INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA

“José María Morelos y Pavón”

DIVISIÓN DE ESTUDIOS PROFESIONALES

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y
BIOQUÍMICA
INGENIERÍA BIOQUÍMICA

BIOLOGÍA MOLECULAR

“GENÓMICA”

PRESENTA(n):
Guillen Ojeda María Fernanda
Ochoa Ruiz Salvador
Salgado Cortes Brenda Monserrat
Vargas Ramírez Sofía Alejandra
Venegas Cornejo Mónica

PROFESOR:
Conteras Cornejo Humberto

Morelia, Michoacán. Diciembre, 2020

I. ¿Qué es la genómica?

El término Genómica hace referencia a la parte de la genética que trata de la disección molecular
del genoma de los organismos; es decir, el conocimiento total de la secuencia de bases nitrogenadas
de su ADN.

El desarrollo espectacular de la genómica se inició en 1995 con el desciframiento de la secuencia

total de los genomas de organismos sencillos, como son las bacterias, para continuar con
organismos más complejos, para terminar con el proyecto Genoma Humano (PGH) como máxima
expresión de la genómica. (Mattei, 2002)

II. Estructura y función del genoma

Se llama genoma al conjunto de todo el ADN de una célula de una especie y los genes que éste
contiene. En sentido estricto, el genoma humano no sólo comprende al ADN del núcleo sino
también al de las mitocondrias que, aunque sólo tiene 16.000 bases de longitud, es esencial para
el funcionamiento celular. (Kornblihtt, 2017). Los genes son segmentos de ADN capaces de ser
transcriptos (copiados) a una molécula de ARN (ácido ribonucleico) con igual secuencia que el
gen. Los genes no se encuentran yuxtapuestos a lo largo de los cromosomas, sino más bien
esparcidos y separados a grandes distancias por secuencias de ADN intergénicas. (Kornblihtt,
2017)

Por su parte los cromosomas son estructuras con apariencia de hilo ubicadas dentro del núcleo de
las células de animales y plantas. Cada cromosoma está compuesto de proteínas combinadas con
una sola molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN). Cada cromosoma tiene muchos genes, y
la posición que ocupa cada gen a lo largo del cromosoma se denomina locus (del latín, lugar).
(Silva, 2011)

El genoma está constituido por una o más moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN), un tipo
de ácido nucleico, el cual es un polímero de compuestos químicos denominados nucleótidos, que
están constituidos por una base nitrogenada, un azúcar pentosa, y de uno a tres grupos fosfato.
Existen dos tipos de nucleótidos de acuerdo con la base nitrogenada que se incorpora a la molécula:
1) Purinas: adenina (A) y guanina (G); y 2) Pirimidinas: citosina (C), timina (T), y uracilo (U).
Este último, el uracilo, sólo está presente en otro ácido nucleico, estructural y funcionalmente
distinto al ADN, conocido como ácido ribonucleico (ARN).

En la estructura del ADN, los nucleótidos se unen covalentemente por enlaces fosfodiéster
formando dos cadenas independientes, las cuales interaccionan entre sí, a través de puentes de
hidrógeno entre pares de bases nitrogenadas, siempre dos entre A y T, y tres entre C y G. Lo
anterior origina que la secuencia de cada cadena sea inversa y complementaria a la otra, y da lugar
a la estructura de doble hélice característica del ADN. El genoma contiene secuencias discretas
con la información necesaria para generar moléculas con función biológica a las que denominamos
genes, y en el caso del humano, el genoma está organizado en el núcleo en un conjunto de 23 pares
de cromosomas. (Silva, 2011)
III. Replicación y mecanismos de reparación

La replicación del ADN es el proceso mediante el cual se duplica una molécula de ADN. Cuando
una célula se divide, en primer lugar, debe duplicar su genoma para que cada célula hija contenga
un juego completo de cromosomas.

Ilustración 1 Replicación de la cadena de ADN.

“La replicación del ADN es probablemente uno de los trucos más impresionantes que hace el
ADN. Si lo piensas bien, cada célula contiene todo el ADN que necesita para fabricar las demás
células. De hecho, empezamos siendo una sola célula y terminamos con billones de células. Y
durante ese proceso de división celular, toda la información de una célula tiene que ser copiada; y
tiene que ser copiada a la perfección. Por tanto, el ADN es una molécula que puede ser replicada
para hacer copias casi perfectas de sí misma. Y eso es sorprendente teniendo en cuenta que hay
casi tres mil millones de pares de bases de ADN para ser copiadas. La replicación del ADN utiliza
polimerasas, que son moléculas dedicadas específicamente sólo a copiar ADN. Replicar todo el
ADN de una sola célula humana lleva varias horas, y al final de este proceso, una vez que el ADN
se ha replicado, en realidad la célula tiene el doble de la cantidad de ADN que necesita. Entonces
la célula se puede dividir y depositar la mitad de este ADN en la célula hija, de manera que la
célula hija y la original sean en muchos casos absolutamente idénticas genéticamente.” (Lawrence
C. Brody, Ph.D.)

Una vez que se comprobó que el ADN era el material hereditario y se descifró su estructura, lo
que quedaba era determinar cómo el ADN copiaba su información y como la misma se expresaba
en el fenotipo. Matthew Meselson y Franklin W. Stahl diseñaron el experimento para determinar
el método de la replicación del ADN. Tres modelos de replicación era plausibles.

1. Replicación conservativa: durante la cual se produciría un ADN completamente nuevo

durante la replicación.

Ilustración 2 Replicación conservativa.

2. Replicación semiconservativa se originan dos moléculas de ADN, cada una de ellas
compuesta de una hebra del ADN original y de una hebra complementaria nueva. En otras
 palabras, el ADN se forma de una hebra vieja y otra nueva. Es decir que las hebras
existentes sirven de molde complementario a las nuevas.

Ilustración 3 Replicación semiconservativa.

3. La replicación dispersiva implicaría la ruptura de las hebras de origen durante la

replicación que, de alguna manera se reordenaron en una molécula con una mezcla de
fragmentos nuevos y viejos en cada hebra de ADN.

Ilustración 4 Replicación dispersiva

Experimento Meselson-Stahl

El experimento de Meselson-Stahl consiste en cultivar la bacteria Escherichia coli en un medio

que contenga nitrógeno pesado (15Nitrógeno que es más pesado que el isótopo más común: el 14
Nitrógeno). La primera generación de bacterias se hizo crecer en un medio que únicamente
contenía 15 Nitrógeno como fuente de N. La bacteria se transfirió luego a un medio con 14N.

Watson y Crick habían pronosticado que la replicación del ADN es semiconservativa, de ser así el
ADN extraído de las bacterias luego de cultivarlas por una generación en 14N tendría un peso
intermedio entre el ADN extraído del medio con 15N y el del extraído de medio con 14N y así fue.
Los detalles del experimento que incluye un proceso de ultracentrifugación en cloruro de Cesio
(CeCl2) puede encontrarse en el Curtis.

La replicación del ADN, que ocurre una sola vez en cada generación celular, necesita de muchos
"ladrillos", enzimas, y una gran cantidad de energía en forma de ATP (recuerde que luego de la
fase S del ciclo celular las células pasan a una fase G a fin de, entre otras cosas, recuperar energía
para la siguiente fase de la división celular). La replicación del ADN en el ser humano a una
velocidad de 50 nucleótidos por segundo, en procariotas a 500/segundo. Los nucleótidos tienen
que ser armados y estar disponibles en el núcleo conjuntamente con la energía para unirlos.
La iniciación de la replicación siempre acontece en un cierto grupo de nucleótidos, el origen de la
replicación, requiere entre otras de las enzimas helicasas para romper los puentes hidrógeno y las
topoisomerasas para aliviar la tensión y de las proteínas de unión a cadena simple para mantener
separadas las cadenas abiertas.

Ilustración 5 Representación de la replicación del ADN, donde se muestran las enzimas y componentes involucrados.

Una vez que se abre la molécula, se forma un área conocida como "burbuja de replicación" en ella
se encuentran las "horquillas de replicación". Por acción de la ADN polimerasa los nuevos
nucleótidos entran en la horquilla y se enlazan con el nucleótido correspondiente de la cadena de
origen (A con T, C con G). Los procariotas abren una sola burbuja de replicación, mientras que
los eucariotas múltiples. El ADN se replica en toda su longitud por la confluencia de las "burbujas".

Dado que las cadenas del ADN son antiparalelas, y que la replicación procede solo en la dirección
5' to 3' en ambas cadenas, numerosos experimentos mostraron que, una cadena formará una copia
continua, mientras que en la otra se formarán una serie de fragmentos cortos conocidos como
fragmentos de Okazaki. La cadena que se sintetiza de manera continua se conoce como cadena
adelantada y, la que se sintetiza en fragmentos, cadena atrasada.

Para que trabaje la ADN polimerasa es necesario la presencia, en el inicio de cada nuevo
fragmento, de pequeñas unidades de ARN conocidas como cebadores, a posteriori, cuando la
polimerasa toca el extremo 5' de un cebador, se activan otras enzimas, que remueven los
fragmentos de ARN, colocan nucleótidos de ADN en su lugar y, una ADN ligasa los une a la
cadena en crecimiento (Raisman, 2013).

IV. Daño y reparación del ADN

En las células existen diferentes maneras de reparar el ADN, dependiendo del tipo de daño y de
los componentes que se encuentren cercanos o sean más asequibles. De manera general, a los
procesos encargados de resguardar la integridad del ADN se les denomina mecanismos de
reparación; éstos se pueden agrupar en aquellos que actúan cuando existe algún daño en una sola
cadena y aquellos que participan cuando se dañan ambas cadenas. Mientras que algunas lesiones
se reparan de forma directa, la gran mayoría se repara tras una serie eventos en los que participan
múltiples proteínas. Así, las vías más importantes para reparar los daños en una sola cadena del
ADN son la reparación por escisión de bases (BER), la reparación por escisión de nucleótidos
(NER) y la reparación por mal apareamiento de las bases (MMR); mientras que la reparación por
unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la reparación por recombinación homóloga (HR) son
más comunes para los daños en ambas cadenas.
 • Reparación directa
La reparación directa es realizada por la acción de una única enzima capaz de reparar la lesión, sin
necesidad de sustituir la base dañada. Así, la estructura original de la molécula del ADN revierte
la lesión. Existen tres mecanismos en la reparación directa: Fotorreactivación, alquiltransferencia
y desmetilación oxidativa.

1. Fotorreactivación
La radiación UV (longitud de onda entre 250 y 320 nm), puede
ocasionar alteraciones químicas en las bases del ADN. Los
fotoproductos de estas reacciones originan los dímeros de
pirimidinas ciclobutano (CPD), pirimidina (6,4) y pirimidonina
(6,4 PP) que causan efectos deletéreos como la inhibición de la
replicación y de la transcripción, el aumento en la aparición de
mutaciones, la detención del ciclo celular y la muerte celular. Los
efectos mutagénicos generados por la radiación UV son invertidos
por un proceso llamado fotorreactivación, catalizado por una
fotoliasa, que posee dos cromóforos que captan un fotón, cuya
energía es utilizada para revertir el dímero, es decir quiebra el
enlace covalente entre las pirimidinas reparando el daño en el
Ilustración 6 Reparación de ADN
ADN. por fotorreactivación.

Las fotoliasas han sido encontradas en bacterias, hongos, plantas y vertebrados, excepto en
mamíferos placentarios. El genoma humano tiene dos genes CRY (genes que codifican para la
proteína cryptochroma) homólogos a las fotoliasas, los cuales codifican fotorreceptores de luz en
la regulación del ritmo circadiano, pero no en la fotorreactivación de daños al DNA.

2. Alquiltransferencia.
Este mecanismo es reconocido por la
remoción de aductos alquilo en las bases del
ADN. Generalmente estos grupos son
incorporados al ADN como agentes químicos
alquilantes (compuestos electrofílicos
altamente reactivos con afinidad por centros
nucleofílicos en macromoléculas orgánicas)
como el metil-metano-sulfonato (MMS) o
enzimáticos (metilasas).
Una de las alteraciones más conocidas en el
ADN es la metilación de restos de guanina
para formar O6 -metilguanina para lo cual la Ilustración 7 Reparación directa del ADN por alquiltransferencia
célula utiliza enzimas “suicidas” llamadas alquitransferasas, que desplazan el grupo metilo desde
la guanina al centro activo de la cisteína, llevando a la inactivación irreversible de la proteína O6
-metilguanina-ADN metiltransferasa (MGMT).

3. Desmetilación oxidativa
Este tipo de reparación remueve daños por metilaciones en el ADN que pueden ser citotóxicas y
con frecuencia presentan acción mutagénica, causada por compuestos nocivos que se producen de
forma endógena como estrés oxidativo, inflamación, peroxidación de lípidos, infecciones y otros
procesos metabólicos naturales como la alteración del microbiota intestinal.
Todos los organismos tienen múltiples estrategias de reparación para contrarrestar daños al ADN,
como por ejemplo las alquilaciones, esta respuesta ha sido ampliamente estudiada en E. coli,
específicamente la proteína AlkB, la cual se encarga de desmetilar oxidativamente las bases
lesionadas, revertiéndolas para adenina y citosina respectivamente, liberando el grupo metilo en
formaldehído. Esta forma de reparación ha sido conservada desde las bacterias hasta el hombre,
en el que han sido identificados homólogos de AlkB, como ABH1, ABH2 y ABH3.

• Reparación indirecta.
Los sistemas de reparación indirecta son aquellos que intervienen sobre el ADN, durante la
replicación (fase S del ciclo celular), transcripción o sobre hebras de ADN fragmentadas. La ADN
polimerasa y algunos de los componentes moleculares del mecanismo de replicación, llevan a cabo
la supervisión de la copia recién sintetizada. Puesto que el ADN se replica de una forma semi-
conservativa, cada hebra de esta molécula genera una nueva, lo cual permite que los errores
introducidos durante la replicación puedan ser corregidos por los mecanismos de reparación por
escisión de la lesión.

Por lo tanto, si los nucleótidos en una hebra presentan un daño, pueden ser eliminados utilizando
como molde a la cadena complementaria para la síntesis de la reparación. Existen tres mecanismos
en la reparación indirecta: reparación por escisión de bases o BER (Base Excision Repair),
reparación por escisión de nucleótidos o NER (Nucleotide Excision Repair) y reparación por
apareamiento erróneo (Mitsmach Repair). El principio de los tres mecanismos de reparación
implica: corte, empalme de la región dañada e inserción de nuevas bases, seguido por la ligación
de la cadena.

1. Reparación por escisión de bases.

La reparación por escisión de bases (BER) es el mecanismo responsable de eliminar los
nucleótidos dañados en el ADN que podrían causar mutaciones por un mal apareamiento, o bien
por la ruptura del ADN durante su replicación. Este proceso involucra a un grupo de enzimas
conocidas como ADN glicosilasas, las cuales reconocen el daño y recortan la base dañada; también
participa otra enzima conocida como AP endonucleasa, que hace un segundo corte, pero ahora
entre los azúcares, para permitir que el nucleótido completo sea eliminado y posteriormente
sustituido. La sustitución puede ser de un único nucleótido o junto con otros aledaños (de 2 a 10
nucleótidos).

2. Reparación por escisión de nucleótidos

La reparación por escisión de nucleótidos (NER) es particularmente importante para remediar el
daño en el ADN que ocurre por la exposición a la radiación solar por un tiempo prolongado; una
hora bajo el sol intenso puede producir hasta 100 000 lesiones en el ADN por cada célula. No
obstante, esta no es la única fuente de daño, pues existen otros agentes que provocan fenómenos
similares.
Así, durante el proceso se produce una distorsión de la doble cadena del ADN, lo que ocasiona
problemas para expresar y replicar su información. Esta distorsión permite que un complejo
enzimático reconozca el daño y corte los azúcares que lo delimitan; una helicasa empuja esta
región lejos y una ADN polimerasa repara el hueco formado al agregar los nucleótidos faltantes;
finalmente, una ADN ligasa pega los extremos.

3. Reparación por mal apareamiento de las bases

La forma de doble hélice es consecuencia directa del apareamiento específico de las bases
nitrogenadas en los nucleótidos que forman el ADN; la adenina (A) se une a la timina (T) y la
citosina (C) se une a la guanina (G). Sin embargo, durante la replicación del ADN es posible que
se inserten bases que no corresponden, y por lo tanto ocurran errores; por ejemplo, una guanina se
aparea con una timina (G/T) o una adenina se une a una citosina (A/C). Así, la reparación por mal
apareamiento de las bases (MMR) es el sistema encargado de reconocer y arreglar este tipo de
errores, con el fin de evitar cambios (mutaciones) en el ARN y las proteínas codificadas.

Al igual que para el mecanismo anterior, resulta

necesaria la presencia de un complejo enzimático que
reconozca el daño en el ADN y al mismo tiempo
determine cuál de las dos cadenas se debe reparar y cuál
se usará como molde. Existe además un grupo de
proteínas que, sin ser centrales en el proceso de
reparación, colaboran para hacer más eficiente el
proceso. De manera general, el mecanismo detecta los
cambios en la estructura de la doble cadena del ADN y
recorta un fragmento de tamaño variable que deja en el
centro a la base mal apareada. Después, una enzima
denominada exonucleasa degrada el fragmento y
Ilustración 8 Mecanismos involucrados en la
permite que se vuelva a sintetizar, pero ahora de manera reparación de rupturas de una sola cadena.
adecuada, para que finalmente una ligasa selle los
extremos.

• Reparación de ambas cadenas del ADN

Un tipo especialmente peligroso de daño en el ADN ocurre cuando ambas cadenas se rompen y no
queda alguna que pueda servir como molde para la reparación; esto abre la posibilidad de que se
produzcan daños importantes para la célula; por ejemplo, que se pierda información.

1. Reparación por unión de extremos no homólogos

La unión de extremos no homólogos (NHEJ) es el mecanismo más simple para reparar este tipo
de daños: los extremos de las cadenas se colocan juntas y se pegan. Puede considerarse una manera
de reparación rápida, pero “sucia”, ya que no se asegura de que se restaure la secuencia o que los
extremos unidos realmente estuvieran cercanos antes del daño. Sin embargo, resulta vital para la
célula, pues el tiempo es una prioridad; además, este mecanismo puede actuar en cualquier
momento del ciclo celular.

Ilustración 9 Reparación por unión de

extremos no homólogos.
 2. Reparación por recombinación homóloga
Una forma más precisa de reparar las rupturas en
ambas cadenas del ADN es la recombinación
homóloga (HR). Los humanos y muchos otros seres
vivos poseemos dos copias de cada cromosoma; así,
este mecanismo utiliza la copia del ADN en el
cromosoma hermano como molde para reparar los
daños. En este proceso, un complejo enzimático se
une al ADN y recorta los extremos de una de las
cadenas; así, la otra cadena queda más larga, y a ella
se une una enzima denominada recombinasa, que
ayuda para que invada al ADN del cromosoma
hermano en el punto homólogo a su secuencia; de
esta manera, lo utiliza como molde para
Ilustración 10 Reparación por recombinación
complementar su secuencia y reparar el daño. homóloga.
Si bien es una manera más “limpia” y precisa de
reparación, este mecanismo solamente lo utiliza la célula durante un breve periodo después de la
replicación del ADN, cuando los cromosomas se encuentran todavía alineados y cerca uno de otro.

Los mecanismos de reparación y las enfermedades.

Los mecanismos de reparación del ADN están involucrados en una diversidad de procesos que se
llevan a cabo día con día. Debido a esto, las células que presentan defectos en su función son más
susceptibles de presentar daños irreparables y, en consecuencia, favorecer el desarrollo de algunas
enfermedades.

1. Cáncer
Los mecanismos de reparación del ADN son clave para el desarrollo de una de las enfermedades
que más afligen a la humanidad: el cáncer. En primera instancia, los defectos en alguno de los
procesos descritos anteriormente permiten que se acumulen daños que poco a poco van alterando
el comportamiento de la célula, que ahora se multiplica más rápidamente y se desprende del tejido
de origen para diseminarse hacia otras partes del cuerpo.
Por otro lado, muchas de las enzimas involucradas en la reparación del ADN están presentes en
grandes cantidades en las células con cáncer, lo cual les permite sobrevivir a los daños ocasionados
con el tratamiento (quimioterapia o radioterapia), a pesar de que vayan acumulando más daños que
vuelven más agresiva a la enfermedad.

2. Envejecimiento prematuro
De manera natural, la edad nos hace más susceptibles a que nuestros sistemas de reparación
cometan errores. De hecho, se piensa que el envejecimiento es resultado de la acumulación de
daños no reparados. Por tal motivo, si los defectos en los sistemas de reparación ocurren temprano
en una persona, esto se verá reflejado como un envejecimiento prematuro. Existen diferentes
enfermedades que se manifiestan así, tales como los síndromes de Hutchinson-Gilford, de Werner,
de Cockayne, y la enfermedad conocida como xeroderma pigmentosum. Aunque son entidades
clínicamente diferentes, comparten la particularidad de deberse a defectos en los sistemas de
reparación del ADN.

3. Neurodegeneración
Debido a que algunos de los defectos en los sistemas de reparación del ADN son congénitos –es
decir, hereditarios–, pueden tener repercusiones observables en etapas tempranas. Durante los
primeros meses de desarrollo del feto, cuando existe una gran proliferación, diferenciación y
migración, las células son más susceptibles de presentar daños en el ADN y ocasionar
enfermedades, lo cual es especialmente importante en las células del sistema nervioso.

Uno de los primeros hallazgos que relacionan la reparación del ADN con la neurodegeneración
fue la enfermedad conocida como ataxia telangiectasia, la cual se caracteriza clínicamente por un
gran deterioro en la parte del cerebro que controla el movimiento y el habla. Ahora se sabe que las
células en esta región son más sensibles al daño y mueren debido a los defectos en la estructura y
función de la proteína ATM, la cual tiene un papel importante durante los rompimientos de doble
cadena del ADN.

IV. La expresión genética y sus niveles de regulación

La regulación genética es el proceso mediante el cual las células o célula de un organismo

determina qué genes se activarán y cuáles serán reprimidos (Bodine, s.f.). Existen diferentes tipos
de regulación genética, dependiendo del tipo de gen que se esté regulando:

Genes constitutivos: Son los genes que se expresan en todas las células o en la mayoría de
estas, ya que codifican proteínas que son necesarias en procesos vitales como la glucólisis.
Estos genes se mantienen activos la mayor parte del tiempo (Bodine, s.f.).

Genes específicos de tejido: Estos genes sólo se activan en células de un área (tejido
determinado del organismo). Son genes que ayudan a que ocurra la diferenciación celular.
Por ejemplo, ayudan a que las neuronas o los eritrocitos cumplan con su función particular.

Debido a esta variedad de genes, la regulación de la expresión génica resulta un proceso muy
complejo, y específico para cada tipo de gen. Sin embargo, de manera general, existen 6 niveles
de regulación:

a. Control transcripcional
La transcripción es un proceso mediante el cual una secuencia de ADN se copia en forma de ARN.
Este paso es fundamental en la formación de proteínas pues, si un gen no se transcribe, no hay
ninguna posibilidad de producir una proteína. Por el contrario, si existe una transcripción de un
fragmento de ADN, aumenta la probabilidad de que la proteína se exprese. Para que este proceso
se lleve a cabo se necesita de secuencias promotoras, intensificadoras, inhibidoras, y de factores
de transcripción (Khan Academy, s.f.).

Una secuencia promotora es una parte del ADN que por lo general se encuentra arriba (hacia el
extremo 5’) o cerca de la región codificante de un gen; es una región que actúa en cis. El promotor
es la región a la que se unen los elementos reguladores (Margulies, s.f.). Se constituye de las
siguientes partes:

Núcleo del promotor: se localiza hasta 100 pares de bases “aguas arriba” y está constituido
por el sitio de ensamblaje del complejo de iniciación por la ARN polimerasa II (Ej. la caja
TATA, localizada 25 pb río arriba).
 Secuencias reguladoras proximales: Constituidas por secuencias a las que se unen
proteínas y factores de transcripción que facilitan el ensamblaje del complejo de iniciación
(Ej. las cajas CAAT y GC).

Secuencias reguladoras distales: Localizadas a más de 100 pb “aguas arriba” del sitio de
iniciación de la transcripción, regulan la actividad del núcleo del promotor. Son de dos
tipos:
a) Intensificadores: Secuencias de acción cis que potencian la tasa de transcripción
de los promotores que se encuentran en la misma molécula, a los que se unen
factores de transcripción activadores.
b) Inhibidores: secuencias de acción cis a las que se unen represores, inhibiendo a los
activadores y reduciendo el nivel de transcripción (De Guglielmo y Fernandez,
2016).

Los factores de transcripción son proteínas que regulan la transcripción de los genes a ARN,
mediante su unión a las regiones promotoras del ADN. Dentro de estos factores existen los
denominados activadores, que son proteínas de unión a ADN y permiten la unión de otros factores
generales de transcripción que a su vez tienen influencia positiva en la unión de la ARN
polimerasa. También existen represores, que son aquellas proteínas que impiden la unión de los
factores generales de transcripción y/o de la enzima ya mencionada a los promotores para
comenzar la transcripción (Khan Academy, s.f.; De Guglielmo y Fernandez, 2016).

b. Procesamiento de ARN
En células procariotas el RNA producido en la transcripción está listo para usarse como RNA
mensajero y ser traducido a una proteína. En el caso de células eucariotas, el RNA transcrito (pre-
RNAm) necesita de una serie de pasos para su maduración para convertirse en ARNm y su
posterior uso en el proceso de traducción:

El cap 5' es un nucleótido modificado de guanina (guanina monofosfato), se agrega al primer

nucleótido del transcrito durante la transcripción, específicamente cuando éste alcanza una
longitud de 20 a 25 ribonucleótidos. Esta modificación sirve para proteger al ARNm de la
degradación y también ayuda al ribosoma a unirse al ARNm para comenzar a sintetizar una
proteína (Marchat y Castañón, 2008; Khan Academy, s.f.).

En el extremo 3’ del pre-ARNm se añaden de 100 a 200 nucleótidos de adenina (A), formando los
que se conoce como cola de poli-A. Esta adición de nucleótidos ocurre cuando durante el proceso
de transcripción hay una secuencia llamada señal de poliadenilación. La cola le proporciona mayor
estabilidad al transcrito (Marchat y Castañón, 2008).

El pre-ARNm también atraviesa un proceso de corte y empalme (splicing). Consiste en eliminar

las zonas del ARN transcrito que no poseen información de codificación para proteínas (intrones),
y posteriormente unir las regiones que sí son de utilidad para la síntesis de proteínas (exones). Este
proceso lo realiza un complejo enzimático denominado espliceosoma. Existe un proceso similar
llamado splicing alternativo, el cual tiene el mismo fundamento que el splicing normal, sin
embargo, la unión de los exones puede llevarse a cabo en diferentes combinaciones, produciendo
así diferentes proteínas o isoformas de éstas. Esto último es la razón por la cual el número de
proteínas que un organismo puede formar es mayor al número de genes del mismo (Khan
Academy, s.f.; Marchat y Castañón, 2008).
 c. Transporte y localización del RNA
El proceso de transcripción y maduración del ARNm se lleva a cabo en el núcleo, por lo que para
continuar con la traducción es necesario su transporte hacia el citoplasma. El proceso de transporte
se encuentra regulado por las ribonucleoproteínas, cuya función es unirse al ARNm mensajero en
secuencias específicas y asociarse a su vez con proteínas del Complejo de Poro Nuclear. Éstas
últimas proteínas se encargan del transporte de moléculas del citoplasma al núcleo y viceversa.
Una vez que el ARNm maduro se encuentra fuera del núcleo, las proteínas nucleares asociadas al
transcrito son reemplazadas por proteínas citoplasmáticas que son capaces de interaccionar con el
citoesqueleto para favorecer el transporte del ARNm al retículo endoplásmico pues, es una zona
rica en ribosomas (Marchat y Castañón, 2008). También puede ocurrir un transporte hacia una
región de la célula específica dependiendo de los requerimientos de la célula. Por ejemplo, se ha
encontrado que, en las neuronas, el ARNm puede ser transportado en su forma inactiva hacia las
dendritas donde posteriormente se activará la traducción. En este transporte en específico se puede
decir que se requiere de una señal sináptica que le indique al núcleo y a las proteínas
transportadoras del citoesqueleto hacia donde mover un ARNm específico; además dichas
proteínas sólo pueden unirse si existe el elemento en cis llamado Elemento de Focalización
Dentrica (Dentric targeting element, DTE) (Kindler et al 2005).

d. Control traduccional

Los MicroARNs (miARNs) son cadenas de ARN largas que se pliegan sobre sí mismas para formar
una horquilla. Posteriormente un conjunto de enzimas corta la horquilla para liberar una doble
cadena de aproximadamente 22 nucleótidos. Una de las cadenas es miARN maduro, el cual se une
a una proteína específica para formar un complejo ARN-proteína. Este complejo se une a ARNm
para conducirlo a su degradación cuando embona perfectamente o para evitar su traducción cuando
tienen alguna incompatibilidad (Khan Academy, s.f.).

Otro mecanismo de la regulación de la transcripción ocurre durante la iniciación de la misma pues,

para que el ribosoma se pueda unir al ARN mensajero requiere de proteínas auxiliares que
verifiquen la correcta colocación del ribosoma en la cadena. En el caso de células eucariotas la
proteína auxiliar sería el factor de iniciación eucariota 2 (eIF2), cuya función es unirse a la
subunidad pequeña del ribosoma para iniciar el proceso de traducción. Esto sólo ocurre cuando la
proteína no se encuentra fosforilada, de lo contrario ésta sufre cambios estructurales que no le
permiten unirse a la subunidad pequeña del ribosoma y por ende la traducción se ve impedida
(Khan Academy, s.f.).

e. Degradación de mRNA
La degradación de ARN mensajero inicia con la eliminación de la cola de poliA y el Cap 5’. La
remoción de la cola es realizada por enzimas conocidas como desadenilasas. Posteriormente,
enzimas diferentes se encargan de la remoción del casquete para dejar al ARNm expuesto a ataques
de las enzimas nucleasas, las cuales descomponen la cadena en sus nucleótidos (Marchat y
Castañón, 2008).

f. Control de la actividad proteica:

Las modificaciones post-traduccionales se refieren a los cambios químicos que ocurren en una
proteína después de que ésta ha sido producida. Puede tener impacto en la estructura,
electrofilicidad y las interacciones que tienen con otras proteínas, el ADN u otros compuestos. A
continuación, se describen algunas de las modificaciones más comunes:
 Adición de grupos químicos

o Fosforilación: Es la adición de un grupo fosfato en un residuo de serina, treonina o tirosina. Es

una de las modificaciones post-traduccionales más estudiadas en procariotas y eucariotas. La
modificación se lleva a cabo por las enzimas quinasas o cinasas cuando es fosforilación, y se
realiza por enzimas fosfatasas en el caso de la desfosforilación.
o La adición del grupo fosfato puede convertir una proteína sin carga a una cargada
negativamente, induciendo entonces un cambio conformacional en la proteína. La fosforilación
está involucrada en diversos procesos celulares incluyendo el ciclo celular, el crecimiento,
apoptosis (activación de p53 en el N-terminal por cinasas) y rutas de transducción de señal
(Surat, 2019).

o Acetilación: Es la adición de un grupo acetilo en una proteína. Está relacionada con funciones
biológicas, incluyendo la estabilidad, ubicación, y síntesis de una proteína. También participa
en la apoptosis y la estabilidad del ADN. Un ejemplo de acetilación es la que ocurre en las
histonas, esta modificación reduce la interacción de las proteínas con el grupo fosfato cargado
negativamente del ADN, provocando un relajamiento en la cromatina para dejar el ADN
disponible para transcripción. Por otra parte, la acetilación de la proteína p53 es crucial para el
desarrollo de sus propiedades de supresión tumoral (Surat, 2019).

o Hidroxilación: En este proceso se añade un grupo hidroxilo (-OH) a las proteínas. Es catalizado
por enzimas hidroxilasas y ayuda a convertir compuestos hidrofóbicos o lipofílicos en
compuestos hidrofílicos.

o Metilación: Se añade un grupo metilo a un residuo de arginina o lisina de una proteína. La

arginina puede ser metilada una o dos veces, mientras que la lisina puede ser metilada hasta tres
veces. Las enzimas que realizan esta modificación se llaman metiltransferasas. En las histonas,
dependiendo del residuo donde ocurra la metilación, puede llevar a la activación o represión de
genes.

Adición de grupos complejos

o Glicosilación: Este tipo de modificación es la adición de un oligosacárido (glicano) a un átomo

de nitrógeno o a un átomo de oxígeno. La glicosilación ligada a nitrógeno ocurre en la amida
de la asparagina; mientras que la glicosilación ligada a oxígeno ocurre en la serina o la treonina.
Los carbohidratos presentes en cualquiera de los dos tipos de unión (N u O) se encuentran es la
superficie celular y proteínas secretoras. Tienen papeles críticos en la clasificación de proteínas,
reconocimiento inmunológico, unión a receptores, y patogenicidad. Por ejemplo, los glicanos
unidos a nitrógeno en una célula inmune puede dirigir la migración a sitios específicos (Surat,
2019).

o Unión de AMP: Es la adición reversible de AMP a una proteína. Involucra la formación de

enlace fosfodiéster entre el grupo hidroxilo de la proteína y el grupo fosfato de AMP.

o Lipidación: La unión covalente de un grupo lipídico a una proteína. La lipidación se puede

dividir en prenilación, N-miristoilación, palmitoilación y anclaje de glicosilfosfatidilinositol
(GPI). La prenilación implica la adición de un resto isoprenoide a un residuo de cisteína de una
proteína sustrato. Es fundamental para controlar la localización y la actividad de varias
proteínas que tienen funciones cruciales en la regulación biológica.
o La miristoilación involucra la adición de un grupo miristoil a un residuo de glicina por un enlace
de amida. Tiene funciones relacionadas a las asociaciones de membrana y la apoptosis. En la
palmitoilación se añade un grupo palmitoil a un residuo de cisteína de una proteína. En la
adición de anclaje de GPI, el péptido señal carboxilo-terminal de la proteína se divide y se
reemplaza por un ancla de GPI. Investigaciones recientes en genética humana han revelado que
los anclajes de GPI son importantes para la salud humana. Cualquier defecto en el ensamblaje,
unión o remodelación de los anclajes de GPI conduce a enfermedades genéticas conocidas como
deficiencia hereditaria de GPI (Surat, 2019).

Adición de polipéptidos

o Ubiquitinación: Como su nombre lo indica, esta modificación involucra la adición de proteínas

nombradas ubiquitinas a un residuo de lisina en una proteína. Puede tratarse de mono-
ubiquitinación o poliubiquitinación. Las proteínas que han sido poli-ubiquitinadas son
reconocidas por el proteasoma y son subsecuentemente marcadas para la proteólisis o su
degradación. En cambio, la monouquitinación de proteínas está involucrada con la endocitosis
y el seguimiento celular (Surat, 2019).

Escisión de proteínas

o Proteólisis: Se refiere a la rotura de las proteínas en polipéptidos más pequeños o en

aminoácidos. Por ejemplo, la remoción de la metionina N-terminal después de la traducción
conduce a la conversión de una proteína inactiva o no funcional a una forma activa de ésta
(Surat, 2019).

Modificación de aminoácidos

o Desamidación: Es la remoción o conversión de residuos de asparagina o glutamina a otro grupo

funcional. La asparagina es convertida a aspartato o iso-aspartato, mientras que la glutamina es
convertida a glutamato o piroglutamato. Esta modificación cambia la estructura, estabilidad y
función de la proteína (Surat, 2019).

V. Ingeniería genética y aplicaciones

A) Cadena en reacción de la polimerasa (PCR)

La cadena en reacción de la polimerasa es un ensayo enzimático desarrollado en 1983 por Kary
Mullis, que permite la amplificación de manera exponencial de un gen o un fragmento específico
de ADN de un conjunto complejo de ADN, sin utilizar organismos vivos. Es un ensayo sensible,
debido a que solo se necesitan cantidades traza para generar copias suficientes de ADN que será
analizado mediante métodos convencionales de laboratorio, como técnicas visuales basadas en su
tamaño y su carga. La PCR es utilizada comúnmente en laboratorios de investigación médica y
biológica para una gran cantidad de labores, como:

Detección de enfermedades hereditarias.

Identificación de huellas genéticas.
Diagnóstico de enfermedades infecciosas. (VIH, citomegalovirus (CMV), micoplasma,
neumonía, sífilis, hepatitis, enfermedades fúngicas, entre otras)
 Clonación de genes.
Pruebas de paternidad.
Secuenciación de ADN.
Filogenética basada en el ADN.
Identificación de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento.

Cada ensayo de PCR requiere de:

DNA templado. Contiene la región del fragmento de ADN que se amplificará.

Primers o cebadores. Especifican exactamente el ADN a amplificar, ya que sirven
como puntos de extensión (indican el inicio y el final) para que la DNA polimerasa
comience a sintetizar. Son fragmentos cortos de ADN con menos de 50 nucleótidos
(alrededor de 18 a 30 pares de bases), con una secuencia definida complementaria del
fragmento de ADN que se amplificará. Debe contener cantidades iguales de cada
nucleótido, no debe formar estructuras secundarias debido a complementariedad
interna y no contener secuencias en los extremos 3’ que permitirían el apareamiento de
las bases consigo mismo o con otros primers presentes en la reacción.
Nucleótidos. Son los “bloques de construcción” utilizados por la DNA polimerasa para
crear el producto de la PCR. Incluye las cuatro bases encontradas en el ADN: Adenina,
Timina, Guanina y Citosina. En casos especiales, se pueden utilizar nucleótidos
modificados.
DNA polimerasa. Enzima clave que permite el enlace de los nucleótidos para formar
el producto de la PCR. Cataliza la síntesis de DNA en la dirección 5’→3’.
Generalmente se utiliza la DNA polimerasa Taq, aislada de la bacteria termófila
Thermus aquaticus, aunque también se utilizan la DNA polimerasa Pfu (Pyrococcus
furiosus), la DNA polimerasa Pwo (Pyrococcus woesi) entre otras.
Buffers. Proveen un ambiente químico favorable para la reacción. Generalmente, los
buffers son proporcionados por el proveedor de la DNA polimerasa que se utilice. Un
componente importante del buffer es el magnesio, ya que su concentración afecta la
especificidad y la eficiencia de la reacción.

Los componentes mencionados son mezclados en un tubo de ensayo o en placas de 96 pocillos,

con volúmen de 0.2-0.5 ml, los cuales se insertan dentro de bloques térmicos, en una máquina
(termociclador) que permite ciclos repetidos (generalmente de 20 a 40) de amplificación del ADN.
Esta máquina aumenta y disminuye la temperatura de los bloques en pasos pre-programados
discretos y precisos.

Pasos de la PCR
La amplificación del ADN ocurre en 3 pasos básicos (Castillo, F., 2005; Garibyan y Avashia,
2013; Rahman et al., 2013):

Desnaturalización. La solución de reacción es calentada (94-96°C) sobre el punto de

fusión de las 2 hebras complementarias del ADN que se quiere amplificar, lo que
permite que las hebras se separen mediante la ruptura de los enlaces puente de
hidrógeno. Dura de 1 a 5 minutos. En este paso, la DNA polimerasa Taq es activada.
Antes del primer ciclo, el ADN es desnaturalizado por un periodo largo de tiempo para
asegurar que el ADN templado y los primers se encuentren completamente separados.
 Hibridación. La temperatura es reducida por debajo del punto de fusión de los primers
(45-60°C) permitiendo que éstos se unan a los fragmentos de ADN blanco, lo cual solo
ocurre si los primers presentan secuencias complementarias. Dura aproximadamente
de 1 a 2 minutos. Una temperatura errónea en este paso, puede resultar en que los
primers no puedan unirse al DNA templado.

Extensión. La temperatura se eleva a 72°C, permitiendo que la DNA polimerasa Taq

extienda los primers añadiendo nucleótidos a la cadena de ADN en desarrollo. La
temperatura depende de la DNA polimerasa que se utilice, además el tiempo de esta
etapa depende de nuevo de la DNA polimerasa y de la longitud del fragmento de ADN
amplificado, aunque generalmente es de 1 minuto por kilo-base.

Con cada repetición de esos tres pasos, el número de moléculas copiadas de ADN se puede
expresar como 2n, donde n es el número de ciclos (suponiendo una eficiencia del 100%).

Ilustración 11 Principio de la reacción en cadena

de la polimerasa (PCR).

¿Cómo haríamos una PCR si pudiéramos ir al laboratorio?

Para realizar una PCR en el laboratorio (McPherson y Møller, 2006), necesitamos:

Equipo
Microcentrífuga
Termociclador
Tanque de gel para electroforesis

Materiales y reactivos
DNA polimerasa termoestable con buffer de reacción
2 mM de solución de dNTP
Primers
DNA templado
Aceite mineral
Agarosa al 0.8%

Procedimiento
1. Añadir a un tubo para microcentrífuga de 0.5 ml:
a. 5 μl de buffer para PCR
b. 5 μl de dNTP’s 2 mM
 c. 1 μl de primer 1 (10 pmol/μl)
d. 1 μl de primer 2 (10 pmol/μl)
e. ADN templado (~ 0.1 pmol de plásmido a 1 μg de DNA genómico)
f. DNA polimerasa termoestable (1 unidad)
g. Agua (50 μl)

Hay que asegurarse de utilizar puntas para pipeta nuevas para cada componente e irlos adicionando
en diferentes secciones del tubo para evitar que se mezclen los componentes hasta que todos los
reactivos sean añadidos.

2. Mezclar los reactivos por centrifugación en una microcentrífuga por 1 s.

3. Añadir 50 μl de aceite mineral ligero para prevenir evaporación durante el proceso.
4. Colocar el tubo en el termociclador y programar el siguiente régimen de temperatura:
a) 94°C por 5 minutos (Para desnaturalizar el templado)
b) 94°C por 1 minuto ⤣
c) 55°C por 1 minuto (repetir de 25-35 veces)
d) 72°C por 1 minuto↝
e) 72°C por 2 minutos (para asegurar que todas las moléculas estén
completamente sintetizadas)
5. Dejar enfriar las muestras y mantener a temperatura ambiente en el termociclador.
6. Sacar los tubos del termociclador. Insertar una punta de pipeta y retirar 45 μl de la reacción con
cuidado para no remover aceite mineral.
7. Limpiar la punta de la pipeta para eliminar residuos de aceite mineral y transferir el producto de
la reacción a un tubo nuevo.
8. Analizar entre 5 y 15 μl de la muestra en gel de agarosa utilizando marcadores moleculares de
DNA de tamaño adecuado.

Cinética de la PCR
De acuerdo a su cinética, el proceso de PCR puede ser dividido en 3 fases (McPherson y Møller,
2006; Rahman et al., 2013;):
1. Ciclo temprano (E). Los primers buscan el ADN templado por sus secuencias
complementarias. Se encuentran pocas copias del templado y un gran número de copias de
los primers.
2. Ciclo medio (M). Se caracteriza porque el proceso de amplificación es puesto en marcha
con los primers actuando en conjunto para lograr una acumulación exponencial del
producto.
3. Ciclo tardío o plateau (L). No se acumula más producto debido al agotamiento de la
enzima y los reactivos o a inhibición en la reacción.

Ilustración 12 Cinética de la acumulación del producto deseado en la PCR.

Ventajas
1. Es una técnica simple de entender y utilizar, que genera resultados rápidamente.
2. Es altamente sensible, con el potencial de producir millones de copias de un producto
específico para su secuenciación, clonación y análisis.
3. Puede ser empleada para analizar alteraciones de niveles en la expresión génica en estados
de enfermedad.
4. Es una técnica que puede modificarse, generando distintos tipos de PCR.

Desventajas
1. Debido a su alta sensibilidad, cualquier forma de contaminación de la muestra, incluso con
cantidades traza de ADN, puede producir resultados erróneos.
2. Para diseñar primers para la PCR, son necesarios datos en las secuencias, por lo tanto, solo
se puede utilizar para identificar la presencia o ausencia de un patógeno o gen conocidos.
3. Los primers utilizados para la PCR pueden hibridarse a secuencias no específicas que son
similares, pero no completamente idénticas al ADN blanco.
4. La DNA polimerasa puede unir nucleótidos incorrectos a la secuencia de la PCR, aunque
en una pequeña tasa, lo que puede generar mutaciones.
5. El proceso de PCR solo puede copiar fragmentos pequeños de ADN (10-40 kb).

Tipos de PCR

PCR larga (L-PCR). Logra amplificar fragmentos de 40 kb. Utiliza una mezcla de DNA
polimerasa Taq que carece de actividad correctora, pero es muy eficaz en la elongación y Pfu que
posee actividad correctora que evita la introducción de errores de elongación de las cadenas.

PCR anidada. Se utiliza para aumentar tanto la especificidad de la amplificación como el factor
de amplificación. Consiste en realizar una segunda reacción de PCR utilizando dos nuevos
cebadores que hibridan con regiones internas del fragmento previamente amplificado en la primera
reacción de PCR. Se estima que la PCR anidada conduce a un aumento de 10 4 en la sensibilidad
de detección del producto correcto.

PCR con adaptadores. Permite amplificar una secuencia desconocida de DNA al unir los
fragmentos obtenidos al digerir el DNA con una enzima de restricción, oligonucleótidos sintéticos
(adaptadores) y utilizar para la reacción de PCR los cebadores correspondientes a dichas
secuencias.

PCR asimétrica. Permite obtener copias de cadena sencilla del DNA al añadir diferentes
cantidades de los cebadores o primers para que, al agotarse el que se añade a menor concentración
tras varios ciclos de amplificación, sólo pueda amplificarse una de las cadenas con el cebador más
abundante.

PCR inversa. Se utiliza para clonar regiones desconocidas de los ADN adyacentes a secuencias
conocidas. Tras cortar con una enzima de restricción el DNA a ambos lados de la región que se
pretende amplificar, se circulariza el fragmento obtenido y se realiza la reacción de PCR con los
cebadores que hibridan con los extremos 5’ de las secuencias conocidas, lo que permite obtener
fragmentos de DNA lineales del tamaño comprendido entre ambos cebadores.

PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR). Se basa en la habilidad de enzima transcriptasa reversa

(DNA polimerasa dependiente de RNA) para generar una hebra complementaria de ADN, usando
mRNA como templado, el cual debe ser RNA citoplásmico o mRNA purificado. Por lo tanto, el
molde utilizado es RNA, pero el producto final obtenido es DNA. Es importante que no haya DNA
genómico presente, ya que éste actuaría como templado para el paso de amplificación. Para evitar
contaminaciones, se recomienda digerir el RNA que se va a utilizar con DNasa I y realizar una
PCR con el RNA tratado, utilizando los primers de genes específicos, para confirmar la ausencia
de DNA genómico (Udvardi et al., 2008).

1. El mRNA es convertido a DNA utilizando la transcripción inversa, mecanismo utilizado

por virus de RNA para convertir su RNA genómico en DNA dentro de la célula hospedera.
Se utiliza un primer oligo-dT que se puede hibridar al extremo 3’ de la cola de poliA de
mRNAs eucariotas. Las transcriptasas reversas más utilizadas son la AMV (Avian
Myeloblastosis virus) y M-MLV (Moloney Murine Leukemia virus).

Ilustración 13 Purificación y síntesis de la primera hebra de cDNA en la RT-PCR.

2. Se realiza una amplificación mediante PCR de la hebra complementaria de ADN obtenido

(cDNA).

RT-PCR en tiempo real. La principal ventaja de la RT-PCR en tiempo real es de que cuantifica
de una manera sensible y reproducible la cantidad inicial del templado (transcrito) monitoreando
la acumulación del producto de amplificación de la PCR (amplicón) durante cada ciclo de PCR.
Además, es una técnica rápida, que posibilita analizar varios transcritos (genes) simultáneamente
y los procesos de cuantificación post-PCR se eliminan.

Su principio básico se parece mucho al proceso de la RT-PCR tradicional: cDNA es sintetizado a

partir de mRNA usando transcriptasa reversa, seguido de amplificación de cDNA mediante PCR
y la cuantificación del amplicón, sin embargo, presenta 2 diferencias fundamentales:

a) La acumulación del amplicón se detecta y cuantifica utilizando un reportero fluorescente y

no por electroforesis de gel convencional.
b) La acumulación del amplicón es medida durante cada ciclo de PCR.

La señal fluorescente (acumulación del amplicón) se detecta y cuantifica utilizando un

termociclador de PCR en tiempo real. La reacción de RT-PCR en tiempo real contiene todos los
componentes utilizados para la RT-PCR, pero en adición contiene un reportero fluorescente, ya
sea en la forma de un colorante fluorescente de unión a DNA o como un primer oligonucleótido
fluorescente. Debido a que el reportero fluorescente solo fluórese cuando se asocia con el
amplicón, el aumento en la señal grabada de fluorescencia durante la amplificación es directamente
proporcional a la cantidad del producto de amplificación en la reacción. La intensidad de la emisión
fluorescente es monitoreada y registrada durante cada ciclo de PCR, por lo cual es posible
identificar el ciclo exacto de la PCR en el cual la señal fluorescente aumenta significativamente y
esto se correlaciona con la cantidad inicial de templado: en pocas palabras, entre mayor sea la
concentración del templado, más pronto se logrará observar un aumento significativo en la
fluorescencia.

Durante las primeras etapas de la reacción de amplificación (3-15 ciclos), la señal de la

fluorescencia no presentará cambios, esto se denomina baseline. Al establecer un valor de umbral
de fluorescencia fijo por encima de la línea de base, se registra un aumento significativo de la
fluorescencia cuando la intensidad de la señal es superior al valor umbral, lo que a su vez determina
el ciclo de umbral o CT (número de ciclo cuando la fluorescencia de la reacción cruza el umbral).
Conociendo el valor de CT de una reacción y generando una curva de concentración estándar de
cDNA (fluorescencia vs concentración de cDNA), la concentración inicial del templado puede ser
extrapolada.

Ilustración 14 Diagrama esquemático mostrando datos de reacción típicos de una RT-PCR en tiempo real de 3 muestras
desconocidas. (A) La señal de fluorescencia medida en cada ciclo de amplificación se traza en contra del número de ciclos.
Se indica la línea base en donde no hay un cambio significativo en la fluorescencia, como el valor del umbral. El valor de C T
de cada muestra representa el número del ciclo cuando la señal de fluorescencia es más alta que el valor del umbral. (B) Una
curva estándar muestra CT versus el logaritmo del número de copias de las muestras de cDNA estándares. La concentración
inicial (número de copias) de las muestras 1, 2 y 3 pueden determinarse en base a sus valores de C T.

De este conjunto de datos, es claro que la muestra 1 contiene más templado inicial que la muestra
2 y que la muestra 3 tiene la menor cantidad de templado inicial.

Un agente fluorescente intercalante en el DNA es

el SYBR Green I, que se une al surco menor del
DNA de doble cadena y tras excitación (498 nm)
emite luz (522 nm) que puede ser detectado por un
termociclador de PCR en tiempo real. Debido a que
el SYBR Green I no se une al DNA de cadena
simple y porque el colorante solo emite una
fluorescencia débil en solución, SYBR Green I se
utiliza extensamente como reportero fluorescente
en experimentos de RT-PCR en tiempo real para
monitorear el producto de amplificación de doble Ilustración 15 Ilustración 16 Diagrama esquemático que
cadena. muestra cómo actúa SYBR Green I durante una PCR.
Hot Start PCR. Su propósito es el de optimizar el rendimiento del producto de amplificación
deseado en la PCR y, simultáneamente, la represión de amplificación no específica y la formación
de dímeros de primers. Esto se logra aumentando el tiempo de desnaturalización inicial
(aproximadamente 5 minutos) y reteniendo un componente esencial de la PCR (por ejemplo, DNA
polimerasa o los primers), hasta que la mezcla de reacción se ha calentado a una temperatura que
inhibe la hibridación de los primers entre sí mismos o entre regiones no específicas del templado.
La modificación puede ser incorporada en conjunto con otras modificaciones de las condiciones
del ciclo (Green y Sambrook, 2018; Lorenz, 2012).

PCR multiplex. Es una variante de la PCR en la cual se pueden amplificar dos o más secuencias
blanco, incluyendo más de un par de primers en la misma reacción. La PCR multiplex tiene el
potencial de ahorrar tiempo y esfuerzo en el laboratorio. La optimización de la PCR multiplex
puede conllevar diversas dificultades, incluyendo baja sensibilidad y especificidad, y/o
amplificación preferencial de ciertas secuencias blanco. Además, la presencia de más de un par de
primers en la reacción aumenta la probabilidad de obtener productos de amplificación espurios
debido a, en principio, la dimerización de los primers. Además, deben existir métodos disponibles
para el análisis de cada producto de amplificación de la mezcla de todos los productos. El
desarrollo de una PCR multiplex eficiente usualmente requiere planeación estratégica y múltiples
intentos para optimizar las condiciones de reacción (Markoulatos et al., 2002).

Análisis de ADN por electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis a través de geles de agarosa o poliacrilamida se utiliza para separar, analizar,

identificar y purificar fragmentos de ADN. La técnica es simple, rápida de realizar y capaz de
resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente mediante otros
procedimientos, como la centrifugación en gradiente de densidad. La ubicación de las bandas de
ADN dentro del gel se puede determinar directamente mediante tinción con bajas concentraciones
de colorantes intercalados fluorescentes, como bromuro de etidio o SYBR Gold; las bandas que
contienen tan solo 20 pg de ADN de doble hebra pueden detectarse mediante el examen directo
del gel con luz ultravioleta (UV). Si es necesario, estas bandas de ADN se pueden recuperar del
gel. (Green,2019) Las opciones dentro de estos parámetros dependen principalmente de los
tamaños de los fragmentos que se separan.

Los geles de poliacrilamida:

Son más eficaces para separar pequeños fragmentos de ADN (5-500 pb)
Su poder de resolución es extremadamente alto.
Los fragmentos de ADN que difieren en tamaño en tan solo 1 pb de longitud o en tan
solo un 0,1% de su masa pueden separarse entre sí
Pueden acomodar cantidades comparativamente grandes de ADN
Desventajas
Más difíciles de preparar y manipular
Casi siempre se ejecutan en una configuración vertical en un campo eléctrico constante.
(green,2019)

Los geles de agarosa

Tienen un poder de resolución menor que los geles de poliacrilamida, pero tienen un mayor rango
de separación. Los ADN de 50 pb a varias megabases de longitud se pueden separar en geles de
agarosa de diversas concentraciones y configuraciones. Los fragmentos pequeños de ADN (50 a
20 000 pb) se resuelven mejor en geles de agarosa en una configuración horizontal en un campo
eléctrico de fuerza y direcciones constantes.

La electroforesis en gel de agarosa se usa con mayor frecuencia en la separación de moléculas de

ADN y, por lo tanto, se usa con frecuencia durante técnicas de manipulación de ADN o estudios
que involucran la identificación de individuos en función de su secuencia de ADN única
(Green,2019)

¿Cómo funciona?
La columna vertebral del ADN contiene una carga negativa para cada nucleobase presente, lo que
hace que la relación masa-carga del ADN sea la misma en diferentes tamaños de fragmentos.
Debido a esta carga negativa, cuando aplicamos un campo eléctrico a una solución que contiene
ADN, las moléculas de ADN migrarán hacia el electrodo cargado positivamente.

La función de la matriz de agarosa crea una resistencia y significa que las moléculas más pequeñas
migran más rápidamente mientras que las moléculas más grandes migran más lentamente. La
diferencia en la tasa de migración es cómo separamos los diferentes tamaños de la molécula de
ADN para determinar su longitud.

Procedimiento
Para un procedimiento típico de electroforesis en gel de agarosa, la matriz de gel se cuela como
una losa horizontal. Los peines de plástico se utilizan para crear hendiduras o pozos en los que se
carga el ADN. Antes de cargar, el ADN se mezcla con un tinte de carga que pesa la muestra en la
solución, para que no salga del pozo, y también incluye un marcador visible para rastrear la
progresión de la ejecución. Las muestras desconocidas a menudo se procesan junto con una
escalera de ADN, que contiene longitudes conocidas de ADN para comparar. Luego, el gel se
coloca en un recipiente, llamado tanque o caja de gel, lleno de solución tampón conductora con
pH controlado, generalmente Tris-acetato-EDTA o Tris-Borato-EDTA y se aplica un campo
eléctrico a lo largo del gel. (Johansson, 1972)

Ilustración 16 Ejecución de un gel de electroforesis de agarosa. 1 - los pozos se forman con peines
durante el vaciado. Se cargan 2-4 muestras con una pipeta. 5-6 - El campo eléctrico se aplica a
muestras separadas.

La velocidad de movimiento a través del gel se determina mediante el gradiente de voltaje, es

decir, el voltaje entre los electrodos. Los tanques de gel horizontales generalmente funcionan a
entre 5 y 10 V / cm, por lo que si su tanque tiene una distancia de electrodo de 10 cm.
Visualizando el ADN
Una vez que el ADN ha migrado a través del gel, es necesario visualizarlo para que podamos
determinar la longitud y la abundancia de las moléculas en la muestra. Dado que el ADN no es
visible a simple vista, se tiñe con un tinte de color, como azul de metileno, o más frecuentemente
con un tinte fluorescente como el bromuro de etidio. Las tinciones fluorescentes proporcionan
niveles de detección mucho mejores cuando se toman imágenes de geles.

Se utilizan cámaras de alta sensibilidad para capturar imágenes de los geles de agarosa. A menudo,
estos sistemas están equipados con transiluminadores de luz ultravioleta o azul, que se utilizan
para excitar las manchas fluorescentes, que luego emiten luz que puede ser capturada por la
cámara. (Johansson, 1972)

Ilustración 17 Imagen de un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio y

capturado usando un sistema de documentación en gel
Clases de agarosa y sus propiedades

Agarosas estándar (temperatura de fusión alta)

Se fabrican a partir de dos especies de algas: Gelidium y Gracilaria. Estas agarosas difieren en sus
temperaturas de gelificación y fusión, pero, con fines prácticos, se pueden usar agarosas de
cualquier fuente para analizar y aislar fragmentos de ADN que varían en tamaño de 1 a 25 kb.
Aspectos que se pueden destacar:

1. Muestran una fluorescencia de fondo mínima después de la tinción con bromuro de etidio
2. Están libres de Dnasa y Rnasa
3. Muestran una inhibición mínima de endonucleasas de restricción y ligasa,
4. Generan una modesta cantidad de flujo electroendoosmótico (eeo)

Los tipos más nuevos de agarosa estándar combinan una alta resistencia del gel con una baja EEO,
lo que permite que los geles se moldeen con concentraciones de agarosa tan bajas como 0,3%.
Estos geles se pueden utilizar en electroforesis convencional para separar ADN de alto peso
molecular (hasta 60 kb). A cualquier concentración de estas nuevas agarosas. La velocidad de
migración del ADN aumenta entre un 10% y un 20% con respecto a la obtenida con las agarosas
estándar anteriores, según el tipo de tampón y la concentración. (Oatey P. 2007)

Agarosas de baja temperatura de fusión / gelificación

Las agarosas de baja temperatura de fusión / gelificación se han modificado mediante
hidroxietilación y, por lo tanto, se funden a temperaturas más bajas que las de las agarosas estándar.
Se utilizan principalmente para la recuperación rápida de ADN porque la mayoría de las agarosas
de este tipo se funden a temperaturas (65 °C) que son significativamente más bajas que la
temperatura de fusión del ADN dúplex. Esta característica permite la purificación simple y el
procesamiento enzimático (digestión / ligadura de endonucleasas de restricción) del ADN y
permite la transformación bacteriana con ácidos nucleicos directamente en el gel refundido. Las
agarosas de baja temperatura de fusión no solo se derriten, sino que también gelifican a bajas
temperaturas. Esta propiedad permite que se mantengan como líquidos en el rango de 30°C-35°C,
de modo que las células se pueden incrustar sin dañar (Johansson, 1972).

Agarosa químicamente modificada

La agarosa químicamente modificada tiene una capacidad de tamizado significativamente mayor

que una concentración equivalente de agarosa estándar. Este hallazgo se ha aprovechado para
hacer agarosas que se acercan a la poliacrilamida en su poder de resolución y, por lo tanto, son
útiles para la separación de productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), fragmentos
pequeños de ADN y ARN pequeños <1 kb.

Ilustración 18 Rango de separación de fragmentos de ADN a través de diferentes tipos de

agarosa.

Tinción de ADN en geles con bromuro de etidio

Un método conveniente y comúnmente utilizado para visualizar ADN en geles de agarosa es la

tinción con el tinte fluorescente bromuro de etidio, que contiene un grupo plano tricíclico que se
intercala entre las bases apiladas de ADN. El bromuro de etidio se intercala en el ADN de doble
hebra de forma independiente de la secuencia con una estequiometría máxima de
aproximadamente dos moléculas de colorante por vuelta de hélice. Después de la inserción en la
hélice, el tinte queda perpendicular al eje helicoidal y hace contactos de van der Waals con los
pares de bases arriba y abajo. La posición fija del grupo y su proximidad a las bases hacen que el
tinte unido al ADN muestre un rendimiento fluorescente aumentado en comparación con el del
tinte en solución libre. La radiación UV a 254 nm es absorbida por el ADN y transmitida al tinte;
la radiación a 302 y 366 nm es absorbida por el propio tinte unido. En ambos casos, la energía se
reemite a 590 nm en la región rojo-naranja del espectro visible (LePecq y Paoletti 1967).

Debido a que el rendimiento fluorescente de los complejos de bromuro de etidio y ADN es de 20

a 30 veces mayor que el del tinte no unido, se pueden detectar bandas que contienen tan solo 10
ng de ADN en presencia de bromuro de etidio libre (0,5 μg / ml) en el gel. El bromuro de etidio se
puede utilizar para detectar ácidos nucleicos monocatenarios y bicatenarios (tanto ADN como
ARN). Sin embargo, la afinidad del tinte por el ácido nucleico monocatenario es relativamente
baja y el rendimiento fluorescente es comparativamente bajo. (Johansson, 1972).
Variantes de electroforesis

Nuevos protocolos y técnicas basadas en la electroforesis de ADN y proteínas, han venido

apareciendo en los últimos años. Mencionaremos brevemente los más importantes:

Electroforesis bidimensional

un proceso de separación e identificación de proteínas en dos dimensiones, orientando los frentes

de corrida en ángulo recto uno de otro. En tal sentido, las moléculas primero son separadas por su
carga o punto isoeléctrico (pI) por la técnica de enfoque isoeléctrico o IEF (Isoelectric Focusing).
Posteriormente, las proteínas son separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular por
electroforesis en SDS PAGE

Ilustración 19 Electroforesis en dos dimensiones de proteínas totales de Caenorhabditis elegans

A diferencia de la electroforesis en una dimensión en el que se puede resolver cerca de 50 bandas,

la electroforesis de dos dimensiones permite resolver 2500 manchas de polipéptidos
(Stellwagen,2009)

Electroforesis de capilaridad

Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de sílica
fundida cubierta con poliamida. Los tubos de sílica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un
diámetro de 25 a 100 µm y presentan radicales oxidrilos que al disociarse confieren una carga neta
negativa.

El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo eléctrico, donde el calor generado
es eficientemente disipado gracias a la acción de los pequeños capilares. Para este propósito, el
buffer utilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los capilares removiendo los H+ de
los radicales oxidrilos. Con ayuda de corriente eléctrica se generará un flujo de protones hacia el
cátodo, proceso conocido como flujo endo-osmótico

Este tipo de electroforesis permite separar una gran variedad de moléculas entre las cuales
tenemos: proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos, iones inorgánicos, bases orgánicas,
ácidos orgánicos y células en general.
En este sistema el tiempo de separación es relativamente corto (5 a 10 minutos), mientras que la
eficiencia de separación es muy alta (Stellwagen,2009)

Ilustración 20 Esquema representativo de un modelo de electroforesis capilar (E= campo eléctrico, V = voltaje, d= distancia).

Electroforesis en campo pulsado (PFEG)

Es una técnica diseñada especialmente para la separación de ADN de alto peso molecular (>100
kilopares de bases). PFEG (Pulsed-Field Electrophoresis Gel) opera alternando dos diferentes
campos eléctricos sobre una matriz de agarosa; de esta manera es posible alterar la migración del
ADN hacia diferentes direcciones facilitando la separación de dos grandes moléculas de ADN.
(Huang, 2010)

La reacción de Feulgen (citología)

La reacción de Feulgen actualmente es el método de elección para la determinación cuantitativa

de ADN en muestras histológicas y citológicas.

Principio
La reacción de Feulgen se basa en la reacción específica entre el reactivo de Schiff y la 2-
desoxirribosa en ácidos nucleicos. Sólo después de la separación de las bases de purina y
pirimidina quedará efectuada una hidrólisis ideal del ADN, posibilitándose de esta manera la
liberación del máximo número de grupos aldehído. La cantidad de ADN puede ser medida a través
de la absorción de luz. Contrariamente a esto, el ARN es inestable bajo las condiciones de la
reacción de Feulgen y, por consiguiente, no puede ser determinado. Para la fiabilidad de la
medición del ADN resulta esencial la reproducibilidad de la reacción de Feulgen.
Resultado
1. Núcleos celulares rojo a violeta
2. Citoplasma incoloro
3. Fondo incoloro

Caso de estudio: Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of Nine Clinically Relevant
Antibiotic Resistance Genes in Staphylococcus aureus

Resumen. En este estudio se describe un ensayo de PCR multiplex para la detección de nueve
genes de resistencia a antibióticos clínicamente relevantes de Staphylococcus aureus. Las
condiciones fueron optimizadas para amplificar fragmentos de mecA (resistencia a meticilina),
aacA-aphD (resistencia a aminoglucósidos), tetK, tetM (resistencia a tetraciclina), erm(A), erm(C)
(resistencia a macrólido-lincosamida-estreptogramina B), vat(A), vat(B) y vat(C) (resistencia a
estreptogramina A) simultáneamente en una amplificación de PCR. Se incluyó un par de primers
adicionales para la amplificación de un fragmento para el rDNA 16s staphylococcal, como control
positivo.

Introducción
Durante los últimos años, la prevalencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA)
se ha incrementado en muchas partes del mundo. Muchas infecciones ocasionadas por MRSA se
asocian a un aumento de la mortalidad en comparación con las infecciones de Staphylococcus
aureus susceptibles a la meticilina. Se han observado las dinámicas de los clones MRSA durante
años pasados y se ha detectado la prevalencia de nuevas cepas causantes de epidemias con patrones
de resistencia menos amplios. Por otra parte, también se han reportado brotes de cepas causantes
de epidemias “viejas” que han adquirido resistencia a antibióticos. Es por ello, que la detección de
genes que confieren resistencia a los “viejos” antibióticos se ha convertido en clínicamente
relevante de nuevo. Por estas razones, diagnósticos rápidos para MRSA deberían incluir test de
resistencia para antibióticos “viejos” estándares, así como para compuestos recientemente
introducidos.
Se reporta un ensayo de PCR multiplex basado en la demostración de los genes de resistencia más
frecuentes para diferentes grupos de antibióticos.

Materiales y métodos
Cepas bacterianas. Las cepas utilizadas de Staphylococcus aureus fueron proporcionadas por el
National Reference Center for Staphylococci en Alemania.
Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Se evaluó la resistencia a antibióticos de las cepas
utilizadas en el estudio.
Extracción de ADN. El ADN fue extraído de 10 colonias aisladas con un kit para lograr la lisis
bacteriana.
PCR Multiplex para la detección de genes selectos de resistencia a antibióticos. Los primers
utilizados se muestran en la tabla 1. Primero se llevó a cabo una PCR sencilla para cada gen que
se buscaba amplificar. Posteriormente, la PCR Multiplex fue llevada a cabo en un volumen de 100
μl con: 40 ng de DNA templado, 10 pmol de cada uno de los 20 primers, una concentración final
de 0.4 mM de cada desoxirribonucleótido trifosfato y 5 U de Taq polimerasa, con un buffer
proporcionado por el fabricante. La concentración de MgCl 2 fue ajustada a 4mM. Las condiciones
del ciclo de reacción fueron: Desnaturalización inicial a 94°C por 30 minutos, seguida de 30 ciclos
de amplificación a 94°C por 30 s, hibridación a 55°C por 30 s y extensión a 72°C por 30 s (excepto
por el ciclo final, el cual fue de 4 minutos). Los productos de amplificación se analizaron en un
gel de agarosa al 2.5% a 80 V por 200 minutos para separar los productos de amplificación
eficientemente.
Hibridación Southern. Se llevó a cabo mediante procedimientos estándar.
Tabla 1 Características de los primers utilizados en el estudio

Resultados
PCR multiplex para la detección de genes selectos de resistencia a antibióticos.
En la figura XA se muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio para ilustrar los
resultados típicos obtenidos con una sola amplificación de PCR y la PCR multiplex optimizada,
respectivamente. También se utilizó un kit (Agilent Bioanalyzer con Agilent DNA LabChip kit)
con el fin de reducir el tiempo de análisis del producto amplificado. Los resultados obtenidos se
muestran en la figura XB.

Ilustración 21Productos de amplificación de PCR simple y multiplex.

Correlación entre evaluación de susceptibilidad y PCR multiplex.

Se compararon los resultados de resistencia a antibióticos y los resultados del ensayo de PCR
multiplex para la detección simultánea de genes de resistencia a antibióticos de Staphylococcus
aureus. Se encontró que la PCR fue llevada a cabo de forma eficiente. De 28 cepas resistentes a la
oxacilina, todas poseían el gen mecA. Todas las cepas resistentes a la gentamicina mostraron el
gen aacA-aphD. De 23 cepas resistentes a la eritromicina y/o clindamicina, 15 poseían el gen
erm(A), 8 el gen erm(C) y una poseía ambos genes. 10 cepas fueron resistentes a la oxitetraciclina
y poseían tanto tetK, tetM o ambos. La única cepa resistente a quinupristina-dalfopristina mostró
poseer el gen vat(B).
 Ilustración 22 Ejemplo de PCR multiplex para 14 cepas diferentes de Staphylococcus aureus

Tabla 2 Correlación entre resultados de resistencia a antibióticos y PCR

Discusión.
El ensayo de PCR multiplex descrito incluye la detección de 9 genes importantes de resistencia en
una reacción, incluyendo la resistencia a compuestos viejos y antibióticos nuevos. Es fácil de
realizar y con un mayor costo-beneficio, además de que la técnica realizada toma alrededor de 6
h, pero esto se reduce a 2.5 horas utilizando kits de análisis del producto amplificado.
Como el número de fragmentos de ADN a amplificar simultáneamente en una PCR es limitado,
se escogieron los genes más frecuentes asociados a la resistencia de Staphylococcus aureus a
antibióticos clínicamente relevantes. La cantidad mínima de ADN templado que puede ser
detectado con la presente técnica es de 100 pg. Por lo tanto, este ensayo puede ser adaptado para
su uso directo en la detección de cultivos de sangre positivos o de muestras clínicas normales
estables como sangre u orina.
 Comparación de protocolos de extracción de ADN con muestras de aleta y larva de peces:
extracción modificada con cloruro de sodio
Resumen:
El uso de apropiados métodos de muestreo, tipo de tejido y la utilización de protocolos viables de
extracción del ADN son aspectos críticos en estudios basados en PCR. Los métodos de extracción
de ADN deben ser simples, reproducibles, económicos y no contaminantes. Este trabajo tuvo por
objetivo comparar un protocolo modificado de extracción con sal común (NaCl) y un protocolo
modificado de extracción con fenol-cloroformo para la obtención de ADN genómico en alta
cantidad y calidad desde muestras de aleta y larva de pez (Brycon orbignyanus, Piaractus
mesopotamicus, Oreochromis niloticus, Leporinus elongatus y Prochilodus lineatus). Las
muestras aisladas de diferentes especies de peces usando la extracción con sal común permitieron
obtener ADN de buena calidad (relación DNA/RNA 1.8-2.2) y fue usado con éxito en la
amplificación de los marcadores moleculares RAPD y microsatélite. Esto demostró la misma
efectividad de la extracción de ADN con sal común en comparación con el protocolo modificado
de extracción con fenolcloroformo. Este procedimiento de extracción de ADN constituye una
alternativa y un reemplazo eficaz para los protocolos anteriores para mejorar los estudios
moleculares en peces.

Introducción
El uso de marcadores moleculares, por ejemplo, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
y microsatélites, permiten que el análisis del potencial genético de un pez, de una comunidad o
una población sea determinada con mayor precisión, antes de la expresión de su fenotipo. De este
modo se puede estimar la diversidad genética, necesaria para estudiar prácticas de manejo y
conservación de peces, inclusive para aquellas especies en riesgo de extinción. Sin embargo, la
viabilidad de estos estudios es frecuentemente limitada por la dificultad de aislar ADN, en cantidad
y calidad suficiente, desde pequeñas muestras de tejidos.
El uso del protocolo de extracción con fenolcloroformo ha sido el método más usado para obtener
ADN genómico de peces. Estos protocolos tienen buenos resultados para muestras de diversos
orígenes. Sin embargo, es un método lento, laborioso y contaminante. La extracción de ADN
usando el protocolo con sal común (NaCl) es una alternativa simple, fácil, rápida y no
contaminante que permite obtener ADN de buena calidad, en cantidades suficientes, desde
muestras de tejido de peces.

Materiales y métodos
Material biológico y protocolos. Muestras (aproximadamente 200-300 mg) de aletas caudales y
larvas se obtuvieron desde cinco individuos de diferentes especies de peces.
Protocolo modificado de extracción con
Protocolo modificado de extracción con sal
fenolcloroformo.
común
550 μL de solución tampón de lisis 550 μL de solución tampón de lisis
1% de SDS 1% de SDS
7 μL de 200 μg·mL1 de proteinasa K. 7 μL de 200 μg·mL-1 de proteinasa K
Se incubó en un baño termorregulado a 50°C por
incubaron en baño termorregulado a 50°C por 12 h
12 h
ADN fue purificado con dos extracciones
Adicionó 600 μL de NaCl 5M separadas de fenol y tres extracciones separadas
de cloroformo
 El ADN se precipitó con 750 μL de etanol
Centrifugar por 10 min a 12000 rpm
absoluto frío y con 300 μL de acetato de sodio.
Se precipitó el ADN con 700 μL de etanol
Se incubó en un congelador a -20°C por 2 h
absoluto frío
Se centrifugan con 700 μL de etanol al 70%, se
Se incubó a -20°C por 2 h
resuspendieron en tampón TE
Lavados con 700 μL de etanol 70% y Se incubó en baño termorregulado a 37°C por 40
resuspendidas en tampón min
30 μg·mL-1 de ARNsa e incubado en baño de
agua por 40 min a 37°C

Integridad y cuantificación del ADN La integridad del ADN se verificó por electroforesis
horizontal utilizando un gel de agarosa 1%, 70 V por 60 min, en tampón TBE.
Amplificación por RAPD Muestras de ADN de todas las especies extraídas por ambos protocolos
fueron utilizadas en la amplificación de un partidor específico mediante el marcador molecular
RAPD.
Amplificación por microsatélites El ADN de P. mesopotamicusse amplificó con tampón 1xTris-
KCl, MgCl2, partidor Pme14, conteniendo l dNTP, una unidad de Platinum Taq ADN polimerasa
y 1 de ADN para larvas y aleta, respectivamente.

Tabla 3 Marcadores Moleculares

Resultados
El protocolo modificado de extracción con sal común permitió obtener un ADN íntegro a partir de
muestras de aleta y larva, sin signos de degradación o fragmentación y con una baja extracción de
contaminantes (proteínas y ARN). Las muestras tratadas con ARNsa mostraron un ADN libre de
ARN.

Ilustración 23 Comparación de la amplificación por el marcador RAPD de aletas (1, 2, 3, 4 y 5) y larvas de peces (6 y 7)
usando el protocolo modificado de extracción con sal (Sal) y el protocolo modificado de extracción con fenol-cloroformo (F/C)
para Brycon orbigny
 Ilustración 24 Amplificación de larvas (1 a 10) y aletas (muestras 11 a 20) de Piaractus mesopotamicus por el marcador
molecular microsatélite, usando el protocolo modificado de extracción con sal.

Conclusiones
Este estudio demostró la efectividad del protocolo modificado de extracción con sal común
desarrollado en este trabajo. Este es un método simple, reproducible, económico y no
contaminante, posible de utilizar para la obtención de ADN a partir de muestras de aleta y larva
de peces. Mediante la amplificación utilizando los marcadores moleculares RAPD y microsatélite,
se confirmó su utilidad y reproducibilidad en estudios genéticos basados en PCR.

De acuerdo con los resultados de este estudio, se demostró la necesidad de la utilización de la

ARNsa durante la extracción de ADN. El ADN extraído a partir de larvas tuvo mejor calidad que
el extraído a partir de muestras de aleta. Mayores cantidades de ADN se obtuvieron al utilizar el
protocolo de extracción con sal común comparado con el protocolo de fenol-cloroformo. Al
analizar las amplificaciones de RAPD y microsatélite realizadas utilizando el ADN extraído con
el protocolo de sal común se obtuvieron amplificaciones claras y reproducibles.

BIBLIOGRAFÍA
• Bodine, D. (s.f.). Regulación génica. NHGRI: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Regulacion-
genica
• Castillo, F. (2005). Biotecnología Ambiental. Editorial Tébar.
• De Guglielmo C, Z. M., & Fernandez Da Silva, R. (2016). Principales promotores utilizados en la
transformación genética de plantas. Revista Colombiana de Biotecnología, 18(2), 119-128.
• Garibyan, L., & Avashia, N. (2013). Research techniques made simple: polymerase chain reaction (PCR).
The Journal of investigative dermatology, 133(3), e6.
• Giuliano, S. M., & Ferrari, M. R. MORFOMETRÍA DEL NÚCLEO Y DE LA CABEZA DE
ESPERMATOZOIDES DE LLAMAS.
• Green, M. R., & Sambrook, J. (2019). Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor
Protocols, 2019(1), pdb-top100388.
• Green, M. R., & Sambrook, J. (2018). Hot start polymerase chain reaction (PCR). Cold Spring Harbor
Protocols, 2018(5), pdb-prot095125.
• Huang Q, Baum L, Fu WL. 2010. Simple and practical staining of DNA with GelRed in agarose gel
electrophoresis. Clin Lab 56: 149–152.
• Johansson, B. G. (1972). Agarose gel electrophoresis. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory
Investigation, 29(sup124), 7-19.
• Khan Academy. (s.f.). Factores de transcripción. KhanAcademy: https://es.khanacademy.org/science/ap-
biology/gene-expression-and-regulation/regulation-of-gene-expression-and-cell-
specialization/a/eukaryotic-transcription-factors
• Khan Academy. (s.f.). Procesamiento de pre-ARNm eucarionte. https://es.khanacademy.org/science/ap-
biology/gene-expression-and-regulation/transcription-and-rna-processing/a/eukaryotic-pre-mrna-processing
• Khan Academy. (s.f.). Regulation after transcription. Recuperado de
https://www.khanacademy.org/science/biology/gene-regulation/gene-regulation-in-eukaryotes/a/regulation-
after-transcription
• Kindler, S., Wang, H., Richter, D., & Tiedge, H. (2005). RNA transport and local control of translation.
Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 21, 223-245.
• Lorenz, T. C. (2012). Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization
strategies. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (63), e3998.
• Lopera-Barrero, N. M., Povh, J. A., Ribeiro, R. P., Gomes, P. C., Jacometo, C. B., & Silva Lopes, T. D.
(2008). Comparación de protocolos de extracción de ADN con muestras de aleta y larva de peces: extracción
modificada con cloruro de sodio. Ciencia e investigación agraria, 35(1), 77-86.
• McPherson, M., Møller, S. (2006). PCR. Taylor & Francis Group.
• Marchat, L. y Castañón, C. (2008). El mensajero de la célula. La casa del tiempo, 1(5),73-76.
http://www.uam.mx/difusion/casadeltiempo/05_iv_mar_2008/casa_del_tiempo_eIV_num05-06_73_75.pdf
• Margulies, E. (s.f.). Promotor. NHGRI: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Promotor
• Markoulatos, P., Siafakas, N., & Moncany, M. (2002). Multiplex polymerase chain reaction: a practical
approach. Journal of clinical laboratory analysis, 16(1), 47-51.
• Rahman, M. T., Uddin, M. S., Sultana, R., Moue, A., & Setu, M. (2013). Polymerase chain reaction (PCR):
a short review. Anwer Khan Modern Medical College Journal, 4(1), 30-36.
• Mattei, J. y Garcia, M. A. (2002). El genoma humano / The Human Genome (pp 44-45). Complutense.
https://books.google.com.mx/books?id=2Rq8HRFZ5ccC&pg=PA44&dq=genomica&hl=es-
419&sa=X&ved=2ahUKEwitodaowuzsAhVBVc0KHdwUDU4Q6AEwBHoECAQQAg#v=onepage&q=ge
nomica&f=false
• Oatey P. 2007. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology: How to increase senstivity and
reduce integration times. Biotechniques43: 376–377.
• Agnez-Lima LF, Medeiros SRB, Marquez RCP, Pinheiro MM, Menck CFM. Processos de reparo de DNA:
garantindo a estabilidade do material genético. In: Valter Kuchenbecker, Director. Mutagênese Ambiental.
1st ed. Universidade Luterana do Brasil: ULBRA; 2003. p. 49-80.
• Thompson CL, Sancar A. Photolyase/cryptochrome blue-light photoreceptors use photon energy to repair
DNA and reset the circadian clock. Oncogen 2002; 21(58):9043-56.
• Deisenhofer J. DNA photolyases and cryptochromes. Mutat Res 2000; 460(3-4):143-9.
• Thiagarajan V, Villette S, Espagne A, Eker APM, Brettel K, Byrdin M. DNA repair by photolyase: a novel
substrate with low background absorption around 265 nm for transient absorption studies in the UV.
Biochemistry 2010; 49(2):297-303.
• Sancar A. Cryptochrome: the second photoactive pigment in the eye and its role in circadian photoreception.
Annu Rev Biochem 2000; 69:31-67.
• Hazlehurst LA, Dalton WS. De Novo and Acquired Resistance to Antitumor Alkylating Agents. In: Teicher
BA, editor. Cancer Drug Resistance. Humana Press; 2006. p. 377-89.
• Margison GP, Povey AC, Kaina B, Koref S, F M. Variability and Regulation of O6-Alkylguanine-DNA
Alkyltransferase. Carcinogenesis 2003; 24(4):625-35.
• Pegg AE, Dolan ME, Moschel RC. Structure, Function, and Inhibition of O6-Alkylguanine-DNA
Alkyltransferase. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Academic Press; 1995. p. 167-
223.
• P, Surat. (2019). Types of Protein Post-Translational Modification. News-Medical: https://www.news-
medical.net/life-sciences/Types-of-Protein-Post-Translational-Modification.aspx.
• Kornblihtt, A. (2017). Genoma humano. CDELS. http://www.salud.gob.ar/dels/entradas/genoma-humano
• Silva Zolezzi, I. (2011). Genómica y medicina. Scielo. http://www.scielo.org.mx/pdf/eq/v22n1/v22n1a4.pdf
• Stellwagen NC, Stellwagen E. 2009. Effect of the matrix on DNA electrophoretic mobility. J Chromatogr A
1216: 1917–1929.
• Strommenger, B., Kettlitz, C., Werner, G., & Witte, W. (2003). Multiplex PCR assay for simultaneous
detection of nine clinically relevant antibiotic resistance genes in Staphylococcus aureus. Journal of clinical
microbiology, 41(9), 4089-4094.
• Udvardi, M. K., Czechowski, T., & Scheible, W. R. (2008). Eleven golden rules of quantitative RT-PCR.
The Plant Cell, 20(7), 1736-1737.