DNA que, en
conjunto con los mtodos de deteccin fluorescentes, han permitido acortar el tiempo para el
desarrollo de la prueba y la automatizacin de la misma (Kimpton y col., 1994; Schumm y col.,
1997). Actualmente, cuando se utiliza un nmero apropiado de marcadores genticos y la
prueba de DNA se realiza e interpreta apropiadamente, la probabilidad de error en la
identificacin de individuos es extremadamente baja.
Cada ser humano tiene un fenotipo o apariencia fsica caracterstica, porque posee una
informacin gentica nica. Los gemelos idnticos son la excepcin a esta regla, los cuales
poseen el mismo genotipo o material gentico. Todas las clulas de un individuo, ya sean de la
raz del pelo, leucocitos, espermatozoides, piel, hueso, etc., tienen la misma informacin
gentica, incluso la informacin necesaria para codificar potencialmente el cuerpo humano
completo. Estos dos principios, el de la individualidad gentica de cada persona y el que todas
las clulas de un mismo individuo posean la misma informacin gentica, son la base para los
estudios de la huella digital de DNA (Lewin, 2000).
La individualidad gentica de un individuo est definida por la informacin gentica que
hereda cada individuo de sus padres. El material gentico est contenido en los 46
cromosomas (23 pares homlogos) del ncleo celular y en el DNA mitocondrial. En la
fertilizacin, el vulo y el espermatozoide, que contienen slo 23 cromosomas diferentes, se
combinan para dar una clula con 23 pares de cromosomas. As, una copia de cada par de
cromosomas es derivada del padre y la otra de la madre. Ambas copias de cada par de
cromosomas contienen la misma informacin gentica con pequeas variaciones. El DNA
mitocondrial, slo es heredado por la madre, por lo que todos los hijos de una misma madre
tienen la misma informacin gentica en el DNA mitocondrial. Un cromosoma est constituido
por una molcula muy grande de DNA unida a protenas y contiene alrededor de 2000 genes. El
DNA est formado por dos largas cadenas de 4 diferentes nucletidos, que pueden ser de
adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T), los cuales se repiten una y otra vez en
secuencias muy variables a lo largo de las cadenas. Estas dos cadenas de nucletidos estn
unidas entre s por uniones dbiles (puentes de hidrgeno) y estn enrolladas en forma de
hlice, parecido a una escalera de caracol. Los genes son fragmentos de DNA [1200 pares de
bases (pb) en promedio] que se encuentran a lo largo de los cromosomas y la mayora
codifican la informacin para las protenas (algunos codifican para la sntesis de RNA ribosomal
y de transferencia). Las protenas forman parte de todas las estructuras celulares y controlan
las funciones de las clulas y del cuerpo humano en conjunto. El DNA humano est compuesto
de 6 x 109 pares de nucletidos y contiene alrededor de 30,000 genes diferentes. Cada gen se
diferencia de los otros por el orden de la secuencia de sus nucletidos (Lewin, 2000).
En las clulas eucariticas (clulas con su material gentico protegido por una
membrana), slo el 1-5 % del DNA codifica para protenas o constituye los genes, el resto,
son secuencias que no codifican. El 30% del genoma humano que no codifica est
compuesto por secuencias repetidas de DNA y se divide en DNA repetido disperso, como las
secuencias Alu, y DNA repetido en tndem (Lewin, 2000). Este ltimo consiste en
repeticiones idnticas, una enseguida de las otras, de secuencias especficas de DNA de
tamao variable e incluye al DNA satlite, las secuencias minisatlites y microsatlites. Los
minisatlites y los microsatlites se encuentran en la eucromatina y son muy polimrficos en
la poblacin. Los minisatlites, tambin conocidos como secuencias repetidas en tndem de
nmero variable (VNTRs), se componen de secuencias repetidas de 10 a 30 pb y
constituyen segmentos variables de DNA de 0.3 a 50 kilobases. Se ha estimado que existen
ms de 5000 loci tipo VNTRs en el genoma humano, de los cuales slo se han caracterizado
algunos de ellos (Jeffreys y col., 1985b, 1986, 1991; Wong y col., 1987; Nakamura y col.,
1987). Los microsatlites, tambin denominados secuencias cortas de repeticin en tndem
(STRs), son secuencias repetidas de 1 a 5 pb y forman fragmentos de alrededor de 100-300
pb (Charlesworth y col., 1994). Los microsatlites son una familia de secuencias de DNA
que se encuentra esparcida en todo el genoma en cantidades de 50,000 a 100,000 (Bowcock
y col., 1994; Dib y col., 1996; Edwards y col., 1991, 1992). La mayora de los marcadores
microsatlites son de la clase dinucleotdica y recientemente se ha descrito un mapa
gentico basado en ms de 5,000 microsatlites del tipo (AC/TG)n, con una heterocigocidad
del 70% en los 23 pares de cromosomas (Dib y col., 1996). Los microsatlites de la clase
tetranucleotdica son ms polimrficos y ms estables que los dinucletidos y estn
presentes cada 300 a 500 kilobases (kb) en el genoma humano (The UTAH Marker
Development Group, 1995).
Los genes y el DNA repetido estn localizados en posiciones particulares de los
cromosomas llamadas locus. Muchos de ellos pueden existir en formas variables, a cada uno
de ellos se les llama alelos. Por ejemplo, de un gen X pueden existir en diferentes individuos de
una poblacin los alelos X1, X2, X3 y X4. Cada individuo puede tener slo dos de esos alelos,
uno en el cromosoma paterno y otro en el materno. Si un individuo posee dos copias idnticas
de un alelo particular, por ejemplo X1 y X1, se dice que es homocigoto en ese locus. Mientras
que un individuo que tiene alelos diferentes en ese locus por ejemplo X1 y X4, se le llama
heterocigoto. La mayora de los genes no varan grandemente en sus secuencias codificantes
(exones) entre los individuos de una poblacin, con excepcin de los genes del complejo mayor
de histocompatibilidad. Por ejemplo, el gen que codifica para la hormona insulina, no es muy
variable ya que su funcin es muy importante en todos los individuos.
El anlisis de identificacin a travs de la huella digital del DNA se basa en la
caracterizacin de las regiones variables o polimrficas del material gentico de los individuos
de una poblacin dada. Estas regiones hipervariables son de tres tipos, i) loci de variacin en la
secuencia, ii) microsatlites y iii) minisatlites. En los loci de variacin de secuencia, el
polimorfismo se presenta por el cambio de uno o varios nucletidos en la secuencia del DNA,
generalmente en los exones y en las regiones de regulacin de la expresin gentica. En los
loci minisatlites y microsatlites, el polimorfismo se presenta por la variacin en el nmero de
repeticiones en tndem de las secuencias minisatlites o microsatlites (Fig. 1). Los loci de
variacin de secuencia son poco polimrficos; en ellos slo vara un nucletido y a lo ms
existen 4 alelos diferentes en la poblacin. Un ejemplo sencillo para un locus es el siguiente:
alelo 1 (ATGCGTACGG), alelo 2 (ATTCGTACGG), alelo 3 (ATCCGTACGG) y alelo 4
(ATACGTACGG). El nucletido que vara aparece subrayado. En cambio, los loci que varan en
el nmero de secuencias repetidas son muy polimrficos. Los loci microsatlites son
medianamente polimrficos y pueden tener hasta 30 alelos y los loci tipo VNTRs son los ms
polimrficos (Jeffreys y col., 1985a; Wong y col., 1987; Nakamura y col., 1987) y en ocasiones
pueden tener hasta 5000 alelos diferentes (Berumen y col., 1994). Por ejemplo, en el locus
MS1 la secuencia (GGCTGGGCATATGCTG) puede estar repetida 30 veces en un individuo,
40 veces en otro y 5000 veces en otro.
La herencia de los alelos polimrficos se da de acuerdo con las leyes mendelianas de la
gentica clsica. Por lo tanto, las frecuencias genotpicas o haplotpicas (conjunto allico de un
individuo) pueden ser establecidas y abordadas estadsticamente de acuerdo con la frecuencia
allica de una poblacin (Balazs y col., 1989; Chakraborty y Kidd, 1991; Cohen, 1990).
Los marcadores genticos tiles en la identificacin de individuos deben tener un gran
poder de discriminacin (PD) o capacidad de distinguir entre dos individuos (variacin
genotpica). Entre ms alelos tenga un marcador gentico (mayor polimorfismo) y ms uniforme
sea su distribucin entre la poblacin (mayor heterocigosidad), mayor ser su PD (Balazs y col.,
1989; Chakraborty y Kidd, 1991; Cohen, 1990). Los loci de variacin de secuencia,
microsatlites y minisatlites ms comnmente utilizados como marcadores genticos en los
estudios de la huella digital del DNA se muestran en la Tabla 1.
Las diferencias estructurales de los alelos de los locus polimrficos pueden ser detectadas por
las tcnicas del DNA recombinante. El polimorfismo de los loci tipo VNTR puede ser
establecido combinando el uso de endonucleasas que corten el DNA en sitios fijos, por fuera de
los VNTRs. Con el mtodo de hibridacin tipo Southern blot, se detecta el polimorfismo como
una variacin en el tamao de los fragmentos de restriccin. A estos fragmentos se les llama
RFLP (del ingls Restriction Fragment Length Polymorphism). El tamao de las bandas de DNA
variar de acuerdo al nmero de copias en tndem de la secuencia minisatlite (Fig. 1 y 2;
Wong y col., 1987; Jeffreys y col., 1991; Waye y Fourney, 1990). Sin embargo, algunos
minisatlites con alelos pequeos menores de 3000 pb, como los del locus D1S80, se pueden
detectar mediante la amplificacin del DNA por el mtodo de la reaccin en cadena de la
polimerasa o PCR (del ingls Polymerase Chain Reaction), similar a los microsatlites (ver ms
abajo). El polimorfismo de secuencia y de microsatlites puede ser establecido con el uso de la
PCR, seguida de la reaccin de secuenciacin del DNA (Higuchi y col. 1988) o la tcnica de
hibridacin en punto (Blake y col., 1992; Comey y col., 1993; Peterson y col., 2000). Los
microsatlites tambin pueden detectarse en electroforesis en geles de poliacrilamida teidos
con plata o usando marcadores fluorescentes (Fig. 1).
La utilizacin de marcadores genticos de un tipo u otro depende de la cantidad y grado
de conservacin del DNA extrado de las muestras biolgicas y del tipo de problema en
estudio. Para el sistema de los minisatlites se requiere cuando menos 1 g de DNA de alto
peso molecular, por lo que no se puede utilizar en muestras con poco DNA o con DNA
degradado. Los marcadores minisatlites son tiles en casos de identificacin de cadveres
recientes, de paternidad y en algunos casos de violaciones en donde sea factible recolectar
suficiente muestra biolgica (0.1 g o ms de sangre, semen u otros tejidos) y se encuentre bien
conservada. Sin embargo, en los casos donde hay poco material biolgico, como en los casos
de crmenes, en los que se cuenta con una gota de sangre o un cabello, o en muestras antiguas
mal conservadas, como es el caso de identificacin de cadveres de mucho tiempo de
10
antigedad, donde el DNA est degradado, no se puede utilizar el sistema de los minisatlites y
se utilizan marcadores microsatlites (Edwards y col., 1991; Alford y col., 1994; Ludes y
Clisson, 2000; Schmerer y col., 2000) o de variacin de secuencia como el HLA DQa y el DNA
mitocondrial (Comey y col., 1993; Orrego y King, 1990; Klitz y col., 2000; Peterson y col., 2000)
(Fig. 1).
El anlisis del DNA mitocondrial, en especial el de una regin polimrfica denominada "DLoop", tambin ha sido utilizado en la identificacin de individuos (Higuchi y col., 1988; Orrego
y King, 1990). El polimorfismo en esta regin es principalmente de variacin de secuencia.
Como es heredado slo por parte de la madre, se utiliza frecuentemente para demostrar el
parentesco maternal entre individuos (hermanos, hermanas, primos, primas, tos, tas, etc.
emparentadas con la madre (Orrego y King, 1990). Sin embargo, el polimorfismo del DNA
mitocondrial es muy bajo, por ejemplo, en poblaciones caucsicas slo se pueden distinguir
alrededor de 700 personas usando el DNA mitocondrial (Orrego y King, 1990). En el DNA
mitocondrial existe tambin polimorfismo en los RFLP. Sin embargo, ste no es debido a
variaciones en repeticiones en tndem de secuencias minisatlites ni microsatlites, sino ms
bien a variaciones de secuencia que afectan los sitios de corte de las endonucleasas. Este
polimorfismo es utilizado para identificar razas humanas, grupos tnicos y enfermedades
genticas. Tambin se utiliza para estudios de evolucin y migracin de poblaciones (Wallace,
1994).
11
Una vez que se ha realizado la prueba de la huella digital del DNA, existen tres resultados
posibles: Primero, la prueba puede resultar no concluyente, ya sea porque el material fue
insuficiente para la prueba o por problemas tcnicos de la metodologa. Segundo, cuando el
patrn de la huella digital de DNA de la muestra problema no coincide con la del sospechoso, el
resultado es excluyente, o sea que la evidencia biolgica no proviene del individuo sospechoso
y puede ser declarada exculpatoria. Para estos dos casos, no se requiere disponer de una base
de datos de gentica de poblacin de los marcadores utilizados (Balazs y col., 1989;
Chakraborty y Kidd, 1991). El 60 a 65% de los casos de crmenes caen en una de estas dos
categoras. La tercera alternativa, cuando coinciden los patrones genticos de la muestra de la
evidencia del crimen y del sospechoso, el estudio es concluyente o sea que la evidencia
biolgica proviene del individuo sospechoso. Sin embargo, en estos casos el sospechoso
puede argumentar que la coincidencia ocurri al azar y que no est ligado a la muestra, o bien,
que existen otros individuos con el mismo patrn gentico. Para estos casos se debe conocer la
probabilidad de que dos individuos tomados al azar de la misma poblacin del sospechoso
tengan el mismo patrn gentico. A esta probabilidad de coincidencia al azar se le llama PCA.
Este es el problema principal y el punto de controversia en los casos legales y su resolucin
requiere de la aplicacin de los mtodos de la gentica de poblaciones (Cohen, 1990;
Chakraborty y Kidd, 1991).
El grado de certeza de un mtodo de identificacin de individuos depende de la PCA, a
menor PCA mayor ser la certeza. En los casos de crmenes y violaciones, el valor de la PCA
para un marcador dado depende de la frecuencia allica de los dos alelos que conforman el
genotipo y se mide con la frmula PCA = q2 para genotipos homocigotos y PCA = 2qp para
genotipos heterocigotos, donde q y p son las frecuencias de los alelos q y p en la poblacin.
12
En los casos para probar la paternidad, el clculo de la PCA incluye slo la frecuencia del alelo
que coincide entre el padre supuesto y el hijo en estudio: PCA = c, donde c es la frecuencia del
alelo que coincide (Li y Chakraborty, 1985; Gjertson y col., 1988). En los casos de paternidad
en los que hay duda tanto de la madre como del padre, como sera el caso de la identificacin
de un cadver irreconocible o un nio extraviado en la cuna, el clculo de la PCA incluye la
frecuencia de ambos alelos y se utilizan las mismas frmulas que en los casos de crmenes y
violaciones. El nmero de alelos de un marcador gentico y la frecuencia de cada uno de ellos
se explora realizando un estudio de gentica de poblacin.
La frecuencia allica depende del nmero y distribucin de los alelos en la poblacin.
Entre menor sea la frecuencia de un alelo en la poblacin menor ser la PCA. La PCA global
para un sistema de identificacin depende del nmero de marcadores utilizados y se calcula
multiplicando la PCA de cada uno de los marcadores. Entre mayor sea el nmero de
marcadores menor ser la PCA. Para un pas de 97 millones de habitantes, una PCA de
1 x 10-8 (0.00000001 o 1 en 100 millones) o menor, podra ser suficiente en los casos de
identificacin. El grado de certeza no debe expresarse en forma de porcentaje porque resulta
engaoso. Por ejemplo, decir que un sistema de identificacin tiene un 99.9% de certeza, que
pareciera que es una certeza prcticamente de 100%, significa que 1 de cada 1000 individuos
explorados al azar coinciden y en un pas de 97 millones, habra 97,000 individuos con un
genotipo idntico. Por ello, la certeza, ms bien se debe expresar como probabilidad de error, la
cual es igual a la PCA.
Las pruebas basadas en marcadores con pocos alelos en la poblacin, tienen una PCA
muy alta y pueden utilizarse con seguridad slo en los casos de exclusin; tal es el caso de la
tipificacin sangunea con el sistema ABO y con los marcadores de DNA poco polimrficos
como los incluidos en los sistemas llamados POLIMARKER" (LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y
13
Sin el clculo de la PCA, el anlisis del DNA para la identificacin de individuos en casos de
inclusin, prcticamente no tiene ninguna validez. Es muy poco probable que las bases de
datos de frecuencias allicas y genotpicas, as como los valores de PCA de los marcadores
genticos de la huella digital de DNA encontrados en los grupos de poblaciones anglosajonas,
sean similares en la poblacin mexicana. En el peor de los casos, se deben considerar las
frecuencias allicas encontradas en poblacin hispana de Estados Unidos (Tablas 2 y 3).
Aunque esta poblacin hispana, seleccionada por el apellido, incluye mexicanos, espaoles,
cubanos, sudamericanos, centroamericanos, etc., la informacin obtenida de ella es la ms
14
cercana que podemos utilizar, al menos para individuos mestizos. Para que esta metodologa
se pueda interpretar apropiadamente en casos de inclusin en Mxico, es necesario tener
informacin de la PCA en diversos grupos de la poblacin mexicana: blancos, mestizos e
indgenas. En las poblaciones indgenas del pas, por ejemplo, es comn el matrimonio entre
parientes cercanos, incluso entre hermanos y en general entre miembros de la misma
comunidad, con poco intercambio con otras comunidades y por lo tanto es comn una
frecuencia alta de consanguinidad. En estas poblaciones la diversidad gentica es mucho ms
baja y la homocigocidad es mucho ms alta que en grandes poblaciones sin consanguinidad, y
es probable que se encuentren pocas variantes genticas en la mayora de las regiones
cromosmicas.
Para los sistemas de variacin de secuencia (LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y GC y HLADQalfa) que son poco polimrficos ya que presentan de 2 a 6 alelos cada uno (Tabla 1), as
como para el locus D1S80 que contiene 27 alelos (Tablas 1 y 3), la frecuencia allica
encontrada en poblacin mestiza de Mxico es muy parecida a la encontrada en grupos
hispanos en Estados Unidos (Berumen y col., 2001a). Sin embargo, se observan algunas
diferencias, por ejemplo, las frecuencias de los alelos C del locus HBGG y 4 del locus DQA1
son menores en la poblacin mestiza mexicana que en los hispanos de Estados Unidos
(p<0.05) (Tabla 2). Estos sistemas son muy utilizados en casos de crmenes, violaciones e
identificacin de cadveres; sin embargo, son poco polimrficos y su PCA global no es muy
baja.
El nmero de genotipos diferentes y por lo tanto individuos genticamente diferentes,
que se puede distinguir con un marcador gentico se calcula con la siguiente frmula: GD=[(a2 a)/2 + a], donde GD son los genotipos diferentes y a es el nmero de alelos diferentes en la
poblacin. El nmero de genotipos diferentes que se pueden diferenciar con cada uno de los
15
16
diferentes, por lo que la asignacin de cada alelo individualmente es difcil. Con los sistemas
multilocus, se calcula la frecuencia allica media (q) y la PCA media con la formula PCA = q2(2q) ( Wong y col., 1987). En poblacin anglosajona, la PCA de marcadores genticos
minisatlites multilocus es aproximadamente de 1x10-11 (Jeffreys y col., 1991) y la de
minisatlites monolocus vara entre 1x10-4 y 1x10-5 (Wong y col., 1987), dependiendo del
marcador utilizado. Combinando varios marcadores monolocus, por ejemplo tres de ellos, se
puede alcanzar una PCA por abajo de 1x10-11. En un estudio previo realizado en la ciudad de
Mxico con 6 sondas monolocus (MS43, g3, MS1, MS31, pH30 y D14S13) en una muestra de
poblacin mestiza seleccionada al azar, la PCA de cada uno de los marcadores vari de
1 x 10-4 a 1 x 10-5 (Tabla 4), la PCA global de los primeros tres marcadores fue de 2.5 x 10-11
(Berumen y col., 1994) y de los 6 en conjunto fue de 4.1 x 10-21. La PCA encontrada en este
estudio, con los tres marcadores monolocus iniciales, indica que este sistema de identificacin
permite distinguir alrededor de 40,000 millones de individuos. En un pas de 97 millones, como
es Mxico, la probabilidad de una falsa positividad es prcticamente nula.
Los marcadores microsatlites son menos polimrficos que los minisatlites, pero mucho
ms polimrficos que los marcadores de variacin de secuencia. Adems, tienen la gran
ventaja de encontrarse en pequeos fragmentos de DNA (100-300 pb) y pueden ser
amplificados con la tcnica de la PCR, lo que permite que se puedan utilizar para identificar
muestras biolgicas pequeas, muy antiguas o degradadas. Los microsatlites tetranucletidos
son los ms utilizados para fines forenses y problemas de paternidad. En Mxico hemos
explorado la diversidad gentica de mas de 15 microsatlites tetranuceltidos (Berumen y col.,
2001b) y 7 dinucletidos del cromosoma X (Berumen y col., 2001c). En la Tabla 5 se muestra
la PCA calculada con los datos obtenidos en un estudio de gentica de poblacin en mestizos y
mazahuas utilizando 9 microsatlites. La PCA promedio combinada fue de 5.6 x 10-17 en los
17
mestizos y 2.1 x 10-15 en la poblacin mazahua. Estos clculos indican que para la mayora de
los casos de identificacin es suficiente utilizar 9-10 marcadores microsatlites. Sin embargo, en
los casos donde los alelos que coinciden son los ms frecuentes de cada loci, la PCA se eleva
considerablemente, hasta 1 x 10-8 en ambas poblaciones. Esto indica que para obtener una
PCA mxima, menor a 1 x 10-8 , es necesario utilizar ms marcadores microsatlites.
Por otra parte, se observa claramente que la PCA en la poblacin mestiza es dos rdenes
de magnitud menor que en la poblacin mazahua, lo cual concuerda con el hecho de que en las
poblaciones indgenas existe un menor intrecruzamiento gentico con individuos de otras
poblaciones.
Se recibieron las muestras de sangre del padre (fallecido das antes), de la madre, de dos hijos
conocidos de la pareja y de un tercero quien deca ser hijo del padre y reclamaba parte de la
herencia. Como control experimental, se incluyeron la sangre del padre, la madre y de un hijo
de dos familias conocidas. Se purific el DNA y se efectu el examen de la "huella digital de
DNA" con sondas minisatlite, corriendo simultneamente en la electroforesis el DNA de los
miembros de la familia 1 (F1), familia 2 (F2) y de los miembros del caso de paternidad,
utilizando primero la sonda MS43A, luego la g3 y finalmente la MS1. En la Figura 2 se muestra
el patrn de bandeo allico con la sonda g3. En las dos familias conocidas (F1 y F2) se observa
claramente que el hijo comparte una banda con el padre y otra con la madre. En el caso de
paternidad, los dos hijos conocidos de la familia en cuestin, comparten una banda con la
18
madre y otra con el padre, mientras que el sujeto problema no comparti ninguna de las bandas
con la madre ni con el padre. Igualmente sucedi con la sonda MS1 y MS43A (datos no
mostrados). Con este estudio se excluy la posibilidad de que el sujeto en disputa fuera hijo del
padre fallecido. La frecuencia de mutacin de estos loci es de 0.001 y la frecuencia de mutacin
de los tres marcadores juntos sera de 1 x 10-9, por lo que sera improbable que fuera una falsa
exclusin.
El estudio lo solicit el supuesto padre quien dudaba ser realmente el padre biolgico del nio
X, porque no se pareca fsicamente a l. Los datos fenotpicos ms importantes eran que el
nio tenia ojos azules y cabello lacio que no correspondan a la mam ni al supuesto padre.
Adems, el tipo sanguneo del supuesto padre no corresponda al del nio: el supuesto padre
era O, la mam era O y el nio era B. Se inici el estudio con 6 loci de variacin de secuencia
(LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y GC y HLA-DQalfa ) y el D1S80. Como se muestra en la Tabla 6,
un alelo de cada uno de los marcadores coincidieron entre el hijo y el supuesto padre; sin
embargo, la PCA fue tan slo de 1 en 212 (0.48 x 0.5 x 0.63 x 0.63 x 0.47 x 0.38 x 0.28). Por tal
motivo se exploraron 5 locus microsatlite (LPL, wWA, TH01, FESFPS y F13B), encontrndose
que ninguno de los alelos coincidi entre el hijo y el supuesto padre, por lo que se excluy la
paternidad. Este es un claro ejemplo en donde se demuestra que la utilizacin de los loci de
variacin de secuencia (Polimarker de Perkin-Elmer) y el D1S80 no son suficientes para los
estudios de paternidad.
19
Una artista muy famosa se fue a Pars con su esposo. Su esposo se regres a Mxico y ella
sigui en Pars con su amante. Cuando regres a Mxico, se di cuenta que estaba
embarazada y no saba si el hijo que esperaba era del esposo o del amante. La angustia era
mayor porque el amante era moreno y el esposo rubio, por lo que solicit se le realizara la
prueba de DNA. En un laboratorio especializado se le realiz una amniosentesis al final del
tercer mes de embarazo para tomar una pequea muestra de lquido amnitico, en el que se
encuentran clulas de descamacin exclusivas del beb en formacin. Se tom una muestra de
sangre de ella y de su esposo pero no pudo conseguir la sangre del amante, por lo que no fue
incluido en el estudio inicial. Se utilizaron 14 microsatlites y se encontr que su esposo era el
padre biolgico del producto en gestacin (datos no mostrados), con una PCA de 1x10-9. Sin
embargo, al final de los 7 meses de embarazo el gineclogo le dijo que de acuerdo al
ultrasonido el producto tena 2 semanas menos que el calculado con la fecha de la ltima
menstruacin. El tiempo de gestacin coincida ms con una fecundacin ocurrida durante sus
relaciones sexuales con el amante. Habl al laboratorio cuestionando el resultado de la prueba
de DNA, a lo que se le contest que con todo gusto se poda repetir el estudio si persuada al
amante para tomarle una muestra de sangre. Una vez que se tom la muestra de sangre se
repiti el anlisis del DNA, corriendo al mismo tiempo en la electroforesis los marcadores
amplificados del esposo, el producto en formacin, la madre y el amante (Fig. 3). En la figura 3,
se observa claramente que las bandas del esposo coinciden con las del producto en gestacin,
mientras que ninguna de las bandas de los 5 marcadores utilizados coinciden entre el amante y
20
el producto en formacin, lo cual indica que el esposo es el padre biolgico del producto en
formacin.
Dos individuos fueron acusados y detenidos porque una mujer violada los identific como los
presuntos responsables. Sin embargo, los individuos afirmaron categricamente que ellos no
fueron los violadores. El abogado de la defensa solicit al juez que se realizara la prueba de
DNA para demostrar que los individuos detenidos no son los responsables del delito de
violacin. Una vez que el juez acept que se realizara la prueba, se tom una muestra de
sangre de cada uno de los individuos detenidos y se tomaron 4 manchas blanquecinoamarillentas de la pantaleta de la mujer violada, que haba permanecido en el juzgado para su
custodia. La mujer que fue violada no asisti en tres ocasiones, por lo que no se le pudo tomar
una muestra de sangre.
Una vez que se extrajo el DNA de las muestras en estudio, se investig el sexo de los
individuos a partir del DNA obtenido de las 4 manchas de la pantaleta, utilizando el marcador
amelogenina que identifica un fragmento del cromosoma Y (212 pb) y un fragmento del
cromosoma X (218 pb) y el marcador SRY que identifica un fragmento del cromosoma Y (409
pb), ambos explorados con la tcnica de la PCR. En tres de las manchas se detect DNA de
origen masculino (carriles P1, P2 y P3 en la Fig. 4, panel A) y en una de ellas DNA de origen
femenino (carril P4 de la Fig. 4, panel A). Esta ltima muestra muy probablemente contena
clulas de la propia mujer violada. Posteriormente, se utilizaron 5 marcadores microsatlites
para identificar el patrn gentico y comparar el de las manchas con el de los dos individuos
detenidos. Con el primer marcador analizado (TH01) se observa claramente que el patrn
21
gentico de los dos individuos no corresponde a ninguna de las tres manchas de origen
masculino (Fig. 4, panel B). Con slo este marcador se puede excluir contundentemente a esos
dos individuos detenidos. El resto de los marcadores genticos tampoco coincidi entre las
manchas y los individuos detenidos. Con los marcadores TPOX, D16S539 y D13S317 se
observa claramente que las manchas P1 y P3 provienen de un individuo diferente a la mancha
P2, y con el marcador D13S317 se demuestra claramente que el DNA de la mancha 4 es
diferente al de las manchas P1, P2 y P3. Con este estudio se demuestra contundentemente que
la pantaleta de la mujer violada contiene algn fluido biolgico, probablemente semen, de dos
individuos varones, diferentes a los individuos detenidos.
22
sangre (0.25 cm2 aproximadamente) y un fragmento de rin fijado en formol y en estado franco
de descomposicin, tomado del cadver una vez que se realiz la exhumacin. Para el anlisis
de las muestras se utilizaron 5 marcadores de variacin de secuencia y 2 microsatlites. Uno de
los marcadores de variacin de secuencia (LDLH, datos no mostrados) y los dos microsatlites
(Fig. 5) no coinciden entre las manchas de sangre y la muestra de rin. El patrn gentico de
los 7 marcadores es idntico entre las dos muestras de sangre. Los resultados de estos
experimentos indican claramente que la sangre de las dos manchas de la blusa no
correspondieron a la occisa.
9. CONCLUSIONES
i)
ii)
iii)
iv)
23
v)
vi)
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por la Secretara de la Defensa Nacional y el CONACYT, donativo
L0036 - M.
ABREVIATURAS
GD
Genotipos diferentes.
PCA
PCR
PD
Poder de discriminacin.
24
RFLP
STRs
VNTRs
BIBLIOGRAFA
Alford y col., 1994. Rapid and Efficient Resolution of Parentage by Amplification of Short
Tandem Repeats. Am. J. Hum. Genet. 55:190.
Balazs, I., Baird, M., Clyne, M., and Meade, E. 1989. Human population genetic studies of five
hypervariable DNA loci. Am. J. Human Genet. 44:182-190.
Bassam, J. B., Caetano-Anolls, G. and Gresshoff, P. M. 1991. Fast and sensitive silver staining
of DNA in polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 196:80-83.
Berumen, J., Casas, A.L., Hernndez, M.A., Segura, S.E., Medina, L.R. and Larriva, S.J. 1994.
Diversidad gentica de tres sondas de DNA en la huella digital de DNA de una poblacin
mexicana. Rev. Invest. Clin. 46:457.
Berumen, J., Jurez, E, and Gmez, R. 2001a. Population genetic of 6 sequence variation loci
(LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, GC and DQA1) and D1S80 minisatellite locus in mexican
mestizo population. Manuscrito en preparacin.
Berumen, J. and Gmez R. 2001b. Population genetic of 12 microsatellite loci used for DNA
fingerprinting in mexican mestizo population. Manuscrito en preparacin.
Berumen J., Vazquez O. and Koffmann, S. 2001c.Genetic diversity of 7 microsatellites of X
chromosome in the Mexican-mestizo population. Manuscrito en preparacin.
Blake, E., Mihalovich, J., Higuchi, R., Walsh, P.S. and Erlich, H.A. 1992. Polymerase Chain
25
26
Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human
population groups. Genomics 12:241.
Fregeau and Fourney. 1993. DNA typing with Fluorescently Tagged Short Tandem Repeats : A
Sensitive and Accurate Approach to human Identification. Biotechniques 15:100.
Gjertson, D.W., Mickey, M.R., Hopfield, J., Takenouchi, T. and Terasaki P.I. 1988. Calculation
of paternity using DNA sequences. Am. J. Hum. Genet. 43: 860.
Higuchi, R., von Beroldingen, C., Sensabaugh, G. and Erlich H., 1988. DNA typing from single
hairs. Nature 332:543-5.
Holgersson y col., 1994. Fluorescent-based Typing of the two Short Tandem Repeat Loci
HUMTH01 and HUMACTBP2: Reproducibility of Size Measurements and Genetic
Variation in the Swedish Population. Electrophoresis 15: 890.
Kimpton y col., 1994.Evaluation of an Automated DNA Profiling System Employing Multiplex
Amplification of four Tetrameric STR loci. Int. J. Leg. Med. 106:302.
Lewin, B. 2000.Genes VII. Oxford University Press, Inc. New York, N.Y.
Li, C.C. and Chakraborty, A. 1985. Basic fallacies in the formulation of the paternity index. Am. J.
Hum. Genet. 37:809.
Lins A.M. y col., 1996."Multiplex sets for the Amplification of polymorphic Short Tandem Repeat
loci-Silver Stain and Fluorescent Detection. Biotechniques 20: 882.
Ludes B, and Clisson I. 2000. Short Tandem Repeat loci analysis in forensic casework.
Anthropol Anz. 58:23-27.
Jeffreys, A.J., Wilson, V. and Thein, S.L. 1985a. Hypervariable "minisatellite" regions in human
DNA. Nature 314:67-73,
Jeffreys, A.J., Wilson, V. and Thein, S.L. 1985b. Individual-specific "fingerprints" of human DNA.
Nature 316:76-79.
27
Jeffreys, A.J., Wilson, V., Thein, S.L., Weatherall, D.J. and Ponder, B.A. 1986. DNA
"fingerprints" and segregation analysis of multiple markers in human pedigrees. Am. J.
Hum. Genet. 39:11- 24.
Jeffreys, A.J., Turner, M. and Debenham, P. 1991.The efficiency of multilocus DNA fingerprint
probes for individualization and establishment of family relationships, determined from
extensive casework. Am. J. Hum. Genet. 48:824-840.
Klitz, W., Reynolds, R., Chen, J. and Erlich, H.A. 2000. Analysis of genotype frequencies and
interlocus association for the PM, DQA1, and D1S80 loci in four populations. J. Forensic
Science 45:1009-10015.
Nakamura, Y., Leppert, M., O'Connell, P., Wolff, R., Holm, T. and Culver, M. 1987.
Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science
235:1616-1622.
Orrego, C. and King, M.C. 1990. Determinations of familial relationships PCR protocols : A
guide to methods and applications. Academic Press, USA:416-428.
Peterson, B.L, Su, B., Chakraborty, R., Budowle, B. and Gaensslen, R.E. 2000. World
population data for the HLA-DQA1, PM and D1S80 loci with least and most common
profile frecuencies for combinations of loci estimated following NRC II guidelines. J.
Forensic Science 45:118-146.
Schmerer, W.M., Hummel, S. and Herrmann, B. 2000. STR-genotyping of archaeological human
bone: experimental design to improve reproducibility by optimisation of DNA extraction.
Anthropol Anz. 58:29-35.
Schumm, J.W. y col., 1996. Automated Fluorescent Detection of STR Multiplexes-
28
Development of Geneprint PowerPlex and FFFL Multiplexes for forensic and paternity
Applications, In: Proceedings from the Seventh International Symposium on Human
Identification 1996, Promega Corporation, 70.
The UTAH Marker Development Group. 1995. A collection of ordered tetranucleotide-repeat
markers from the human genome. Am. J. Hum. Genet. 57:619.
Wallace, D.C. 1994. Mitochondrial DNA sequence variation in human evolution and disease.
Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 91:8739-8746.
Waye, J.S. and Fourney, R.M. 1990. Identification of complex DNA polymorphism based on
variable number of tandem repeats (VNTR) and restriction site polymorphism. Hum.
Genet. 84:223-227.
Wong, Z., Wilson, V., Patel, I., Povey, S. and Jeffreys, A.J. 1987.Characterization of a panel of
highly variable minisatellites cloned from human DNA. Ann. Hum. Genet. 269:288.
29
CROMOSOMA
TAMAO
(pb)
VARIACIN DE SECUENCIA: PCR/HIBRIDACIN
DQA1
6
239 - 242
LDLR
19
214
GYPA
4
190
HBGG
11
172
D7S8
7
151
GC
4
138
MICROSATLITES: PCR/ELECTROFORESIS
LPL
8p22
105 - 133
VWA
12p12-pter
139 - 167
F13A01
1q31-q32.1
169 - 185
TH01
11p15.5
179 - 203
FESFPS
15q25-qter
222 - 250
TPOX
2p23-2pter
224 - 252
HPRTB
Xq26
259 - 303
F13B
6P24-25
283 - 331
CSF1PO
5q33.3-34
299 - 323
D3S1358
3p
114 - 142
D5S818
5q22-31
135 -171
D13S317
13q22-q31
165-197
D7S820
7q11.21 -22
215 -247
D16S539
16q24-qter
264 - 304
FGA
4p28
219 - 267
MINISATLITES: SOUTHERN BLOT/PCR
D1S80
1p
369 - 801
APOB
2p24-p23
560-1070
YNZ22
17p 13.3
1100-2000
COL2A1
12q13.1
615-800
MS43A
12q24.3qter
3000-25000
G3
7q36-qter
1600-17700
MS1
1p33-p35
1600-45400
MS31
7p22-pter
600-20700
PH30
4q
1900-21900
D14S13
14
4500-22000
No. DE
ALELOS
GENOTIPOS
DIFERENTES
6
2
2
3
2
3
21
3
3
6
3
6
7
8
5
7
8
8
12
12
9
7
9
9
9
9
12
28
36
15
28
36
36
78
78
45
28
45
45
45
45
78
27
18
>10
>10
>100
>100
>100
>100
>100
>100
378
171
>55
>55
>5000
>5000
>5000
>5000
>5000
>5000
30
ALELOS
HISPANOS EN USAa
MESTIZOS EN MEXICOb
A
0.48
0.48
B
0.52
0.52
GYPA
A
0.61
0.62
B
0.39
0.38
A
0.39
0.36
HBGG
B
0.56
0.63
Cc
0.05
0.01
D7S8
A
0.66
0.63
B
0.34
0.37
GC
A
0.20
0.23
B
0.36
0.30
C
0.44
0.47
1.1
0.09
0.06
DQA1
1.2
0.09
0.1
1.3
0.04
0.1
2
0.08
0.07
3
0.30
0.38
c
4
0.41
0.31
a. Tomado del manual del kit Amplitype PM/DQA1 de Perkin-Elmer (n=200)
b. n = 160
c. p < 0.05, chi cuadrada.
31
32
ALELOSb (pb)
FRECUENCIA ALLICA
PCAa
10301
0.07
0.00079
8001
0.06
(1 en 1265)
20213
0.05
16888
0.05
14109
0.O4
G3
8602
0.05
0.00044
6557
0.04
(1 en 2272)
5674
0.04
16888
0.03
9849
0.03
MS1
12330
0.02
0.000071
6474
0.02
(1 en 14084)
14109
0.02
11497
0.02
9898
0.02
pH30
6241
0.039
0.00033
8798
0.031
(1 en 3030)
6381
0.023
5881
0.023
4202
0.023
MS31
6799
0.054
0.00064
6677
0.05
(1 en 1562)
8602
0.04
7442
0.035
8296
0.025
D14S13
8296
0.043
0.00079
17142
0.032
265)
8147
0.032
6479
0.032
6402
0.032
a. PCA (Probabilidad de coincidencia al azar) media = q2 (2 - q), donde q es
la frecuencia allica media. La PCA global con los 6 marcadores fue de 4.1 x 10-21.
b. Se muestran los 5 alelos ms frecuentes en la poblacin mestiza mexicana.
33
MAZAHUAS
LOCUS
Mnima
Media
Mxima
Mnima
Media
Mxima
D3S1358
Vwa
FGA
TH01
TPOX
CSF1PO
D5S818
D13S317
D7S820
PCAcombinada
0.0001
0.0001
0.0001
0.0001
0.0001
0.0001
0.0001
0.0025
0.0001
2.3x10-37
0.03
0.03
0.01
0.05
0.03
0.04
0.04
0.03
0.04
5.6x10-17
0.24
0.21
0.05
0.19
0.23
0.21
0.25
0.09
0.19
1.3x10-8
0.0001
0.0001
0.0001
0.0001
0.0016
0.0001
0.0001
0.0016
0.0009
2.3x10-37
0.07
0.05
0.01
0.05
0.05
0.04
0.05
0.03
0.04
2.1x10-15
0.34
0.30
0.06
0.30
0.16
0.22
0.20
0.10
0.11
1.8x10-8
34
MADRE
HIJO
PADRE SUPUESTO
LDLR
A,B
A,A
A,A
GYPA
A,B
A,B
A,B
HBGG
A,A
A,B
B,B
D7S8
A,B
A,A
A,B
GC
A,B
B,C
B,C
DQA1
3,4
3,3
3,3
D1S80
31,30
18,31
18,18
LPL
10,13
11,13
10,10
vWA
16,17
15,16
16,19
TH01
7,8
7,11
9,10
FESFPS 10,12
10,10
11,12
F13B
9,10
10,10
8,9
Los alelos que coinciden entre el hijo y el padre supuesto estn en negritas
y subrayados.
35
PIES DE FIGURAS
Fig. 1. Esquema de los tipos y mtodos de deteccin de los marcadores genticos para
identificar individuos. Para cada mtodo se comparan dos individuos diferentes. Para los
minisatlites, se muestra el locus MS1 con 4 alelos diferentes (los cuales varan en el nmero
de repeticiones en tndem). Los alelos se detectan con la tcnica de Southern blot utilizando
una enzima de restriccin (ER) que corte en sitios fijos por fuera de la regin variable. Para los
marcadores de variacin de secuencia se muestra el locus LDLR con 2 alelos (A y B; los
cuales varan slo en una base). Los alelos se amplifican primero con el mtodo de PCR
utilizando oligonucletidos biotinilados (flechas) y luego se identifican por hibridacin en punto
reversa, utilizando la banda amplificada como sonda y oligonucletidos con la secuencia
especfica unidos al filtro, como blancos. Para los microsatlites se muestra un locus
dinucletido (AT/TA) con 4 alelos (5, 7, 9 y 12; los cuales varan en el nmero de repeticiones
del dinucletido AT/TA). Los alelos se amplifican primero con la PCR utilizando oligonucletidos
especficos (flechas) y luego se identifican mediante una electroforesis en un gel de
poliacrilamida revelado con una tincin de plata.
36
Captulo 17
Clulas Madre (Stem Cells), la nueva revolucin de la Biomedicina
Leonel Barraza Pacheco1 y Guillermo Bojrquez Rangel2.
1
2.
Email: lbarraza@uacj.mx
PALABRAS CLAVE: Clulas madre, stem cells, transplantes.
NDICE
1. Introduccin.
2. Objetivos del captulo.
3. Antecedentes: el hallazgo.
4. Las expectativas tericas.
5. Los avances reales.
6. La naciente industria.
7. Las implicaciones.
7.1 Implicaciones socioeconmicas.
7.2 Implicaciones ticas.
7.3 Implicaciones religiosas.
7.4 Implicaciones legales.
8. Conclusiones.
Abreviaturas
Bibliografa.
2
1. INTRODUCCIN
Una nueva tecnologa de la biomedicina, llena de grandes promesas para tratar
muchas enfermedades, ha aparecido en la frontera del conocimiento cientfico.
Enfermedades reconocidas hasta hace apenas unos aos como irreversibles o
incurables como el cncer, las enfermedades cardiovasculares y renales, la cirrosis
heptica, las leucemias, la osteoporosis, la diabetes, la enfermedad de Alzheimer y de
Parkinson, y muchas otras ms, presumiblemente pueden ser curadas con esta nueva
revolucin biolgica basada en las llamadas Clulas Madre (Stem cells).
Estas clulas pueden dividirse y permanecer indiferenciadas indefinidamente,
por lo que algunos las califican como clulas eternas, y pueden ser inducidas para
diferenciarse y convertirse en casi cualquier tipo de tejido. El desarrollo de la
biotecnologa para lograr manipular a estas clulas tena ya varios aos de afanosa
dedicacin por varios grupos cientficos del mundo. La idea generalizada entre estos
grupos, de obtener clulas lo ms verstiles posibles para el desarrollo de diferentes
cultivos celulares, les llev a profundizar en el conocimiento de la manipulacin
gentica y mecnica de las clulas pluripotenciales del embrin durante las primeras
fases de su desarrollo. Finalmente, la interaccin multidisciplinaria de investigadores
coincidentes con la bioingeniera de tejidos produjo, en la ltima dcada, las tcnicas
que influyeron grandemente en el hallazgo de estas clulas madre.
Con las clulas madre, todo ser vivo construye sus rganos durante su
desarrollo o los repara cuando son daados. Se sabe que un buen nmero de
3
estas clulas permanecen viables en las primeras etapas del recin nacido, luego
tienden a disminuir en el adulto. Por ello, resulta de gran trascendencia el que ahora se
puedan cultivar y mantener indiferenciadas in vitro de manera permanente y que luego
puedan ser inducidas a voluntad para reproducir algn tejido especfico. Estas son las
clulas madre de mltiples aplicaciones para mltiples males.
Las clulas maestras que todo ser vivo posee y usa desde su fase embrionaria
hasta su fase adulta, han representado un enigma para los cientficos, pues en ellas
reside la capacidad del rejuvenecimiento de los tejidos. Con esta nueva tecnologa de
las clulas madre, lo que est por venir en estos albores del nuevo milenio ser muy
distinto de lo que hemos conocido; veremos algo verdaderamente revolucionario en la
biomedicina del nuevo milenio (Fig.1).
4
diferencias de criterio y uso entre los distintos pases y muy pronto Mxico deber estar
adoptando su propia postura. Para esto, se requiere que los diferentes grupos y
sectores fortalezcan su conocimiento sobres estos aspectos. Los actuales debates
mundiales se centran en aspectos ticos y cientficos, y esta tecnologa tarde o
temprano influir en muchas de las decisiones teraputicas de nuestros sectores
mdicos nos guste o no. Es por ello importante dar a conocer los aspectos ms
sobresalientes de estos nuevos descubrimientos a la sociedad y comunidad cientfica
de Mxico. El propsito de los autores es contribuir con literatura en espaol sobre este
acalorado tema que es hoy, junto con el tema de la clonacion, el ms candente de la
biomedicina en la comunidad cientfica mundial.
3. ANTECEDENTES: EL HALLAZGO
5
El logro de Thompson consisti en haber logrado la captura de las clulas en su estado
indiferenciado y conservarlas in vitro en cultivos sucesivos (Thomson y col., 1998) (Fig.
2).
A partir de ah, el mundo desarrollado de la medicina y la biologa se inici en la
carrera por buscar maneras de hacer que estas clulas se convirtieran en tipos
especficos que les permitieran una fuente ilimitada de clulas para transplantes,
ensayos tisulares y muchos otros aspectos de la medicina y la biologa. Este
movimiento biomdico tambin recibi un enorme impulso y expansin cuando en
Baltimore en 1998, John D. Gearhart report que las clulas madre podan obtenerse a
partir de tejidos de adultos (Gearhart, 1998; Solter y Gearhart, 1999). As, el nuevo
milenio llega con un impresionante ejrcito de cientficos en busca del tejido donador
universal (Fig. 3).
Desde hace mucho tiempo se sabe que un ser vivo inicia su desarrollo cuando
un espermatozoide y un vulo se unen para formar un cigoto. Este cigoto es una clula
que tiene la capacidad de generar un organismo completo, y debido a esto se dice que
es una clula totipotencial. Durante las primeras etapas de desarrollo, el cigoto entra
en una serie de divisiones continuas llamadas segmentacin, que generan nuevas
clulas totipotenciales. Es decir, estas clulas al ser separadas generan un organismo
completo. Al cabo de ciertas divisiones se formar una estructura llamada blastocisto
que finalmente se implanta en el tero. El blastocisto es una estructura formada por
una capa de clulas externas que, eventualmente darn lugar a la placenta, y por una
masa de clulas internas. Esta masa de clulas depende de la externa para sobrevivir
6
pues, si se quita, las clulas internas no podran sobrevivir en el tero. Entonces se
dice que estas clulas son pluripotenciales, lo cual significa que pueden generar
muchos tipos de clulas, pero no las necesarias para la sobrevivencia fetal. Estas
clulas pluripotenciales posteriormente se dividen y generan clulas capaces de formar
tejidos especiales. Por ejemplo, clulas precursoras de la sangre, de la piel y de otros
tejidos. Estas ltimas reciben el nombre de clulas multipotenciales.
En resumen, las clulas totipotenciales pueden generar un organismo completo,
las pluripotenciales pueden formar un nmero considerable de clulas especializadas y
por lo tanto, tejidos y rganos, pero no son suficientes para conseguir un desarrollo
fetal, mientras que las clulas multipotenciales slo pueden formar un nmero reducido
de clulas generalmente relacionadas entre ellas.
Cada tipo celular descrito, en su contexto, ha sido denominado clulas madre,
progenitoras o troncales, respectivamente, y se caracterizan por ser clulas
indiferenciadas que se pueden dividir de manera indefinida y que eventualmente darn
lugar a clulas especializadas.
Mucho tiempo atrs se saba de la generacin de diferentes clulas sanguneas
(leucocitos, eritrocitos y plaquetas) a partir de clulas precursoras o clulas madres
multipotenciales. Muy recientemente, algunos grupos de investigadores han logrado
obtener clulas madre totipotenciales (obtenidas de embriones en etapas iniciales) y
clulas madres pluripotenciales obtenidas de blastocistos. Este hecho ha abierto toda
una gama de posibilidades para el tratamiento de mltiples padecimientos humanos
con base en la terapia celular con clulas madre (Fig. 4).
7
4. LAS EXPECTATIVAS TERICAS
Aunque todo parece indicar que la reparacin y renovacin de los tejidos y rganos
estn a la vuelta de la esquina, a medida que se avanza en este conocimiento, surgen
nuevos conceptos, ideas, y cuestionamientos. Desde el descubrimiento de las clulas
madre, muchas expectativas cientficas han emergido. En dos aos, desde 1998 en
que fueron reportadas por primera vez, hasta mayo del 2000, slo en Internet se
encontraron ms de 1,500 referencias cientficas relacionadas con ellas, la mayora
referidas a intentos de identificar su comportamiento en animales o bajo diferentes
condiciones de laboratorio, con la perspectiva de aplicarlas ms tarde en humanos. De
ese acervo bibliogrfico se pueden desprender las siguientes expectativas tericas:
i)
Se podrn reponer amplias reas de la piel; porque sta, al igual que otros
rganos, mantiene clulas madre en el estroma celular que le permite producir
progenies que tienden a reproducir una clula destinada a la diferenciacin y
otra a permanecer indiferenciada (Slack, 2000).
ii)
8
iii)
iv)
v)
9
vi)
A pesar de lo promisorio de los hallazgos, los cientficos consideran que todava falta el
arribo de una joven generacin de expertos mundiales que habrn de dedicar una parte
de sus vidas al avance de esta rea de la ciencia. Se estima que hay que esperar
entre 8 y 10 aos para ver aplicaciones definitivas y exitosas en grandes sectores de la
poblacin. A la fecha, los avances reales son relativos, porque aunque se especula
mucho sobre el futuro, las clulas madre an no han salido del laboratorio debido a que
no se ha rebasado la etapa de diferenciacin.
La siguiente etapa debe ser de funcionalidad total de las clulas a las que se
incorporan y de funcionalidad total de los tejidos y rganos que deben reproducirse a
partir de ellas mismas. Los avances que mencionamos a continuacin son prcticas
mdicas que se han venido experimentando y que lograron consolidarse como tcnicas
especializadas con el avance de la gentica molecular. Por ejemplo, el trasplante de
clulas madre, bajo la tcnica de hemo-aferesis, ya es rutinariamente utilizado a altas
10
dosis como tratamiento quimioteraputico del cncer. Las tablas 1 y 2 son un resumen
de estas tcnicas.
Asmismo, a travs de la tcnica teraputica denominada hemo-aferesis o
plasma-aferesis, el uso de las clulas madre ya se indican para una serie de
desrdenes fisiolgicos y metablicos en el mundo de la clnica mdica.
Otra aplicacin donde la bioingeniera y la biologa celular se han enlazado, es la
terapia de las clulas encapsuladas, que utiliza pequeos tubitos con poros que
permiten el paso de nutrientes para que las clulas liberen los nutrientes o metabolitos
deseados en el paciente enfermo y aquellas se mantengan viables por mucho tiempo
(Lysaht y Aebischer, 1999).
6. LA NACIENTE INDUSTRIA
11
la industria mdica. Por una parte, la Universidad de Wisconsin en Madison reclama su
derecho a distribuir las clulas con propsitos acadmicos, pero tambin cre una
compaa separada y dirigida por el descubridor Thomson (Marshall, 2000). La
empresa Geron ha recibido ms de 100 solicitudes de clulas madre para la
investigacin, 12 de ellas de compaas privadas. Todas las compaas interesadas
debern alinearse cuando se aplique la legislacin que normar el uso de estas clulas
(Tabla 3).
7. LAS IMPLICACIONES
El hecho de que estas clulas sean derivadas de un embrin, el cual debe obtenerse y
destruirse para poder obtener las clulas madre, lo hace un tema muy sensible porque
mientras que la fuente de las clulas madre sea a partir de embriones de animales de
laboratorio, el problema es pequeo, pero si la fuente es humana, el problema se
agiganta pues muchos grupos provida y similares se han pronunciado en contra.
Seguramente veremos un debate mundial que durar varios aos entre los grupos provida, los abortistas y los grupos religiosos, sobre si las investigaciones de estas clulas
madre son necesarias o no. Una buena dosis de elementos socioeconmicos, ticos,
religiosos y legales se encuentran involucrados con esta nueva tecnologa.
12
con cifras abrumadoras que favorecen el avance de estas investigaciones. Un total de
128 millones de personas en los Estados Unidos podran beneficiarse del desarrollo de
investigaciones de las clulas madre. El costo en salud de la poblacin en los prximos
20 aos aumentar considerablemente pues se duplicar la poblacin de ms de 65
aos, y se cuadruplicar la de ms de 85 aos. La esperanza es que esta poblacin
pudiese mantenerse activa y a bajo costo de salud. La pregunta es si la investigacin
biomdica de estas clulas aportara alguna solucin sustantiva a esta carga. El
nmero de personas afectadas actualmente por diferentes enfermedades en los
Estados Unidos refleja la problemtica de salud que enfrentar la humanidad en las
prximas dcadas.
Aunque el debate sobre si los fondos federales deben aplicarse o no a esta
tecnologa durar un buen tiempo, los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados
Unidos ya han declarado su decisin de apoyar estas investigaciones. Es de esperarse
un aumento significativo en el inters mundial sobre las clulas madre dada la
influencia econmica de este pas sobre el resto del mundo.
En consecuencia, Mxico tendr el arribo de esta tecnologa tarde o temprano.
Por sus estadsticas, se puede apreciar que la situacin no es muy diferente a la de los
Estados Unidos, aunque los problemas de salud tambin reclaman atencin en el pas.
En la tabla 5 se muestran las principales causas de mortalidad en Mxico y se puede
percibir que un gran sector de la poblacin est urgentemente necesitada de algn tipo
de intervencin clnica donde esta tecnologa tendra una muy vasta aplicacin.
13
Desde el punto de vista tico, se cuestiona el origen y el destino de las clulas. Si las
clulas provienen de un animal de laboratorio, qu garanta se le ofrece al paciente de
complicaciones de largo plazo? qu aspectos deber contener un convenio para tratar
al paciente humano que se desea curar? Si las clulas provienen de un humano para
ser aplicados en otro ser humano, existen derechos inalienables sobre la propiedad de
las clulas que deben ser cuidadosamente regulados, aunque por otro lado, el
problema se minimizara si se usan las mismas clulas del paciente en tratamiento. En
el mes de noviembre de 1998, el entonces Presidente de los Estados Unidos, Bill
Clinton, encarg a la Comisin Nacional Asesora en Biotica (National Bioethics
Advisory Commission) la tarea de revisar con cuidado todos los aspectos relacionados
con la investigacin de las clulas madre. Solicit balancear todas las consideraciones
ticas y mdicas. El encargo fue en respuesta a tres reportes separados que le dieron
una visin del gran futuro cientfico de las clulas madre, pero que indicaron serias
controversias ticas si se comprometan fondos federales (NBAC, 1999). La comisin
pronostic un largo debate nacional sobre los embriones humanos y el uso de material
fetal cadavrico. Sin embargo, justific el financiamiento federal dado el mrito
cientfico del tema, pero no toc el tema de la destruccin de embriones. Varios
cientficos norteamericanos consideran que es inapropiado en estos momentos el uso
de fondos federales para estas investigaciones (Young, 2000). En Europa, la situacin
se ha tornado ms confusa, pues existe una pluralidad multicultural, multilingustica y
multirreligiosa que hace difcil el establecimiento de un estndar del valor tico o moral
14
sobre el embrin, lo cual ha generado que las normas y conceptos ticos varen en
cada pas europeo.
15
Desde el punto de vista religioso, las investigaciones de las clulas madre estn
encontrando una oposicin considerable. Son los grupos religiosos cristianos (catlicos
y protestantes) quienes ms se oponen al uso del embrin humano para obtener las
clulas madre. La crtica nace de la apreciacin de que se usa la sofisticacin
tecnolgica para seguir cometiendo los mismos crmenes de eras pasadas pues se
disputa la viabilidad de la vida y se cuestiona sobre el cmo justificar la destruccin de
la vida con el pretexto del avance cientfico segn comenta el Dr. Kevin Fitzgerald,
jesuita de la Escuela de Medicina de la Universidad de Loyola. A esto comenta el Dr.
Lori Andrews de la Escuela de Leyes del Colegio Chicago-Kent: siempre que tomas
una clula de un blastocisto, esa clula puede ser usada para crear un ser humano de
manera que algunos grupos piensan que, al hacerla trasplantable, has desviado el
rumbo para convertirlo en rin o algn otro tejido. Estas argumentaciones se estn
dando no slo en los Estados Unidos sino tambin en Europa (Tucker, 1998). Uno de
los problemas que se ven venir es que la tecnologa no sea tan promisoria en obtener
clulas madre de fuentes alternas de tejido y la investigacin se centre en el uso de
clulas provenientes de fetos abortados en las clnicas legales en busca de
histocompatibilidades. Esto lleva a preguntarse si el sesgo que tome la tecnologa de
las clulas madre en los prximos aos contribuir a elevar la produccin de abortos,
producto de una complicidad moral entre abortistas y biotecnlogos.
16
El hecho de que se puedan obtener tener clulas madre a partir de tejidos adultos ha
suavizado en algo los aspectos ticos y legales. Pero el problema reside en que las
clulas adultas tienden a tener ms errores genticos, causados por su normal
exposicin a la vida diaria, que las clulas embrionarias y tambin tienden a proliferar
menos. Adems, como no se ha logrado la diferenciacin en todos los tipos de tejidos a
partir de clulas adultas y como stas se localizan en muy bajas cantidades, sigue
existiendo un notable inters cientfico sobre las clulas embrionarias.
En 1994 en Estados Unidos se prohibi la produccin de embriones humanos
con fines exclusivamente de investigacin. El departamento de Salud y Servicios
Humanos interpret errneamente que esta disposicin no se aplicaba a las clulas
madre y, desde entonces, la presin social se centr en el debate de que cundo las
clulas madre se reproducen normalmente, producen los rganos del infante y que eso
debe protegerse. Por ello, la prohibicin se ampli para regular la investigacin de las
clulas madre. Sin embargo, el gobierno por otro lado, est financiando algunas
investigaciones en las que asume que no financia la destruccin del embrin. Esta
doble posicin est llevando a ciertos grupos a plantear el asunto al Congreso de la
Unin donde seguramente habr una larga lucha para proteger al infante en todos los
estadios de su vida. Otro problema es que las clulas de origen humano pueden alojar
fcilmente enfermedades peligrosas para el hombre. Esto ha hecho que la
Administracin Federal de drogas de los Estados Unidos (FDA) intervenga con muy
17
muy serias reglamentaciones. La bioingeniera de tejidos a partir de clulas madre ya
es una industria que continuamente rebasa estas reglas. Por ejemplo, la demanda para
reponer cartlago en la rodilla y la rapidez con que se suceden los adelantos en esta
rea ha rebasado a la FDA en su capacidad para dirimir a tiempo si la terapia es buena
o no. En estos momentos, la FDA dice que cualquier terapia a partir de clulas
humanas deber garantizar ciertas normas de seguridad de acuerdo con su nivel de
riesgo de infeccin, adems de probar, cuando sea necesario, su efectividad
teraputica.
8. CONCLUSIONES
18
Sin duda, la ciencia ha dado grandes beneficios a la humanidad, pero sin
filosofa la ciencia puede ser mal usada. Es importante pues, encontrar el terreno
filosfico apropiado y comn para todas las partes involucradas en la investigacin,
aplicacin, legislacin, etc., para presentar mejor el debate sobre las clulas madre.
Adems, todos los valores sociales debern ser ponderados cuidadosamente. Deber
darse paso a los resultados escuetos que vayan ms all del perodo de la
incertidumbre cientfica y arribar a adelantos definitivos que den resultados de
trascendencia. Esta nueva biotecnologa bien usada nos puede llevar a una sociedad
ms sana. La revolucin cientfica que influir en la biomedicina en este siglo, ya
empez. Es importante entonces reconocer la pluralidad social y buscar el respeto en
todos en los debates que se darn, pues finalmente los recursos que se dedicarn a
esta naciente tecnologa vendrn de la sociedad, ya sea por la va publica o la
privada.
ABREVIATURAS
NBAC
FDA
BIBLIOGRAFA
Alliance for Aging Research, 2021 K Street, NW, Suite 305, Washington, D.C. 2000,
USA.
19
Cromie, W. J. 1999. Nerve Cell Clones Repair Brain Damage. The Harvard University
Gazette.
Fontes, P. A. and Thomson, A.W. 1999. Stem Cell Technology, Where Are We Going?.
British Medical. 319:1308.
Gearhart, J.D. 1998. New Potential for Human Embrionic Stem Cells. Science
282:1061.
Gretchen, V. 2000. Can Old Cells Learn New Tricks? Science 287:1418-1419. INEGI,
Secretaria de Salubridad y Asistencia / Direccin General de Estadstica, Mxico
1998, modificado.
Klug, M. G., Soonpaa, M.H., Kho, G.Y. and Field, L.J. 1996. Genetically Selected
Cardiomiocytes From Differetiating Embrionic Stem Cells Form Stable
Intracardiac Grafts. Clinical Investigation 98:1216-1224.
Ley General de Salud. Organos Tejidos y Clulas. Captulo 2, artculo 324. Mxico.
Lysaht, M.J. and Aebischer, P. 1999. Encapsulated Cells as Theraphy. Scientific
American 280:52-58.
Marshall, E. 2000. The Bussiness of Stem Cells. Science 287:1419-1421.
McKay, R., Studer, L. and Tabar, V. 1998. Transplantation of expanded mesencephalic
precursors leads to recovery in Parkinsonian rats. Nature Neuroscience 1:290295.
Menzo, H., Hoogerbrugge, P., Dinko, V. and Helmut, H.G. 1997. Retroviral Stem Cell
Gene Therapy. Journal of Cell Biology On Line. Stem Cells 15:162-179.
Mooney, D. J. and Mikos, A. G. 1999. Growing New Organs. Scientific American
280:38-43.
20
NBAC, Executive Summary. 1999. Ethical Issues in Human Stem Cell Research
Rockville, M.D. disponible en: http://bioethics.gov/cgi-bin/bioeth-counter.pl.
NIH. Stem Cell Information, 2000. Stem Cells, A Primer. USA National Institutes of
Health, The Directors Web Page,. Disponible en:
http://nccam.nih.gov/nccam/an/message/.
Pedersen, R.A. 1999. Embrionic Stem Cells for Medicine. Scientific American 280:4449.
Perry, D. 2000. Patients Voices: The Powerful Sound in the Stem Cell Debate.Science
287:1423.
Pittenger, M.F. 1999. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells.
Science 284:143-147.
Shapiro, A.M.J., Lakey, J.R.T., Ryan, E.A., Korbutt, G.S., Toth, E., Warnock, G.L.,
Kneteman, N.M. and Rajotte, R.V. 2000. Islet Transplantation in Seven Patients
with type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-free Immunosuppresive
Regimen. Released before its publication date on June 6, 2000 at:
http://www.nejm.org/content/shapiro/1.asp, New England J. Med.
Slack, J.M. 2000. Stem Cells in Epithelial Tissues. Science 287:1431.
Solter, D. and Gearhart, J.D. 1999. Putting Stem Cells to Work. Science 283:14681470.
Stem Cell Sciences, Inc . Oncology / Hematology practice of Nicholas Ciobanu and
Associates.
21
Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J.,
Marshall, V.S. and Jones, J.M. 1998. Embrionic Stem Cells Lines Derived From
Human Blastocysts. Science 282:1145-1147.
Tucker, K. 1998. Scientists isolate embrionic Stem Cells. The World Socialist Web Site,
published by The international Committee of the fourth International (ICFI).
Disponible en: http://www.wsws.org.
Young, F.E. 2000. A Time for Restraint. Science 287:1424.
22
Tabla 1. Tcnicas de transplantes de celulas madre ya consolidadas en la
prctica mdica.
TIPO DE TRANSPLANTE
ENFERMEDAD
AUTOLGO
ALOGNICO
SIMILAR,NOPARENTAL
X
23
Trombocitoaferesis
Plasmaaferesis
ENFERMEDAD
Leucemia linfoctica crnica
Leucemia mieloctica crnica
Trombocitopenia de plaquetas
X
excesivas
Trombocitopenia prpura inmune
X
Paraproteinemia
X
Vasculitis
X
Myastenia gravis Poliomyositis
X
Dermatomyositis Sndrome de BarrX
Guillain
Sndrome de Goodpasture
X
Lupus nefrtico
X
Glomerulonefritis
X
Rechazo a trasplante renal
X
Crioglobulinemia
X
Hipercolesterolemia
X
Fuente: Oncology / Hematology practice of Nicholas Ciobanu and Associates. Stem
Cell Sciences, Inc (Web Page: Disease Indications for Stem Cells Transplantation.
2000. http//:www. Stem-Cell.com/table.html).
24
Ciudad
Ann Arbor, MI
Menlo Park, CA
Atherton, CA
Bethesda, MD
Malvern, PA
Irvine, CA
Baltimore, MD
London, UK
Melbourne,
Australia
StemCells Inc.
Sunnyvale, CA
Fuente: Marshall, 2000.
Empleados
33
Especialidad
Clulas hematopoyticas
100
25
14
10
120
75
17
---
16
25
Condicin
Enf. Cardiovasculares
58
Enf. Autoinmunes
30
Diabetes
16
Cancer
8.2
Enf. Alzheimers
4
Enf. Parkinson
1.5
Quemaduras severas
0.3
Lesiones de columna
0.25
Defectos de nacimiento
0.015
TOTAL
128.4
Fuente: Patients Voices: The powerful sound in the Stem Cells Debate.
Revista Science, Vol 287, No 5457 February 2000, p 1423
26
Tabla 5. Indices de mortalidad por enfermedades que requieren investigacion
aplicada con clulas madre en Mxico.
Lugar
Enfermedad
Primera
Enfermedades cardacas (Corazn)
71.8
Primera
Enfermedades cardacas (Isqumicas)
44.9
Segunda
Tumores Malignos
54.1
Tercera
Diabetes Mellitus
38.8
Quinta
Enfermedades Cerebrovasculares
26.1
Sexta
Cirrosis y enferm. Cronicas del higado
24.1
Dcima
Nefritis, sindrome nefrtico y nefrosis
10.8
Dieciseisava Anemias
4.1
Fuente: Mxico, INEGI, Secretaria de Salubridad y Asistencia / Direccin General de
Estadstica, 1998, modificado.
27
PIES DE FIGURAS