1

Justificación

Las plantas han sido utilizadas desde tiempos remotos con fines curativos para buscar nuevos
agentes terapéuticos y siguen siendo una alternativa importante en la medicina moderna (García
y Morales, 2005).

En la actualidad existe un interés creciente por el estudio y la utilización de las plantas
medicinales, tanto en países desarrollados, como en aquellos en vías de desarrollo (García y
Morales, 2005). Se ha incrementado el interés por las sustancias extraídas de plantas, debido
quizá a la falta de eficacia de algunos tratamientos alopáticos, al abuso o inadecuado uso de las
drogas sintéticas, incrementando así sus efectos secundarios y a que un gran porcentaje de la
población mundial no tiene acceso a los tratamientos farmacológicos convencionales (Rates,
2001).

Los tratamientos tradicionales (folklóricos) de plantas medicinales han sido utilizados en el
manejo de diversas enfermedades. Así por ejemplo, para el tratamiento de la Enfermedad de
Parkinson (EP), basados en los principios de la medicina Ayurveda, se recomienda una cocción
en leche de varias especies de plantas: Mucuna pruriens (especie principalmente encontrada en
India), semillas de Hyosciamus reticulates, Withania somnifera y raíces de Sida cardifolia. Por
otro lado, ya existen preparados comerciales de M. pruriens que están actualmente disponibles
en India (Nagashayana et al, 2000).

Diferentes preparaciones de las semillas de M. pruriens se han utilizado en el manejo de la EP
debido a que es una buena fuente de L-3,4-dihidroxifenil-alanina (L-Dopa). Estudios
fitoquímicos del extracto alcohólico fraccionado de las semillas de esta planta, demostraron la
presencia además de otras sustancias químicas, entre ellas, compuestos indólicos como la
triptamina y la 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Tripathi y Upadhyay, 2001).

La EP es un síndrome clínico que se presenta principalmente en adultos mayores, en la mayoría
de los casos llega a ser incapacitante, y sus tres principales síntomas son el tremor en reposo, la
acinesia y la bradicinesia, además genera alteraciones de la marcha (Zigmond et al, 2002). La EP
idiopática posee como característica fisiopatológica clásica, la pérdida de neuronas
dopaminérgicas pigmentadas de la parte compacta (pc) de la sustancia negra en el mesencéfalo,
que es la región con mayor cantidad de células dopaminérgicas del sistema nervioso central
(SNC) (Gibb, 1992).

Otro de los centros cerebrales de control del movimiento implicado en la EP, es el cuerpo
estriado. Dentro de éste, existen interneuronas colinérgicas; las cuales reciben aferencias
corticales glutamatérgicas excitatorias. Estas interneuronas son controladas colateralmente por la
vía dopaminérgica proveniente de la sustancia negra (pc), que al activarse inhibe la liberación de
acetilcolina de estas interneuronas. Es por esto, que uno de los tratamientos iniciales en la EP
fueron los anticolinérgicos (Braunwald et al, 2001). En relación con lo anterior, distintos
metabolitos producidos por el género Mucuna, podrían tener un efecto anticolinérgico,
mejorando de esta manera los signos y síntomas de la enfermedad (Morais et al, 2004).

2

Hussain y Manyam (1997), evaluaron el efecto que producía un preparado de endocarpo de
Mucuna pruriens mezclado con la alimentación, en ratas macho Sprague-Dawley. Ellos
compararon dos dosis de L-Dopa (125 y 250 mg/Kg) + carbidopa, utilizando para tal efecto, el
modelo animal de lesión unilateral con 6-hidroxidopamina (6-OHDA). En este estudio, se
demostró que Mucuna pruriens, posee casi el doble de la actividad antiparkinsoniana que la
obtenida con L-Dopa + carbidopa. Basándose en lo anterior, los autores sugierieron que el
endocarpo de M. pruriens además de L-Dopa podría contener otros componentes con actividad
antiparkinsoniana aún no identificados, u otras sustancias que potencien la eficacia de ese
compuesto.

En el trabajo de tesis realizado por Molina y Solís (2003), de manera análoga a Hussain y
Manyam, se obtuvo evidencia del efecto antiparkinsoniano del extracto hidroalcohólico crudo de
Mucuna urens, una de las especies de este género que se encuentra en C.R. El tratamiento con M.
urens + carbidopa (intraperitoneal), mostró un efecto antiparkinsoniano mayor que el efecto
obtenido utilizando L-Dopa + carbidopa administrado por la misma vía (Molina y Solís, 2003).

En otro estudio del Dr. Fornaguera y la Dra. Badilla aún no publicado, M. urens provocó una
disminución en la distancia recorrida por el carbón activado en la prueba de tránsito intestinal
con ratas comparado contra solución salina; sugiriendo de este modo, la presencia de
componentes anticolinérgicos dentro del extracto crudo.

Además, otros estudios preliminares aún no publicados llevados a cabo en cultivos de células
PC-12 (por interés del Dr. Jaime Fornaguera en Córdoba, España), sugieren que el
pretratamiento de dichas células con el mismo extracto de M. urens tiene un efecto
neuroprotector ante dosis crecientes de 6-OHDA. En el mismo estudio se demostró además un
leve efecto de proliferación celular.

Los hallazgos positivos encontrados hasta ahora en relación con el extracto de M. urens (Molina
y Solís, 2003) fundamentan este trabajo, el cual pretende implementar estudios experimentales
que permitan por un lado, comprender mejor los mecanismos subyacentes de los efectos
observados, y por el otro, intentar sugerir las moléculas responsables.

Por otra parte, los efectos nocivos reportados en la literatura sobre la utilización crónica de L-
Dopa en pacientes con la EP (Yahr, 1993), se convierten en una motivación adicional para
continuar con más estudios experimentales sobre posibles tratamientos que permitan
disminuirlos.


Objetivo General
Evaluar el efecto muscarínico in vitro del extracto crudo y fraccionado de las semillas de
Mucuna urens, mediante un modelo celular de receptores acoplados a proteínas G.



3

Objetivos Específicos

Realizar la recolecta, el secado y la molienda de las semillas de Mucuna urens, para preparar el
extracto hidroalcohólico.

Preparar por percolación el extracto hidroalcohólico 8:2 de las semillas molidas de M. urens.

Elaborar un liofilizado a partir del extracto hidroalcohólico obtenido de las semillas de Mucuna
urens.

Efectuar pruebas fitoquímicas preliminares en M. urens para la identificación de grupos de
metabolitos secundarios.

Determinar el efecto farmacológico in vitro del extracto hidroalcohólico crudo de M. urens sobre
receptores muscarínicos y sobre receptores para quimiocinas asociados con proteínas G.

Obtener la huella digital cromatográfica del extracto hidroalcohólico crudo de las semillas de
Mucuna urens.

Llevar a cabo el fraccionamiento cromatográfico biodirigido del extracto hidroalcohólico crudo
de M. urens.

Determinar el efecto farmacológico de las fracciones del extracto hidroalcohólico de M. urens
separadas por HPLC sobre receptores muscarínicos asociados con proteínas G.


Marco Teórico
Enfermedad de Parkinson
La EP, es un desorden progresivo del SNC, que se caracteriza por la degeneración de las
neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra, parte compacta. En muchos casos en estas
neuronas ocurre además la aparición de inclusiones eosinófilas intracelulares, llamadas cuerpos
de Lewy (Braunwald et al, 2001). En la EP, los síntomas característicos no aparecen hasta que el
grado de pérdida celular alcanza casi un 80 % de la población de las neuronas en el caudado
putamen y de un 60% en la sustancia negra (Braunwald et al, 2001; Zigmond et al, 2002). La EP
se caracteriza clínicamente por: temblor en reposo, rigidez, bradicinesia (lentitud en los
movimientos), dificultad con el balance corporal, depresión y demencia (Young, 1999).




4

Bases celulares de la EP
Resulta importante conocer los principios básicos del funcionamiento cerebral, relacionados con
la EP, puesto que este conocimiento, permite comprender los signos y síntomas de la
enfermedad, así como las posibles dianas de tratamiento farmacológico alopáticas y folclóricas.
Las neuronas de la parte compacta de la sustancia negra envían impulsos dopaminérgicos hacia
el cuerpo estriado (vía nigroestriatal), el cual forma parte de los ganglios basales (Hardman et al,
2001).

A su vez, los ganglios basales se pueden considerar como un asa lateral reguladora que controla
el flujo de información desde la corteza hacia las neuronas motoras de la médula espinal. Un
subgrupo pequeño pero importante, de las neuronas estriatales incluye interneuronas
colinérgicas, las cuales dentro del cuerpo estriado hacen sinapsis con neuronas gabaérgicas
(Hardman et al, 2001).





Figura 1. Diagrama de los circuitos cerebrales en los ganglios basales en estado normal
(modificado de Hardman et al, 2001).


La emisión de impulsos desde el cuerpo estriado se efectúa por dos vías distintas denominadas
directa e indirecta (Hardman et al, 2001). La vía directa está formada por neuronas del cuerpo
estriado que se proyectan hacia la parte reticulada de la sustancia negra y la parte medial del
STR
SNpc GPL SNT
Tálamo
VA / VL
SNpr / GPM
Corteza Cerebral
Neuronas
Glutamatérgicas
excitadoras.
Neuronas
Gabaérgicas
inhibitorias.
Neuronas
Dopaminérgicas.


+
-
STR = cuerpo estriado
(neoestriado)
SN = sustancia negra, pc = pars
compacta y pr = pars reticulata
GP = globo pálido, L = lateral
(externo), M = medial (interno)
STN = núcleo subtalámico
VA = ventroanterior
VL = ventrolateral
Vía
Indirecta
D
2
D
1

Vía
Directa
5

globo pálido (ver figuras 1 y 2); mientras que la vía indirecta está formada por neuronas estriato-
palidales que se unen con la parte lateral del globo pálido, luego otras neuronas conectan con el
núcleo subtalámico, y este a su vez con el globo pálido medial (Gerfen, 2006).


Figura 2. Diagrama de los circuitos cerebrales en los ganglios basales con Enfermedad de
Parkinson (modificado de Hardman et al, 2001). En el diagrama las líneas punteadas representan
una disminución en la actividad de la vía, mientras que las líneas más gruesas simbolizan una
actividad aumentada en la vía esquematizada.

El neurotransmisor de la vía directa es el ácido γ-amino butírico (GABA), un neurotransmisor
con funciones inhibidoras; cuyo efecto neto de estimulación por la vía directa, consiste en un
incremento de la emisión de impulsos excitadores del tálamo hacia la corteza (ver figuras 1 y 2).
Por tanto, la dopamina que se descarga en el cuerpo estriado tiende a incrementar la actividad de
la vía directa y a reducir la de la vía indirecta, en tanto que, el agotamiento del neurotransmisor
que ocurre en la EP tiene el efecto opuesto (ver figura 2) (Hardman et al, 2001).

El éxito de este modelo de función de los ganglios basales, radica en que explica los síntomas
observados en casos de EP, como una consecuencia de la pérdida de neuronas dopaminérgicas
por el efecto diferencial de la dopamina en las vías directa e indirecta (ver figura 2). Las
neuronas dopaminérgicas de la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) inervan todas las
partes del cuerpo estriado; sin embargo, las neuronas estriatales expresan dos tipos distintos de
receptores de dopamina. Las neuronas estriatales que originan la vía directa, expresan
primordialmente el receptor dopaminérgico D
1
, cuya respuesta está asociada a un aumento de
adenilatociclasa (AC). En tanto que las neuronas estriatales que forman la vía indirecta, expresan
fundamentalmente el D
2
cuya respuesta está asociada a una disminución de AC (Marsden, 2006).

SNpc PGL SNT
SNpr / GPM
Corteza Cerebral
STR
Tálamo
VA / VL

Vía
Indirecta
D
1
D
2

Vía
Directa
Neuronas
Glutamatérgicas
excitadoras.
Neuronas
Gabaérgicas
inhibitorias.
Neuronas
Dopaminérgicas.

+
-
6

Manifestaciones clínicas
Algunas de las manifestaciones más comunes y evidentes al avanzar la EP como se mencionó
anteriormente, son el temblor en reposo, la bradicinesia y la rigidez. El temblor empeora con la
ansiedad. Suele comenzar con movimientos rítmicos de flexo-extensión de una o ambas
extremidades del mismo lado, antes de generalizarse. La manifestación más incapacitante es la
bradicinesia, que consiste en un enlentecimiento de los movimientos voluntarios asociado con
una disminución de los movimientos automáticos, como el balanceo de los brazos al caminar. La
fuerza en las extremidades se conserva, pero los movimientos finos y los movimientos alternos
rápidos están alterados (Braunwald et al, 2001). La expresión facial se vuelve fija, las hendiduras
palpebrales se ensanchan y el parpadeo es escaso. La combinación de temblor, rigidez y
bradicinesia, hace que la letra se vuelva pequeña, temblorosa y con frecuencia ilegible
(Marjama-Lyons y Koller, 2001). La voz se vuelve hipofónica (débil) y poco modulada. Los
pacientes tienen dificultad para levantarse de la cama o de una silla, y tienden a adoptar una
postura en flexión cuando están de pie. Con frecuencia les cuesta iniciar la marcha, y tienen que
inclinarse cada vez más hacia adelante para conseguir comenzar a caminar. En los estadios
finales, la marcha es a pasos cortos, arrastrando los pies, sin balanceo de los brazos, inestable en
los giros, y pueden tener dificultad para detenerse. Algunos pacientes caminan con una marcha
festinante, es decir con una velocidad cada vez mayor para evitar caerse, debido a que su centro
de gravedad ocupa una posición anormal (Braunwald et al, 2001; Marjama-Lyons y Koller,
2001).
Tratamiento farmacológico sintomático
Muchas investigaciones acerca del Parkinson y sus posibles curas se realizan en el mundo entero,
pero pese a todos esos esfuerzos aún no se dispone en el mercado de un tratamiento que logre
revertir completamente la enfermedad. Los tratamientos actuales se dirigen a compensar los
desajustes fisiológicos y paliar los síntomas. Desde un inicio, el tratamiento de la EP se ha
dirigido a restablecer la función del sistema dopaminérgico; el cual, como ya se mencionó, se
encuentra fuertemente afectado en esta enfermedad.

El tratamiento más utilizado es la levodopa (L-Dopa) por sus evidentes beneficios terapéuticos.
El uso de la levodopa, precursor metabólico de la dopamina provoca una mejoría sintomática
especialmente sobre la bradicinesia. La presencia en la mucosa intestinal de la dopa
descarboxilasa, que convierte la levodopa en dopamina, hace que se pierda la mayor parte de la
dosis ingerida antes de que entre en la circulación general. Por esa razón, la L-Dopa se
administra con un inhibidor extracerebral de la dopa-descarboxilasa (carbidopa en EU y
benserazida en Europa), el cual disminuye su transformación periférica en dopamina (que no
pasa la barrera hematoencefálica). De esta manera se disminuye la incidencia de efectos
secundarios periféricos producidos por ese neurotransmisor y se aumenta la biodisponibilidad del
medicamento en sangre y en cerebro (Braunwald et al, 2001).

Los efectos secundarios iniciales más frecuentes de la levodopa son: náuseas, vómitos,
hipotensión postural y en algunos casos arritmias cardiacas. La utilización crónica de este
tratamiento produce otros síntomas como movimientos anómalos (discinesias), inquietud motora
(acatisia) y confusión (Braunwald et al, 2001). Un problema habitual es la aparición del
7

“fenómeno de desgaste”; cada dosis de levodopa mejora de modo eficaz la movilidad durante
cierto periodo, pero rigidez y acinesia vuelven pronto al final del intervalo entre dosis. En las
etapas tardías de la EP, los pacientes pueden fluctuar con rapidez entre estar “inactivos” u “off”,
sin efectos beneficiosos de sus medicamentos, y estar “activos” “on” pero con discinesias
incapacitantes, situación que se ha denominado “fenómeno de actividad e inactividad”
(“encendido on y apagado off”) (Hardman et al, 2001; Marjama-Lyons y Koller, 2001).

Otro de los tratamientos más utilizados, han sido los antagonistas de los receptores muscarínicos.
Los cuales, actúan dentro del cuerpo estriado disminuyendo su actividad anormalmente elevada
en los pacientes con la EP (Hardman et al, 2001). Los antagonistas muscarínicos no selectivos
(fármacos anticolinérgicos), pueden ser útiles sobre todo para mejorar el temblor. Diferentes
preparados están disponibles en el mercado, tales como el trihexifenidilo, mesilato de
benztropina, clorhidrato de difenhidramina, la prociclidina y la orfenadrina (Braunwald et al,
2001).
Los efectos adversos de estos medicamentos son el resultado de sus propiedades
anticolinérgicas; causando así, problemas de sedación y confusión mental. También pueden
provocar estreñimiento, retención urinaria y visión borrosa (Hardman et al, 2001).

Otros tratamientos también usados para la EP son los agonistas del receptor de dopamina, los
inhibidores de la catecol-O-metil transferasa, los inhibidores de la enzima monoaminoxidasa
(MAO) y la amantadina (Hardman et al, 2001).

Entre los agonistas del receptor de dopamina están la bromocriptina (agonista D
2
y antagonista
D
1
), la pergolida (agonista mixto D
1
y D
2
), el ropinirol y el pramipexol (agonistas selectivos D
2
).
Esta clase de medicamentos tienden a ser más selectivos en sus acciones que la levodopa,
manifiestan buena selectividad por los diferentes subtipos de receptores; tienen acciones de
duración mucho más prolongada que la levodopa, y en muchos casos resultan útiles para tratar
las fluctuaciones del estado motor (Hardman et al, 2001).

Los inhibidores de la catecol-O-metil transferasa (COMT) como la tolcapona y la entacapona,
potencian los efectos beneficiosos de la levodopa al disminuir la conversión de levodopa a 3-O-
metildopa aumentando tanto la vida media plasmática de levodopa, como la fracción de cada
dosis que llega al sistema nervioso central.

La MAO es la enzima encargada de oxidar las monoaminas, esta presenta dos isoenzimas A y B,
que se encuentran tanto a nivel periférico como cerebral. La isoenzima MAO-B es la modalidad
predominante en el cuerpo estriado, y la que hace posible la mayor parte del metabolismo
oxidativo de la dopamina a este nivel. A dosis bajas, la seleginina es un inhibidor selectivo de la
MAO-B, lo cual da como resultado la inhibición irreversible de la enzima aumentando la
concentración de dopamina disponible (Hardman et al, 2001).
Modelo experimental de la EP inducido por 6-hidroxidopamina
Ya que el presente trabajo se motivó en los resultados obtenidos por Molina y Solís en el 2003 es
que se describe brevemente a continuación el modelo de 6-OHDA empleado por ellos.

8

De manera general, el desarrollo de los modelos animales de EP se ha orientado a inducir
modificaciones estructurales o funcionales de la transmisión dopaminérgica nigroestriada. Así,
estos modelos son de gran utilidad para el estudio del funcionamiento de los ganglios basales, la
actividad antiparkinsoniana de determinadas sustancias y la eficacia de posibles tratamientos
neuroprotectores (Luquin, 1998).

La 6-OHDA es un análogo sintético de la dopamina. El primer efecto descrito fue la capacidad
de inducir depleción noradrenérgica a nivel del sistema nervioso autónomo cardiaco. La acción
de la toxina sobre las neuronas dopaminérgicas y noradrenérgicas se debe a su analogía
estructural con las catecolaminas; así, cuando se administra en bajas concentraciones
intracerebralmente, se introduce a la neurona presináptica dopaminérgica por medio de un
sistema de recaptura de alta afinidad (Zigmond et al, 1992).

Una vez en el interior de la célula, la toxina provoca un aumento en el estrés oxidativo, que
afectará la estructura y función del ADN, produce la peroxidación lipídica, alterando las
estructuras de las membranas celulares y de un gran número de proteínas (principalmente los
puentes disulfuro). Por otro lado se ha visto que el estrés oxidativo causa la inhibición de la
actividad mitocondrial del complejo I, el desacople de la fosforilación oxidativa y la alteración
del potencial de membrana mitocondrial celular (Lambeng et al, 2002).

Incapaz de atravesar la barrera hematoencefálica, la 6-OHDA, no puede inducir lesión de la
sustancia negra en la rata, a menos que sea inyectada estereotáxicamente a nivel ventricular, en
la sustancia negra o en el cuerpo estriado. Desde el punto de vista conductual, una lesión
unilateral considerable del sistema dopaminérgico puede ser evidenciada mediante la
administración periférica de apomorfina o de anfetamina. Estos fármacos producen un
comportamiento giratorio característico contra-lateral o ipsi-lateral respectivamente. Así pues, el
comportamiento giratorio, permite sugerir un índice del grado de degeneración neuronal en los
animales y el efecto que pueden estar ejerciendo ciertas sustancias a este nivel (Lambeng et al,
2002).
Las plantas medicinales y su uso popular
En la actualidad existe un interés renovado y creciente por el estudio y la utilización de las
plantas medicinales, tanto en países desarrollados como en aquellos en vías de desarrollo. En
países desarrollados se trata, muchas veces de una moda, la cual intenta combatir el excesivo
consumo de fármacos de síntesis o evitar los efectos secundarios que de ellos se derivan. En
cambio, en los países en desarrollo se trata más bien de una opción alternativa para una gran
parte de la población, ante la imposibilidad por limitaciones económicas, de acceder a una
terapia farmacológica. Tanto en unos países como en otros, el resultado del uso de plantas
medicinales ha desembocado, en muchas ocasiones, en el abuso de drogas de origen vegetal, lo
cual apunta a la importancia de validar científicamente los efectos de las plantas de uso
medicinal y popular (García y Morales, 2005).

La etnobotánica (o el estudio del uso de las plantas en las sociedades tradicionales) ofrece
grandes posibilidades para descubrir nuevos productos útiles a la humanidad y para respaldar los
usos tradicionales de las plantas (Acuña, 1954).
9


Las diversas especies latinoamericanas de Mucuna, poseen una gran variedad de usos en la
medicina popular, razón por la cual es importante comprobar científicamente sus efectos y más
aun, realizar estudios fitoquímicos sobre los metabolitos que contienen y el efecto de estos a
nivel fisiológico.
Características y descripción de la planta estudiada
Nombre científico: Mucuna urens (L.) DC: Fabaceae
Nombre común: Ojo de buey, pica-pica (Ocampo, 1987).

Ubicación geográfica: es un bejuco propio de tierra templada, que ha sido introducido en un
gran número de países. Se utiliza como alimento humano ya sea en forma de harina, espesante
para sopas u condimento. El frijol entero (semilla), también es usado en los platos cotidianos de
muchos países de escasos recursos. Se usa además como alimento para animales, forraje
(pastura) y abono para suelos, ya que les proporciona nutrientes y minerales (aminoácidos,
calcio, magnesio e hierro). Su distribución es muy amplia, se encuentra en países de América
como México, Guatemala, Salvador, Honduras, Belice, Costa Rica, Colombia, Argentina, Brasil,
Estados Unidos y Hawai; así como en muchas partes de África: Nigeria, Ghana, Zambia,
Malawi, República de Benín, República de Guinea y Asia: China, Malasia, Madagascar, India,
Sri Lanka, Indonesia, Filipinas y Java entre otros (Eilittä et al, 2002).

En Costa Rica, se puede encontrar este tipo de trepadoras en los bosques y malezas del Valle
Central. También crece en tierras calientes del Pacífico, en el bosque nuboso de Monte Verde, en
manglares, cerros, crecimientos secundarios y hasta en las costas (Núñez, 1982).

Existen muchas especies a nivel mundial, de las cuales la más conocida y caracterizada es
Mucuna pruriens (St-Laurent et al, 2000). En nuestro país se encuentran aproximadamente 8
especies del género Mucuna identificadas y reportadas por el Instituto de Biodiversidad (INBIO):
Mucuna urens, M. holtonii, M. andreana, M. argyropyilla, M. mutisiana, M. deeringiana, M.
sloanei y M. rostrata. (a)

Descripción botánica de Mucuna sp: es un bejuco leñoso y de extenso crecimiento. Las hojas
son grandes, suavemente vellosas en el dorso; pedúnculos grandemente alargados y pendientes;
el fruto es una legumbre (vaina) de cerca de 18 cm de largo y 4.5 cm de ancho, con 3 a 4 semillas
negras ovoides, de aproximadamente 3 cm de largo cada una (ver figura 3). El término ojo de
buey se debe a la apariencia de las semillas (Agharkar, 1991; Caius, 1989; Rastogi y Mehrotra,
1994).

La planta Mucuna es una enredadera de brote anual, sus hojas son trifoliadas (tienen 3 lóbulos),
de forma elíptica o rómbica y anchas en la base. Los pecíolos son largos y sedosos, con un
tamaño entre 6.3 y 11.3 cm. Las flores se encuentran en racimos colgantes, con un color que va
desde blanco hasta morado oscuro. El fruto de esta planta es una vaina gruesa y rugosa. La
superficie total y los rebordes de la vaina están densamente cubiertos por tricomas (pelos
radicales o espinas) café pálido o amarillos, responsables del prurito al entrar en contacto con la
piel (Sastry y Kavathekar, 1990; Verma et al, 1993).
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Figura 3: Detalles morfológicos de Mucuna sp. (www.waynesword; www.cybertufle)
Usos y composición química de Mucuna sp
Las raíces, de acuerdo con “Ayurveda” (conocimiento concerniente a la longevidad), son
antihelmínticas, diuréticas, emolientes, afrodisíacas, purgantes, febrífugas y tónicas (Warrier et
al, 1996; Nadkarni, 2001). Son consideradas útiles para aliviar el estreñimiento, los problemas
menstruales, la amenorrea, la hidropesia, las neuropatías, las hemorroides, las úlceras gástricas
(Warrier et al, 1996).

Las semillas tienen conocido efecto astringente, expectorante y se usan en el asma, la tos y las
infecciones de la lengua (Prakash et al, 2001). Sin olvidar su uso más conocido en los síntomas
de la Enfermedad de Parkinson (Hussain et al, 1997; Manyam et al, 2004 (a); Vaidya et al,
1978).

Para Mucuna pruriens ha sido establecida su actividad como antidiabética (Akhtar et al, 1990;
Grover et al, 2002; Grover et al, 2003; Rathi et al, 2002), antiprotozoaria (Ekanem et al, 2004),
antiinflamatoria, antipirética, analgésica (Hishikar et al, 1981; Lauk et al, 1993) y
espermatogénica (Saksena et al, 1987).

Hay pocas investigaciones sobre la composición química de las semillas de Mucuna urens, por
esto aún no se tienen reportes sobre sus componentes. La única información publicada hasta el
momento, es la composición de las semillas de Mucuna pruriens. Esta planta de la misma
especie contiene una gran cantidad de compuestos, entre ellos: L-dopa de un 1% a un 5% (L-3,4-
dihidroxi-fenilalanina), glutatión, ácido gálico, bufotenina, colina, lecitina, serotonina, ácido 2-
amino-3-(3,4-dihidroxifenil) propánico, mucunina, NADH (nicotina adenina dinucleótido),
coenzima Q-10, ácidos grasos, prurienina, prurienidina y ácido 1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxi-
3-isoquinolinico (Manyam et al, 2004 (b); Prakash et al, 2001). Es además una buena fuente de
minerales como: calcio, magnesio y hierro (Bell et al, 1971; Eilittä et al, 2002; Rastogi y
Mehrotra, 1991 (a) y (b); Singh et al, 1995).

La actividad ejercida por las sustancias bioactivas que entran en contacto con los tejidos, se lleva
a cabo a nivel molecular por unión a sus receptores que desencadenan una respuesta
farmacológica. En los últimos años ha ocurrido un veloz avance en el conocimiento de la
estructura química y los mecanismos bioquímicos de acción de los receptores fisiológicos.
11

Tipos de receptores fisiológicos: Generalidades y clasificación
Las moléculas con que los fármacos son capaces de interactuar selectivamente, generándose
como consecuencia de ello una modificación constante y específica en la función celular, se
denominan receptores farmacológicos (Flórez, 1997).

La decodificación del genoma humano y la clonación han permitido la identificación y
descubrimiento de nuevos receptores. También se ha avanzado en la purificación de muchas
clases de receptores, proteínas efectoras y proteínas transductoras de señal mediante estrategias
genéticas de expresión celular. Con estos modelos, se logra inducir la expresión de receptores
endógenos y exógenos en muy diversos tipos celulares para facilitar su purificación y la
caracterización de sus mecanismos de acción (Hardman et al, 2001).

Existen varios tipos de receptores y de mecanismos bioquímicos de transducción asociados con
ellos tenemos a los receptores de membrana como por ejemplo los receptores enzima, los canales
iónicos, y los receptores acoplados a proteínas G. Además existen los receptores intracelulares,
como los receptores de hormonas esteroideas (Hardman et al, 2001; www.123bio.net). A
continuación se describirán en más detalle los receptores acoplados a proteínas G ya que serán
objeto de estudio en el presente trabajo.

Receptores acoplados a proteína G: es una gran familia de receptores conocidos como proteínas
G, que utilizan proteínas reguladoras heterotriméricas que unen GTP, para realizar la
transducción de señales hasta las proteínas efectoras. Los efectores regulados por proteínas G
incluyen enzimas como la adenilato ciclasa, la fosfolipasa C y los canales selectivos para calcio y
potasio. Los receptores acoplados a proteínas G, atraviesan las dos capas de la membrana
plasmática en forma de un haz de siete hélices alfa con el grupo amino en la cara extracelular y
el grupo carboxilo en la cara intracelular. Los ligandos pueden unirse de tres formas diferentes al
receptor: 1) los que se ligan a nivel de las regiones transmembrana del receptor sin interaccionar
con su grupo amino terminal. 2) los que se unen a nivel de los bucles extracelulares e
interaccionan con el grupo amino terminal del receptor. 3) los que se ligan al receptor solo por
unión al grupo amino terminal de extremo largo. Las proteínas G se ligan a la superficie
citoplasmática de los receptores. Los receptores de esta familia al ser estimulados por agonistas
promueven la unión de GTP con la proteína G y así la proteína se disocia y queda en su forma
activa. Los sistemas de proteínas G forman redes complejas de interacciones divergentes y
convergentes que permiten una regulación multifásica de la función celular (Hardman et al,
2001).
Segundos mensajeros citoplasmáticos
Algunas señales fisiológicas asociadas con los mecanismos de transducción anteriormente
citados, se integran dentro de la célula como resultado de interacciones entre vías de segundos
mensajeros. Entre los segundos mensajeros hidrofílicos más conocidos están el AMP, GMP
cíclicos, el inositol trifosfato (IP
3
) y los iones calcio; entre los mensajeros hidrófobos están el
óxido nítrico y el diacilglicerol.

12

Calcio: los iones de calcio constituyen un segundo mensajero bastante estudiado; su
concentración intracelular es regulada a través de diversos mecanismos: receptores de membrana
plasmática asociados con proteínas G; cambios en el potencial de membrana, los propios iones
potasio o calcio, y receptores en regiones especializadas del retículo endoplasmático que
reaccionan al IP
3
. El calcio citoplasmático es eliminado por extrusión y/o posterior retorno hacia
el retículo endoplásmico (Hardman et al, 2001).
Regulación de receptores
La estimulación ininterrumpida de células por agonistas suele culminar en un estado de
desensibilización (llamado también estado resistente o de regulación sustractiva), de modo que
disminuye el efecto que surge con la exposición continuada o ulterior del fármaco a la misma
concentración.
La desensibilización de la respuesta a un agonista, es llevada a cabo principalmente mediante
cuatro mecanismos: disminución de la concentración de agonista por degradación o recaptura
pre-sináptica; desacople funcional por fosforilación y unión de arrestinas; internalización de
complejos fosforilados ligando-receptor y regulación negativa del número de receptores en la
superficie celular (disminución de síntesis y degradación) (www.123bio.net).

La inhibición de señales por medio de retroalimentación puede limitarse a las que envía
solamente un receptor estimulado, llamado desensibilización homóloga. Mientras que la
desensibilización heteróloga comprende la inhibición o la pérdida de una o más proteínas
“corriente abajo” que participan en el envío y recepción de señales de otros receptores (Hardman
et al, 2001).

Dada la relación de la acetilcolina con el funcionamiento general de los ganglios basales, a
continuación se describen los receptores para este neurotransmisor.
Receptores muscarínicos su y transducción de señales
La acetilcolina es un neurotransmisor liberado de las terminales de nervios presinápticos en
vesículas, actuando luego sobre receptores nicotínicos y muscarínicos. Dos tipos de receptores de
acetilcolina, muy diferentes en cuanto a su estructura y función (Felder, 1995).
La familia de receptores muscarínicos fueron descubiertos gracias a su habilidad de unir el
alcaloide muscarina, derivado del hongo venenoso Amanita muscaria. Los receptores
muscarínicos están compuestos de una sola proteína con el mismo conjunto de características
estructurales unidas a la superfamilia de los receptores acoplados a proteínas G (Felder, 1995).

La estimulación del receptor M
1
activa la fosfolipasa C, resultando en la liberación del segundo
mensajero inositol 1,4,5-trifosfato (IP
3
) y la subsiguiente movilización de calcio intracelular (ver
figura 4). La activación de receptores cuyos efectos son mediados por la fosfolipasa C, resulta en
la liberación de diacilglicerol (DAG) e IP
3
a través de la hidrólisis del fosfolípido de membrana
fosfatidil inositol 4,5-bifosfato (PIP
2
). Mientras el DAG se une y estimula a la proteína cinasa C
(PKC), el IP
3
por su parte saca el calcio almacenado en el retículo endoplasmático por unión al
receptor de IP
3
(IP
3
R). La familia de enzimas fosfolipasa C (PLC) ha sido agrupada en tres clases
β, γ y δ; de las cuales PLC β ha sido sugerida en algunos experimentos, como el efector para el
13

receptor M
1
(Berstein et al, 1992). La activación del receptor M
2
en contraste, atenúa la
actividad de la adenilato ciclasa, reduciendo de este modo los niveles intracelulares de AMPc
(ver figura 4).



Figura 4: Resumen de las vías de transducción celular moduladas por receptores muscarínicos.
1) Receptores muscarínicos M
2
y M
4
correspondientes a la vía celular acoplada a Gi. 2)
Receptores muscarínicos M
1
, M
3
y M
5
correspondientes a la vía celular acoplada a Gq.
Modificado de Dautzenberg y Hauger, 2002 (Fig 2).

A través de la clonación, cinco subtipos de receptores muscarínicos han sido identificados y
denominados de M
1
hasta M
5
de acuerdo con su orden de descubrimiento (Felder, 1995). Los
receptores muscarínicos se agrupan generalmente de acuerdo con su acoplamiento funcional, por
la movilización de calcio intracelular (M
1
, M
3
y M
5
) o por su inhibición de la adenilato ciclasa
(M
2
y M
4
). Cada subtipo M
1
, M
3
y M
5
tiene el potencial adicional de activar la fosfolipasa A
2
, las
fosfolipasas C y D; además favorecen el influjo de calcio. Los subtipos M
2
y M
4
solo juegan un
rol adicional en el aumento de fosfolipasa A
2
(Felder, 1995).
Dinámica de las concentraciones de calcio intracelular
La activación de los receptores muscarínicos produce cambios típicos en el calcio intracelular,
caracterizados por una rápida espiga que representa la liberación de calcio estimulado por el IP
3

de los almacenes intracelulares, seguida en ocasiones de una fase de meseta luego de la espiga
14

rápida, que representa la entrada de calcio extracelular a través de canales de calcio. En células
excitables como las células musculares y las neuronas, el calcio pasa predominantemente a través
de un canal de calcio voltaje dependiente (VOCC) que se abre después de la despolarización de
la membrana. En células no excitables como las células epiteliales, el calcio pasa a través de una
familia poco caracterizada de canales de calcio insensibles a voltaje (VICC) (Felder, 1995).

Los VICC se abren en respuesta a la activación de un receptor y han sido clasificados en tres
grupos generales: 1) canales de calcio operados por receptor (ROCCs), los cuales son
independientes de segundos mensajeros, 2) canales de calcio operados por segundos mensajeros
(SMOCCs) y 3) canales de calcio operados por depleción (DOCCs), los cuales se abren después
de la depleción del almacén de calcio intracelular mediado por IP
3
y proveen una fuente para
volver a llenar los almacenes de calcio (ver figura 4A). La activación de los VICC mediada por
los receptores muscarínicos ha sido menos estudiada. Pero evidencia indirecta usando pruebas
fluorescentes de calcio intracelular, apunta a un rol de interacción de los receptores M
1
, M
3
y M
5

con todos los tipos de VICC mencionados (Felder, 1995).

Puesto que muchas patologías incluyendo la EP han sido asociadas con procesos inflamatorios,
es que resulta interesante estudiar además algunas de las vías relacionadas con la inflamación
como por ejemplo la de las citocinas de la familia CXCR.
Receptores para citocinas de la familia CXCR
Citocinas: las citocinas son proteínas solubles secretadas por muy diversos tipos celulares
hematopoyéticos y no hematopoyéticos. Su importancia es crucial para que las respuestas
inmunitarias innata y adaptativa se desarrollen con normalidad; su expresión puede alterarse en
la mayoría de las enfermedades inmunitarias, inflamatorias e infecciosas (Braunwald et al,
2001).

Las citocinas participan en la regulación del crecimiento y del desarrollo, así como en la
activación de las células del sistema inmunitario y en la mediación de la respuesta inflamatoria.
En general, las citocinas se caracterizan por una considerable redundancia, en el sentido de que
diferentes citocinas comparten idénticas funciones. Además, muchas citocinas son pleiotrópicas,
es decir, son capaces de actuar sobre muy diversos tipos de células. Este pleiotropismo deriva de
la expresión en múltiples tipos celulares de receptores para la citocina (Braunwald et al, 2001).
Las quimiocinas son factores que regulan el desarrollo y la migración de varios tipos de células;
más de 40 quimiocinas han sido identificadas en humanos hasta el momento (Spano et al, 2004).

Las quimiocinas pueden ser clasificadas dentro de 4 grupos (CC, CXC, CX3C y C), basados en
la posición de los residuos de cisteinas altamente conservados de la secuencia amino acídica. Los
receptores de quimiocinas pertenecen al grupo de las proteínas de siete dominios transmembrana,
acoplados a las proteínas G antes mencionadas (Schioppa et al, 2003).

La evidencia indica que la activación inapropiada del receptor CXCR4 puede estar involucrada
en enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas como por ejemplo la demencia
asociada al virus de inmunodeficiencia adquirida (HIV) (Khan et al, 2003).

15

La quimiocina (citocina quimiotáctica) factor derivado de las células del estroma (SDF-1) y su
receptor CXCR4, están constitutivamente expresados en el cerebro en desarrollo y adulto. Su
expresión se da tanto en células neuronales como no neuronales, implicadas en varios procesos
fisiológicos (Spano et al, 2004).

Aunque el laboratorio colaborador de la Universidad Louis Pasteur en Estrasburgo Francia
trabaja con varios de los receptores para quimiocinas, tales como: CXCR1, CXCR2, CCR5,
CCR2 y CXCR4 (Zoffmann et al, 2002), se eligió probar el receptor CXCR4 antes que
cualquier otro, porque se encuentra relacionado con la respuesta inflamatoria cerebral; y porque
en el laboratorio colaborador de Estrasburgo, se poseían la mayor cantidad de herramientas y de
protocolos de medidas de unión ligando/receptor y respuesta celular puestas a punto para este
receptor de quimiocina.

Para tratar de identificar posibles receptores involucrados en el efecto antiparkinsoniano la
administración de Mucuna urens; se estudió la actividad biológica del extracto crudo y
fraccionado de esa planta. La actividad biológica de los compuestos presentes en el extracto de
Mucuna urens, puede ser cuantificada mediante la respuesta de calcio desencadenada en las
células al activarse diferentes receptores de 7 dominios transmembrana (muscarínicos,
purinérgicos, etc).
Medición de actividad biológica y sondas fluorescentes
Los receptores investigados en este trabajo, se encuentran asociados con las proteínas G, que son
proteínas integrales de membrana. Cuando los receptores se encuentran acoplados al tipo G αq,
su activación provoca indirectamente la liberación de calcio del retículo endoplasmático. El
calcio liberado puede ser medido mediante sondas fluorescentes específicas como indo-1, fura-2,
fluo-3, fluo-4, entre otras (Takahashi et al, 1999). La unión del calcio a la sonda provoca un
aumento (ó una disminución en otros tipos de sondas) en la emisión del espectro de fluorescencia
de esta, el cual puede ser cuantificado por medio de un espectrofluorómetro (Takahashi et al,
1999). Los distintos tipos de células, expresan diversos tipos de receptores; que pueden utilizar el
mismo mecanismo de transducción asociado con los niveles de calcio intracelular. Por esta razón
y para obtener información específica de la actividad sobre alguno de ellos, es que se hace
imprescindible la utilización de tipos celulares que expresen diferencialmente los receptores que
se desean estudiar.

Por otro lado, es posible sobreexpresar ciertos receptores de interés en tipos celulares que no los
poseen, o los poseen en bajas proporciones. Este proceso se conoce como transfección celular, y
se realiza utilizando plásmidos (González y Coroas, 2002; Ovidio y Portelles, 1997; Rocha et al,
2002).

Algunos de los tipos de células utilizadas para mediciones de calcio por activación de receptores
asociados con proteínas G son: las CHO (chinese hamster ovary; ovario de hamster chino) y las
HEK-293 (human embryonic kidney; riñón de embrión humano). En el caso de las CHO éstas no
expresan de manera endógena los receptores muscarínicos; lo cual concede especificidad a las
respuestas del receptor muscarínico, ya que solo posee el M
1
transfectado de forma estable
(Sternfeld et al, 2007). En las células HEK-293 se expresan de manera endógena receptores
16

muscarínicos M
3
entre otros; aparte de que pueden ser transfectadas con receptores para
quimiocinas CXCR4, que sí poseen, pero en baja proporción (Sternfeld et al, 2007).

La fluorescencia es un tipo de emisión de luz producida por algunas moléculas al relajarse; esta
emisión proporciona un instrumento útil para medir fenómenos biológicos. La excitación de
moléculas fluorescentes relacionadas con los procesos celulares y su dinámica de activación en
el transcurrir del tiempo, permiten cuantificar y comparar las respuestas de dichos sistemas
biológicos.
Procesos de fotoluminiscencia: la fluorescencia
El fenómeno de fotoluminiscencia ocurre cuando una especie química es excitada por medio de
radiación electromagnética y como consecuencia la especie pierde la energía adquirida
reemitiendo ésta en forma parcial o total (Skoog et al, 1994).

La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas a niveles
energéticos superiores por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se
relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones (Skoog et al,
1994).

La desactivación o pérdida de la energía en exceso se puede efectuar a través de diferentes
procesos. El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo
de vida del estado excitado. Por tanto, si la desactivación por fluorescencia es rápida con
respecto a los procesos sin radiación, se observa tal emisión.

La fluorescencia y la fosforescencia son dos manifestaciones diferentes del fenómeno
fotoluminiscente. La fluorescencia cesa casi inmediatamente después de que a la muestra se le ha
suspendido la radiación electromagnética (<10
-6
seg.). La fluorescencia puede existir en: gases,
sólidos o líquidos (Skoog et al, 1994).

Las sondas son moléculas químicas que se unen con mayor o menor afinidad a los iones (calcio,
magnesio, etc) y regularmente su estructura química se basa en un quelante asociado a un
fluoróforo. De esta manera es posible seguir y cuantificar las variaciones que sufre el calcio
celular en diferentes procesos biológicos.
Las sondas fluorescentes dependientes del calcio
Las sondas mencionadas se unen especialmente al calcio con mayor o menor afinidad. Estas
moléculas, poseen constantes de disociación (Kd) que les permiten marcar débiles cambios del
calcio intracelular en diferentes tipos de células. La unión al calcio provoca una variación de la
intensidad de fluorescencia emitida por la sonda. Esas variaciones son cuantificadas por medio
de diferentes equipos de lectura de fluorescencia y se utilizan en técnicas como la citometría de
flujo, la foto-activación atrapada por quelantes, los sistemas de segundos mensajeros,
neurotransmisores y el cribaje en el descubrimiento de nuevos fármacos (Takahashi et al, 1999).

17

La mayor parte de los indicadores fluorescentes de calcio, son aniones policarboxilados
impermeantes. Para solucionar este problema, las moléculas han sido permeabilizadas por
adición de un grupo acetoximetil éster (AM), destinado a enmascarar las cargas negativas. Bajo
esta forma AM, la sonda puede atravesar la membrana celular, pero es insensible al calcio. La
insensibilidad al calcio se soluciona por la acción de las esterasas celulares endógenas, que
cortan los enlaces éster; permitiendo la acumulación intracelular de sonda en su forma química
funcional (Leclerc et al, 2004).

Existen varios tipos de sonda dependiendo de su estructura y función. En general, todas ellas
permiten un marcaje fluorescente del sistema biológico (una proteína, un ión, un nucleótido, etc).
Entre algunas de las más utilizadas se encuentran: el Indo-1 y el Fluo-4.
Sondas Indo-1 y Fluo-4
Como ya se describió antes, estas sondas son moléculas estructuralmente derivadas de quelantes
de calcio, las cuales se unen a dicho ión y cambian sus máximos de emisión de fluorescencia;
además, estas dos sondas requieren la desesterificación a nivel intracelular para unirse al calcio y
fluorecer. Estos marcadores permiten evidenciar los procesos intracelulares relacionados al
calcio en tiempo real.

Tsien y colaboradores han utilizado como modelo estructural del Indo-1 y otras sondas
fluorescentes el BAPTA y el EGTA (quelantes de calcio). El Indo-1 es uno de los llamados
indicadores raciométricos de calcio; ya que produce una longitud de onda (λ) de emisión
diferente al tener unido calcio o al estar sin él. Así, la razón de ambas longitudes de onda (401 y
475nm) permite una estimación más exacta de la concentración de calcio intracelular;
independientemente de la distancia óptica y la concentración total del marcador (Invitrogen,
2008).

La razón entre las longitudes de onda corrige diferencias como: cargas desiguales de la sonda, la
fuga o expulsión, el fotoblanqueamiento y los cambios en el volumen celular (Takahashi et al,
1999). Las principales desventajas de Indo-1 son: el rápido fotoblanqueamiento que sufre y la
necesidad de excitación en el espectro UV que causa daño celular (Invitrogen, 2008).

El Fluo-4 es un análogo del Fluo-3, con la sustitución de dos átomos de cloro por átomos de
fluor, correspondiente a la nueva generación de sondas de excitación en el espectro visible.
Fluo-4 exhibe una alta Kd para el calcio (345 nM) y una fuerte señal de fluorescencia. La fuerte
señal de fluorescencia resulta una ventaja particular al trabajar con células como las HEK-293,
puesto que están comúnmente en menor número respecto al volumen usado para los ensayos de
cribaje farmacológico (Invitrogen, 2008). Los derivados esterificados de Fluo-3 y Fluo-4 no son
fluorescentes por sí mismos, diferenciándose en esto de los derivados de Indo-1; esto disminuye
el ruido de fondo. Otras de las ventajas del Fluo-4 son: sus cortos tiempos de incubación para
cargar las células (introducción de la sonda al interior) y las menores concentraciones de sonda
requeridas para realizar los análisis (Invitrogen, 2008).

18

La mayor desventaja del Fluo-4 es que no exhibe un cambio en el máximo del espectro de
emisión al unirse al calcio. Lo anterior, hace imposible realizar medidas raciométricas de las
concentraciones de calcio (Takahashi et al, 1999).

De acuerdo con los resultados de Molina y Solís, 2004 en los que se demostró en el extracto
crudo, una actividad antiparkinsoniana mayor que la del L-Dopa, se supone que existen otras
sustancias que potencian la actividad de este compuesto. Para corroborar tal suposición, se
pretende separar y purificar algunas de las fracciones del extracto crudo para caracterizar de una
mejor manera el o los compuestos responsables de la actividad biológica observada.
Técnicas de separación y purificación de sustancias
Para tal efecto, el extracto crudo debe ser sometido a separación química; siendo la
cromatografía una de las técnicas más usadas y accesibles para este fin. La cromatografía es una
técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial
de los mismos. La separación se establece al ser arrastrados los solutos por una fase móvil
(líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria (sólida
o líquida) (Skoog et al, 2001).

Según la relación que se establezca entre la fase estacionaria y la fase móvil, cabe distinguir
entre: cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
exclusión (de geles) y cromatografía de afinidad (Morrison et al, 1992).

El principio más común y con mayor aplicación entre las diferentes técnicas cromatográficas, es
la cromatografía de adsorción; en la cual, el sólido adsorbe al componente que inicialmente
estaba en la fase móvil por medio de las fuerzas de Van der Waals (Morrison et al, 1992).
Determinación de la huella cromatográfica
Los análisis de huella cromatográfica han sido aceptados como criterio de calidad por la
Organización Mundial de la Salud (WHO) y como un requerimiento de regulación por la SDFA
(State Food and Drug Administration of China) para productos naturales (Alaerts et al, 2007;
Han et al, 2007; Jiang et al, 2007). Entre los métodos para determinación de la huella digital en
general se encuentran: la electroforesis capilar, la cromatografía de gases, los rayos X, la
cromatografía en capa fina y la cromatografía líquida de alta resolución (Chen et al, 2007; Ma et
al, 2007).

La “huella cromatográfica” es una representación gráfica de las señales que producen el conjunto
de componentes de un extracto de origen vegetal (Li et al, 2007). Las huellas cromatográficas
son normalmente cromatogramas complejos, que exigen una alta capacidad de resolución en el
proceso de separación (Han et al, 2007; Jiang et al, 2007).

Es muy conocido que los efectos terapéuticos de las plantas medicinales, se deben a los efectos
sinérgicos de múltiples componentes bioactivos presentes en los extractos. De tal manera, la
determinación de control de calidad por medio de uno o unos pocos componentes del extracto
natural no ha resultado ser suficientemente representativa. Por lo tanto, la implementación de la
19

huella digital cromatográfica como parámetro de control de calidad para plantas medicinales, se
perfila como un método de análisis bastante integral (Chen et al, 2007; Wang et al, 2008).

La “huella digital cromatográfica” es específica para cada especie de planta o tipo de extracto
natural, por lo que en la actualidad, se ha comenzado a usar como método de identificación de
las plantas medicinales y sus derivados (Chen et al, 2007; Han et al, 2007).

Además, la huella digital cromatográfica también puede emplearse como un marcador de
actividad farmacológica; ya que si un patrón cromatográfico es responsable de cierto efecto
establecido por un modelo farmacológico, se puede asumir que subsiguientes extractos de la
planta que presenten el mismo cromatograma de huella digital, mantendrán las propiedades
farmacológicas determinadas por el modelo (Figueroa et al, 2007; Li et al, 2007).
Cromatografía líquida de alta resolución
La cromatografía líquida de alta resolución o “High performance Liquid Chromatography”
(HPLC) es una técnica en la cual la fase estacionaria es un sólido y la fase móvil, es un líquido.
Se utiliza para separar los componentes de una mezcla, basándose en los diferentes principios de
interacción química entre los analitos y la columna (Skoog et al, 1994).

En la HPLC, el analito disuelto en la fase móvil, pasa por la columna cromatográfica a través de
la fase estacionaria a alta presión. Los componentes de la muestra analizada son detectados
diferencialmente en el tiempo, dependiendo de las interacciones químicas y físicas que
establezcan con la fase estacionaria y de la composición química de la fase líquida. El tiempo
que tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se
considera una propiedad identificativa del compuesto en una determinada fase móvil y
estacionaria a cierta temperatura. Para la fase móvil, los disolventes más utilizados por sus
diferentes características de polaridad son: el agua, el metanol y el acetonitrilo. También se
utilizan sustancias como tampones, sales, o el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación
de los compuestos (Pérez et al, 2002).

La fase móvil en el HPLC puede ser isocrática o en gradiente; en el primer caso, la fase móvil
permanece constante durante todo el análisis, mientras que en el segundo, la fase móvil cambia
su composición durante el periodo del análisis. El gradiente utilizado varía en función de la
hidrofobicidad de la fase móvil y busca separar los componentes de la muestra como una función
de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada, respecto a la afinidad por la fase
estacionaria (Pérez et al, 2002).

La detección de analitos en el HPLC puede llevarse a cabo mediante diferentes tipos de detector,
tales como: índice de refracción, ultravioleta/visible, electroquímico, espectrómetro de masas y
fluorimétrico (Skoog et al, 1994). De ellos, el más utilizado es el detector ultravioleta/visible
(UV/VIS), el cual consiste en un espectrómetro que excita los analitos con radiación
electromagnética fija o variable. Esta radiación corresponde a longitudes de onda entre 200-380
nm en el UV y 380-780 nm en el VIS (visible). La absorción de dicha energía depende de
requisitos estructurales del analito como: presencia de dobles enlaces y grado de conjugación en
el UV y presencia de color en el VIS. Así por ejemplo, la cantidad exacta de luz UV absorbida
20

por una sustancia se expresa como absortividad molar, la cual es una constante física
característica de cada sustancia en particular (McMurry, 2000).
Hipótesis
Existen efectos anticolinérgicos producidos por el extracto hidroalcohólico crudo de Mucuna
urens.
Materiales y Métodos
I Parte: Recolección y tratamiento del material vegetal
I a) Recolección del material vegetal
Los frutos de la planta Mucuna urens se recolectaron, secaron y separaron de las vainas en forma
manual con ayuda de guantes y alicate.

Las semillas se recolectaron en la localidad de Fraijanes de Poás de Alajuela, Costa Rica. A una
altitud de 1650 m.s.n.m. con las siguientes coordenadas Norte 10° 7’ 40.8’’, Oeste 84°
11’46.3’’, con un error estimado de 5 metros. En el mismo sitio donde se habían llevado a cabo
las colectas anteriores para la tesis de Molina y Solís, 2003. Depósito de la muestra en el
herbario Juvenal Valerio Rodríguez de Heredia (UNA); recibido por don Marco Otárola Rojas.
I b) Tratamiento del material vegetal
Se recolectaron aproximadamente 600 gramos de material fresco (semillas). El material se
separó de cualquier impureza y se secó en una bandeja al calor del sol (época de verano) por
aproximadamente 6 días. Una vez secas las vainas, se extrajeron las semillas; se molieron
completas en un molino Dietz-motor WRB hasta ser convertidas en un polvo fino. Luego el
polvo resultante se sometió a extracción por percolación con una mezcla de etanol (95 º) y agua
(8:2) por tres días. Para este fin, el material se introdujo en una bolsa de manta sellada; la cual,
luego se colocó en un recipiente de vidrio que contenía la mezcla hidroalcohólica. La
percolación se realizó dos veces, con el fin de maximizar la extracción de los componentes
presentes. El extracto obtenido de las dos extracciones se conservó en botellas ámbar de vidrio
debidamente tapadas y en refrigeración por aproximadamente 15 días para su posterior
concentración. La concentración del extracto por evaporación se llevó a cabo utilizando un
evaporador rotatorio a presión reducida (rotavapor) Büchi R152 (de aprox. 10 L), a una
temperatura entre 38-40 ºC, y el extracto acuoso obtenido, se conservó entre 4-7 días en
refrigeración (0-8 °C) hasta ser liofilizado.
I c) Liofilización
El extracto acuoso se congeló a una temperatura aproximada de -40 °C en frascos de vidrio
especiales para liofilizador (Labconco 500 mL), el procedimiento anterior se realizó rotando el
frasco con el concentrado en un baño de hielo seco (CO
2
), con etanol como sustancia criogénica.
Dicho proceso se llevó a cabo hasta que la muestra estuviera completamente congelada. Los
frascos se llenaron con el extracto acuoso sin exceder la tercera parte de su capacidad e
inmediatamente congelados fueron unidos a los conectores del liofilizador Labconco®. Para
21

asegurar un secado completo, las muestras se mantuvieron en el liofilizador por cerca de 48
horas, luego de lo cual el material se almacenó en frascos de vidrio bien tapados (recubiertos
además con papel parafina) y guardados en un congelador a -20 °C marca Forma Scientific®
modelo 8339 hasta el momento de su uso.
I d) Preparación de soluciones madre del extracto liofilizado
Se realizaron cuatro disoluciones en diferentes solventes de 100 mg del extracto hidroalcohólico
liofilizado cada una. Estas diluciones se ajustaron a concentraciones finales de 50 mg/mL en uno
de los siguientes solventes: 1) Solución salina + 1% DMSO; 2) DMSO 100%; 3) Agua + 5%
DMSO y 4) Etanol/Agua 8:2. Todas las disoluciones fueron agitadas fuertemente a temperatura
ambiente por algunos minutos utilizando un vórtex; luego se centrifugó cada solución a 10000
r.p.m por 2.5 minutos. A continuación, se filtró cada solución resultante a través de una
membrana Millipore® de 0.22 µm. Los filtrados constituyeron las soluciones de 50 mg/mL de
M. urens que se utilizaron sobre las células, en los experimentos de respuesta al calcio y en las
inyecciones de HPLC.
II Parte: Pruebas para identificación de metabolitos secundarios
II a) Pruebas cualitativas para identificación de grupos de metabolitos secundarios
Se llevaron a cabo pruebas cualitativas de tubo de ensayo para alcaloides, taninos, flavonoides y
glicósidos antracénicos con el extracto hidroalcohólico 8:2 de Mucuna urens. Para estas pruebas,
se colocó directamente 1 mL de extracto hidroalcohólico de M. urens o 1 mL de los residuos
provenientes de extracciones aplicadas al extracto en cada tubo de ensayo. Se agregaron 3 ó 4
gotas de uno de los reactivos de prueba a cada tubo de ensayo, repitiéndose el mismo
procedimiento por separado hasta completar la lista de reactivos que se muestran en la Tabla 1.
Luego de agregar cada reactivo, se permitió que sucediera la reacción durante 2 minutos sin
agitación. Se observó cuidadosamente cada tubo de ensayo y se anotaron los cambios ocurridos.
Finalmente, antes de descartar los tubos de reacción, se sometieron a agitación manual y se
confirmaron las observaciones inicialmente realizadas (Lock, 1994; Harborne, 1973).

Las pruebas para flavonoides se realizan directamente con el extracto hidroalcohólico de M.
urens, ya que el etanol extrae bien este tipo de compuestos, y los solventes utilizados son una
mezcla mayormente etanólica (8:2). Para los demás grupos de metabolitos, se realizó la
extracción y separación pertinente a partir del extracto inicial.

El procedimiento seguido para la separación y extracción de alcaloides, glicósidos y taninos fue
el siguiente: se calentaron hasta ebullición agitando periódicamente 20 mL del extracto
hidroalcohólico 8:2 de M. urens con 20 mL de solución HCl al 10% por 5 min. A continuación,
se dejó enfriar la dilución, se filtró y se extrajo 2 veces con 10 mL de cloroformo cada vez. La
capa clorofórmica de ambas extracciones se colocó en un tubo de ensayo con tapa, se le
adicionaron 5 mL de solución de amoniaco al 10%, se agitó fuertemente por 2 minutos y se dejó
cubierta reposar durante 2 horas; revisando periódicamente si ocurría un cambio de color en la
capa amoniacal (prueba para glicósidos antracénicos).


22

En la Tabla 1 se describen algunos detalles del procedimiento específico para cada tipo de
metabolito:

Tabla 1: Pruebas y reactivos para la marcha fitoquímica de algunos grupos de metabolitos
secundarios (López, 1998).

Metabolito
Secundario


Reactivos de prueba

Patrones

Alcaloides.

Reactivo de Mayer, Reactivo de
Valser, Ácido Tánico, Reactivo de
Dragendorff, Reactivo de Wagner
y Reactivo de Reineckato.


Solución acuosa de sales de
Quinina, Cinchonina, Atropina y
Estricnina al 0.5% cada uno.

Taninos.

Molibdato de Sodio, Ferrocianuro-
amoniaco, solución de iones
Plomo (Pb(NO
3
)
2
), soluciones de
patrones para alcaloides, Yodato
de Potasio y Nitrito de Sodio.


Solución acuosa de Ácido Tánico
al 2%.

Flavonoides.

Reactivo de Shinoda o Cianidina,
Reactivo de Wilson, Ácido
Sulfúrico y Cloruro Férrico.


Solución hidroalcohólica de
Quercetina al 1%.

Glicósidos
Antracénicos.

Reacción de Borrntraeger (o
amoniaco diluido).


No se dispuso de patrón, pero se
reporta resultado de acuerdo con
la literatura (Robinson, 1967).



Con la capa acuosa restante de la extracción, se continuó trabajando de la siguiente manera: se
colocó en un embudo separador limpio, se le agregaron 10 mL de solución de amoniaco al 30% y
se agitó fuertemente. Tras la verificación con un papel tornasol de que la solución era alcalina
(pH >7), se realizaron nuevamente 2 extracciones sucesivas con 10 mL de cloroformo. La capa
clorofórmica obtenida de estas dos extracciones se unió y se colocó a secar en el evaporador
rotatorio a presión reducida (rotavapor). El residuo resultante de la evaporación se volvió a
disolver en 10 mL de metanol, el cual constituyó la solución utilizada para hacer las pruebas de
alcaloides. La capa acuosa remanente de la última extracción se utilizó directamente para llevar a
cabo las pruebas correspondientes a taninos.

23

III Parte: Ensayos biológicos del extracto crudo y separado
III a) Cultivo de Células
Se cultivaron placas de 10 cm de diámetro (Falcon) de cada tipo celular: HEK-293, CHO, CHO-
M1 y HEK CXCR4 a una temperatura de 37 ºC en atmósfera humedecida de 5% CO
2
y 95%
aire. Por ser líneas de células adherentes fueron despegadas de las placas en cada dilución con
tripsina 0.5% - EDTA. Las células HEK (transfectadas o no) se diluyeron a 1/4 cada 3 ó 4 días;
utilizan el mismo medio de cultivo descrito a continuación: 500 mL de medio MEM (Minimum
Essential Medium) con sales de Eagle, sin glutamina marca Gibco®, más 10% de suero fetal
bovino (no descomplementado), más 10 mL de PSG (100 U/mL final de Penicilina, 100 µg/mL
final de Estreptomicina y 2 mM final de L-Glutamina marca Invitrogen las tres).

Las células CHO (transfectadas o no) se diluyeron a 1/10 cada 4 días utilizando otro medio de
cultivo común entre ellas, descrito a continuación: 500 mL de medio F-12 (Ham) marca Gibco®,
más 5% de suero fetal bovino (no descomplementado), más 5 mL de PS (100 U/mL final de
Penicilina y 100 µg/mL final de Estreptomicina marca Invitrogen ambos). Los subcultivos
(diluciones de células) fueron realizados con el fin de mantener las células en fase de crecimiento
y disponer de células en condiciones óptimas para los experimentos de respuesta al calcio
(correcto % de confluencia). Se realizaron cada 3 ó 4 días, según la velocidad de crecimiento de
cada línea celular. Los subcultivos, se efectuaron en una cámara de flujo laminar vertical de
seguridad biológica marca Holten®; se utilizaron materiales plásticos desechables de uso único.
Se siguieron en toda esta parte los métodos del Laboratorio UMR 7175 del CNRS de
Estrasburgo, Francia.
III b) Curva Dosis/Respuesta a la Acetilcolina (Ach)
Antes de comenzar a probar el extracto sobre las células, se realizó una curva dosis respuesta con
acetilcolina (agonista muscarínico). La curva dosis/respuesta se lleva a cabo para verificar que se
obtiene una correcta respuesta celular del sistema biológico, que el protocolo de carga es
adecuado, que los parámetros del espectrofluorómetro son correctos y que con un agonista
conocido, el valor de EC
50
es próximo al esperado.

Esta curva se llevó a cabo mediante un experimento de respuesta al calcio en células CHO-M
1
al
90% de confluencia, suspendidas en 15 mL de tampón Hepes/ BSA/ Probenecid 2.5 mM,
utilizando como sonda Indo-1 AM 5 µM final incubado por 1 hora a 37 ºC. Los tubos de
suspensión celular una vez preparados se guardaron por 15 minutos protegidos de la luz en un
baño-maría a temperatura regulada de 21 ºC antes de iniciar los ensayos. En los ensayos se
emplearon cubetas de cuarzo provistas con una pequeña barra de agitación magnética y 1.0 mL
de suspensión celular (~ 1 x 10
6
células/cubeta).

Los parámetros establecidos en el espectrofluorómetro fueron los siguientes: Tiempo total: 240 s,
tiempo de integración: 0.3 s, tiempo de incremento: 0.3 s, λ (longitud de onda) de excitación: 338
nm, λ de emisión: 401 nm y ancho de rendijas: excitación 2 nm y emisión 4 nm.

Se prepararon por aparte diluciones seriadas de acetilcolina (Ach) a partir de una solución madre
en agua 100 mM; conservada a -20 ºC. Las diluciones de Ach usadas se presentan en la Tabla 2:

24

Además se utilizó solución madre de digitonina en agua 25 mM; almacenada también a -20 ºC.
La digitonina se adicionó a las células en una concentración final de 50 µM un minuto antes de
terminar cada prueba. Todas las soluciones de trabajo de Ach y de digitonina se mantuvieron a 4
ºC durante el tiempo de experimentación.

Tabla 2: Concentraciones de Ach realizadas para la curva dosis/respuesta sobre células CHO-
M
1
.
Concentración nM para
la solución de trabajo.
Concentración nM final/mL en
suspensión celular.
250 1
750 3
2500 10
7500 30
25000 100
75000 300

III c) Experimentos de respuesta por calcio
Las células se diluyeron en el medio de cultivo respectivo descrito en la sección IIIa, con 2 o 3
días de anticipación. El día de la prueba se verificó que se encontraran entre un 80-90% de
confluencia para continuar con la carga (introducción de la sonda). Las células se lavaron con
PBS (tampón salino de fosfatos) y se colocaron a cargar por 45 minutos o por 1 hora en la
incubadora a 37 °C con una mezcla de tampón Hepes/BSA (NaCl 137.5mM, MgCl
2
·6H
2
O
1.25mM, CaCl
2
·2H
2
O 1.25mM, KCl 6mM, Glucosa 10mM, HEPES 10mM, NaH
2
PO
4
·H
2
O
0.4mM pH: 7.4) + Indo-1 AM 5 µM (o Fluo-4 AM 2 µM). Después, se lavaron nuevamente las
células, se despegaron de la placa con una dilución de Tripsina-EDTA (Gibco®) al 0.5% y 0.2%
respectivamente a 37°C, se homogenizaron, se centrifugaron y el precipitado de células se
resuspendió en 10 ó 12 mL (de acuerdo con el % de confluencia) de solución de Hepes/BSA a
temperatura ambiente. La suspensión de células fue distribuida en viales de polietileno con
capacidad para 1.5 mL protegidos de la luz y dejados a temperatura ambiente hasta que hubiesen
transcurrido 30 minutos desde el momento en que se quitó la sonda y se realizó el lavado
posterior a la carga. Lo anterior, permitió la adecuada desesterificación del Indo-1 AM o el Fluo-
4 AM (acetoximetil éster). Alcanzado este paso se pudo comenzar las lecturas de fluorescencia
en el espectrofluorómetro con cubetas de cuarzo equipadas con una barra de agitación magnética
y 1.0 mL de suspensión celular a temperatura regulada (21 °C ó 37 °C). Las lecturas de
fluorescencia pueden efectuarse por un periodo máximo de 90 minutos luego de concluido el
paso de desesterificación. Para marcaje con Indo-1 se excitó a 338 nm y se colectaron las
emisiones a 401 y 475 nm, por otro lado para Fluo-4, la excitación se realizó a 494 nm y la
emisión se colectó a 516 nm. Para los análisis con Indo-1, los resultados de la emisión
fluorescente se presentan como una razón 401/475 nm.

En todos los ensayos celulares de esta sección, se usaron 10 µL de M. urens 50 mg/mL. Además
se realizaron controles positivos con agonistas conocidos, de acuerdo con el tipo de receptor
estimulado. Se realizaron también controles negativos con un antagonista, de acuerdo con cada
caso, para verificar el bloqueo de la respuesta. Para este trabajo, los marcajes del calcio se
25

efectuaron con dos tipos distintos de sondas fluorescentes: el Indo-1 y el Fluo-4 adquiridos de
Molecular Probes®. Como se menciono antes, se siguieron con cada tipo de células los métodos
del Laboratorio UMR 7175 del CNRS de Estrasburgo, Francia.

Células HEK-293 no transfectadas
Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21°C marcado con Indo-1 y Fluo-4,
utilizando 4 disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:
a) DMSO 100%
b) Etanol/Agua 8:2
c) Solución salina + 1% DMSO
d) Agua + 5% DMSO
Como agonista muscarínico se utilizó carbacol 50 µM final y como antagonista se utilizó
atropina a 8 µM o 10 µM según la efectividad del antagonismo.

Células CHO no transfectadas
Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21 °C marcado con Fluo-4, utilizando las
mismas 3 disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:
a) DMSO 100%
b) Etanol/Agua 8:2
c) Solución salina + 1% DMSO

Como agonista se usó el ATP 20 µM ya que este tipo de células contienen receptores
purinérgicos endógenos P
2
Y. No se realizó antagonismo a falta de disponibilidad de un reactivo
con dicha función.

Células CHO-M
1
transfectadas
Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21 °C marcado con Fluo-4, utilizando las
siguientes disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:
a) DMSO 100%
b) Etanol/Agua 8:2
c) Solución salina + 1% DMSO

Como agonistas muscarínicos se utilizaron el carbacol 50 µM final y en algunas ocasiones la
acetilcolina (100 nM de acuerdo con la curva dosis/respuesta). Como antagonista se utilizó la
atropina 8 µM o 10 µM.

Células HEK CXCR4 transfectadas
Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 37 °C marcado con Fluo-4 utilizando las
mismas 3 disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:
a) DMSO 100%
b) Etanol/Agua 8:2
c) Solución salina + 1% DMSO

Como agonista CXCR4 se utilizó SDF-1 5 nM (“stromal-cell derived factor 1α”; factor 1α
derivado de las células del estroma) y como antagonista se utilizó el péptido T-134 a 500 nM.
26

Para confirmar que las respuestas vistas sobre las células no correspondieran a la acción sobre
receptores muscarínicos M
3
endógenos, se realizaron bajo las mismas condiciones, experimentos
de respuesta al calcio marcados con Fluo-4 para las 3 diluciones de M. urens. Como agonista
muscarínico se utilizó el carbacol 50 µM final y como antagonista se utilizó la atropina 10 µM
final.
III d) Espectros de emisión de fluorescencia de M. urens
III d1) Separación del extracto por HPLC para la elaboración del espectro de emisión de
fluorescencia
Para esta prueba se usó la columna C
18
marca Beckman® ya que resultó óptima para la
separación de los componentes del extracto en las pruebas anteriores. Además, se conservó la
misma variación de fase móvil descrita en la sección IV 1a) de Materiales y Métodos. En este
caso, se realizó una inyección de 20 µL de M. urens 25 mg/mL en solución salina + 1% DMSO a
temperatura ambiente. La corrida se colectó en fracciones de 1 ml/tubo para realizar los
espectros de emisión del extracto fraccionado. El total de fracciones colectadas fue de 51; ya que
se incluyó todo el tiempo hasta alcanzar un 100% de solvente Y, más 1 mL extra. El mL extra,
contempla el retraso existente entre la señal del detector y la recolección hecha por el colector de
fracciones; no obstante, los registros de los canales de detección se detuvieron automáticamente
en el minuto 45.
III d2) Espectros de Emisión de Fluorescencia para las fracciones del extracto
Este experimento se divide en dos partes: la primera donde se excita y se colecta a las longitudes
de onda (λ) correspondientes al Indo-1 y la segunda, las λ correspondientes al Fluo-4.

Para la primera parte del experimento, en el espectrofluorómetro Fluorolog® ISA se estableció
338nm como longitud de onda de excitación, la cual corresponde a la misma longitud de onda de
excitación del Indo-1. De manera que se simulan las condiciones de análisis por fluorescencia en
la respuesta celular. Las emisiones de fluorescencia fueron colectadas de 355-500 nm, con un
incremento de 1 nm; un tiempo de integración de 0.5 s, un ancho de rendijas espectrales de 2 nm
y una temperatura ambiente de aproximadamente (~) 21 ºC. Bajo las condiciones descritas, se
realizó la lectura de fluorescencia de cada una de las 51 fracciones colectadas.

Para la segunda parte del experimento, excepto las λ de excitación y detección (emisión), todos
los demás parámetros fueron iguales a los descritos arriba. Según lo anterior, se estableció 494
nm como λ de excitación (la cual corresponde a la excitación del Fluo-4) y la emisión de
fluorescencia fue colectada de 510-700 nm. De igual manera se realizó la lectura de
fluorescencia de las 51 fracciones colectadas más las lecturas de ambos solventes de
cromatografía.
27

III e) Experimentos de respuesta al calcio en células CHO-M
1
del extracto de M. urens
separado
III e1) Pruebas de respuesta al calcio para los pooles inicialmente separados de M. urens
Los pooles 1 y 2 provenientes de una corrida específica (C2.001) se volvieron a ensayar sobre las
células CHO-M
1
; procurando mantener las mismas condiciones experimentales que en las
pruebas anteriores con el extracto crudo (no fraccionado).

Se realizó un experimento de respuesta al calcio a 21 °C marcado con Fluo-4 para los pooles del
extracto de M. urens resuspendidos en DMSO 100%; 5 µL de cada pool por prueba. En este
experimento se realizó como en todos los casos una prueba de control inicial solo con agonista y
digitonina. Como agonista muscarínico se utilizó carbacol 50 µM y como antagonista atropina
10 µM.
III e2) Experimentos de respuesta al calcio en células CHO-M
1
para el fraccionamiento
final del extracto
Todas las fracciones de 5 minutos pertenecientes a la corrida llamada Zao7.001, se probaron
sobre las células CHO-M
1
. Las fracciones fueron resuspendidas en DMSO 100%; se procuró
mantener las mismas condiciones experimentales que en las pruebas anteriores.

Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21 °C marcados con Fluo-4 para cada una de
las fracciones del extracto de M. urens, 5 µL de cada fracción por prueba. Simultáneamente se
realizaron pruebas de control con solventes, agonista y digitonina. Como agonista muscarínico se
utilizó carbacol 50 µM y como antagonista atropina 10 µM.

IV Parte: 1) Análisis de las disoluciones del extracto por HPLC
IV 1a) Inyecciones cromatográficas de prueba para definir condiciones de análisis
Las inyecciones se realizaron en un HPLC con inyector manual; cuya separación se realiza por
medio de una columna de fase estacionaria reversa C
8
o C
18
. El gradiente de presión fue
generado por dos bombas marca Gilson® 306 y 307 conectadas a un mezclador también
Gilson® Dynamic mixer 811C. Se utilizó un detector UV-Visible marca Gilson® 119 de
detección variable. Los canales de detección fueron fijados en 219 nm y 280 nm debido a que
corresponden con las longitudes de onda de máxima absorción del Espectro ultravioleta-visible
realizado para el extracto (ver anexos, figura 1).

Las especificaciones de las columnas analíticas utilizadas fueron:
C8 marca Zorbax® Z5C8-25QS, diámetro de poro: 5 µm, dimensiones: 4.6 mm x 25 cm.
C18 marca Beckman®, diámetro de poro: 5 µm, dimensiones: 4.6 mm x 15 cm.
C18 marca Phenomenex® Luna, diámetro de poro: 5 µm, 100 Å, dimensiones: 4.6 mm x 15 cm.

En esta sección, las corridas fueron realizadas a temperatura ambiente, empleando una
combinación de fase móvil isocrática y en gradiente, como se muestra en la Tabla 3. El solvente
X corresponde a agua pura (Milli-Q), mientras que el solvente Y corresponde a acetonitrilo
28

(ACN) puro calidad HPLC. Las columnas fueron equilibradas con 100% X por 15 minutos,
previo al inicio de las inyecciones.

Excepto en este experimento en particular, las condiciones de fase móvil para HPLC a lo largo
de todos los ensayos, mantuvieron la adición a ambos solventes (X y Y) de ácido trifluoroacético
(TFA). El TFA se agregó a una concentración final de 0.1% a cada solvente para bajar el pH de
la fase móvil.

Tabla 3: Fase móvil aplicada en cromatografía líquida de alta resolución, X: H
2
O Milli-Q; Y:
ACN calidad HPLC.
Tiempo (min) X% Y% Fase Móvil Flujo (mL/min)

0 100 0 1.0
Isocrática
10 100 0 1.0
Gradiente lineal
50 0 100 1.0
Isocrática
51 0 100 1.0
Gradiente lineal
54 100 0 1.0
Isocrática
55 100 0 0.1

Se realizaron inyecciones de 10 µL de Mucuna urens 50 mg/mL disuelta en DMSO 100% y de
20 µL de M. urens 25 mg/mL en solución salina + 1% DMSO. Para estas primeras inyecciones
se utilizó la columna Zorbax® C
8
. Luego se realizaron nuevas inyecciones de 20 µL de M. urens
25 mg/mL en solución salina + 1% DMSO y solventes solos. En estas nuevas inyecciones, se
empleó una columna Beckman® C
18
en la separación. El fin de estas múltiples inyecciones, fue
determinar con cual columna (C
8
u C
18
) se lograba resolver mejor los picos de las sustancias
contenidas en el extracto de M. urens.

IV Parte: 2) Análisis de las disoluciones del extracto por HPLC
IV 2a) Inyecciones para determinación de la huella digital del extracto de M. urens en
diferentes solventes
Se realizaron inyecciones cada una de 20 µL de Mucuna urens 50 mg/mL disuelta en 4
diferentes solventes: DMSO 100%; en Etanol/Agua 8:2; en solución salina + 1% DMSO y en
agua + 5% DMSO utilizando la misma columna C
18
Beckman® previamente seleccionada. Las
corridas se realizaron con el gradiente de fase móvil descrito en la sección IV 1a); con la
modificación antes mencionada de agregar el ácido trifluoroacético (TFA) 0.1% a cada una de
las botellas de fase móvil. Todos los siguientes análisis cromatográficos de este trabajo incluyen
ese cambio.

29

Para mejorar la repetibilidad, se decidió implementar entre cada inyección los siguientes pasos
de limpieza: primero se hizo una inyección de agua Milli Q correspondiente al doble del
volumen de la capacidad del lazo usado. Se dejó el lazo en posición de inyección (abierto).
Luego, con un flujo de 1.0 mL/min se asciende hasta 100% ACN + 0.1% TFA en 10 minutos, se
permitió que se estabilizaran las longitudes de onda con 100% ACN y luego se hace un gradiente
hacia agua + 0.1% TFA en 10 minutos al mismo flujo. Para finalizar, se verificó antes de volver
a inyectar, la estabilidad de ambos canales de detección (señal en cero a lo largo de la línea base
para 219 nm y 280nm).
IV 2b) Inyección para determinación de la huella digital mejorada del extracto de M. urens
en DMSO 100%
Luego de varias pruebas de separación por HPLC, se realizó la huella digital del extracto disuelto
en DMSO 100% con la mejor separación obtenida. Se utilizaron 5 µL de extracto crudo con un
gradiente de fase móvil descrito en la Tabla 4.
Tabla 4: Fase móvil aplicada en cromatografía líquida de alta resolución, X: H
2
O Milli-Q +
0.1% TFA; Y: ACN + 0.1% TFA calidad HPLC.
Tiempo (min) X% Y% Fase Móvil Flujo (mL/min)

0 100 0 1.0
Isocrática
10 100 0 1.0
Gradiente lineal
40 70 30 1.0
Isocrática
50 70 30 1.0
Gradiente lineal
60 0 100 1.0
Isocrática
75 0 100 1.0
Gradiente lineal
80 100 0 1.0
Isocrática
85 100 0 1.0

IV Parte: 3) Separación y fraccionamiento inicial de las disoluciones
del extracto por HPLC
IV 3a) Inyecciones de separación y fraccionamiento inicial del extracto crudo
Se realizaron dos inyecciones de 200 µL de extracto de Mucuna urens 50 mg/mL disuelto en
DMSO 100% bajo el método de separación C2 descrito en la Tabla 5. Solo se presentan los datos
para una de las corridas aunque se analizaron ambas; además en la colecta se contempla el
retraso de 1 mL/min entre el detector y el colector de fracciones.
30

Tabla 5: Fase móvil aplicada en HPLC, para la corrida B de separación, X: H
2
O Milli-Q + 0.1%
TFA; Y: ACN calidad HPLC + 0.1% TFA.
Tiempo (min) X% Y% Fase Móvil Flujo (mL/min)

0 100 0 1.0
Isocrática
20 100 0 1.0
Gradiente lineal
55 0 100 1.0
Gradiente lineal
60 100 0 1.0
Isocrática
62 100 0 0.1


Con la ayuda de un colector de fracciones Gilson® FC 205 se colectaron las fracciones a 5
mL/tubo durante el tiempo de corrida (60 minutos), luego se eligieron los puntos de separación
de acuerdo con la polaridad de las señales obtenidas. Se establecieron los pooles 1 y 2 de
características “hidrofílicas e hidrofóbicas” respectivamente (ver figura 35). El Pool 1
corresponde a las fracciones de los minutos 1-20 del cromatograma, y el Pool 2 a las fracciones
comprendidas entre los minutos 20-60 del mismo cromatograma.
IV 3b) Preparación, concentración y redisolución de los pooles establecidos en la
separación inicial
Las fracciones colectadas cada 5 minutos en tubos de vidrio se concentraron utilizando una
centrífuga de vacío marca Speed-Vac® a velocidad baja por ~30 horas. Los residuos secos de las
fracciones cada cinco minutos se diluyeron nuevamente por separado en un volumen de 5 µL de
DMSO 100% cada una y se agitaron en un vórtex a alta velocidad por 2 minutos. Luego de
disueltas las fracciones, se juntaron las cuatro fracciones del minuto 1-20 en lo que constituyó el
Pool 1 (20 µL) y las ocho fracciones del minuto 20-60 en lo que constituyó el pool 2 (40 µL).

Todo el proceso anterior se llevó a cabo de la misma manera para las colectas de las corridas C2.
Estas nuevas diluciones de los pooles del extracto separado constituyeron el material de prueba
para continuar los ensayos sobre células CHO-M
1
.
IV 3c) Inyecciones para comprobación de fraccionamiento inicial del extracto
Con los pooles de las corridas C2 obtenidos en el paso anterior, se realizaron inyecciones de 5
µL de extracto de la corrida C2.001 para verificar la separación entre los pooles. La fase móvil
empleada en este caso fue la misma que para la corrida de separación IV 1a). Las inyecciones se
realizaron a temperatura ambiente y además se realizó al finalizar, una inyección de blanco con 5
µL de DMSO 100% (solvente).


31

IV Parte: 4) Separación y fraccionamiento final de las disoluciones
del extracto por HPLC
IV 4a) Inyecciones de separación y fraccionamiento final del extracto crudo
Se realizaron varias pruebas de HPLC variando el gradiente de fase móvil, inyectando la
disolución de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% (datos no mostrados). Lo anterior con el
objetivo de mejorar la separación de los componentes de M. urens a partir directamente de la
disolución del extracto.

De estas pruebas, en la que comienza a observarse una mejor separación de los componentes del
extracto, es la corrida llamada Zhao.001. Se usaron 20 µL de M. urens 50 mg/mL en DMSO
100% con la fase móvil “Zhao” descrita en la Tabla 6.
Tabla 6: Fase móvil “Zhao” aplicada en HPLC, para los ensayos de separación, X: H
2
O Milli-Q
+ 0.1% TFA; Y: ACN calidad HPLC + 0.1% TFA.
Tiempo (min) X% Y% Fase Móvil
0 100 0
Isocrática
10 100 0
Gradiente lineal
40 70 30
Isocrática
50 70 30
Gradiente lineal
60 0 100
Gradiente lineal
70 100 0
Tabla 7: Fase móvil “Zao7” aplicada en HPLC para los ensayos de fraccionamiento del extracto,
X: H
2
O Milli-Q + 0.1% TFA; Y: ACN calidad HPLC + 0.1% TFA.
Tiempo (min) X% Y% Fase Móvil
0 100 0
Isocrática
20 100 0
Gradiente lineal
50 70 30
Isocrática
60 70 30
Gradiente lineal
70 0 100
Isocrática
85 0 100
Gradiente lineal
90 100 0
32

El registro de los canales de detección se detuvo a los 65 minutos y la velocidad de flujo durante
la corrida completa fue de 1 mL/min.

Como prueba final, se llevó a cabo una inyección de 400 µL de extracto de M. urens 50 mg/mL
en DMSO 100%, utilizando una fase móvil similar a la anterior. Los eventos de la fase móvil
“Zao7” se muestran en la Tabla 7. Ambos canales de detección se detuvieron a los 90 minutos.
La corrida se colectó cada 5 mL/tubo a partir del minuto 1 del cromatograma hasta el minuto 91;
por el retraso existente entre el detector y el colector. El flujo de la fase móvil se mantuvo en 1
mL/min y los canales de detección a 219 y 280 nm.
IV 4b) Preparación, concentración y redisolución de las fracciones provenientes de la
separación final
Las fracciones colectadas cada 5 minutos en tubos de vidrio se concentraron utilizando una
centrífuga de vacío marca Speed-Vac® a velocidad baja por ~30 horas. Los residuos secos de las
fracciones cada cinco minutos se diluyeron nuevamente por separado en un volumen de 20 µL de
DMSO 100% cada una y se agitaron en un vórtex a alta velocidad por 2 minutos. Luego de
disueltas, se ensayó en el modelo biológico cada una de las fracciones (o sea 18 fracciones en
total).

Resultados
I Parte: Pruebas para identificación de metabolitos secundarios
Tabla 8: Pruebas cualitativas para identificación de alcaloides en el extracto hidroalcohólico 8:2
de Mucuna urens.
Pruebas para
Alcaloides
Reactivo de
Mayer
Reactivo de
Valser
Solución
de Ácido
Tánico
Reactivo de
Dragendorff
Reactivo
de Wagner
Reactivo
de
Reineckato

Patrón de
alcaloides al 0.5%
(Quinina,
Cinchonina,
Atropina y
Estricnina)

Precipitado
color blanco
en el fondo
Precipitado
color
amarillo en
el fondo
Precipitado
color
blanco en
el fondo
Precipitado
color naranja
en el fondo
Precipitado
color
marrón en el
fondo
Precipitado
color rosado
floculante
Extracto
hidroalcohólico 8:2
de Mucuna urens

negativa

negativa

negativa negativa negativa negativa
33

Tabla 9: Pruebas cualitativas para identificación de glicósidos antracénicos en el extracto
hidroalcohólico 8:2 de Mucuna urens.

Prueba para Glicósidos Antracénicos

Solución amoniacal acuosa o
reacción de Borrntraeger
Extracto hidroalcohólico 8:2 de Mucuna urens





negativa

(color rojo cereza en la capa acuosa si es
positiva la prueba)




Como se observa en las Tablas 8 y 9, no se detectó ninguna reacción positiva para alcaloides
(Tabla 8), ni para glicósidos antracénicos (Tabla 9).

En la tabla 10 se observa como cuatro de las pruebas para taninos fueron positivas, por lo que se
puede presumir que M. urens contiene componentes del grupo de los taninos.

Tabla 10: Pruebas cualitativas para identificación de taninos en el extracto hidroalcohólico 8:2
de Mucuna urens.
Pruebas para
Taninos

Molibdato
de Sodio
Ferrocianuro-
amoniaco
Solución
de iones
Plomo
Solución
de
alcaloides
Yodato
de
Potasio
Nitrito de
Sodio
Patrón de Ácido
Tánico al 2%



Solución
translúcida
rojo-naranja
Solución
translúcida
amarilla
Precipitado
blanco en el
fondo
(cristales)
Precipitado
blanco en el
fondo
(gránulos)
Solución
naranja
oscuro
translúcido

Reacción
burbujeante
que deja
solución
amarillo
oscuro

Extracto
hidroalcohólico 8:2
de Mucuna urens

positiva negativa positiva negativa positiva positiva



34

Tabla 11: Pruebas cualitativas para identificación de flavonoides en el extracto hidroalcohólico
8:2 de Mucuna urens.
Pruebas para
Flavonoides

Reactivo de
Shinoda o
Cianidina
Reactivo de Wilson
Ácido
Sulfúrico
Cloruro
Férrico



Patrón de Quercetina al
1%




Solución
translúcida rojo
sangre
Solución translúcida
amarilla que da
fluorescencia
amarillo-verdoso a
365 nm (UV)
Solución
translúcida
amarillo
oscuro
Solución
opaca verde
oscuro
Extracto hidroalcohólico
8:2 de Mucuna urens

negativa negativa negativa positiva


Cabe la posibilidad de que algún (os) metabolito (s) con grupos estructurales similares a los
flavonoides o con varios grupos OH, esté presente en el extracto (ver tabla 11); ya que la prueba
de cloruro férrico fue positiva. Sin embargo, si solo esa prueba fue positiva no se puede
presumir que existan flavonoides en el extracto; pues la prueba de cloruro férrico, no es
específica de flavonoides (también se usa para taninos) y las demás pruebas del grupo fueron
negativas.

II Parte: Ensayos biológicos del extracto crudo y separado
II 1) Experimentos de respuesta de calcio sobre receptor M
3
. Células HEK-293 no
transfectadas

II 1a) Comparación de disoluciones de extracto bruto en diferentes solventes
La actividad que se buscó en estas células fue aquella relacionada con el receptor M
3
endógeno,
aunque es importante mencionar que las células poseen otros receptores endógenos que podrían
ser susceptibles a activación por las sustancias presentes en el extracto.
35



Figura 5: Respuesta al calcio desencadenada por el receptor M
3
en células HEK-293 empleando
como sonda Indo-1. Emisiones tomadas a 401 y 475 nm; temperatura regulada a 21 ºC. A) M.
urens 50 mg/mL en solución salina + 1% DMSO y solvente, datos brutos. B) Extracto y solvente
de la misma prueba, con valores de fluorescencia normalizados.


En la figura 5A se observa como señala la primera flecha (tiempo 1 min) que se agrega extracto
crudo disuelto en solución salina o solvente según corresponda; como puede notarse la adición
del extracto produjo un incremento súbito en el nivel de fluorescencia pero sin ninguna respuesta
celular (auto fluorescencia del extracto). La adición de solvente no mostró ningún efecto ni de
fluorescencia, ni de liberación intracelular de calcio sobre las células. A los 4 min y 4 min 40 s se
señalan la adición de carbacol, agonista que produjo la respuesta por movilización de calcio en
ambas ocasiones. En la cuarta flecha (tiempo 7 min) se señala la adición de digitonina,
detergente que produce el aumento máximo posible de fluorescencia al tomar en cuenta todo el
calcio (intra y extra celular). Como puede notarse, las medidas de fluorescencia para el solvente
(verde claro), tanto en el carbacol como en la digitonina parecen mayores; sin embargo, como se
demuestra en la figura 5B (parte superior), al normalizar los datos tomando la digitonina como el
máximo de calcio (100% de respuesta), ambas respuestas son de amplitud equivalente.

36

Para las primeras pruebas, el marcaje del calcio fue realizado con la sonda Indo-1. En todos los
casos donde se use esta sonda, se hizo una razón de ambas longitudes de onda para presentar los
datos; a menos que se indique lo contrario. La temperatura en este caso fue fijada a 21 °C.

En la figura 6A y 6B se observa en la primera flecha (minuto 1) que se agrega extracto disuelto
en DMSO puro o agua + DMSO respectivamente; junto a los solventes de cada caso. Como
puede notarse en la figura 6A, la adición del extracto produce un incremento súbito en el nivel de
fluorescencia, pero sin ninguna respuesta celular. La adición de solvente en ambos casos no
realizó ningún efecto ni de fluorescencia, ni de liberación intracelular de calcio al minuto uno. Al
minuto 4 se señala la adición de carbacol, este agonista produce la respuesta por movilización de
calcio (espiga) en ambas figuras (A y B) tanto para el extracto como para los solventes. En el
minuto 7 se señala la adición de digitonina (detergente que rompe las membranas), para asegurar
el nivel máximo de fluorescencia (calcio intra y extra celular). Al igual que para el caso anterior,
la normalización de los gráficos siguientes, mostró una respuesta de amplitud equivalente del
carbacol en cada uno de los casos (datos no mostrados).




Figura 6: Respuestas al calcio desencadenadas por el receptor M
3
, en células HEK-293
empleando como sonda Indo-1; emisiones tomadas a 401 y 475 nm; temperatura regulada a 21
ºC. A) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100%. B) M. urens 50 mg/mL disuelta en agua + 5%
DMSO.

37



Figura 7: Respuesta al calcio desencadenada por el receptor M
3
, al adicionar M. urens 50
mg/mL disuelta en EtOH/H
2
O 8:2, células HEK-293 cargadas con la sonda Indo-1; emisiones
tomadas a 401 y 475 nm; temperatura regulada a 21 ºC.


En la figura 7 se observa como señala la primera flecha (minuto 1) que se agrega extracto
disuelto en etanol/agua 8:2 o solvente según corresponda. La línea en la que se agrega atropina y
extracto posee un minuto de retraso en la adición de extracto (minuto 2) y no disminuyó la giba.
Como puede notarse la adición del extracto produce un incremento súbito en el nivel de
fluorescencia y una cuantificable respuesta celular en forma de giba.

La adición de solvente provoca un efecto de aumento muy sutil en la línea base por movilización
de calcio, el cual no es de la misma magnitud que aquel producido por el extracto. En el minuto
4 y 5 se señala la adición de carbacol que produce la respuesta por calcio en los ensayos de
extracto solo y solvente, pero no en el que fue agregada anteriormente la atropina al extracto,
debido al bloqueo muscarínico.

En la última flecha (tiempo 7 min) se señala la adición de digitonina que asegura el máximo de
fluorescencia posible en cada ensayo (100% al normalizarlo).

38



Figura 8: Respuesta al calcio desencadenada por el receptor M
3
en células HEK-293, empleando
como sonda Fluo-4; emisión tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC.
A) M. urens 50 mg/mL en solución salina + 1% DMSO y solvente. B) M. urens 50 mg/mL en
EtOH/H
2
O 8:2 y solvente.

En la figura 8, se observa un experimento de respuesta al calcio en el mismo tipo de células y
con las mismas condiciones anteriores, variando en esta ocasión solamente el tipo de sonda
utilizado para el marcaje (Fluo-4). La dinámica de adición de los compuestos tal como se indica
en la figura 8A (extracto disuelto en solución salina + 1% DMSO) y 8B (extracto disuelto en
EtOH/ H
2
O 8:2) fue: a 1 minuto extracto crudo o solvente, a los 4 minutos carbacol 50 µM final
y a los 7 minutos digitonina 50 µM. Ninguna de estas dos disoluciones de extracto o solvente
produjo respuesta M
3
.


Figura 9: Respuesta al calcio desencadenada por el receptor M
3
en células HEK-293, empleando
como sonda Fluo-4; emisión tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC.
A) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% y solvente. B) M. urens 50 mg/mL en agua + 5%
DMSO y solventes.
39

Finalmente, en la figura 9A y 9B se muestra el mismo tipo de experimento; pero utilizando el
extracto disuelto en DMSO 100% y agua + 5% DMSO respectivamente. La dinámica de adición
de los compuestos fue la misma que para la figura 8 y se encuentran indicadas en los gráficos.

En ninguno de los dos últimos casos de M. urens en diferentes solventes (DMSO y agua + 5%
DMSO) se presentó una respuesta al calcio por el receptor M
3
; aunque estos receptores se
encontraban en condiciones de responder al estímulo de un agonista, como puede comprobarse
en cada uno de los gráficos mediante la giba producida por el carbacol.


II Parte: Ensayos biológicos del extracto crudo y separado
II 2) Espectros de emisión de fluorescencia de M. urens
II 2a) Separación del extracto por HPLC para la elaboración del espectro de emisión de
fluorescencia
Se realizó la inyección de 20 µL de M. urens cruda 25 mg/mL disuelta en solución salina + 1%
DMSO como se muestra en la figura 10; con el fin de colectar todas las fracciones de la corrida a
1 mL/tubo cada una. Con esas fracciones, se efectuó luego el espectro de emisión fluorescente a
las longitudes de onda del Indo-1 y del Fluo-4.




Figura 10: Cromatograma resultado de un análisis de HPLC en gradiente con columna C
18
,
inyección de 20 µL de M. urens 25 mg/mL en solución salina + 1% DMSO a T. A. Colecta de
fracciones a 1 mL/min.
40

II 2b) Espectros de Emisión de Fluorescencia para las fracciones del extracto
En la figura 11 se muestran las fracciones más representativas del extracto (aunque se analizaron
las 51 mencionadas en la metodología), representando solo unas del inicio de la corrida y otras
del final; así como uno de los solventes utilizados en HPLC y en los cuales salen disueltas las
fracciones colectadas (blanco de fluorescencia). Se eligieron estas fracciones, ya que mostraron
los valores más altos de fluorescencia bajo las condiciones del Indo-1 o del Fluo-4.



Figura 11: Espectro de Emisión de Fluorescencia para fracciones colectadas por HPLC de M.
urens 25 mg/mL en solución salina + 1% DMSO a T. A.

Como puede observarse en la figura 11, para la primera parte de la prueba la excitación se realiza
a 338 nm, la cual corresponde a la misma longitud de onda de excitación de la sonda Indo-1 que
luego se utilizará en los ensayos biológicos con células. Siguiendo con el gráfico, el espectro de
emisión es colectado entre 355 y 500 nm que comprende ambas longitudes de onda de emisión
máxima que corresponderían al Indo-1 (401 y 475 nm) para determinar posibles interferencias
fluorescentes de las fracciones del extracto. En este caso se observa como las fracciones 8 y 9
producen la más alta cantidad de fluorescencia, sobre todo a 401nm (marcado en el gráfico), lo
cual coincide con la longitud de emisión más importante del Indo-1.

Ese experimento fue llevado a cabo para las mismas fracciones pero simulando las condiciones
de análisis del Fluo-4; excitación 494 nm, espectro de emisión entre 510 y 700 nm, el cual
comprende la longitud de onda de trabajo del Fluo-4: 516 nm (marcada en el gráfico); y como
41

puede observarse, la cantidad de fluorescencia producida por las fracciones del extracto fue
mínima comparada con la producida bajo las condiciones del Indo-1.

II 3) Experimentos de respuesta de calcio sobre receptor M
1
. Células CHO-M
1

transfectadas
II 3a) Curva Dosis/Respuesta a la Acetilcolina (Ach)
Antes de comenzar a hacer pruebas del extracto crudo y fraccionado, se realizó una curva
dosis/respuesta con acetilcolina que fue utilizado en los primeros experimentos (datos no
mostrados en este trabajo). La curva dosis/respuesta para carbacol no se realizó ya que los
protocolos de trabajo del laboratorio UMR 7175 del CNRS: Biomoléculas, Biotecnología e
Innovación Terapéutica la tenían establecida de antemano en: 50 µM, así como la concentración
de antagonista (atropina 10 µM) a ser utilizado para bloquear dicha respuesta en células CHO-
M
1
.


Figura 12: Respuesta al calcio en células CHO-M
1
; curva Dosis/Respuesta correspondientes a la
Acetilcolina empleando como sonda Indo-1; emisión tomada solamente a 401 nm y temperatura
regulada a 21 ºC.

En la figura 12 se observa un experimento de respuesta al calcio en células CHO-M
1
en la cual
en cada ensayo se adicionan concentraciones crecientes de acetilcolina para formar una curva
dosis/respuesta.
42

En la misma figura, podemos ver como a concentraciones bajas de agonista no se obtiene
respuesta; no es sino hasta 10 nM que la acetilcolina supera el umbral de activación sobre el
receptor movilizando calcio. La Ach continúa aumentando la respuesta hasta un punto máximo
en el cual por más exceso de agonista que se aplique, la amplitud de la respuesta no incrementa
(~300 nM). De la curva anterior se extrae que la EC
50
para la Ach es de 25.5 nM y que la
concentración óptima que se debe utilizar sobre las células CHO-M
1
es de 100 nM, ya que
produce una respuesta considerable, pero no máxima.

Se calculó el porcentaje de respuesta de acuerdo a la normalización con digitonina como un
100% de respuesta. Dicho porcentaje de respuesta para las cuatro últimas concentraciones de
Ach (de 10 a 300 nM) permitió obtener la figura de la parte superior. Al graficar el porcentaje de
respuesta obtenido de Ach versus la concentración de Ach utilizada se consigue una función que
sigue la forma hiperbólica de la curva dosis/respuesta teórica.

II 3b) Comparación de disoluciones de extracto bruto en diferentes solventes y bloqueo por
atropina
Se realizan las mismas pruebas que para el receptor M
3
sobre el M
1
, usando Fluo-4 como sonda;
ya que como se vio en los espectros de emisión de las fracciones del extracto, con esta sonda las
medidas de fluorescencia por calcio presentan muy poca interferencia. Se omitió la solución en
agua + 5% DMSO; ya que en algunas pruebas iniciales sobre el receptor M
1
marcadas con Indo-
1 (datos no mostrados) no se obtuvo ningún tipo de actividad (agonista o antagonista).

Como se aprecia en la figura 13A el extracto disuelto en solución salina no produce ninguna
respuesta por liberación de calcio (activación del receptor). Los solventes no muestran ninguna
interferencia o variación en la línea base. La dinámica de adición de los compuestos fue la
misma que la expuesta para la figura 8 y además se indica en cada gráfico.



Figura 13: Respuesta al calcio en células CHO-M
1
empleando como sonda Fluo-4; emisión
tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC.
A) M. urens 50 mg/mL en solución salina + 1% DMSO y solventes. B) M. urens 50 mg/mL en
solución salina + 1% DMSO al adicionar atropina 8 µM.
43


Las líneas verticales sobre cada punto de evento, fueron producidas por la inyección de los
componentes en el espectrofluorómetro. Estas líneas, provienen de la luz que entra al
compartimiento de prueba al abrir la ventanilla y descargar cada uno de los componentes antes
indicados.

La concentración de atropina utilizada fue de 8 µM o 10 µM; pues así la recomendaban como
óptima los protocolos establecidos en el laboratorio de Biomoléculas para Fluo-4 en ese tipo de
células.

Aunque con el extracto crudo disuelto en solución salina no se obtuvo respuesta, se realizó un
ensayo con extracto y atropina (figura 13B), para confirmar el correcto bloqueo de la respuesta a
carbacol en presencia de extracto y el máximo de fluorescencia alcanzado por la digitonina.



Figura 14: Respuesta al calcio en células CHO-M
1
empleando como sonda Fluo-4; emisión
tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC. A) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% y
solvente. B) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% al adicionar atropina 8 µM.

En la figura 14A, el extracto disuelto en DMSO produjo una respuesta muscarínica apreciable
por liberación de calcio (agonismo del receptor). El solvente en este caso no mostró ningún
cambio en la línea base al ser adicionado a las células. Los controles con carbacol respondieron
realizando las gibas correspondientes en el caso de extracto y de solvente. La digitonina mostró
un nivel de fluorescencia correspondiente.

La respuesta desencadenada por el extracto (figura 14A), fue bloqueada completamente por la
atropina (respuesta muscarínica antagonisada) y el carbacol también fue correctamente
bloqueado como se muestra en la figura 14B.
44



Figura 15: Respuesta al calcio en células CHO-M
1
empleando como sonda Fluo-4; emisión
tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC. A) M. urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O 8:2 y
solventes. B) M. urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O 8:2 calcio al adicionar Atropina 8 µM.

En la figura 15A se muestra el mismo tipo de prueba pero adicionando el extracto disuelto en
etanol/agua 8:2; se obtuvo una gran respuesta agonista al agregar el extracto (giba azul luego de
1 minuto). El solvente no provocó ningún efecto sobre las células. La digitonina alcanzó un nivel
máximo muy parecido (calcio total); ya que con la sonda Fluo-4 no se presentó el ruido de fondo
(autofluorescencia) de los componentes del extracto.

La respuesta vista en la figura 15A provocada por el extracto, fue bloqueada parcialmente según
la figura 15B al agregar atropina (giba después de 2 minutos). La cantidad de atropina colocada
fue suficiente puesto que se confirma en el minuto 5, el bloqueo completo de la respuesta a
carbacol.

Debido a la sospecha de una reducción de amplitud en la respuesta del agonista control al colocar
el extracto, fue realizada una curva dosis/respuesta con Mucuna urens disuelta en DMSO 100%.
Dicha curva dosis/respuesta, es presentada en los anexos, para corroborar si se trataba de un
efecto producido por el extracto en forma dosis dependiente o no (ver figura 2 en anexos).

Además, se realizó otra prueba con agonistas de diferentes receptores (M
1
y purinérgicos) en las
mismas células. Lo anterior, con el fin de verificar si la disminución en la respuesta al agonista
se debía a antagonismo muscarínico del extracto o a una desensibilización general de receptores
(ver figura 3 en anexos).

II 3c) Respuestas de las disoluciones del extracto bruto en células CHO no transfectadas,
sin receptor M
1

Las células CHO no poseen normalmente ningún receptor muscarínico asociado con proteínas G
por lo que se verifica la respuesta mediante los receptores purinérgicos endógenos con adenosina
trifosfato (ATP) como agonista.

45



Figura 16: Respuestas al calcio por receptores endógenos en células CHO no transfectadas
empleando como sonda Fluo-4; emisiones tomadas a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC. A)
M. urens 50 mg/mL disuelta en salina + 1% DMSO y solvente. B) M. urens 50 mg/mL disuelta
en DMSO 100% y solvente.

Como se aprecia en las figuras 16A y 16B el extracto no produce ninguna respuesta por
liberación de calcio (activación de receptores). En 16B el extracto realizó una especie de
fluorescencia que no es una respuesta ya que no desciende en forma de giba. Los solventes no
mostraron ninguna respuesta, interferencia o variación en la línea base. En ambas figuras se
observa como al agregar el ATP, este produce una respuesta agonista desencadenada por los
receptores purinérgicos endógenos.



Figura 17: Respuesta al calcio por receptores endógenos de células CHO no transfectadas, al
adicionar M. urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O 8:2 y solventes. Se empleó como sonda Fluo-4,
emisión tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC.
46

En la figura 17, a diferencia de lo visto en las figuras 16A y 16B; el extracto disuelto en
etanol/agua produce una pequeña respuesta a ser considerada. Esta giba luego de 1 minuto, fue
producida por la liberación de calcio al activarse algún receptor endógeno. El solvente en este
caso, no muestra ningún cambio en la línea base. Y los demás controles con ATP (agonista
purinérgico) y digitonina, presentaron respuestas en forma de giba como las habituales.

II 4) Experimentos de respuesta de calcio sobre receptor CXCR4. Células HEK CXCR4
transfectadas
II 4a) Comparación de disoluciones de extracto bruto en diferentes solventes
Estas células poseen el receptor CXCR4 (de quimiocinas) transfectado, hay que tomar en cuenta
que existen en ellas otros tipos de receptores endógenos. El acople del receptor a G αq se realiza
a temperaturas fisiológicas por lo que se regula la temperatura a 37 ºC. Para estos ensayos se
realiza el agonismo con el SDF-1 (stromal-cell derived factor 1α) y el correspondiente
antagonismo con el conocido péptido T134.



Figura 18: Respuesta al calcio por CXCR4. Sonda empleada Fluo-4; emisiones tomadas a 516
nm, temperatura regulada a 37 ºC. A) M. urens 50 mg/mL en solución salina + 1% DMSO y
solventes. B) M. urens 50 mg/mL en solución salina + 1% DMSO + T134.


La dinámica de adición de los compuestos como se observa en la figura 18A es la siguiente: a 1
minuto extracto crudo o solvente, a los 4 minutos SDF-1 5 nM final y a los 7 minutos digitonina
50 µM. En el caso del extracto más T134 (figura 18B) se produce un retraso de 1 min en el
tiempo de adición del extracto (a los 2 min) y el SDF-1 (a los 5 min); ya que en el minuto 1 se
agrega el antagonista (T134 500 nM). La digitonina conserva su adición a ~7 minutos y presenta
una leve disminución en el nivel de fluorescencia por calcio total.

47



Figura 19: Respuesta al calcio por CXCR4. Sonda empleada Fluo-4; emisiones tomadas a 516
nm, temperatura regulada a 37 ºC. A) M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% y solventes. B) M.
urens 50 mg/mL en DMSO 100% + T134.


Como se aprecia en la figura 18 A y B, el extracto produce una respuesta notoria por liberación
de calcio (activación de un receptor), la cual no es bloqueada por el T134. El solvente no mostró
ningún cambio en la línea base.

En la figura 19A se observa que el extracto produce una respuesta por liberación de calcio
(activación de un receptor), la cual no es bloqueada por el T134 (19B). La adición de solvente,
muestra una respuesta en la línea base de igual amplitud a la del extracto para la disolución con
DMSO.

En la figura 19B se observa claramente que el extracto produce una respuesta bifásica, con una
giba rápida en forma de pico, seguida de una giba lenta y extensa, dicha respuesta no fue debida
al receptor de quimiocinas CXCR4, puesto que la respuesta a SDF-1 fue satisfactoriamente
bloqueada.

En las figuras 20A y 20B se observa que el extracto produce una respuesta notoria por liberación
de calcio (activación de un receptor); la cual no es bloqueada por el T134. La adición de solvente
muestra por sí misma una respuesta en la línea base, pero de menor amplitud que para el extracto
disuelto en etanol/agua.
48



Figura 20: Respuesta al calcio por CXCR4. Sonda empleada Fluo-4; emisiones tomadas a 516
nm, temperatura regulada a 37 ºC. A) M. urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O 8:2 y solventes. B) M.
urens 50 mg/mL en EtOH/H
2
O + T134.
II 4b) Respuesta de disoluciones de extracto bruto bloqueadas con atropina
Por poseer estas células otros tipos de receptores endógenos como el M
3
se verifica si las
respuestas vistas con el extracto a 37 ºC corresponden a dicho receptor muscarínico. Para estos
ensayos se realiza el agonismo con carbacol 50 µM y el correspondiente antagonismo con
atropina 10 µM.

En el caso de la figura 21 A y B (disolución en salina), la respuesta agonista del extracto se
mantiene igual aunque se agregue atropina; mientras el solvente no presenta respuesta.



Figura 21: Respuesta al calcio por M
3
en células HEK CXCR4. Sonda empleada Fluo-4;
emisiones tomadas a 516 nm, temperatura regulada a 37 ºC. A) M. urens 50 mg/mL en solución
salina + 1% DMSO y solventes. B) M. urens 50 mg/mL en solución salina + 1% DMSO +
atropina.
49


En la figura 22A (disolución en etanol/agua) nuevamente se produce una respuesta, la cual no es
bloqueada por la atropina (figura 22B) y además, la respuesta agonista que se obtiene con los
solventes es menor que la obtenida con el extracto crudo. En este caso la respuesta producida por
el extracto es de mayor intensidad que con la solución salina y con una forma de giba diferente.



Figura 22: Respuesta al calcio por M
3
en células HEK CXCR4. Sonda empleada Fluo-4;
emisiones tomadas a 516 nm, temperatura regulada a 37 ºC. A) M. urens 50 mg/mL disuelta en
EtOH/H
2
O 8:2. B) M. urens 50 mg/mL disuelta en EtOH/H
2
O 8:2 + atropina y solventes.

II 5) Tabla resumen de todos los experimentos de respuesta de calcio realizados sobre los
diferentes receptores mencionados
Tabla 12: Resumen de las respuestas por calcio al agregar el extracto hidroalcohólico crudo
liofilizado de Mucuna urens en diferentes líneas celulares.

Antagonista
usado
CHO M
1

21°C
CHO
21°C
HEK-293
21°C y 37°C
HEK-293
CXCR4, 37°C
Extracto en
solución salina
+ 1 % DMSO

sin Atropina
con Atropina
sin T134
con T134
+/-
-
x
x
-
x
x
x
- -
- -
x x
x x
+
+
+
+

Extracto en
DMSO 100 %
sin Atropina
con Atropina
sin T134
con T134

+
Bloqueada
x
x
-
x
x
x
- +
- +
x x
x x
+/-
+/-
+/-
+/-

Extracto en
EtOH/H
2
O 8:2

sin Atropina
con Atropina
sin T134
con T134
+
Reducida
x
x
+/-
x
x
x
+/- +
+ +
x +
x +
+
+
+
+
50

+: Presentó respuesta agonista -: No presentó respuesta
x: Prueba no realizada o no pertinente +/-: En ocasiones presentó respuesta y en otras no

En la tabla 12 se registra un resumen de todas las pruebas realizadas con el extracto crudo en los
diferentes receptores y líneas celulares (mostradas anteriormente). Todos los ensayos,
corresponden a mediciones de calcio intracelular.
III Parte: 1) Análisis de las disoluciones del extracto por HPLC
III 1a) Inyecciones cromatográficas de prueba para definir condiciones de análisis
En la figura 23A se observa la huella digital producida por los componentes de M. urens disuelta
en DMSO 100% separada en una columna C
8
; el gradiente de fase móvil es el mismo descrito en
la sección IV 1a) de la metodología. Esta fase móvil, permite una etapa de la corrida muy polar
(agua 100%) y otra no polar (gradiente ascendente hacia ACN 100%). Para la detección
ultravioleta (UV), se utilizaron dos longitudes de onda de máxima absorción del extracto
confirmadas como se muestra en la figura 1 de los anexos. A 219 nm se registra la señal de
mayor intensidad; ésta señal está compuesta por los solventes y los componentes del extracto. A
280 nm la señal registra principalmente los componentes del extracto La mayoría de los picos se
agrupan cerca del frente solvente; con algunos picos al comienzo del gradiente hacia 100%
ACN.


Figura 23: Cromatogramas resultado de análisis por HPLC en gradiente, columna C
8
Zorbax®, a
temperatura ambiente (T. A). A) Inyección de 10 µL de M. urens 50 mg/mL disuelta en DMSO
100%. B) Inyección de 20 µL de M. urens 25 mg/mL disuelta en solución salina + 1% DMSO.

Como se observa en la figura 23B, se realizó otra inyección de prueba con el extracto disuelto en
solución salina + 1% DMSO. Dicha inyección se llevó a cabo con el fin de ver la huella digital
del extracto bajo las mismas condiciones al cambiar solamente el disolvente. Los picos
mostraron un poco más de resolución (separación entre picos) que en el cromatograma 23A; pero
siguieron apareciendo muy cerca al frente solvente. En esta corrida ya se puede apreciar mejor el
51

grupo de picos cercanos al comienzo del gradiente hacia ACN 100%. Los volúmenes de
inyección se ajustaron de acuerdo con la concentración de extracto en cada disolución para
producir respuestas comparables entre sí.

Debido a la mala resolución vista en los dos casos anteriores, se decide probar con otra columna
de fase estacionaria, octadecilsilano (C
18
); la cual resulta aun más hidrofóbica y retrasa un poco
la salida de los analitos menos polares.



Figura 24: Cromatogramas resultado de análisis por HPLC en gradiente, columna C
18
Beckman®, a temperatura ambiente (T.A.). A) Inyección de 20 µL de M. urens 25 mg/mL en
solución salina + 1% DMSO. B) Inyección de 20 µL de solvente, solución salina + 2.5% DMSO.

Esta nueva inyección de extracto se muestra en la figura 24A. Se observa una mejor separación
de picos a las dos longitudes de onda analizadas. Los tiempos de retención aumentan, alejándose
de la línea de frente de solvente y además, los picos se resuelven más entre sí. El conjunto de
picos hidrofóbicos vistos antes en mínima cantidad, ahora se logra resolver con mayor claridad.
La aparición de estos picos hidrofóbicos se da después de cinco minutos de iniciado el gradiente
con ACN.

La figura 24B muestra un blanco con solo los solventes usados para la dilución del extracto. Esta
composición es similar a la mezcla de solventes de la inyección mostrada en la figura 27A, pero
con un mayor porcentaje de dimetilsulfóxido (DMSO). Puede observarse en la figura 27B, que
una parte de los picos inmediatos al frente solvente, corresponden a señales provenientes de la
mezcla de solventes. Especialmente al DMSO que absorbe en el UV a aprox. 215 nm (www.kaye
y laby). Nuevamente 219 nm mostró señales correspondientes a los solventes más los
componentes del extracto mientras que a 280 nm señales principalmente correspondientes a
componentes del extracto.

52

III Parte: 2) Análisis de las disoluciones del extracto por HPLC
III 2a) Inyecciones para determinación de la huella digital del extracto de M. urens
En la figura 25A se presenta la huella digital de M. urens redisuelta en agua + 5% DMSO. Se
producen varios picos en el frente solvente, otros dos picos no muy bien resueltos entre 7 y 13
minutos y un grupo de aprox. 8 picos entre 14 y 26 minutos con un carácter un poco más
hidrofóbico.

En la figura 25B se presenta la huella digital de M. urens redisuelta en una mezcla de solución
salina y DMSO al 1%. Se obtiene un patrón similar al de la figura 25A pero con mayor
resolución; el grupo de picos hidrofóbicos se presenta visiblemente en mayor cantidad.



Figura 25: Cromatogramas resultado de análisis por HPLC en gradiente con columna C
18
Beckman®. A) Inyección de 20 µL de M. urens 50 mg/mL en agua + 5% DMSO a T.A.
B) Inyección de 20 µL de M. urens 50 mg/mL en solución salina + 1% DMSO a T.A.



Figura 26: Cromatogramas resultado de análisis por HPLC en gradiente con columna C
18
Beckman®. A) Inyección de 20 µL de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% a T. A. B) Inyección
de 20 µL de M. urens 50 mg/mL en etanol/agua 8:2 a T. A.
53

En forma similar, la figura 26A presenta la huella digital de M. urens disuelta en DMSO 100%,
obteniéndose un patrón con menor resolución. Con este disolvente, los tiempos de retención de
todas las sustancias del extracto disminuyen. Las sustancias hidrofílicas se encuentran entre 8 y
10 minutos y el grupo más hidrofóbico se encuentra entre los minutos 14 y 24.

En la figura 26B se presenta la huella digital de M. urens disuelta en etanol/agua 8:2,
obteniéndose un patrón de picos no tan parecido a los anteriores, aunque los tiempos de retención
de algunos picos son los mismos de la disolución en DMSO 100%. La cantidad de componentes
disueltos con respecto a las otras disoluciones probadas fue considerablemente menor.

Luego de varias pruebas cromatográficas para optimizar la separación de los componentes del
extracto de M. urens, se obtuvo el gradiente mostrado en la figura 27. Este gradiente permitió
una adecuada separación de gran parte de los componentes del extracto. Se establece solo la
huella digital de M. urens en DMSO 100%, ya que fue el tipo de disolución que se continúo
desarrollando a lo largo de este trabajo.



Figura 27: Cromatograma resultado de un análisis de HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex®, inyección de 5 µL de M. urens 50 mg/mL en DMSO a T. A.

En los primeros 10 minutos salen varias señales de componentes completamente hidrofílicos;
seguidos de señales estrechamente relacionadas entre sí posiblemente en su estructura y que
aumentan paulatinamente su hidrofobicidad, pues eluyen conforme aumenta el porcentaje de
54

ACN hasta un 30%. Es importante hacer notar que la mayoría de los componentes del extracto
poseen un carácter altamente hidrofílico, el cual dificulta su separación, purificación y análisis.
Los grupos de picos que eluyeron cercanos reflejan la presencia de componentes
estructuralmente similares.

En la figura 28 se muestra un blanco de DMSO 100% donde se observan las señales producidas
por el solvente en sí mismo. Se debe tomar en cuenta que esta inyección utilizó un volumen de
solvente considerablemente mayor al empleado en el cromatograma de huella digital, por lo que
las señales del solvente son de mayor intensidad. Se observa que a 219 nm tanto la giba que se
forma como el último pico en las señales, están presentes también en la señal del solvente.



Figura 28: Cromatograma resultado de un análisis de HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex®, inyección de 200 µL de solvente, DMSO 100% a T. A.
III Parte: 3) Separación y fraccionamiento inicial de las disoluciones
del extracto por HPLC
III 3a) Inyecciones de separación y fraccionamiento inicial del extracto crudo
Se realizaron dos inyecciones de gran volumen bajo el gradiente C2.001 para obtener los pooles
separados (figura 29, datos mostrados solo para una de las corridas).

En la corrida C2.001, se inyectó un volumen de 200 µL de Mucuna urens disuelta en DMSO
100%. Como puede observarse en la figura 29, la separación de los pooles ocurrió en la fracción
20; donde se estableció como pool 1 el primer grupo de fracciones de carácter hidrofílico (1-20
min) y como pool 2 el segundo grupo de fracciones de carácter hidrofóbico (21-60 min).
55

Las fracciones se colectaron utilizando un flujo de 1 mL/min cada 5 minutos y fueron secadas
individualmente, para luego ser resuspendidas en el solvente de partida y unidas en los pooles.



Figura 29: Cromatograma resultado de un análisis de HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex®, inyección de 200 µL de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% a T. A. Colecta de
fracciones a 5 mL/min y separación en pooles de la corrida C2.001.

III 3b) Inyecciones de comprobación para los “pooles” fraccionados inicialmente del
extracto
Se realizaron inyecciones de 10 µL de pool 1 y 2 concentrado, obtenidos en la colecta de
separación (figura 29). Se utilizó el mismo gradiente que el usado para la determinación de la
huella digital del extracto de M. urens en diferentes solventes (figuras 25 y 26).

Como puede observarse en la figura 30A, el pool 1 de Mucuna urens resuspendido en DMSO
100% no muestra una separación muy eficiente de los componentes hidrofílicos e hidrofóbicos;
ya que aunque se encuentran concentrados los compuestos correspondientes al pool 1
(hidrofílico), se conserva una buena cantidad de pool 2 mezclado (picos entre 18 y 22 minutos).
Mientras que para el pool 2, presentado en la figura 30B (hidrofóbico), se encuentran bastante
bien separados los compuestos hidrofóbicos, pues no posee prácticamente señales del pool 1.
56



Figura 30: Cromatogramas resultado de análisis por HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex®. A) Inyección de 5 µL de pool 1 de M. urens concentrado y resuspendido en
DMSO 100% a T. A. B) Inyección de 5 µL de pool 2 de M. urens concentrado y resuspendido en
DMSO 100% a T. A. Revisión para la separación de pooles correspondientes a la corrida
C2.001.



Figura 31: Cromatogramas resultado de análisis por HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex®. A) Inyección de 5 µL de solvente DMSO 100% a T. A. Blanco para la revisión
de pooles.

Se presenta además una corrida de 5 µL de solvente (DMSO 100%) bajo el mismo gradiente que
para la verificación de pooles, con el fin de determinar cuáles señales del cromatograma son
debidas al solvente (figura 31). Solo se observa una fuerte señal en el frente solvente a los 2
minutos aproximadamente y a los 31 minutos se ve otra señal pequeña no correspondiente a los
solventes, sino más bien a contaminación restante en la columna de las inyecciones anteriores de
extracto.
57

III Parte: 4) Repetición de experimentos de respuesta al calcio en
células CHO-M
1
del extracto separado
III 4a) Pruebas de respuesta al calcio para los “pooles” inicialmente separados de M. urens
Debido a que el extracto crudo disuelto en DMSO mostró actividad sobre el receptor
muscarínico M
1
(figura 14) se tomó como base esa disolución de extracto para preparar la
separación de los pooles. Luego de concentrarlos a sequedad y resuspenderlos en el solvente de
partida, se volvieron a ensayar los pooles sobre las células, procurando mantener las mismas
condiciones experimentales que con el extracto crudo. Para el ensayo mostrado se usan los
pooles concentrados obtenidos de la corrida C2.001 sobre células CHO-M
1
.

En el caso de la figuras 32A (disolución de pooles en DMSO), se realizó un control con
solamente las células más carbacol para verificar la respuesta máxima que alcanza el agonista
(trazo violeta); continuando con la misma figura, se observa una importante respuesta al calcio,
desencadenada por el pool 1 de extracto. La cual es casi totalmente bloqueada cuando se agrega
atropina (trazo azul). En el ensayo de Mucuna sin atropina (trazo naranja), es importante hacer
notar la fuerte disminución de la respuesta al carbacol observada ya en otras ocasiones.



Figura 32: A) Respuesta al calcio al adicionar Pool 1 de M. urens en DMSO 100% en células
CHO-M
1
empleando como sonda Fluo-4; emisión tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21
ºC. B) Respuesta al calcio al adicionar pool 2 de M. urens en DMSO 100% en células CHO-M
1

bajo las mismas condiciones.

De manera consistente con los resultados iniciales de extracto crudo (figura 14), el pool 2 del
extracto produce una respuesta muscarínica pequeña por movilización de calcio (figura 31B), la
cual es completamente bloqueada por la atropina como se observa en la figura 32B (trazo azul).
58

III Parte: 5) Separación y fraccionamiento final de las disoluciones
del extracto por HPLC
III 5a) Inyecciones de separación y fraccionamiento final del extracto crudo
Se realizaron algunas pruebas a partir de la disolución madre de M. urens 50 mg/mL disuelta en
DMSO 100% con miras a mejorar la separación por cromatografía líquida, con las columnas
disponibles, de los componentes del pool 2 y pool 1 para continuar con estudios de fracciones
más reducidas.

Con este objetivo, se realizó la inyección de 20 µL de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100%
variando la fase móvil. Como se observa en la figura 32: los primeros 10 minutos 100% de agua
+ 0.1% de TFA, seguido de un gradiente hasta 30% de ACN en 30 minutos, 10 minutos más de
30% de ACN constante, luego de los cuales comienza a ascender nuevamente el porcentaje de
ACN hasta 100% en 10 minutos. Para finalizar la corrida el gradiente regresa a 100% agua
quedando listo para la siguiente inyección. Los canales de detección se registran hasta los 65
minutos. Como puede verse en la figura 33, logran separarse tres grandes señales de entre el
grupo perteneciente al pool 2, las cuales podrían fraccionarse más para continuar los estudios
biológicos en células CHO-M
1
.





Figura 33: Cromatograma resultado de un análisis de HPLC en gradiente con columna C
18
,
inyección de 20 µL de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% a T. A. Optimización para la
separación de pooles.

59



Figura 34: Cromatograma resultado de un análisis de HPLC en gradiente con columna C
18
Phenomenex®, inyección de 400 µL de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% a T. A. Colecta de
fracciones cada 5 minutos; separación optimizada final, corrida llamada Zao7.001.

En la figura 34 se muestra una inyección de 400 µL del extracto crudo disuelto en DMSO 100%,
pero aumentando 15 minutos de tiempo a 100% ACN para permitir salir las sustancias más
hidrofóbicas del extracto. A pesar de ser un considerable volumen de extracto, algunos picos
logran diferenciarse entre sí. Esta inyección se efectuó con un flujo de 1 mL/min y se colectó
cada 5 minutos.

III 5b) Experimentos de respuesta al calcio en células CHO-M
1
para el fraccionamiento
final del extracto
Aunque se probó cada una de las fracciones cada cinco minutos de la figura 34, se muestran a
continuación solamente las fracciones que arrojaron resultados significativos, un control y una de
las fracciones en las que no se obtuvo ningún tipo de efecto.


60


Figura 35: Respuestas al calcio en células CHO-M
1
al adicionar 5 µL de cada fracción
empleando como sonda Fluo-4; emisión tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC.
A) Control con solvente. B) Fracción 65-70 resuspendida en DMSO 100%.

En la figura 35A se presenta un ensayo control, como puede notarse en la flecha a un minuto se
agregaron 5 µL de solvente, con el que no se produjo ninguna respuesta de liberación de calcio
por activación del receptor M
1
. En el mismo gráfico se muestra el bloqueo con atropina 10 µM
(trazo azul, 35A). En el caso de la figura 35B se observa la fracción 65-70 del extracto, con la
que no se presentó ningún tipo de respuesta. Sin embargo es importante subrayar la correcta
respuesta por parte del carbacol y la digitonina en el ensayo, que aseguran el buen
funcionamiento del sistema biológico.



Figura 36: Respuestas al calcio en células CHO-M
1
al adicionar 5 µL de cada fracción
empleando como sonda Fluo-4; emisión tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC. A)
Fracción 70-75 resuspendida en DMSO 100%. B) Fracción 75-80 resuspendida en DMSO 100%.
En la figura 36A puede notarse como la fracción 70-75 produjo una considerable respuesta de
liberación de calcio por activación del receptor M
1
, la cual fue parcialmente bloqueada por la
61

atropina 10 µM (trazo azul, 36A). Así mismo se observa como la atropina utilizada en el ensayo
tampoco fue capaz de bloquear completamente la respuesta a carbacol agregado a los cuatro
minutos. En el caso de la figura 36B; se observa la siguiente fracción 75-80, con la que se
presentó una pequeña respuesta de fluorescencia (giba) producto de actividad muscarínica, ya
que la atropina bloqueó completamente la respuesta al extracto (trazo azul 36B). Tal como se
observó con la fracción anterior el bloqueo de la respuesta a carbacol no fue completo, aunque sí
se redujo la respuesta del agonista.




Figura 37: Respuestas al calcio en células CHO-M
1
al adicionar 5 µL de cada fracción
empleando como sonda Fluo-4; emisión tomada a 516 nm; temperatura regulada a 21 ºC.
A) Fracción 1-5 resuspendida en DMSO 100%. B) Fracción 5-10 resuspendida en DMSO 100%.


En la figura 37A puede notarse como la primera fracción (1-5) produjo una considerable
respuesta de liberación de calcio por activación del receptor M
1
, la cual es totalmente bloqueada
por la atropina 10 µM (trazo azul, 37A). En el caso de la figura 36B se observa la siguiente
fracción (5-10), con la que se presentó un pequeño pico de fluorescencia, el cual no parece ser
producto de actividad muscarínica, debido a que la atropina no produjo ningún efecto
significativo sobre el mismo y a la forma del pico no parece una respuesta por liberación de
calcio del retículo endoplasmático (no tiene forma de giba). En ambos casos (37A y B), se
produjo una considerable reducción de la respuesta celular control desencadenada por el carbacol
si se compara con respecto al control de la figura 35A.




62

Tabla 13: Resumen de las respuestas por calcio al agregar el extracto hidroalcohólico
fraccionado de Mucuna urens sobre células con receptor M
1
.

Fracciones del extracto en
DMSO 100%
(provenientes de la figura 34)
Antagonista usado: Atropina CHO M
1

21°C
1-5

sin
con
+
Bloqueada
5-10 sin
con
-
x
10-15 sin
con
-
x
15-20 sin
con
-
x
20-25 sin
con
-
x
25-30 sin
con
-
x
30-35 sin
con
-
x
35-40 sin
con
-
x
40-45 sin
con
-
x
45-50 sin
con
-
x
50-55 sin
con
-
x
55-60 sin
con
-
x
60-65 sin
con
-
x
65-70 sin
con
-
x
70-75

sin
con
+
Reducida
75-80

sin
con
+
Bloqueada
80-85 sin
con
-
x
85-90 sin
con
-
x

+: Presentó respuesta agonista -: No presentó respuesta x: Prueba no realizada o no necesaria

63

Discusión
La enfermedad de Parkinson es una patología de alta incidencia en la población mundial. Pese a
que ya existen medicamentos para mejorar los síntomas y signos de este mal, sus efectos
adversos y la incapacidad de frenar su progreso, motivan la continua búsqueda de nuevas
opciones terapéuticas. Molina y Solís (2003) encontraron que el liofilizado del extracto
hidroalcohólico de la semilla de Mucuna urens posee actividad antiparkinsoniana en el modelo
unilateral de 6-OHDA.

El presente estudio evaluó el efecto muscarínico in vitro del extracto crudo de las semilla de M.
urens y sus fracciones.

Luego de comprobar los efectos de un extracto natural crudo mediante algún modelo biológico,
se vuelve sumamente necesario conocer los grupos de metabolitos presentes en dicho extracto.
Debido a que los extractos naturales pueden contener varios tipos de metabolitos para ejercer su
efecto fisiológico, ya sea por medio de un único metabolito o una mezcla de ellos en forma
sinérgica.

Los estudios realizados por otros investigadores en el género Mucuna (Grover et al, 2002;
Grover et al, 2001 y Ahmad et al, 2007) demuestran varios efectos que podrían ser de
importancia en el tratamiento de diversas dolencias; entre ellas el Parkinson (Katzenschlager et
al, 2004; Mahajani et al, 1996; Manyam et al, 2004 (a y b); Nagashayana et al, 2000) por lo que
vale la pena conocer los componentes causantes de los efectos farmacológicos en este género de
plantas.

Teniendo en cuenta lo anterior, y además por la falta de estudios químicos precedentes en lo que
respecta a la semilla de Mucuna urens; al inicio de este trabajo se realizaron las pruebas
fitoquímicas preliminares para detectar diferentes grupos de metabolitos secundarios como:
flavonoides, taninos, alcaloides y glicósidos antracénicos (Soriano et al, 2004).

En estas pruebas cualitativas, si al menos cuatro de los diferentes reactivos resultan positivos
para un mismo grupo de metabolitos secundarios, se puede considerar que el extracto posee
componentes con estructuras del tipo de metabolito evaluado. De esta manera, según las tablas 8,
9, 10 y 11 el extracto hidroalcohólico 8:2 de M. urens, posee con certeza taninos. La presencia de
taninos, (estructuras polifenólicas) en el extracto de M. urens, aunque esperable resulta notable,
en el sentido de que pocas caracterizaciones y reportes del contenido de estos en el género
Mucuna se han llevado a cabo. Al respecto, un estudio Filipino de legumbres indígenas
comestibles que incluyó a la Mucuna curanii, reportó en esta, la presencia en bajos niveles de
taninos condensados y polifenoles en general (Laurena et al, 1994).

La posibilidad de algún flavonoide con grupos fenoles surge en la reacción llevada a cabo con
cloruro férrico, aunque esta prueba no es específica, pues también se utiliza para la
determinación de taninos (Isaza et al, 2005; Bell et al, 1971). En estos casos un color verdoso es
presuntivo de un derivado catecol; mientras que un color azul es sugestivo de un derivado de
pirogalol (Lock, 1994). Sin embargo, con solo una reacción inespecífica positiva para
flavonoides no se puede afirmar que existan estos metabolitos en el extracto, a menos que se
64

efectúen más pruebas químicas específicas como espectrometría infrarroja, RMN y HPLC-MS
que así lo confirmen. Todas las pruebas para alcaloides y glicósidos antracénicos resultaron
negativas, probablemente debido a que la planta los posee en muy bajas concentraciones para ser
detectados por una prueba visual. Esto se sugiere ya varios autores han reportado para otras
especies de Mucuna la presencia de alcaloides utilizando resonancia magnética nuclear (RMN)
(Bell et al, 1971; Manyam et al, 2004; Mehta et al, 1944; Santra et al, 1953).

Se realizó la identificación de estos cuatro grupos de metabolitos secundarios debido a que son
de los más abundantes en las plantas, poseen diferentes actividades biológicas y sus pruebas de
caracterización visual son ampliamente conocidas.

Algunas de las actividades biológicas y de las características químicas de estos grupos de
metabolitos son las siguientes: los taninos son sustancias no cristalizables con aplicación
medicinal, principalmente gracias a su efecto astringente. A los alcaloides, por su parte, se les
han atribuido muy variadas acciones, tales como estimulantes, antiespasmódicas, analgésicas,
anestésicas, sedantes, hipnóticas, antieméticas, expectorantes, antipiréticas, antiasmáticas y como
relajantes musculares (www.salud.com). Los flavonoides por otra parte, son sustancias
cristalizables que poseen entre otras, propiedades astringentes, estrogénicas, antioxidantes y
antifúngicas (González et al, 2008; Ishige et al, 2001). Por último, los glicósidos antracénicos se
caracterizan principalmente por sus efectos laxantes y catárticos (www.salud.com).

Respecto a actividades fisiológicas ya descritas para M. pruriens; se han publicado sus efectos
antiparkinsonianos, hipoglicémicos, hipocolesterolémicos, antitumorales, antioxidantes,
neuroprotectores, potenciadores del aprendizaje y la memoria, afrodisíacos, antiprotozoarios,
antiinflamatorios y analgésicos (Sathiyanarayana et al, 2007).

En estudios de plantas medicinales, se han desarrollado dos conocidas tendencias: aquella basada
en la identificación y purificación de componentes químicos, provenientes de extractos de
plantas medicinales a partir de las cuales se desarrollan nuevos fármacos mediante la modelación
de sus farmacóforos (Zepeda y Lira, 2007; Lager et, 2006). O los que utilizan los extractos de
plantas medicinales crudas; sin purificación posterior. En esta segunda corriente, se rescata que
la mezcla de compuestos presentes en un extracto crudo, producen interacciones de la acción
biológica in vivo. Los seguidores de esta tendencia abogan por no purificar los extractos crudos,
debido a que pierden o disminuyen su acción in vivo (Chen et al, 2007; Wang et al, 2008).

Debido al alto costo de las purificaciones en los extractos llevadas a cabo por los partidarios de
la primera tendencia y a la razón de disminución en la actividad biológica de la segunda, es que
se justifica la disminución general del número de estudios fitoquímicos de purificación; así como
el número de estudios recientes para el género Mucuna.

Como se mencionó en la introducción de este trabajo, la planta estudiada, (M. urens) tiene al
igual que otras plantas medicinales, varios efectos biológicos. Uno de los efectos descritos y
probados en el laboratorio del Programa de Neurociencias utilizando el extracto hidroalcohólico
de esta planta, tiene que ver con una recuperación funcional mayor de animales experimentales
que recibieron el extracto, comparada con la de los controles que recibieron L-Dopa en el
modelo unilateral de 6-OHDA (Molina y Solís, 2003). Inspirados en dichos datos y tratando de
65

buscar una posible explicación para el efecto del extracto, es que en este estudio se investigó su
posible acción sobre el sistema colinérgico, que también ha sido implicado en el funcionamiento
normal y patológico de los ganglios basales.

De acuerdo con lo anteriormente mencionado, se estudiaron algunos de los receptores de este
sistema y específicamente aquellos relacionados con proteínas Gq como el M
1
y el M
3
que
desencadenan la liberación de calcio, cuantificable con el método experimental usado. Puesto
que se postula una acción del extracto sobre receptores muscarínicos, se debe conocer la
distribución de estos en el cerebro, si se quiere sugerir la acción del extracto sobre alguno de
ellos en específico.

Los receptores muscarínicos M
1
se encuentran abundantemente en la corteza cerebral, el
tubérculo olfatorio, el hipocampo y el cuerpo estriado (Flores et al, 2005; Hardman, 2001; Levey
et al, 1991). Los receptores M
2
se encuentran en el cuerpo estriado, la corteza (principalmente
tubérculo olfatorio), el hipocampo, algunos núcleos talámicos (Flores et al, 2005; Gattu et al,
1997), el tronco encefálico y principalmente en el cerebelo (Flores et al, 2005; Levey, 1993;
Levey et al, 1991). Los receptores M
3
se encuentran en un porcentaje notable en corteza, cuerpo
estriado, estructuras talámicas e hipocampo (Flores et al, 2005; Levey, 1993). El receptor M
4
se
distribuye más en prosencéfalo, corteza y cuerpo estriado de las ratas (Levey, 1993). Mientras
que el receptor M
5
se encuentra en el cuerpo estriado, el hipocampo y la corteza cerebral (Flores
et al, 2005).

En los pacientes parkinsonianos se ha visto un incremento de los receptores muscarínicos M
1
y
M
4
en los lóbulos occipitales del cerebro y una marcada disminución de los mismos en los
lóbulos temporales y frontales de ambos hemisferios (Colloby et al, 2006).

Puesto que en el cerebro adulto de los seres humanos, las sinapsis muscarínicas están
involucradas en una gran variedad de funciones tales como el sueño, la conducta de huida, el
aprendizaje, la memoria, el humor, la atención, la regulación neuroendocrina en el hipotálamo y
la modulación del control de movimientos extrapiramidales (Gremo et al, 1987) es que resulta
importante conocer el efecto del extracto de M. urens sobre receptores muscarínicos.

Así, en las pruebas biológicas de respuesta al calcio se buscó el tipo de actividad sobre
receptores muscarínicos M
1
y M
3
en las células CHO-M
1
y HEK-293 respectivamente. No se
probó los subtipos M
2
y M
4
;

ya que estos tienen como acoplaje Gi y disminución de AMPc el
cual debe cuantificarse con otros métodos analíticos no disponibles para este trabajo. El receptor
M
5
no fue ensayado, ya que no encontraba disponible en las células adquiridas de forma
endógena, ni bajo transfección. La mayoría de ensayos se realizaron a 21 ºC pues esta
temperatura es suficiente para producir la activación de G αq y la liberación de calcio vía
fosfatidil inositol 4,5-bifosfato (PIP
2
) (Sallese et al, 2000; Stehno-Bittel et al, 1995). Otros
ensayos se hicieron a 37 ºC para producir la activación más eficiente de los receptores acoplados
a G αq como los CXCR4, aunque es posible que además de la activación del retículo
endoplasmático, a temperaturas fisiológicas se presente la activación de los canales operados por
receptor (ROCCs) que permiten la entrada de este ión desde el líquido extracelular (Brown et al,
2005; Zagranichnaya et al, 2005). Aunque la entrada de calcio extracelular no fue corroborado
por una prueba experimental en la que se elimine dicho ion; se sabe de acuerdo con otros
66

investigadores, que en las ocasiones donde los experimentos presentan un comportamiento
bifásico, la segunda parte de esta respuesta, se debe frecuentemente a la entrada de calcio
extracelular (Putney, 1994).

Según la respuesta al calcio del receptor M
3
a 21 ºC, marcada con Indo-1 para las cuatro
disoluciones diferentes ensayadas del extracto, solo la solución en etanol/agua 8:2 muestra un
efecto agonista de M. urens, el cual no es de tipo muscarínico ya que no es bloqueado por la
preincubación con atropina.

Dicho efecto podría corresponder a cualquiera de los otros receptores endógenos de estas células,
asociados con Gq (vitronectina, adenosina 2B (A
2B
), α1 adrenérgicos, β adrenérgicos,
bradicininas, endotelina, purinérgicos Y
1
, Y
2
y Y
13
, somatostatina, esfingosina y trombina entre
otros) (Cooper et al, 1997; Linden et al, 1999). De ellos, los únicos que han sido asociados con la
terapéutica de Parkinson son los receptores de adenosina, en especial un antagonismo de los
receptores A
2A
, A
2B
y A
1
, al mejorar los efectos secundarios producidos por los anticolinérgicos
dados como terapia antiparkinsoniana (Góngora et al, 2005).

Por otro lado, la respuesta al calcio por acción del extracto sobre el receptor M
3
a 21 ºC en
células HEK, marcadas con la otra sonda fluorescente (Fluo-4), no mostró ninguna actividad
agonista ni antagonista sobre el receptor muscarínico M
3
. En este caso la respuesta agonista no
muscarínica de la disolución en etanol/agua no apareció. Lo anterior pudo ser consecuencia del
envejecimiento celular que se había producido en los cultivos de prueba, lo que disminuiría la
efectividad en la movilización de calcio intracelular (comunicación personal con Muriel Hachet,
laboratorio de RPM, Estrasburgo); o a que Fluo-4 no fue capaz de marcar pequeñas variaciones
de calcio; si la carga de sonda se realiza a una concentración mínima efectiva (2 µM)
(comunicación personal con Sandrine Daval, laboratorio de RPM, Estrasburgo). Sin embargo,
aun no está clara la causa de este efecto; y no se puede esclarecer con las pruebas aportadas en
este trabajo.

Siguiendo con la discusión de los resultados, se llevó a cabo una parte del análisis y separación
cromatográfica del extracto para corroborar y explicar la autofluorescencia vista en las pruebas
celulares realizadas y discutidas anteriormente en las que se uso la sonda Indo-1, luego de esta
breve discusión, se continuará el estudio del extracto sobre los receptores M
1
.

Con la columna C
18
se efectuó una inyección de colecta de fracciones presentada en la figura 10.
Para la colecta se eligió inyectar el extracto liofilizado disuelto en solución salina + 1% DMSO;
ya que solución salina, fue el solvente usado en el trabajo anterior de Molina y Solís (2003); con
el cual se obtuvo el efecto antiparkinsoniano de M. urens. En el caso de las pruebas celulares de
este trabajo, se le adicionó un 1% de DMSO para mejorar la solubilidad del extracto liofilizado.
También, se adicionó el ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1% a ambas botellas de fase móvil en
el presente estudio, con el fin de mejorar la separación de picos y solubilizar sustancias de
carácter básico al bajar el pH.

Continuando el análisis de las fracciones anteriormente separadas por medio de pruebas de
fluorescencia, se adquirieron los datos mostrados en la figura 11. De dicha figura se obtuvo
67

información confirmativa e importante sobre el comportamiento del extracto y de sus
componentes.

Primero que todo, queda claro que bajo las condiciones de análisis del Indo-1, se produce una
señal interferente (autofluorescencia o fluorescencia nativa) proveniente de las fracciones 8 y 9
(carácter hidrofílico) de la colecta. Tal fluorescencia nativa encontrada en el extracto podría
haber sido prevista si las pruebas cualitativas iniciales hubiesen mostrado más resultados
positivos para flavonoides y alcaloides, ya que se sabe que varios de estos tipos de estructuras
con anillos de resonancia y grupos hidroxilo unidos a heterociclos, poseen fluorescencia nativa
(autofluorescencia), la cual es muy sensible a cambios en la polaridad del entorno (disolventes) y
el pH (Romero et al, 2002). Según esta observación, las fracciones 8 y 9 de la corrida mostrada
en la figura 10, podrían contener este tipo de compuestos.

La señal autoflorescente vista en las condiciones del Indo-1 no se produjo o lo hizo en una
proporción mínima bajo las condiciones de análisis del Fluo-4. En este caso, es de notar que son
las fracciones 36 y 45 (carácter hidrofóbico) de la colecta, las que presentaron un pequeño
aumento en el nivel de fluorescencia; mientras las fracciones 8 y 9 (hidrofílicas) se mantuvieron
en la línea base junto con los solventes. Teniendo en cuenta las evidencias expuestas, la mayoría
de análisis biológicos de este trabajo se realizaron marcados con Fluo-4, aunque al inicio de la
etapa experimental se habían previsto en su mayoría con Indo-1.

Con el fin de continuar los análisis biológicos del extracto crudo sobre receptores M
1
; e
implementando la utilización de la sonda Fluo-4 para el resto de pruebas celulares, se inició el
trabajo realizando una curva dosis/respuesta por varias razones. Algunas de ellas fueron: conocer
la concentración final de acetilcolina a utilizarse como patrón, corroborar la EC
50
de este
agonista, verificar que todo el sistema biológico se encontraba en un nivel óptimo de
funcionalidad y que tanto los procedimientos de dilución de las células, como los procedimientos
de preparación de carga de la sonda eran adecuados.

En la figura 12 podemos ver como bajas concentraciones de ligando (1 nM y 3 nM), no
desencadenan fluorescencia por movilización de calcio, ya que son incapaces de activar la vía de
señalización intracelular acoplada al receptor. Sin embargo, al incrementar la concentración de
Ach aplicada, se supera el umbral de activación del receptor (~3-10 nM) y se produce una
respuesta en forma de giba debida a la liberación de calcio del retículo endoplasmático por
acción del IP
3
sobre su receptor endoplasmático; seguido de su posterior recaptura (Qi et al,
2000; Quintanar y Calderón, 2007) en tiempo real. La cantidad de calcio movilizada por acción
del agonista sobre el receptor asociado con proteínas Gq, va en aumento al incrementar la
concentración de agonista (Dawson et al, 2004). En la parte superior de la figura 12 se representa
la fluorescencia como el porcentaje de respuesta fluorescente medida en la inferior. Puede
notarse como las dos últimas concentraciones se aproximan a la respuesta máxima del receptor
M
1
, ya que incrementos considerables (de 200 nM) en la concentración de ligando, no logran
obtener porcentajes de respuesta proporcionalmente mayores. También, como puede verse en la
parte superior de esta misma figura; la concentración eficaz para una respuesta del 50% (EC
50
) es
de 25.5 nM. Este valor es bastante cercano a los datos experimentales que se manejan en el
Laboratorio UMR 7175 del CNRS de 20 nM para acetilcolina en este tipo de células. El valor del
índice de ajuste de la figura superior R
2
= 0.9975 demuestra que el porcentaje de respuesta del
68

receptor se ajusta con la concentración de Ach en una curva hiperbólica (curva S), que sigue la
teoría clásica de ocupación del receptor (Hardman et al, 2001). Se escogió 100 nM de Ach como
patrón en experimentos celulares, ya que libera una considerable cantidad de calcio, sin alcanzar
la activación máxima del receptor, lo cual podría producir desensibilización en los receptores
muscarínicos (Billington y Penn, 2002).

Siguiendo el análisis de las pruebas sobre células CHO-M
1
marcadas con Fluo-4 (ver figuras 13-
15) se observaron efectos diferentes de los observados con el receptor M
3
. Se aprecia una
disolución diferencial de los componentes de Mucuna en los solventes, ya que la solución salina
no logra disolver los componentes que ejercen un efecto agonista del receptor muscarínico M
1
;
mientras que en el DMSO y el etanol/agua se comprueba que existen componentes agonistas M
1

susceptibles a bloqueo con atropina. En la disolución del extracto en DMSO 100%, se obtuvo
una respuesta agonista completamente muscarínica M
1
(ver figura 14), mientras que en la
disolución etanol/agua 8:2 además de parte de un agonismo M
1
(ver figura 15), se obtuvo un
agonismo asociado con otro receptor endógeno, pues como se observa en la figura 15B, la
respuesta desencadenada por el extracto no logró ser completamente bloqueada por la atropina
(fue reducida su amplitud en aproximadamente la mitad).

De conformidad con los ensayos anteriores, al repetir las pruebas sobre receptor M
1
usando la
sonda Indo-1 para marcaje de calcio, las pruebas arrojaron idénticos resultados (datos no
mostrados), brindando más consistencia y credibilidad; con la desventaja ya mencionada del
ruido de fondo producido por la autofluorescencia del extracto.

Con el fin de complementar los resultados anteriores, y recordando que las células CHO sin
transfectar, endógenamente presentan receptores purinérgicos del tipo P
2
Y, se realizaron
verificaciones con las disoluciones de M. urens cruda y ATP (agonista purinérgico) marcadas
con la sonda Fluo-4. Puede comprobarse en la figura 16 que no se obtuvo respuesta alguna
después de agregar el extracto disuelto en solución salina + 1% DMSO o en DMSO 100%. En la
disolución de Mucuna en etanol/agua (figura 17), se presentó una pequeña respuesta agonista de
alguno de los receptores endógenos reportados para estas células y asociados con movilizaciones
de calcio (adenosina (A
2B
), α
2
adrenérgicos, β adrenérgicos, calcitonina, complemento (C3a), 5-
HT1b, purinérgicos Y
1
, Y
2
y Y
13
, esfingosina, ácido lisofosfatídico, bombesina o trombina); en
concordancia con los resultados antes vistos de agonismo no asociado con receptores
muscarínicos (figura 15) (Akerman et al, 1998; Brough et al, 2000; Holdsworth, et al, 2005;
Marcet et al, 2004).

Se realizaron además pruebas con dosis crecientes de Mucuna, para determinar el efecto sobre la
respuesta al agonista muscarínico control (figura 2 de anexos). En la parte A de la figura 2 de
anexos se observa como a mayor concentración de extracto, menor respuesta a la acetilcolina; sin
embargo, se realizó la normalización de los datos a 100% digitonina para asegurar la
comparabilidad de las respuestas (misma figura, parte B) y en este caso se confirma que a mayor
concentración de extracto en la suspensión celular, menor respuesta al patrón de acetilcolina.
Esto podría deberse a la desensibilización rápida por fosforilación del receptor M
1
que induce su
internalización (Billington y Penn, 2002), una interacción de los componentes del extracto con
los ligandos agonistas patrón, o un agonismo por medio de una modulación alostérica que afecte
la dinámica de unión del ligando patrón al sitio activo del receptor.
69

Con la perspectiva de aclarar si dicho comportamiento estaba relacionado con un efecto
antagonista sobre el receptor M
1
específicamente, se realizó la prueba mostrada en la figura 3 de
los anexos. El experimento realizado muestra que no importa el tipo de agonista (muscarínico o
purinérgico) que se agregue en presencia del pool 1 de M. urens, en ambos casos se reduce la
capacidad de respuesta.

De acuerdo con estos resultados; la hipótesis planteada en esta investigación: existen efectos
anticolinérgicos producidos por el extracto hidroalcohólico crudo de Mucuna urens, se rechaza al
menos para los receptores muscarínicos M
1
y M
3
. Esto porque el extracto de Mucuna urens
disuelto en solución salina + 1% DMSO no presentó ni agonismo, ni antagonismo de dichos
receptores asociados con proteínas G; se hace énfasis en esta disolución, puesto que fue la forma
más parecida de disolver el extracto que el aplicado a las ratas en la tesis de Molina y Solís
(solución salina), 2003 (Merino et al, 2003). Para las otras disoluciones ensayadas DMSO 100%
y etanol/agua 8:2 la hipótesis tampoco se cumple, ya que los resultados muestran un agonismo
muscarínico M
1
en vez de un antagonismo y ninguna acción sobre el receptor M
3
.

En oposición a lo que predeciría la teoría antiparkinsoniana sobre efectos anticolinérgicos
benéficos sobre la enfermedad, el efecto del extracto hidroalcohólico liofilizado de la semilla,
resultó agonista muscarínico selectivo M
1
en el modelo celular. Como se mencionó antes, dichos
receptores se encuentran presentes en el cuerpo estriado y reciben regulación inhibitoria por
parte de la dopamina. Estas interneuronas colinérgicas hiperactivas en la enfermedad de
Parkinson, intervienen en la modulación de todas las vías que salen del cuerpo estriado; por lo
que un agonismo colinérgico puro en el cuerpo estriado probablemente tendría un efecto
contraproducente sobre la sintomatología de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, si estos
componentes del extracto actuaran solamente como un agonista parcial de los receptores M
1

estriatales, podrían mejorar los signos y síntomas parkinsonianos; ya que, al desencadenar una
menor activación de la respuesta intrínseca de los receptores postsinápticos comparados con la
activación producida por la Ach endógena que se encuentra aumentada en el cuerpo estriado
enfermo, se vería una disminución general de la actividad muscarínica.

Dicha actividad muscarínica del extracto puede no estar directamente relacionada con la vía de
los ganglios basales y la EP, pero debido a que existen receptores M
1
en diferentes vías
cerebrales como el hipocampo (Gremo et al, 1987; Levey et al, 1991), la acción agonista sobre
M
1
podría provocar efectos que modularan otros procesos asociados por ejemplo con la memoria
y el aprendizaje (Sathiyanarayana et al, 2007).

Sin embargo no se puede perder de vista que en este caso, nos encontramos en un sistema in
vitro, totalmente diferente del sistema nervioso central y más aún de las vías dopaminérgicas
degeneradas en la EP. Es entonces importante tomar en cuenta que el modelo in vitro de
receptores muscarínicos solo permite ver en un sistema aislado la interacción del conjunto de
moléculas presentes en el extracto de M. urens sobre el receptor de interés y otros receptores de
membrana celular endógenos sin toda la compleja interrelación de un organismo. Pero al menos
estos modelos, nos permiten explicar en parte la información subyacente a los receptores sobre
los que actúa el extracto y las vías intracelulares que se activan.

70

Además debe quedar claro que para analizar los efectos muscarínicos agonistas encontrados
deben usarse in vivo las disoluciones de etanol/agua y DMSO 100% de M. urens, para
comprobar la toxicidad del extracto disuelto en estos vehículos específicamente y la
biodisponibilidad que con ellos se logra para los componentes del extracto hacia el SNC.
Estudios de toxicidad aguda llevados a cabo en la UCR por la Dra. Mildred García y el Dr. Jaime
Fornaguera para el extracto crudo de M. urens disuelto en solución salina, demostraron que el
extracto no es tóxico ni a 5000 mg/kg (datos aún no publicados). Además de que en la prueba de
viabilidad con azul de tripán para las células CHO-M
1
el extracto mostró una mortalidad celular
semejante a la del control (ver tabla 1 de los anexos).

Por otra parte, este trabajo también incluyó una pequeña parte de experimentación con
mediadores inflamatorios como lo son las citocinas, estas vías y otras, referentes a los procesos
inflamatorios han sido relacionadas con las etapas iniciales de la EP y con su progresión, así
como con varias enfermedades neurodegenerativas tipo Alzheimer, Huntington, Síndrome de
Down y esclerosis múltiple, donde se sugiere un mecanismo inflamatorio que está relacionado
con la muerte celular (Wersinger et al, 2002).

En el caso específico de la EP se ha visto el aumento en la expresión del Complejo Mayor de
Histocompatibidad tipo II (MHC II) tanto en la microglia como en parte de linfocitos T de la
sustancia negra (parte compacta); mientras que se ha visto un aumento en la expresión del MHC
tipo I en el cuerpo estriado. Además en pacientes con EP se ha encontrado un aumento en los
niveles de citocinas inflamatorias tales como IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12, TNF-α, TGF-α y TGF- β1
a nivel cerebral y de fluido cerebroespinal (Wersinger et al, 2002).

Debido al conocido efecto de las citocinas y sus receptores como el CXCR4 en la activación de
las células del sistema inmunitario (quimiotaxis) y en la mediación de la respuesta inflamatoria,
se ensayó el efecto del extracto sobre un modelo celular con sobreexpresión del receptor
CXCR4. El fin de realizar estas pruebas, fue determinar si el efecto antiparkinsoniano observado
con el extracto de Mucuna urens podía tener alguna relación con procesos antiinflamatorios que
hubiesen coparticipado con los de la L-Dopa en la tesis de Molina y Solís.

Los resultados mostraron que el agonismo producido por el extracto sobre las células HEK-293
transfectadas con CXCR4 no estaba directamente relacionado con la actividad de este receptor.
Se puede afirmar, que mediante este receptor de quimiocinas, el extracto no posee efecto anti-
inflamatorio o pro-inflamatorio. Pues como se observa en la figura 18 de extracto en disolución
salina, se desencadena una respuesta agonista sobre las células, la cual no es bloqueada por el
antagonista de CXCR4, T134. Lo mismo ocurre con las otras disoluciones de extracto (ver
figuras 19 y 20) marcadas con Fluo-4. Las mismas pruebas cambiando la sonda a Indo-1
confirman que en los casos donde se presenta una respuesta agonista del extracto, esta no es
mediada por el receptor transfectado CXCR4; sino más bien por otro receptor endógeno de ese
tipo de células (datos no mostrados).

Probablemente si existe alguna actividad coadyuvante en el extracto, sea más de tipo
antioxidante que anti-inflamatoria o anti-quimiotáctica. Lo sugerido, se sustenta en datos
preliminares que se observaron en células PC-12 en el Laboratorio de Inmunología de la
Universidad de Córdoba, España los cuales mostraron un efecto protector y antioxidante del
71

extracto a concentraciones crecientes de 6-OHDA (comunicación personal con el Dr.
Fornaguera).

Como un dato importante, se encuentra la presencia de sustancias tipo antioxidantes en el
extracto, ya que en la fracción 20-25 del cromatograma de huella digital obtenido (figura 27), se
encontraron estructuras tipo bivanilinas, una trihidroximetoxiflavona y otro componente cuyos
fragmentos moleculares concuerdan con los del resveratrol. Estos análisis, se llevaron a cabo
gracias a la colaboración del Dr. Eric Marchioni de la Facultad de Farmacia de la Universidad
Louis Pasteur de Estrasburgo, Francia; mediante cromatografía de gases acoplada con
espectrometría de masas. El único inconveniente al respecto, fue que los análisis nunca fueron
realizados por duplicado y el programa computacional acoplado al cromatógrafo decidió la
identificación de las estructuras de acuerdo con el ión molecular y los otros iones carga/masa
obtenidos, mostrando porcentajes de probabilidad de 80.75 y 83.3%.

Para comprobar si las respuestas producidas por el extracto no estaban asociadas con el receptor
M
3
endógeno se realizaron las mismas pruebas a 37 ºC, agonizando con carbacol y
antagonizando con atropina. Como se observa en la figura 21 se obtiene nuevamente la respuesta
agonista del extracto disuelto en solución salina, la cual no es muscarínica M
3
pues no es
bloqueada por la atropina. Resultados concordantes con los anteriores se obtienen también con el
extracto disuelto en DMSO 100%, en donde una pequeña respuesta es desencadenada por los
solventes más que por el extracto (datos no mostrados). Finalmente, en la figura 22 se observa
que la disolución de extracto en etanol/agua presentó una pequeña respuesta no muscarínica;
puesto que los solventes ejercieron parte de la respuesta, pero el extracto mostró una respuesta de
amplitud aún mayor. Debido a que las células transfectadas con receptor CXCR4 son también
HEK, de forma endógena contienen los mismos receptores antes mencionados y cualquiera de
ellos puede estar siendo agonizado por los componentes de M. urens.

Se presentó a 37 ºC una respuesta bifásica al colocar el extracto, disuelto en DMSO 100% y
etanol/agua 8:2, como por ejemplo se muestra en la figura 22. Según la literatura, la primera
parte de esa respuesta bifásica podría corresponder a la liberación de calcio de las reservas
intracelulares (retículo endoplasmático); mientras que la segunda parte podría darse por la
entrada de calcio a través de los canales operados por receptor (ROCCs) o por los canales
capacitantes de calcio (SOCCs) (Bugaj et al, 2005; Gilon y Henquin, 2001; Zagranichnaya et al,
2005). Lo anterior sugiere que a nivel fisiológico, múltiples vías celulares de activación y
diversos efectos podrían ser desencadenados con la aplicación del extracto hidroalcohólico de
Mucuna urens.

Buscando realizar una caracterización más precisa de los componentes activos en los ensayos
realizados, se procuró conocer el espectro de absorción de los compuestos por estudiar en HPLC
detección UV/Vis. Se realizó el correspondiente espectro de absorción o densidad óptica del
extracto crudo disuelto en diferentes solventes. Las longitudes de onda de máxima absorción
(longitudes de onda de trabajo) del extracto, se obtuvieron de los máximos mostrados en la figura
1 de los anexos (espectro de absorción). A 219 nm se registró la señal de mayor intensidad; señal
que está compuesta tanto por solventes como por componentes del extracto. A 280 nm la señal
registra principalmente los componentes del extracto. En estas longitudes de absorción se
encuentran comúnmente señales de aldehídos, cetonas, sulfóxidos, eninos, nitroderivados,
72

taninos condensados y sistemas conjugados. Resulta difícil predecir con certeza, cuáles de estos
tipos de compuestos se encuentran en el extracto con solo un espectro de absorción UV-Vis, pero
parece probable la presencia de taninos condensados (polifenoles) y otros sistemas conjugados
según las longitudes de onda del espectro (Isaza et al, 2005).

Una parte importante de la caracterización de los extractos naturales obtenidos de plantas es
obtener registros de sus propiedades físicas o químicas que permitan respaldar la
reproducibilidad de dichos ensayos y la identificación de los extractos naturales. Como ya fue
mencionado en el marco teórico, las “huellas digitales cromatográficas” de los extractos
naturales son una representación gráfica de las señales producidas por los componentes del
extracto mediante la detección de diversas técnicas analíticas, y resultan de suma importancia ya
que permiten la identificación, y el control de calidad de los productos naturales, así como el
estudio de sus componentes (Li et al, 2007).

Como puede verse en las figuras 23A y 23B, la separación obtenida para dos disoluciones de
extracto liofilizado (M. urens) en distintos solventes con la columna C
8
, fue bastante deficiente.
La mayoría de señales se unen al frente solvente y se ven como un solo bloque sin resolver. Ya
en estas primeras inyecciones, aunque no con buena resolución, se observa que para solventes
diferentes con una misma columna, la huella cromatográfica de las sustancias disueltas del
extracto liofilizado no es la misma. Se continúan las pruebas bajo las mismas condiciones
realizando un cambio solo en el tipo de columna utilizada (figura 24). Con la columna C
18
se dio
una mejor separación y migración de los componentes de Mucuna de acuerdo con los distintos
gradientes. El aumento en la longitud de las cadenas no polares (C
18
) de la columna, aumentan la
superficie de contacto, y por tanto el área de interacción con los componentes hidrofóbicos de M.
urens, permitiendo que sean retenidos por más tiempo dentro de la fase móvil estacionaria. En la
figura 24B se muestra un blanco de una mezcla similar a la de los solventes de la inyección
anterior, donde se confirma que los picos inmediatos al frente de elución corresponden en buena
medida a la mezcla de los solventes; especialmente al dimetilsulfóxido que absorbe en el
ultravioleta a aproximadamente 215 nm (www.kaye and laby).

En las pruebas cromatográficas siguientes, se procuró obtener las huellas digitales del extracto
liofilizado resuspendido en diferentes solventes. Se realizaron varias pruebas hasta determinar
más certeramente, el tiempo y la composición de los solventes que deberían utilizarse para la
limpieza entre inyecciones, el tiempo de estabilización de las longitudes de onda, así como la
limpieza del lazo de inyección. Lo anterior, debido a que en las primeras pruebas llevadas a cabo
(datos no mostrados), desaparecían los picos entre inyecciones sucesivas, o se corrían hacia el
frente de elución. Principalmente, los picos hidrofílicos cambiaban los tiempos de retención al
paso de las inyecciones. En estas pruebas se mantuvo el lazo abierto los 55 minutos de corrida y
se cerraba durante la limpieza. El problema mencionado mejoró con los pasos de limpieza
implementados (descritos en la metodología) antes de la siguiente inyección de extracto; así
como, al permitir un tiempo de estabilización de las longitudes de onda del detector, con la
composición de fase móvil inicial de inyección (agua). Una de las explicaciones posibles a los
problemas vistos, es que hayan quedado residuos de acetonitrilo del gradiente en el lazo, que
variaban la polaridad de la fase móvil al reiniciar las inyecciones. Sin embargo, consultando en
la literatura, algunos autores también reportan la falta de reproductividad en los tiempos de
retención con columnas de fase reversa bajo condiciones de fase móvil 100% acuosa (Doshi et
73

al, 2003). Unos autores, lo explican en términos de colapso de la matriz en la que se encuentran
las cadenas alquílicas de la fase estacionaria; mientras que otros, proponen una expulsión del
agua que hay dentro de los poros de la fase estacionaria a la salida de la columna (Doshi et al,
2003; Wolcott y Dolan, 1999). En el segundo caso mencionado; al disminuir o detener el flujo, la
expulsión de la fase móvil acuosa baja la presión dentro de la columna, y reduce los tiempos de
retención de los analitos en la siguiente inyección. Estos autores, demuestran como los analitos
en fase móvil completamente acuosa, disminuyen hasta en un 80% sus tiempos de retención con
columnas C
18
(Doshi et al, 2003).

Finalmente, luego de solucionar los problemas relacionados con el tiempo de retención de los
componentes hidrofílicos, se hicieron las inyecciones de M. urens mostradas en las figuras 25A,
25B, 26A y 26B. Las cuales demuestran una solubilidad diferencial de los componentes del
extracto de Mucuna urens con respecto a los solventes empleados. La solución salina + 1%
DMSO y el agua + 5% DMSO cuya polaridad es similar y alta, solubilizan en mayor proporción
los componentes hidrofílicos como era de esperarse; mientras que el DMSO 100% y el
etanol/agua 8:2 cuya polaridad es menor, solubilizan en mayor proporción los componentes
hidrofóbicos. En las pruebas anteriores, solo se introdujo un cambio en el sistema cromatográfico
respecto a las condiciones de las figuras 23 y 24, y fue la adición de 0.1% TFA a cada una de las
botellas de fase móvil (agua y acetonitrilo).

Ya en la figura 27 se presentan los resultados de la huella digital cromatográfica de M. urens
disuelta en DMSO 100%, la cual fue establecida al final de varias pruebas hasta mejorar el
gradiente de separación. El extracto contiene componentes altamente hidrofílicos que salen en
los primeros 10 minutos sin resolverse muy bien. Además presenta una porción de componentes
menos hidrofílicos resueltos entre sí en el gradiente hacia 30% acetonitrilo, la cercanía
cromatográfica de estos picos sugiere que este grupo de componentes poseen estructuras
químicas similares entre ellos. Finalmente, el gradiente se hace ascender hasta 100% acetonitrilo;
aunque en esta porción la salida de componentes parece mínima a ambas longitudes de onda, se
llevó a cabo para eluir cualquier componente de carácter altamente hidrofóbico que no presente
absorción UV a las longitudes de onda registradas.

Se continúo luego con las corridas de separación del extracto, para ampliar el conocimiento
sobre el o los componentes agonistas M
1
encontrados en la primera fase de pruebas. La corrida
C2.001 de la figura 29 fue la elegida para llevar a cabo la separación del extracto en pooles
según su polaridad. Luego del secado y redisolución se realizaron, pruebas cromatográficas sobre
cada uno de los pooles separados. De acuerdo con lo que se observa en la figura 30B, el pool 2 se
obtuvo bastante limpio y concentrado, a pesar de utilizar la misma columna analítica en
inyecciones con un volumen preparativo. En el pool 1 (figura 30A) los resultados fueron menos
exitosos porque se obtuvo una mezcla con una cantidad considerable de pool 2. Sin embargo, la
separación del pool 1 no fue del todo ineficiente, ya que sí se encontró una mayor concentración
de sustancias correspondientes a lo que se definió como pool 1 (sustancias hidrofílicas). En la
figura 31 se realizó un blanco en las mismas condiciones que el análisis anterior con el objetivo
de descartar las señales debidas al solvente.

En las nuevas pruebas sobre el receptor M
1
con los pooles separados, los resultados hallados
fueron que el o los componentes agonistas muscarínicos M
1
se repartían entre el pool 1 (ver
74

figura 32A) principalmente y en el pool 2 (figura 32B) en forma más débil. De acuerdo con lo
observado en la figura 32A, el pool 1 produce una considerable respuesta casi completamente
muscarínica M
1
comprobada con el bloqueo visto en la misma figura. Se nota también una
disminución de la respuesta al agonista patrón, la cual puede relacionarse con una
desensibilización del receptor (Billington y Penn, 2002); una interferencia con la unión del
ligando patrón (carbacol) al receptor muscarínico o con la desensibilización de los receptores del
retículo endoplasmático (IP
3
R).

Para la primera propuesta de disminución de la respuesta al agonista, llamada desensibilización
(disminución en la capacidad de respuesta), muchos autores la explican por medio de la
fosforilación del receptor asociado a proteínas G por una kinasa (vía GRKs) y posterior unión de
este con moléculas de arrestina. Al unirse las moléculas de arrestina, estas promueven el
desacople del receptor con la proteína G y favorecen la internalización del receptor (Billington y
Penn, 2002; Fuentes et al, 2005; Shinyama et al, 2003; Walsh et al, 2000) lo que
experimentalmente puede observase en una disminución de la respuesta a las mismas
concentraciones de agonista patrón.

Los resultados de la figura 3 de anexos apuntan un poco más a la tercera hipótesis de
desensibilización de los receptores del retículo endoplasmático. Ya que cada receptor específico
asociados con proteínas G tiene diferente mecanismo y velocidad de desensibilización, mientras
que todos estos tipos de receptores comparten la estimulación de los receptores de IP
3
y la salida
de calcio del retículo endoplasmático. Esta salida de calcio, puede agotarse por activaciones que
vacíen extensamente la organela celular mencionada.

Según se observa en la figura 32B, el pool 2 produce una pequeña respuesta completamente
muscarínica M
1
que prácticamente no desensibiliza la respuesta al agonista si se compara el nivel
de fluorescencia con el control de la figura 32A. Lo anterior confirma que hay presencia de
agonismo muscarínico tanto en la parte hidrofílica como hidrofóbica del extracto.

Nuevamente, se llevaron a cabo pruebas para mejorar la separación de los componentes del
extracto por medio de HPLC. Como puede notarse en las figuras de huella digital y separación
del extracto crudo (figura 25, 26, 29 y 30), la mayor parte de los componentes hidrofóbicos (pool
2) salen en la primera parte del gradiente con ACN, por lo que comienza a trabajarse la
separación del pool 2 extendiendo el tiempo para que la fase móvil alcance un 30% de ACN (ver
figura 33). En la parte final del gradiente se asciende hasta 100% ACN, pero se observan muy
pocas señales en la etapa final del cromatograma.

Luego de varias corridas (no mostradas), la inyección de extracto con la separación final se
estableció como se muestra en la figura 34; dos fueron los cambios importantes respecto a la
figura 33. Primero, se agregaron 10 minutos más a la fase móvil con agua, y segundo se
corrieron 15 minutos más a 100% acetonitrilo para dejar salir todos los componentes
hidrofóbicos del extracto. En esta inyección semi-preparativa del extracto (400 µL, figura 34),
fueron colectadas las fracciones cada 5 minutos a partir del primer minuto hasta el minuto 90.
Cada una de las fracciones se concentraron y se resuspendieron para efectuar posteriores análisis
de respuesta al calcio en las células CHO-M
1
, con miras a buscar en qué puntos de los pooles
75

hidrofílico e hidrofóbico se encontraban el o los compuestos del extracto de Mucuna urens
responsables del agonismo muscarínico M
1
.

En la figura 35B se muestra una de las fracciones finales (65-70) de lo que correspondería al
pool 2 de la separación inicial, y se observa como con esta fracción del extracto no se produjo
ningún tipo de respuesta (muscarínica ni de otro tipo acoplado a Gq). A pesar de la correcta
función del sistema celular, corroborada con el 60% de la respuesta a carbacol alcanzado.

En la figura 36A se muestra que la quinceava fracción de la colecta (70-75) provocó una
respuesta muscarínica (correspondiente al 22% de la fluorescencia por calcio total), la cual es
bloqueada en la mitad por la atropina, por otro lado, la siguiente fracción (75-80, figura 36B)
presentó solo una pequeña respuesta muscarínica (5% del total) bloqueada completamente por la
atropina. En estos dos últimos experimentos la eficacia en el bloqueo de la atropina parece
haberse disminuido tanto en el caso del extracto como en el caso del carbacol, posiblemente por
la competencia que se produce entre las dos cargas de agonistas (extracto y patrón) y el
antagonista aplicado al inicio (a 30 segundos). Se confirma de esta manera que entre el minuto
70 y 80 eluyen las moléculas de agonista muscarínico responsables en la separación inicial de
llevar a cabo la respuesta muscarínica M
1
del pool 2.

En la figura 37A se muestra que la primera fracción de la colecta (1-5) provocó también una
respuesta muscarínica (correspondiente al 25% de la fluorescencia por calcio total), la cual es
casi totalmente bloqueada por la atropina, mientras que la siguiente fracción (5-10, figura 37B)
presentó solo una pequeña respuesta de fluorescencia más rápida de lo normal no bloqueada por
atropina. Esto sugiere, que la primera fracción de elución (1-5) contiene principalmente la otra
parte de compuestos agonistas muscarínicos M
1
que se observaron en el pool 1 de la separación
inicial. Para una óptima interpretación y respaldo de los resultados en la figura 35A se muestra
un control que evidencia tanto la correcta respuesta celular como el bloqueo de la respuesta
agonista por la atropina.

Entre las figuras 35A y 37A, se observa como la respuesta del agonista control se ve reducida al
aplicar el extracto, sobre todo con la fracción hidrofílica; esta disminución podría ser en parte
una desensibilización del receptor por el estímulo continuo en corto tiempo o por acción de algún
componente de M. urens contenido en las fracciones (Billington y Penn, 2002; Chen et al, 2008).

Basado en el agonismo muscarínico encontrado para M. urens, puede sugerirse que aunque la
acción agonista M
1
inducida por el extracto en las células, no concuerda con el efecto
antiparkinsoniano de los compuestos anticolinérgicos usados como terapia actualmente (Góngora
et al, 2005); sí explica en parte y va en la dirección de los resultados vistos para otras Mucunas
como M. pruriens, de potenciación de la memoria y el aprendizaje tan relacionados con la
actividad muscarínica hipocampal y la Enfermedad de Alzheimer (Sathiyanarayana et al, 2007).

Con respecto a los resultados mostrados por esta tesis; no se encontraron publicados en las bases
de datos disponibles, resultados directamente relacionados con la actividad muscarínica del
extracto de otra de las especies de Mucuna en estudios in vitro, ni in vivo.

76

Sin embargo, sí se tiene bastante información acerca de la presencia de levodopa en este género
de plantas. El conocimiento científico de la especie más estudiada, Mucuna pruriens, resulta un
poco contradictorio respecto a las bases fisiopatológicas de la EP. El efecto de M. pruriens sobre
los neurotransmisores monoaminérgicos a nivel del sistema nervioso central en ratas no
lesionadas con 6-OHDA, no sugiere fuertes evidencias sobre el efecto antiparkinsoniano de esta
especie. Ya que aunque levodopa se encontró en la sangre de las ratas tratadas con el extracto, el
análisis post-mortem de neuroquímica cerebral, no demostró cambios sobre la concentración de
levodopa en corteza, hipocampo, estriado o sustancia negra. Además, el neurotransmisor
dopamina solo aumentó a nivel de la corteza, sin variar en ninguna de las otras regiones
mencionadas (Manyam et al, 2004a).

Los autores del estudio anterior, sugieren que el efecto del extracto puede deberse a otros
componentes además de la levodopa, sin especificar qué tipo de efecto podrían tener esos otros
compuestos (Manyam et al, 2004a). Una limitante de ese estudio, fue que utilizaron animales
sanos para probar el efecto del extracto a nivel cerebral, y es conocido que la condición basal de
las vías sanas y las lesionadas es muy diferente. Por ello la comparación se hace difícil.

En otro estudio con ratas lesionadas por 6-OHDA, los científicos identificaron efectos
neuroprotectores de M. pruriens a través de su acción antioxidante. Este estudio identificó en el
extracto la presencia de coenzima Q-10 y NADH en cantidades significativas, sin obtenerse
efecto alguno sobre la MAO. Además este estudio mostró que el extracto restauró los niveles
generales de neurotransmisores monoaminérgicos en la sustancia negra mejor que la levodopa
sintética pura (Manyam et al, 2004b). Estos efectos sobre las monoaminas pudieron deberse en
parte a la presencia de sustancias como la L-Dopa, precursor de dopamina y en otra parte a la
presencia de antioxidantes como la coenzima Q-10 y el NADH (Manyam et al, 2004b)
encontrados por estos investigadores.

A nivel clínico, un estudio de M. pruriens demostró contener L-Dopa, la cual se cuantificó en la
sangre de los pacientes que recibieron el extracto. Los pacientes, presentaron una mejora motora,
equivalente a la observada con L-Dopa/carbidopa sintética (patrón). En este estudio clínico, los
perfiles farmacocinéticos de L-Dopa provenientes de la dosis de 30 g de extracto, produjeron un
inicio de acción más rápido y una duración del efecto terapéutico más prolongada que los
patrones (Katzenschlanger et al, 2004). Por lo tanto, en este estudio se evidenciaron las
potenciales ventajas del extracto de M. pruriens con respecto al tratamiento convencional de L-
Dopa/carbidopa.

Queda con este trabajo de tesis, abierta la posibilidad para el análisis químico e identificación de
los compuestos presentes en las fracciones activas de M. urens, así como la comprobación de la
actividad muscarínica M
1
de las fracciones activas en un modelo in vivo, ya sea de Parkinson
como el de 6-OHDA, o los de memoria de trabajo y aprendizaje relacionados con la enfermedad
de Alzheimer. Para de este modo, sustentar una línea de investigación con fundamentos más
aplicables de la actividad muscarínica del extracto hidroalcohólico de esta especie de planta
presente en la biodiversidad costarricense.

Con este trabajo se logró comprobar la presencia de actividad muscarínica M
1
in vitro en el
extracto hidroalcohólico de M. urens crudo y fraccionado, inspirados en investigaciones de tesis
77

anteriores de la Universidad de Costa Rica. Se logró realizar una separación cromatográfica del
extracto de M. urens y establecer un “cromatograma de huella digital” del extracto que servirá
como control de calidad o patrón de posteriores estudios de esta semilla. Adicionalmente, se
consiguió dejar abiertas nuevas preguntas de investigación orientadas a otras perspectivas
terapéuticas, no imaginadas al inicio de este trabajo; tal como los efectos sobre algunos procesos
degenerativos subyacentes a la enfermedad de Alzheimer.

Conclusiones
1. El extracto hidroalcohólico 8:2 de la semilla de M. urens contiene cantidades
considerables de taninos, detectables por pruebas visuales. Sin embargo, no fue posible
detectar la presencia de otros grupos de metabolitos como glicósidos antracénicos,
alcaloides o flavonoides en dicho extracto.

2. En HPLC, la columna C
18
logró efectuar una mejor separación de los componentes del
extracto hidroalcohólico de M. urens y permitió establecer la huella digital
cromatográfica del extracto utilizado, el cual mostró según dicho registro la presencia
mayoritaria de componentes hidrofílicos.

3. En las pruebas de fluorescencia, las fracciones 8 y 9 del extracto liofilizado de M. urens
redisuelto en solución salina + 1% DMSO produjeron una marcada autofluorescencia al
ser excitadas bajo las condiciones de análisis del Indo-1; por lo que se confirmó la
existencia de una interferencia propia del extracto que impidió continuar los análisis con
dicha sonda.

4. Las pruebas biológicas in vitro de respuesta al calcio evidenciaron que el extracto
hidroalcohólico de M. urens redisuelto en solución salina + 1% DMSO, EtOH/H
2
O 8:2,
DMSO 100% o agua + 5% DMSO no posee actividad antagonista, ni agonista sobre el
receptor muscarínico M
3
a 21 ºC, por lo que aparentemente este receptor no estaría
involucrado en los efectos antiparkinsonianos descritos para esta planta.

5. Las pruebas biológicas in vitro de respuesta al calcio evidenciaron que el extracto
hidroalcohólico de M. urens redisuelto en solución salina + 1% DMSO o agua + 5%
DMSO no posee ninguna actividad antagonista, ni agonista sobre el receptor muscarínico
M
1
a 21 ºC, por lo cual tampoco parece tener relación la actividad de este receptor con los
efectos antiparkinsonianos descritos para M. urens.

6. Las pruebas biológicas in vitro de respuesta al calcio con células CHO-M
1
transfectadas,
mostraron que el extracto hidroalcohólico de M. urens redisuelto en DMSO 100% posee
actividad agonista sobre el receptor muscarínico M
1
a 21 ºC. Mientras que el mismo
extracto redisuelto en EtOH/H
2
O 8:2 posee actividad tanto agonista sobre el receptor
muscarínico M
1
como agonista sobre otro(s) receptor(es) endógeno(s) no identificado(s).

7. En las pruebas biológicas in vitro de respuesta al calcio con células CHO sin transfectar,
el extracto hidroalcohólico de M. urens redisuelto en EtOH/H
2
O 8:2 presentó actividad
78

agonista a 21 ºC sobre un receptor endógeno no identificado, lo cual demuestra y
comprueba la actividad agonista no muscarínica encontrada anteriormente sobre las
células transfectadas con el receptor M
1
.

8. Según otras pruebas biológicas in vitro de respuesta al calcio en células HEK
transfectadas con el receptor CXCR4, el extracto hidroalcohólico de M. urens redisuelto
en solución salina + 1% DMSO, EtOH/H
2
O 8:2 o DMSO 100% no ejerció actividad
agonista o antagonista sobre este receptor a 37 ºC, pero sí mostró una actividad agonista
sobre algún receptor endógeno celular no identificado.

9. Se estableció una “huella digital cromatográfica” suficientemente separada para los
componentes del extracto crudo de M. urens redisueltos en DMSO 100%. Dicha huella se
obtuvo mediante HPLC y constituye un punto importante de referencia y control para
posteriores análisis de la misma planta.

10. Los componentes del extracto hidroalcohólico liofilizado de Mucuna urens presentaron
una solubilidad diferencial en los cuatro solventes empleados para la redisolución del
mismo. Lo anterior, se demostró al obtener distintos cromatogramas de huella digital por
HPLC, lo que además podría explicar las diferencias vistas entre las respuestas biológicas
in vitro al receptor M
1
.

11. El método cromatográfico usado en la separación del extracto crudo fue más eficiente
para el pool 2 (hidrofóbico) que para el pool 1, debido a la gran cantidad de componentes
con carácter hidrofílico presentes en él.

12. Las pruebas biológicas in vitro en células CHO-M
1
transfectadas, demostraron que tanto
el pool 1 como el pool 2 de la separación de M. urens redisuelto en DMSO 100% ejerció
actividad agonista sobre el receptor muscarínico M
1
a 21 ºC.

13. Las pruebas biológicas in vitro sobre el receptor M
1
evidenciaron que tanto la fracción 1-
5 (hidrofílica) como las fracciones 70-75 y 75-80 (hidrofóbicas) del extracto de M. urens
redisuelto en DMSO 100%, ejercieron actividad agonista muscarínica a 21 ºC. Esta
actividad podría de alguna manera relacionarse con el desarrollo y consolidación de
procesos cognitivos como los de aprendizaje y memoria.

Recomendaciones
• Mantener el lazo de inyección abierto durante la corrida y luego durante toda la etapa de
limpieza posterior a cada inyección de extracto disuelto de M. urens en el cromatógrafo.

• Realizar limpiezas que incluyan polaridades de gradiente de fase móvil similares a los
usados en el análisis de extracto entre cada inyección.

• Verificar antes de realizar las inyecciones la estabilidad de las señales de detección, bajo
las condiciones de flujo inicial del análisis antes de realizar la inyección.
79


• Utilizar ácido trifluoroacético 0.1% en cada una de las botellas de fase móvil para
mantener bajo el pH.

• Para las inyecciones de separación del extracto crudo por HPLC utilizar volúmenes
pequeños para mejorar la separación o emplear un sistema de HPLC semi-preparativo.

• Utilizar solventes polares para evitar problemas de precipitación del extracto en el
sistema cromatográfico.

• Llevar a cabo un cribaje con vehículos polares, próticos y apróticos para optimizar la
disolución de los liofilizados provenientes de extractos naturales.

• Conservar la tripsina y los medios de cultivo celular a 4 °C para evitar la degradación de
los aminoácidos constituyentes.

• No utilizar probenecid en el tampón de carga para células HEK-293 cuando el marcaje se
realiza con la sonda Indo-1, porque no se logran registrar posteriormente los cambios de
concentración de calcio intracelular.

• No utilizar las células cargadas por un periodo superior a 120 minutos ya que varia
considerablemente el nivel de fluorescencia total.

• Controlar muy bien la temperatura experimental en los ensayos biológicos celulares; así
como proteger de la luz las células ya cargadas.

• Homogenizar por aspiración y expulsión suave las alícuotas de suspensiones celulares
antes de cada prueba.

• Realizar la descarga de las alícuotas de analitos de manera rápida y completa en las
pruebas celulares.

• Ejecutar controles agonistas y antagonistas en cada pool de células preparadas para
experimentos por calcio fluorescente.

• Controlar la temperatura y velocidad de secado al vacío de las fracciones del extracto, ya
que altas velocidades aumentan considerablemente la temperatura y pueden producirse
reacciones químicas indeseadas.

• Probar en el modelo animal de lesión unilateral con 6-OHDA las fracciones activas
(sobre M
1
) del extracto de M. urens para analizar sus efectos conductuales y potencial
antiparkinsoniano.

• Realizar estudios en modelos animales para evaluar el efecto de las fracciones activas del
extracto de M. urens sobre memoria y aprendizaje.

80

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91

Anexos

Figura 1: Espectro de absorción UV- Visible para Mucuna urens 2.5 mg/mL en DMSO 100% y
solución salina + 3% DMSO a T. A.


Figura 2: A) Dosis/Respuesta al calcio por M
1
al adicionar M. urens disuelta en DMSO 100%.
B) Mismo ensayo de curva dosis/respuesta normalizada. Células CHO-M
1
, empleando como
sonda Indo-1; emisiones tomadas a 401 y 475 nm; temperatura regulada a 21 ºC.
92



Figura 3: Respuesta al calcio con M. urens disuelta en DMSO 100% más agonistas
muscarínicos o purinérgicos. Células CHO-M
1
, empleando como sonda Fluo-4; emisión tomada
a 516 nm y temperatura regulada a 21 ºC.



Tabla 1: Prueba de Viabilidad Celular con azul de tripán al 0.4% en células CHO-M
1
, cargadas
con Fluo-4 y agitadas 6 minutos en el espectrofluorómetro bajo condiciones similares a los
ensayos biológicos in vitro.

Condiciones de
la prueba
% de muerte
celular 1
% de muerte
celular 2
% de muerte
celular 3
Promedio de los
% de muerte
celular

Células cargadas
+ DMSO + Azul
de tripán (control)
1.33 7.19 2.02 3.51
Células cargadas
+ M. urens en
DMSO 100% +
Azul de tripán
3.15 4.79 2.27 3.40

Mediciones hechas en placas de conteo celular Kova-slide.

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