LABORATORIO DE ANALISIS INSTRUMENTAL UNIVERSIDAD DEL VALLE

DETERMINACIÓN DE VITAMINA B2 (RIBOFLAVINA)

EN COMPLEJO B POR ESPECTOFOTOMETRÍA DE
FLUORESCENCIA MOLECULAR

Castillo Jorge Luis (1827089); Gómez Pérez Laura (1826356)

castillo.jorge@correounivalle.edu.co , laura.gomez.perez@correounivalle.edu.co

Universidad del Valle.

Departamento de Química, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas
Laboratorio de Análisis Instrumental

Profesor Harold Humberto Díaz Segura

Fecha de la practica: 13/03/2021
Fecha de entrega: 22/03/2021

Resumen: El objetivo principal de la practica fue la determinación de riboflavina en una ampolla de complejo
B del laboratorio ECAR ®, mediante espectrofotometría de fluorescencia molecular. Para esto, se realizó una
curva de calibración preparando 50,00 ± 0,06 mL de una solución madre cuya concentración es de 128 ± 2ppm
de riboflavina. A partir de esta solución madre, se tomó una alícuota de 20,00 ± 0,03 mL y se llevó a un matraz
de 50,00 ±0,06 mL donde se aforo con HCl 0,1 M. A partir de esta solución se tomaron alícuotas de 1,00; 2,00;
3,00; 4,00; 5,00 mL, se llevaron a matraces de 50,00 ± 0,06 y se aforaron con HCl 0,1M. Para la preparación
de la muestra. Se tomo un 1,00 ± 0,02 mL de complejo B se aforaron a 100,00 mL, posteriormente se tomó una
alícuota de 3,00 mL y se llevó a un matraz de 50,00 aforando con HCl. Donde se obtuvo una concentración
experimental de riboflavina de 4650 ± 314 ppm y un porcentaje de error del 7%

Palabras Claves: Fluorescencia, alícuota, riboflavina.

1. Datos, Cálculos y Resultados 0,1 2

6𝑥10−5
2
%𝑒 = √( 𝑥100) + ( 𝑥100) = 1,56%
6,4 0,05
Para poder realizar la curva de calibración primero se debe
Et = 128 ∗ 1,56% = 2
calcular la concentración de la solución madre del patrón de
𝐸𝑡 = 128 ± 2 𝑝𝑝𝑚
riboflavina, para luego conocer la concentración de las
• Segunda dilución para realizar la solución madre
soluciones. Se muestra el cálculo de la concentración del
patrón de riboflavina en la solución madre a continuación
(128 ± 2)ppm ∗ (20.00 ± 0.03) ml
• Primera dilución = 51,2 𝑝𝑝𝑚
1 50.00 ± 0.06 ml
6.4 ± 0.1 mg ∗ = 128𝑝𝑝𝑚
0.05000 ± 0.00006 L
= 51.20 p𝑝𝑚
Mediante la ecuación 1 se procede a calcular la propagación
del error para poder determinar la incertidumbre de la • Incertidumbre concentración segunda dilución.
concentración de la solución patrón. .
2 2 2
2 0,03 0,06
%𝑒 = √( 𝑥100) + ( 𝑥100) + ( 𝑥100) = 1,57%
128 20,00 50,00
Et = 51.20 ∗ 1,57% = 0,8
𝐸𝑡 = 51,2 ± 0,8 𝑝𝑝𝑚

Ecuacion 1. Propagación del error

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Posteriormente se calcula la concentración de las soluciones SXX SXY SYY Xprom Yprom
patrones como se muestra a continuación 10.486 4.650E3 2.069E6 3.072 1.504E3

(51.2 ± 0.8)ppm ∗ (1.00 ± 0.02)ml Tabla 2. Datos de mínimos cuadrados

Mediante la ecuación 1 se puede determinar el valor de la
50.00 ± 0.06 ml
pendiente.
𝑠𝑥𝑦
= 1.024 ppm 𝑏=
𝑠𝑥𝑥

• Incertidumbre soluciones estándar curva calibración Ecuacion.2 Pendiente

. 4.650𝑥103
𝑏= = 443.46
0,8 2
0,2 2
0,06 2 0.010𝑥103
%𝑒 = √( 𝑥100) + ( 𝑥100) + ( 𝑥100) = 2,54%
51,2 1,00 50,00
Mediante la ecuación 2 se puede determinar el intercepto de
Et = 1,024 ∗ 2,54% = 0,026
la gráfica.
𝐸𝑡 = 1,02 ± 0,03 𝑝𝑝𝑚
A= Yprom- (b*Xprom)
Los cálculos de las incertidumbres se realizan de manera
sistemática, por lo tanto, el cálculo presentado previamente Ecuación 3. Intercepto.
nos sirve de ejemplo para calcular las demás incertidumbres
de las concentraciones. A= 1.504x103- (443.46*3.072)=141.57
En la tabla 1 se muestran las concentraciones de cada solución
patrón. Mediante la ecuación 3 se puede determinar el r de la curva de
calibración
Mililitro tomado de Concentración Señal
solución madre (ppm) 𝑆𝑥𝑦
1.00±0.02 1.02±0.03 560.7934
𝑟=
2.00±0.03 2.05±0.04 1053.2029
√𝑆𝑥𝑥 ∗ 𝑆𝑦𝑦
3.00±0.02 3.07±0.05 1569.6598
4.00±0.05 4.10±0.08 1955.7174 ecuación 4 R de la grafica
5.00±0.04 5.12±0.09 2380.0766
Tabla 1. Datos para la curva de calibración 4.650𝑥103
𝑟= = 0,9968
√2.069𝑥106 ∗ 10.486
Con los datos de la tabla 1 se realiza la curva de calibración
que es la gráfica 1. Mediante la ecuación 4 se puede determinar la desviación de r

𝑆𝑦𝑦 − 𝑏 2 ∗ 𝑆𝑥𝑥
Curva de Calibración 𝑆𝑟 = √
𝑛−2
3000
2500 y = 443,46x + 141,57 Ecuación 5. Desviación r
R² = 0,9968
2000
2.069𝑥106 − 443.462 ∗ 10.486
Señal

1500 𝑆𝑟 = √ = 56.851
5−2
1000
500
Mediante la ecuación 5 se puede determinar la desviación de
0
la pendiente.
0,0000000 2,0000000 4,0000000 6,0000000
Concentración 𝑆𝑟
Grafica 1. Curva de calibración para la determinación de
Sb=
√𝑠𝑥𝑥
riboflavina
Ecuación 6. Desviación de la pendiente
En la tabla 2 se encuentran los datos de los mínimos cuadrados 56.851
Sb= = 14.468
los cuales se usaron para calcular el intercepto, pendiente y las √10.486
desviaciones del intercepto y de la pendiente de la gráfica 1.
Mediante la ecuación 6 se puede determinar la ecuación de la
desviación del intercepto.
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𝑋𝑝𝑟𝑜𝑚2 1
Sa=Sr√ 𝑠𝑥𝑥
+
𝑛 2,8𝑚𝑔 𝑟𝑖𝑣𝑜 50 𝑚𝑙 𝑠𝑙𝑛2 100 𝑚𝑙 𝑠𝑙𝑛1 1000 𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
∗ ∗ 𝑥 = 4650𝑝𝑝𝑚
1000 𝑚𝐿 𝑆𝑙𝑛 2 3 𝑚𝐿 𝑠𝑙𝑛1 1 𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 1𝐿
Ecuación 7. Desviación del intercepto
Del mismo modo la concentración de la riboflavina calculada
2
√3.072 previamente posee una incertidumbre asociada a sus variables
Sa=56.851 10.486
+ 15 = 49.138
respectivas. Este calculo se realiza mediante la ecuacion 1. El
Se presenta a continuación una tabla resumiendo los datos cálculo correspondiente se presenta a continuación.
calculados anteriormente
2 2 2 2 2
0,1 0,02 0,04 0,06 0,02
%𝑒 = √( 𝑥100) ( 𝑥100) ( 𝑥100) + ( 𝑥100) + ( 𝑥100) = 6,76%
2,8 3 50 100 1
Parametro Resultado
a 141.57
b 443.46 𝐸𝑇 = 4650 ∗ 6,76% = 314
r2 0.9968
Sr 56.851
Sa 49.138 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑓𝑙𝑎𝑣𝑖𝑛𝑎 = 4650 ± 314 𝑝𝑝𝑚
Sb 14.468
Ecuación de la Recta y = 443,46x + 141,57 A continuación, se procede a calcular el porcentaje de error
Tabla 3. Datos estadísticos de la curva de calibración experimental mediante la ecuación 10. Sin embargo, es
necesario reportar el valor teórico de riboflavina en ppm. El
En la determinación de riboflavina a la muestra se le realizaron cálculo se presenta a continuación.
dos diluciones, a la última dilución se le midió la intensidad,
la cual dio 1379.2366, dato que nos sirve para calcular la 𝑚𝑔 1000 𝑚𝐿
concentración en la segunda dilución como se muestra 5 ∗ = 5000𝑝𝑝𝑚
𝑚𝐿 1𝐿
seguidamente.
𝑦 − 141.57 Una vez se hace la conversión del valor teórico de riboflavina
=𝑥 a ppm, se procede a calcular el error experimental.
443.46
𝑉𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜 − 𝑉𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙
Ecuación 8. Ecuación de la recta despejada para la %𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 = 𝑥100
𝑉𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜
concentración (x) Ecuacion 10 %Error experimental
1379.2366 − 141.57 5000 − 4650
=𝑥 %𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 = 𝑥100 = 7%
443.46 5000
2.79 𝑝𝑝𝑚 = 𝑥 2. Discusión de Resultados

Del mismo modo se procede a calcular la incertidumbre de la La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las
concentración, mediante la ecuación 9 moléculas son excitadas por la absorción de radiación
𝑆𝑟 1 1 𝑦𝑝𝑟𝑜𝑚 − 𝑦 2 1 electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado
𝑆𝑥 = 𝑥√ + + ( ) = 0,14
𝑏 𝑛 𝑚 𝑏 𝑠𝑥𝑥 fundamental, liberando su exceso de energía en forma de
Ecuacion 9 Desviacion estandar x fotones. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican
mucho menos que los métodos de absorción debido al número
relativamente limitado de sistemas químicos que se pueden
56.851 1 1 1500 − 1379.23 2 1 hacer fluorescer.
𝑆𝑥 = 𝑥√ + + ( ) = 0,14
443.46 1 5 443.46 10.486
En la cuantificación de riboflavina por medio de fluorescencia,
Por lo tanto, la concentración de riboflavina en la dilución es se obtuvo una concentración de 4650 ± 314 ppm de riboflavina
la siguiente en la ampolleta de vitamina B. Con un porcentaje de error del
7% con respecto al valor teórico que debía de tener la muestra,
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑟𝑖𝑣𝑜𝑓𝑎𝑏𝑙𝑖𝑛𝑎 𝑑𝑖𝑙 = 2,8 ± 0,1 𝑝𝑝𝑚 el cual es un porcentaje de error bajo, sin embargo, hubo
ciertos errores en el análisis, ya que la fluorescencia es una
Para determinar la concentración en la muestra se procedió a
realizar el calculo que se muestra a continuación
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técnica eficaz y más que todo cuando se analizan compuestos
como el de la riboflavina el cual tiene anillos aromáticos y
dobles enlaces conjugados Los posibles errores más
significativos que se pudieron presentar son dos, en primer
lugar el haber dejado la muestra en algún momento expuesta
para que reaccionar con el oxígeno, la luz solar o a la luz de
las lámparas incandescentes, ya que la riboflavina se podría
haber transformado en otro compuesto minoritario
irreversiblemente (1). Se pudo presentar un error aleatorio, en
los instrumentos de medición que se utilizaron en la
preparación de la muestra, también porque la muestra se diluyo
dos veces y se pudo presentar perdida de la muestra cuando se
debía de sacar las alícuotas correspondientes, por lo cual
posiblemente habría una cantidad menor de muestra de la
esperada.
Del mismo modo cabe recalcar que la muestra se acidifico con
HCl 0.1M, esto se hizo con el fin de que la estabilidad de la
rivofalbina aumente, en pH básico la tiende a ser muy
inestable, y en pH neutro es medianamente estable. De esto
también se puede derivar otro posible error, el cual pudo ser
que la cantidad de acido adicionado no fue el suficiente para
estabilizar por completo la muestra. (2)
Por ultimo, un error muy común en el tratamiento de la
muestra es la agitación excesiva de la muestra, esto disminuye
considerablemente la fluoresencia del compuesto.
3. Preguntas y respuestas
a. ¿Por qué la radiación de fluoresencia se mide a 90
grados con respect a la radiación de exitación.
R// A comparación de otros métodos donde la radiación esta
lineal con el detector, en fluorescencia la radiación se mide a
90 grados a fin de evitar la interferencia de la luz de excitación
transmitida. El monocromador no es perfecto y transmitirá la
luz con otras longitudes de onda diferentes a las establecidas.
Al medir en un ángulo de 90º, sólo la luz dispersa por la
muestra provoca luz. (3)
b. Explique claramente la diferencia instrumental entre
un fluorímetro y un espectrofluorímetro, indique las
ventajas y desventajas de cada uno
R// La diferencia recae en que los fluorímetro utilizan filtros
para seleccionar la longitud de onda de excitación y de
emisión, a comparación de los espectrofluorimetros que
utilizan uno o dos monocromadores. Un espectrofluorimetros
puede realizar un barrido continuo durante todos los espectros,
y un fluorímetro es siempre un instrumento manual y es más
bien adecuado para realizar medidas a una o dos longitudes de
onda, ya que es necesario cambiar el filtro cada vez que se
quiera cambiar la longitud de onda. (4)
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c. Dibuje la estructura de la riboflavina y explique por
qué es una molécula altamente fluorescente
Figura 1 estructura de la riboflavina
La molécula de la riboflavina está compuesta por dos
anillos heterocíclicos y un anillo aromático, donde a su
vez posee átomos de oxígeno y nitrógeno con pares de
electrones libres. Lo que permite aún más la conjugación
de los electrones presentes en la molécula, del mismo
modo la estructura de la riboflavina es una estructura
sólida, la cual permite también la fluorescencia. (3)
d. ¿Cuál es la diferencia entre la fluorescencia y la
fosforescencia? ¿Existe alguna diferencia en la
instrumentación? Explique. ¿Es posible obtener
medidas de fosforescencia en un fluorímetro? Si es
afirmativo, ¿en qué condiciones?
R// La diferencia entre la fluorescencia y la fosforescencia
recae en como emiten la radiación ambos fenómenos, en la
fluorescencia el primer paso es excitar el compuesto, una vez
excitado el compuesto el tendera a volver a su estado
energético inicial esta transición se da entre estados con los
mismos números cuánticos. A comparación de la
fosforescencia donde la transición ocurre entre estados con
diferentes cuánticos. La única diferencia instrumental que
existe en la fluorescencia y la fosforescencia es que en los
espectrofosforimetros debe de tener un obturador rotatorio que
se le denomina fosforoscopio y un compartimiento de
muestras que permita mantener la muestra a la temperatura del
nitrógeno líquido. (4)
Conclusiones
No todas las moléculas fluorescen, la fluorescencia ocurre solo
en compuestos aromáticos o que posean una alta conjugación.
La fluoresencia es un método mucho mas sensible a diversos
métodos de absorción. La radiación a 90 grados disminuye
significativamente las interferencias ocasionadas por la propia
radiación.
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4. Referencias

(1) Korolkovas, A. Burckhalter. J. Vitaminas hidrosolubles

en: Compendio esencial de química farmacéutica. Editorial
Reverte. México, 1983. pag 735.

(2) Hernandez, A. Influencia de los procesos tecnológicos sobre el

valor nutritivo de los alimentos en: Tratado de nutrición. Editorial
PANAMERICANA, Madrid 2010 .pag 558

(3) Skoog, D.; West, D. Espectrofotometría de fluorescencia

molecular. En: Fundamentos de Química analítica. Editorial
REVERTÉ México D.F, Novena edición. pag 765-766

(4) Olsen, E. Fluorimetria y fosforimetria en: Métodos ópticos de

análisis. Editorial REVERTÉ Barcelona, 1990. Pag417-427