AUDIO INSTRUMENTAL (Agosto 4)

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Etapas que se implican en la preparación de una muestra:

Homogenización  reducción de tamaño de la muestra.

Extracción / Pre-tratamiento  está dirigido a la eliminación de los interferentes

mayoritarios.

Ejemplos:

 Los interferentes mayoritarios de la muestra de pescado en donde el interés en

monitorizar metales serian: proteínas, lípidos.

Nota: toda la materia orgánica no puede ser porque se puede llevar el analito porque este es
una molécula orgánica.

Es importante tener en cuenta cuales son los interferentes mayoritarios que afectan al
analito y esto depende del tipo de muestra.

 Si se habla de una muestra de sedimentos, los interferentes mayoritarios serian la arena.

El hilo conductor de estas etapas siempre es la molécula de interés, nunca el enfoque es la

matriz.

No se puede escoger un reactivo porque ese sea el que mejor elimine toda la tierra que está
en la muestra de sedimento, se debe escoger un reactivo porque sea el mejor en disolver el
analito de interés de modo que haga que se revierta la interacción que tiene con la matriz y
lo saque de esta  cuando se hace esto por consecuencia se está eliminando todo el
componente mayoritario. Por más que se busque un solvente en el que el analito sea lo
máximo soluble siempre van a haber componentes endógenos de la matriz que también van
a sentir el mismo comportamiento que mi analito de interés; por esto es que no es cierto que
en el pre-tratamiento se eliminan todos los componentes orgánicos porque aunque se haga
esta etapa siempre quedan componentes endógenos que pueden ser de naturaleza orgánica.

Una vez haber hecho el pre-tratamiento o extracción que lo que busca es eliminar los
componentes endógenos mayoritarios y por lo tanto sacar el analito del extracto con
interferentes y tenerlo en un extracto más simple, sin embargo sigue siendo de alta
complejidad pero comparado con la muestra original es más sencillo.

Se dice que los métodos de pre-tratamiento de algún modo son métodos de concentración
pero vistos desde el punto de vista que cada vez que se están eliminando componentes que
hacen interferencias se está ganando mayor posibilidad de conseguir al analito en la nueva
matriz.

Cuando ya se tiene el primer extracto, se da paso a las siguientes etapas:

Concentración y limpieza  este conjunto de etapas están hablando es del tratamiento de

la muestra, aquí nos dirigimos a dos cosas:

1) Concentrar mi analito de interés: Si se está ante una muestra que tiene una elevada
concentración de mi analito de interés no me interesa pre-concentrar porque tengo en
gran concentración el analito, mi finalidad aquí seria diluir para que mis interferencias
preexistentes también bajen de intensidad.

Método de cuantificación:

¿Por qué se usó como método de cuantificación estándar añadido en la muestra de

acetaminofén tableta?

 Muestra de tomate.
 Un medicamento para hacerle control de calidad.
 Medicamento pero para hacerlo por monitorización al paciente.
 Muestra de alimento.
 Muestra ambiental.

¿Cuál método de cuantificación se usaría para añadido y por qué?

 Añadido: en técnicas espectroscopias.

 Interno: en técnicas cromatograficas.

No es así porque si solamente se tiene un solo equipo en el laboratorio en ese se pueden

aplicar todos los métodos de cuantificación.
Ella tiene un vestido diseñado por Christian Dior (CD) y tiene que ir a la tienda de por su
casa, no se pondría este vestido para ir allá (xD!), porque llevaría a un desperdicio de
recursos para algo que no lo requiere. Pero si recibe una invitación del presidente de la
republica porque van a hacerle un agasajo al programa por la reacreditación…esto si
amerita que se ponga el vestido de CD.  Lo mismo pasa con los métodos de
cuantificación.

En un método de cuantificación ¿Qué está ocurriendo?, ustedes me dicen que el método de

cuantificación se amarra a la técnica y esto no es real porque yo no elijo un método de
cuantificación basándome en la técnica, yo elijo un método de cuantificación basándome en
la muestra.

UV-VIS  tiene capacidad de funcionar cuando se trabaja por el método de estándar

externo, porque el NO RESPONDE AL MÉTODO SINO AL ANALITOOO!! Acaso el
resultado va a cambiarme por el método que se eligió hacer (en un momento hice
acetaminofén por estándar externo pero en otro momento por añadido…)? La respuesta
instrumental no cambiaría porque la señal corresponde es a la molécula.

Si se tiene un inyectable (agua y principio activo…agua isotónica a mí mismo pH para que

no me haga daño, para que no haya un choque de polaridades y no se precipite el principio
activo)  lo que se quiere es meter el medicamento y que sea en la concentración
terapéutica (teniendo en cuenta la tasa de eliminación…si esta es del 80% se coloca un
120% de cantidad para que el 80% se bote y quede el resto)  se tiene una solución de alta
concentración, ¿cierto o falso? Cierto.

1. Inyectable  (500mg/mL de ácido ascórbico) (1000)= 500000ppm (concentración

alta).
2. Desechos de ácido ascórbico en la bahía (problema porque el ácido ascórbico ayuda a
tautomerizar los complejos de plaguicidas que se encuentran en la bahía, lo que hace
que sean perennes; es decir, que con el pasar del tiempo se encuentran los plaguicidas
en buenas contaminaciones en las aguas; si el ácido ascórbico no estuviera los
plaguicidas se eliminarían más rápido).

Lo primero que se debe hacer es una cuantificación del ácido ascórbico en la bahía, la
primera pregunta que me hago es:

¿Cómo llega el ácido ascórbico allá? ¿Qué fuentes? Las cuales pueden ser por los inodoros
de las casas (cuando se arrojan medicamentos), por vías urinarias (cuando se elimina el
medicamento), la industria farmacéutica (cuando lavan los recipientes donde hacen los
mezclados de la producción que hicieron; cuando lavan desechan y en dichos desechos hay
residuos de ácido ascórbico), los hospitales (aquí están todos los puntos)…finalmente todo
esto viaja hasta que llega a la ciénaga.  En la ciénaga la concentración estaría en trazas y
peor porque el ácido ascórbico tiene la capacidad de irse para donde él quiera (al agua o al
sedimento)  empieza a repartirse, si esta en trazas y empieza a repartirse  el ácido
ascórbico en sedimento puede estar en un nivel de concentración de ppt y ppc.

¿Dónde se erigiría aplicar un método de estándar añadido?

En el segundo porque es una muestra más compleja, hay mayores interferencias.

1er caso  No compleja, concentración elevada, no posee reto analito (solo se diluye para
meterla al equipo), se usaría estándar externo.

2do caso  Mayor complejidad, concentración baja, un reto analítico elevado, se usaría
estándar añadido.

La complejidad de la muestra es lo que define el método de cuantificación.

Omar: el ácido ascórbico es de fácil degradación, es termolábil y se degrada con mucha

facilidad; por un método analítico para determinar ácido ascórbico sería muy complejo.

Profesora: Si y no, aquí es donde viene la modificación del comportamiento de la sustancia.

La ciproproxacina es termoinestable y fotolabil (mismas características), es el primer
contaminante que se está encontrando en cuerpos de agua, ocurre que establece complejos
con el sedimento, lo cual lo hace estable y que cambie su propiedad (porque una cosa es
cuando estoy sola y otra cuando estoy en manada).  Por esto cuando se habla de mayor
pureza en un reactivo estamos diciendo que se vuelve más inestable (reacciona más
fácilmente que cuando está asociado) porque de algún modo las asociaciones con otras
moléculas le confieren estabilidad porque modifican sus propiedades originales.

El acido ascórbico tiene moléculas de grupos carboxilos y estos sistemas tienen una
capacidad alta de reaccionar, cuando lo hacen se estabilizan por puentes de H y esto hace
que la volatibilidad cambie, de hecho, el índice de polaridad también cambia (no es el
mismo cuando está asociado que cuando esta suelto), lo mismo que pasa con la volatilidad.

Si no se tiene complejidad en la matriz significa que se tiene baja posibilidad de que los
interferentes de la matriz afecten la lectura instrumental del analito de interés, existe poca
posibilidad de que se esté cuantificando como analito de interés algo que no lo sea (falsos
positivos).  Estas características me las da la muestra.
En el laboratorio no es lo mismo cuantificar por un método de estándar añadido que por
uno externo. En el sedimento no se aplicaría el externo porque tiene muchas interferencias
que podrían arrojar resultados no confiables.

Blanco  todo menos el analito.

Blanco de muestra  matriz sin analito.

Cuando se abordan las etapas de una preparación de muestra cualquiera y se realizan las
lecturas, estas corresponden al analito de interés y a los componentes endógenos
minoritarios persistentes. Esto se evidencia cuando se coge el blanco se lee y se le resta a la
muestra.

En el análisis se leen componentes endógenos persistentes y analito, dicho de otro modo: si

se tiene un pico cromatografica, esta es la ventana de retención de ese pico (foto), desde el
momento que se eleva mi línea base hasta que cae (la ventana de retención es un intervalo y
el tiempo de retención es un valor especifico y coincide con el máximo de la curva), lo que
se está diciendo es: en el análisis cuando se tiene la lectura del blanco, en ese mismo
intervalo el blanco si tiene componentes y esos componentes que coinciden la ventana de
retención de mi pico son los responsables de darme lectura, son los componentes
endógenos persistentes que coinciden su lectura de absorción dentro de la misma
ventana…es importante que esto sea despreciable, siempre se tiene presente que esa señal
no es pura.

¿Qué ocurriría si ahora no se está leyendo el analito de interés en el blanco de la muestra

sino que se está leyendo en disolvente puro?

Se esperaría que si se está trabajando con reactivos de alta pureza la ventana de retención la
respuesta sea esta (foto)…esa seria del reactivo o del vehículo donde se está disolviendo la
muestra.
Se tiene la ventana de una muestra y un blanco, la diferencia está en que la zona de la
ventana instrumental del analito de interés o en la zona de lectura de este el reactivo por ser
de alta pureza tiene un cutt off (todos los solventes orgánicos si tiene absorción en el UV-
VIS, pero mi condición de análisis siempre va a ser trabajar a una Long de onda que no sea
aquella en la que ellos absorban porque le añadiría complejidad al análisis  se debe
trabajar lejos del cutt off; es decir, se trabaja a una menor longitud de onda de corte donde
sale mi analito de interés. Por esto es que la mayoría de los análisis en UV-VIS están por
encima de los 295nm.

Producto de que yo revise un analito en presencia de reactivos puros va a haber un cambio

en el compartimiento de la pendiente de la curva de calibrado, de modo que, normalmente
se espera que la respuesta instrumental que se arroja de una curva de calibrado cuando se
prepara en ausencia de la matriz del blanco tiene una inclinación menor que cuando se
trabaja en presencia del blanco porque obviamente a la altura instrumental del analito de
interés se está sumando la lectura del componente endógeno.  Jamás y nunca se puede
preparar una curva de calibrado para cuantificar una muestra sin tomar en cuenta la matriz
de la muestra, porque se está diciendo que en la muestra al preparar la curva de calibrado
usando solo reactivos y no blanco de muestra que toda la respuesta instrumental que va a
dar la muestra solamente proviene del analito de interés.  Habrán interferentes endógenos
que aportaran a la lectura y esto haría que se sobrecuantificara la muestra (falsos positivos).

No se puede cuantificar analito de interés en un ambiente químico que esté totalmente

distinto al ambiente químico de la muestra que se va a analizar.

Cuando se hace una curva de calibrado basándose solamente en reactivos se está

inventando un ambiente químico que no existe en la muestra. Si se habla de un jarabe el
ambiente químico viene dado por el azúcar, saborizante, preservante… (Moléculas
orgánicas que están interactuando con el analito de interés), como es que se va a cuantificar
por estándar externo y no se va a tener en cuenta la matriz que está afectando al analito de
interés.
En una medición por estándar externo no se debe usar blanco de reactivo porque no se
estarían teniendo en cuenta los interferentes que están presentes en la matriz; debe hacerse
es con un blanco de muestra, el cual se puede comprar o hacer en el laboratorio (partiendo
de los componentes que tiene la muestra).

No se necesita hacer un blanco de reactivo, el blanco de muestra tiene todos los reactivos
de forma que si los reactivos que se añaden durante el tratamiento de la muestra pudieran
generar una respuesta instrumental en la ventana de retención. El blanco de reactivo jamás
es un blanco de muestra. Un blanco de reactivo lo único que ayuda a monitorizar es que
todos los reactivos que se han usado durante el tratamiento de la muestra no están
provocando una respuesta instrumental que interfiera con el análisis, pero el blanco de
reactivo jamás y nunca está afectando el comportamiento de la matriz.

Jamás y nunca se puede cuantificar en el laboratorio preparando una curva de calibración

con blanco de reactivo; siempre se prepara con blanco de matriz idéntico a aquel en el que
se va a analizar la muestra porque eso tiene una seria implicación sobre la curva de
calibrado.

Cada matriz tiene su blanco de muestra.

Cuando se desarrolla un método analítico la selectividad se evalúa preparando 20 muestras

blancos por triplicado y leyendo dos veces cada triplicado (se lee 120 veces el blanco para
darle exactitud a la muestra).

Cuando se va el límite de detección (LD) si esta la ventana de retención y este es el blanco

¿cómo se calcula experimentalmente el LD? Se calcula por medio de la señal/ruido, siendo
dado la señal por parte del blanco y el ruido lo dan los disolventes puros porque se supone
que estos no están generando señal (transparencia) por tanto los oscilaciones que se ven
como respuesta instrumental van a deberse al funcionamiento mecánico del equipo. El LD
debe ser 3 veces la relación señal/ruido. Si no se construye la curva usando el blanco sino
como disolvente, en la curva de calibrado de los disolventes puros nadie me va a dar la
señal, por lo que va a haber incógnitas sobre ruidos.  No se puede hablar de límite de
detección cuando se tienen es reactivos puros, porque el ambiente químico de la molécula
está siendo afectado.

Nota: |

 Bad Graw: Lo generan todos los componentes mecánicos que funcionan en el equipo.
 Umbral: Valor de oscilación del ruido dentro del cual debe permanecer esa
perturbación.
Ejemplo: Si este es el novio de ella, se supone que se relacionan bien; cuando a la novia la
sacan de ese ambiente y la llevan al salón de clases, ¿cómo se relaciona ella? Diferente.
Esto mismo le pasa al analito; ¿cuándo se encuentra en un medio limpio como los
disolventes puros se va a encontrar igual que cuando esta con grasa, proteínas…? ¿El
ambiente químico y comportamiento va a ser igual? No.

1. Cuando se desarrolla en un método para determinar ciproproxacina en sangre de un

paciente, lo último que se busca es la muestra del paciente, lo primero que se hace es
recoger muestras de pacientes que no estén siendo medicados, para así poder evaluar la
exactitud.  todos los métodos se desarrollan a partir de muestras preparadas en el
laboratorio, porque se necesita tener el control del valor de concentración en que se
encuentra la especie química en la muestra; por esto cuando se va a desarrollar un
método primero se consigue el blanco.  En el caso de la sangre, se buscan personas
no medicadas con ciproproxacina, se les saca una muestra de sangre, luego se mezclan
y se tiene el blanco. Porque el blanco de muestra es todo menos el analito y ellos no
están siendo medicados con dicho medicamento.

2. Una muestra de carne de res, ¿Cómo se consigue la muestra blanco? Se debe contactar
un laboratorio que trabaje con espectrometría de masa para que evalúen si el musculo
de res tiene la presencia de la ciproproxacina, ya que sería muy difícil conseguir el
blanco de muestra, si está contaminada en 4ppc no hay problema porque mi sistema no
alcanza a trabajar con ese valor de ppc.

Se habla de exactitud cuándo se está teniendo en cuenta el ambiente químico en que están.

Los estándares añadidos son muy costosos y por ende no se pueden desperdiciar en
cualquier muestra. Ejemplo: difícilmente se analizara la concentración de un medicamento
por estándar interno, porque la simpleza de la matriz y la elevada concentración del analito
de interés no hace necesario trabajar métodos tan complicados como el estándar añadido o
interno; porque sencillamente la preparación de la muestra tendrá solamente una etapa de
manipulación (dilución) o quizás dos (si se hace una solución intermedia). En sedimento si
se debe usar añadido porque la concentración va a estar baja (ppc) y en cada paso cualquier
perdida puede ser mucha.

Cuando se habla de estándar añadido se está diciendo que por más que se ha querido
eliminar un interferente que se tiene en la matriz, no se ha podido y que cada vez que se
intenta quitar pueden haber perdidas (y se quieren quitar porque cuando se analizó el blanco
de la muestra se encuentro una señal que es interferente)  ya en estos casos toca convivir
con las interferencias  como alternativa se deja el V de muestra constante porque así la
respuesta instrumental de los interferentes no va a cambiar; se modifica el V del estándar
porque se va a construir la curva de calibrado.  La respuesta de la muestra es constante y
cuando se empiezan a hacer las adiciones es cuando se empiezan a tener las variaciones las
cuales son causadas por la respuesta del analito que se ha agregado.

En un estándar externo la condición es: si hay interferentes, estos se tienen controlados y no

perturban la señal instrumental.

Ejemplo: Hay casos en los que el blanco genera interferentes porque no se pueden eliminar
pero estos no afectan la señal del analito de interés  en estos casos es viable estándar
externo.

Preparación de muestra

La exactitud es finalmente el objetivo de un análisis.

Cuando se está haciendo una determinación se debe tener mucho cuidado durante la
preparación de la muestra, un descuido en la etapa de homogenización, extracción o
concentración puede reflejarse en el resultado final.

Errores en esas tres etapas son errores que no se pueden corregir después  esto va a
generar automáticamente un dato analítico erróneo.  Errores no rectificables.

Se debe tener:

 Noción del resultado  tener idea aprox. de lo que va a dar un resultado.

 Identificación del objetivo del análisis y analito de interés.

Se debe analizar el método en términos de:

 Exactitud  de esto vive el análisis, se quiere encontrar el valor lo más cercano al

verdadero.
 Precisión  se está hablando de la concordancia entre los datos experimentales.
 Costo  inyectable no justifica una técnica complicada cuando es una muestra sencilla,
aplicar la técnica adecuada según el reto analítico que se tenga en la muestra.
 Manipulación  Lograr eliminar parte de los interferentes y obtener confiabilidad en el
dato analítico, mucha manipulación va en contra de la exactitud y precisión porque se
dan perdidas del analito.
 Tiempo de análisis  Por tener mucha manipulación se llega a elevados tiempos de
análisis.
 Automatización  Se hace uso de esta para disminuir la manipulación y el tiempo de
análisis.
El método de preparación de la muestra debe aplicarse en el momento y muestra adecuada.

Aseguramiento de la calidad: el efecto de la matriz

Cuando se quiere asegurar la calidad de un resultado analítico se debe demostrar que se han
controlado el efecto matriz.

Efecto matriz  así como es inestable la molécula de interés también puede serlo la matriz.
Se necesita evaluar como es el comportamiento, si ella cambia a través del tiempo o no, por
eso en los métodos de validación dicen que para hacer los ensayos de precisión se van a
hacer las curvas de calibrado utilizando 3 réplicas por puntos utilizando un mínimo de 3
puntos, esto se debe repetir por lo menos por 2 días más en tiempos diferentes.  Se quiere
ver si la matriz del blanco de la muestra siempre va a mostrar el mismo comportamiento de
interferencias.

Si se preparan una curva de calibración un lunes (y no se preparan más porque se trata del
mismo blanco y analito) y se utiliza un viernes pueden presentarse que las interferencias del
blanco estén contribuyendo demasiado al analito de interés  la matriz está evolucionando
 por esto se dice que las curvas de calibración deben realizarse el mismo día del análisis.

¿Por qué el efecto matriz es importante que lo evalúen?

Porque se tienen problemas con la exactitud y precisión.

? Recuperación cuantitativa  analíticamente hablando significa que todo lo que está allí
se va a extraer.

Respuesta a la primera pregunta.

Enriquecimiento surrogado  Se ha considerado como otro método (nuevo), vienen a raíz

de entender que los sistemas evolucionan, no se puede creer que porque es un reactivo es
eternamente estable.

Estos métodos lo que buscan es el tiempo de estabilidad o fecha de vencimiento (momento

en que el reactivo empezó a generar subproductos o ha empezado a desestabilizarse y
generar otras señales que anteriormente no se estaban generando) de un reactivo de
derivatizacion.

El estándar surrogado es un patrón que se añade a todo (muestra, soluciones patrón, blanco
de muestra y matriz enriquecida), no tiene como finalidad hacer cuantificación  su
finalidad es confirmar que la señal se mantenga en los análisis.  Cuando se añade el
surrogado se genera inmediatamente la lectura instrumental para saber cuándo está en la sln
del patrón el surrogado que señal me da. Si se vuelve a inyectar el surrogado después de 5
meses de haber preparado la muestra y se ve que cambio la señal del analito pero la del
surrogado no  el problema es del equipo no del reactivo.  El surrogado es un marcaje
(marcador) que se le realiza a las soluciones y muestras del laboratorio.

En mayo me dio la respuesta bien pero en agosto que se volvió a inyectar la misma sln se
encontró que cambio  si cambia el surrogado significa que la señal evoluciono, se debe
preparar una sln nueva, no solamente se sigue porque cambie el analito de interés, la
confirmación la hace el surrogado.

Si se mantiene el surrogado pero cambia la señal del analito  problema del equipo porque
el surrogado dice que la situación está bien.

El surrogado es una forma de control de calidad de los solventes y es una forma de saber si
el análisis está bien.

Cuando el interferente no está dentro de la ventana de retención del analito de interés se

puede hacer el análisis  se puede trabajar con estándar externo o interno, con interno
cuando es una matriz muy compleja que requiere mucha manipulación, entonces se debía
tener un control en todas las etapas porque se estaba teniendo una pérdida del analito del
interés  para garantizar la exactitud de las cuantificaciones.

En UV-VIS la única manera de que se pueda analizar simultáneamente distintas moléculas

es que cada molécula tenga una longitud de onda distinta, pero si todas las moléculas
absorben a la misma longitud de onda es imposible cuantificar.  Tiene una seria
limitación en desarrollar análisis multiresiduos y multiclase.

Cuando se habla de haber desarrollado un método analítico multiresiduo, se está diciendo

que todas las moléculas que se han analizado pertenecen a la misma familia (grupo
farmacológico).  Se pueden analizar al mismo tiempo varias moléculas de la misma
familia con una misma muestra.

Método multipropósito  solo interesa evaluar una molécula.

Métodos para analizar sustancias de diferentes clases al mismo tiempo con una misma
muestra.  Método analítico multiclase.

Cuando se tienen diferentes sustancias pero hay algunas que son de la misma familia  se
dice que el método analítico es multiclase y a la vez multiresiduo.

Una muestra compleja demanda un método complejo.

¿Qué implicación tiene haber aplicado una técnica de preparación de muestra equivocada
para una matriz y me aventure a hacer una cuantificación?

Cuando el equipo va a cuantificar lo que hace es trazar imaginariamente una línea de base y
proyecta el pico cromatografico hasta la línea base; es decir, lo baja. Si ese fuese un pico
causiano con poco fondo  se provocara un bad Graw por matriz. Si fuese un pico base
correcto, al cuantificar el error por línea base seria despreciable…pero cuando se cuantifica
se tiene de línea a línea donde se levanta el pico un área, pero el equipo está cuantificando
también eso como parte de la respuesta instrumental del analito de interés.  Hay un falso
positivo.  Es imposible enviar esa cuantificación porque hay mucha implicación en la
lectura instrumental de cada sustancia de interés provocada por la presencia de tantos
componentes endógenos en la matriz, que perturbaron todas las respuestas instrumentales.

Todos los equipos tienen una línea base y es lo que se monitoriza antes de inyectar una
muestra  cuando la línea base a medida que pasa el tiempo comienza a elevarse o a caer
 se dice que se generó una deriva porque lo que se esperaba era que siguiera constante.
 Cuando es hacia arriba es deriva positiva y hacia abajo deriva negativa.  El problema
de trabajar en presencia de derivas es que si la concentración del analito es muy pequeña no
se leen las cantidades negativas y el equipo lo toma como ruido; y si es muy alta la
concentración y es negativa la anula porque la toma como ruido de fondo y solo muestra
como respuesta instrumental una porción porque es la que está en escala positiva.  Con
derivas no se pueden realizar análisis porque arrojan resultados erróneos.
Existe una serie dependencia entre la complejidad de la muestra, la concentración analítica
y la técnica de tratamiento de la muestra.

No es viable trabajar muestras complejas con técnicas simples.

En cuanto se cuantifica un primer eluato de la muestra nos daremos cuenta si acertamos en

la escogencia de la técnica de tratamiento de muestra.

¿Cuándo la relación señal/ruido hace el ruido despreciable?

No es que sea despreciable, se necesita es que este dentro de su ventana porque cuando me
pase de la ventana me provoca derivas.

Las interferencias pueden ser despreciables, pero no quiere decir que sean cero.

Procedimientos de extracción

En la etapa de extracción se eliminan los interferentes endógenos mayoritarios,

interferentes exógenos son contaminación que nosotros hemos agregado a la muestra, no le
pertenecen a la muestra, son producto de nuestra manipulación o de los solventes
utilizados, por esto cuando se hace el análisis de la muestra se buscan reactivos que sean de
alta pureza.
En las técnicas instrumentales si se notan los daños en los reactivos porque ya las líneas
bases no son perfectas  se necesitan reactivos de buena pureza, calidad analítica o
cromatografica (por lo menos), nada de calidad comercial o de reactivo.

Si se usan los de calidad comercial se le esta es añadiendo complejidad a la muestra, se

altera la estabilidad del analito.

Todos los métodos de análisis exigen alta pureza de los reactivos  ya no se hacen blancos
de reactivos.

Técnicas de preparación de muestra (concentración y limpieza)

Extracción en fase solida (SPE):

 Actualmente es de las técnicas más comunes para preparar las muestras.

 Más económica.
 Versatilidad de cartuchos en el mercado (cartuchos de extracción en fase solida basadas
en cromatografías de fase reversa, fase normal, fase modificada tipo ciano, amino, fenil,
intercambios mixtos (anionicos y catiónicos)…)
 Versatilidad en tipos de FE (fase estacionaria).
 Polímeros de impronta molecular (sistemas sintetizados en el laboratorio y que son
altamente específicos).

En el sistema de fase reversa  Sistemas activos de centros activos de baja polaridad

usando analitos de alta polaridad. El tipo de interacción van a ser tipo pi-pi, dipolo-dipolo y
tipo interacciones hidrofobicas.

¿Por qué son interacciones intermoleculares?

La cromatografía se basa en la reversibilidad de la unión intermolecular.

Según los grupos funcionales que tenga el analito y según la polaridad que tenga la FE 
se van a establecer diferentes tipos de interacciones moleculares, de modo que cuando
venga una fase móvil (FM) y arrastre al analito  lo que está haciendo es reverter. Y
cuando se revierte se vuelve a tener el analito de forma original no modificado. Esto es
clave en la cromatografía liquida, nunca se modifica al analito original  hacemos todo
basándonos en interacciones intermoleculares reversibles.

Sistema mixto  es un sistema comercial, tenemos intercambios basados en un sistema C8

y sistemas de intercambios anionicos.
La resina de intercambio ionico hace extracción anionica fuerte pero también se tendrá la
interacción de baja polaridad que es el sistema pi-pi y las interacciones hidrofobicas.

En un sistema de fase reversa meramente, mi analito va a hacer interacciones

exclusivamente de baja fuerza, de baja interacción, tipo van der Waals. Pero cuando se le
mete una combinación C8 de tipo fase reversa con un intercambiador ionico, el ionico va a
interacción electrostática y esto es de alta polaridad.  Mi analito está haciendo diferentes
tipos de interacciones, de modo que las FMs de elución tendrán que romper para recuperar
completamente el analito.

Polímeros de impronta molecular (MIP)

Ventaja: Tiene una mayor especificidad al momento de interactuar con el centro activo, en
fase reversa hay diferentes tipos de interacciones. ¿Qué desventaja tiene que la FE le
ofrezca al analito diferentes tipos de interacciones? Que así como las puede aprovechar el
analito también la van a aprovechar otros contaminantes endógenos de la molécula porque
las interacciones de sistemas de fase reversa o intercambio ionico no son especificas ni
selectivas y cualquier molécula que tenga la capacidad de interaccionar, lo hará.  esto
provoca que cuando se trabaje con un cartucho en fase sólida en sistema de fase reversa, no
se va a tener tanta selectividad en la retención  cuando pase una muestra compleja
esperando que el analito de interés se retenga en el centro activo de la FE, no solamente lo
hará el, sino otros componentes presentes en la muestra.  Tendré que luchar contra
muchos interferentes que se han adherido.

El sistema de MIP se basa en el mismo tipo de interacciones antígeno-anticuerpo, estas se

caracterizan por tener sitios específicos (sitios electivos) y allí no pueden entrar todo tipo de
moléculas a interaccionar.  Esto también lo hacen los MIP.
Se genera una plantilla o un molde y entonces mi analito de interés es el único que encaja.

Cuando se tiene semejante selectividad, se pueden tener un mundo de interferentes en la

matriz, pero estos dan igual. (xD!).

Lo que se hace para crear un MIP es:

1. Se coloca una plantilla molde  que pertenece al grupo de analitos que se quieren
identificar en la muestra (que sean de la misma familia). Este molde va a conservar la
estructura base de ese tipo de sustancia, se diferencian es por el grupo funcional que
tengan adicionado.

2. Se adicionan monómeros funcionales  hacen un reconocimiento selectivo de los

grupos funcionales, para determinar la espacialidad de la molécula  se adhiere e
interacciona con el grupo funcional. Lo que sigue después es intentar fijarlo para que no
se mueva.

3. Se agregan entrecruzantes  Fijan al monómero para que este no se mueva.

Se añade y se encuentra en alta proporción con respecto a la plantilla y el monómero

funcional.  Se provocan condiciones adecuadas de rxn en medio de un disolvente
adecuado (a temperatura y en un tiempo específico)  el entrecruzante se distribuye y se
solidifica  entonces provoca que ya el monómero funcional no se pueda mover de ese
sitio.

4. Como se tiene fijo el monómero  se retira la molécula molde  queda hecho el

molde, de forma que cualquier interferente de la matriz, que no tenga ningún parecido
con ese espacio de la molécula le es imposible interaccionar con el centro activo de ese
polímero. (por esto se dice que son altamente selectivos.

5. Reconocimiento.

Nota: el analito que se va a retener no es el mismo que se utilizó para generar el molde,
pero si va a ser reconocido porque la estructura base es idéntica (son del mismo grupo). No
se utiliza la misma molécula porque cuando esta se está retirando no se tiene la certeza de
que se está eliminando en su totalidad  puede haber error de cuantificación.
Ventaja:

 Es reutilizable (fase reversa, intercambio ionico, modificados con ciano, amino…y

demás son desechables  se usan una vez y se botan).

 Selectivo  Permiten que se utilicen niveles de ppc; se pueden analizar grandes

cantidades de agua sin agregarle complejidad al análisis porque los interferentes que
podían estar han ido pasando y no se retienen por la no especificidad que tiene con el
sitio de unión.  no reconocen el sitio activo  no se pueden unir y salen.  se tiene
una mejor cuantificación.

Extracción en fase solida (SPE)

Se puede hacer extracción en fase solida utilizando fase reversa o polímero de impronta
molecular.

Se tienen unas jeringas (las de inyección)  se tiene solo el cuerpo externo (sin embolo),
se tiene una membrana de filtración para que la FE no se salga.

Se coloca la membrana  se tiene el cartucho de FE  el líquido se adiciona a una cabina

de vacío, porque al ser tan fino el polvo, el líquido no pasa si no se envía por vacío.

1. Acondicionamiento:

Cuando la FE está seca (polvo seco), el centro activo no tiene capacidad de fijar a nadie 
se tiene que solvatar, se le agrega un disolvente (el fabricante me dice cual)  solvata al
centro activo y hace que este tenga la capacidad de retener al analito de interés  se agrega
el mismo disolvente que se tiene como vehículo de la muestra; es decir, se utiliza el mismo
solvente que se usó cuando se hizo el pre-tratamiento de muestra, esto se hace para evitar
choques de polaridad (para evitar que el solvente recomendado por el fabricante vaya a
generar precipitaciones).  Cuando hay choques de polaridad se genera insolubilidad por
kps  se provoca insolubilidad de la molécula en el extracto original.

Siempre que se habla de acondicionamiento y solvatar, después se debe pasar el cartucho a

la misma polaridad que tiene la muestra para evitar precipitación.

2. Carga de la muestra:

En SPE se tienen que validar el volumen y la concentración de la muestra porque son

sistemas finitos.
Si el centro activo es un sistema C18 (baja polaridad  interacciones van der Waals  si
es una molécula que tiene carboxilos, aminos cuaternarios, grupos flúor  no podrá
interaccionar)  el solvente tiene sistemas anillo base, de resonancia, electrones pi
deslocalizados  los sistemas pi hacen interaccion con los C18  cuando van pasando los
10mL de la muestra (inyectándola) se están pasando moléculas, las cuales van
interaccionando porque tienen la capacidad para hacerlo  mientras se siga pasando más
volumen se está agregando al centro activo más moléculas que tienen la capacidad de
seguir uniéndose  hasta que se llega a un momento que se ha pasado equis número de
volumen que representan el número suficiente de moléculas que han utilizado todos los
centros activos que estaban disponibles  si se han pasado 6mL de muestra y ocurrió esto
(ya se saturo), si se agrega más volumen de muestra que llevara mas analito, entonces estos
analitos se van a los desechos porque el sistema está saturado; por esto cuando se habla de
carga de la muestra se tiene que optimizar la variable de cuanta muestra se tiene que
agregar en función de la concentración (volumen de ruptura), porque si esta diluida se
podrá pasar más volumen pero si está concentrado será menor.

Volumen de ruptura del cartucho  Máxima capacidad que tiene de fijar esa muestra.

No viene dado solamente por la cantidad de FE que tiene el cartucho, también estará dado
por la complejidad de la matriz (esta última es la determinante); porque los sistemas de
interaccion de fase reversa, intercambio ionico…no son selectivos  los centros activos no
van a estar ocupados solamente por el analito de interés sino también por interferentes que
tenga la capacidad de interaccionar con un sistema van der Waals.  Esto hará que se
sature más rápido el cartucho.

Cuando se está optimizando la carga de la muestra, la variable que se debe tener en cuenta
es la complejidad de la matriz  entre más compleja seguramente el V de ruptura va a ser
más corto.

En este paso la finalidad es: retener el analito de interés.

Determinar el V de ruptura es crítico porque si se olvida esa saturación entonces se estará

perdiendo analito que no se podrá cuantificar  exactitud mala.

Cuando se determina cuanto V de muestra se puede permear a través de la FE  vuelve a

quedar solamente la FE, el líquido ya ha bajado y todo ha quedado retenido, el analito de
interés y también la interferencia.

3. Lavado de contaminantes  agregar un disolvente que ayude a que los interferentes

que habían quedado retenidos se vayan.  así solo queda el analito de interés.
4. Elución  se eluye el analito con el disolvente más adecuado para el análisis (mas
soluble). No debe ser poco soluble porque esto me indica que para solubilizar la
muestra tengo que adicionar mayor volumen de esto y esto hace que se me diluya la
muestra y es algo que no se quiere.

En las etapas 3 y 4 el volumen y la composición del disolvente son críticos:

 el 3 si el solvente no es lo suficiente selectivo se me puede llevar al analito de interés y

se pierde, si me excedo en el volumen aunque la composición sea adecuada, la parte
adecuada se lleva los interferentes pero el exceso se lleva lo que quedaba
interaccionando (el analito)  hay muchas moléculas peleando el espacio y por eso
sacan al analito.

 En 4 cuando la composición es la mejor, se puede usar poco volumen para recuperar

todas las moléculas que habían quedado retenidas  esta es la manera como se pre-
concentra en SPE.

AUDIO INSTRUMENTAL AGOSTO 9

Y Erika haciendo hablar a la gente. Chicos lo último que hablamos ¿?

Se hablaron de la montada de columna, adición de polvo adsorbente, analito, solventes.

Cargada de muestra y quedara atrapada en solución y polvo. Hay que tener en cuenta
volumen y concentración. Tener en cuenta volumen de ruptura, elución del analito

Pregunta..

Si yo tengo un cromatograma que muestra lo siguiente:

Cromatograma de la mezcla de patrones que estoy determinando (en lápiz), luego yo corro
una muestra, que tengo que tener los analitos en el mismo nivel de enriquecimiento (en
cromatograma)que los tengo en mi muestra enriquecida. Cuando yo desarrollo un método
se sabe que se trabajan con muestras preparadas en el laboratorio, muestras que son blanco
y a las cuales yo soy quien contamina intencionalmente, y como yo soy la que contamina,
yo sé a qué nivel de concentración lo echo.

Esa muestra, en mi caso, para preparar esa muestra yo he elegido una técnica de SPE.
¿Cómo sé que todo el analito que luego estoy monotorizando en mi cromatograma y que
me da eso?… punteada roja es mi muestra, la gris es un patrón. Normalmente la técnica
cómo se maneja: yo tengo en el laboratorio 3 tipos de muestra, hablamos de tipos de
muestra aunque el origen ese el mismo. Por ejemplo, voy a la finca, tengo leche cruda y
debe ser de animales que no han sido expuestos a la sustancia que yo quiero analizar. Esa
muestra llega al laboratorio y lo primero que hago con la muestra es alicuotar.

En cada uno agrego un volumen contante de mi muestra. Supongamos que yo estoy

trabajando con 15mL de muestra en cartucho, entonces en cada uno estoy agregando 15mL
de esa muestra blanco, de la leche que traje de la finca. Cada uno tiene el mismo volumen.

Después lo que hago es que a una de ellas la contamino enseguida con los anualitos de
interés, en este caso será Tetraciclina. Cuando yo la contamino, fíjense que lo estoy
haciendo YO, sobre una muestra que me consta que no posee tetraciclina, por que lo se?
Porque yo he ido antes con el ganadero y le he preguntado si tiene animales que no han sido
medicados. Entonces a la muestra 1: yo le agrego la tetraciclina a 100ppm la muestra 2: la
dejo intacta porque va ser mi muestra blanco, quiero ver cómo se comporta esa matriz del
blanco cuando yo aplico mi estrategia SPE. Y la muestra 3: que también es blanco y la voy
a tratar como si fuera blanco, la única diferencia que va tener es que después de que yo la
someto al proceso de SPE y justo antes de inyectarla en mi HPLC, yo lo que hago es
agragarle los analitos de interés, o sea la tetraciclina. Es decir, justo yo cogí la muestra, le
aplique SPE, ya tengo el eluato que se supone que voy a inyectar en el HPLC para el
análisis, justo antes de este paso de inyectar, es cuando la contamino. ¿A qué nivel de
concentración la voy a contaminar? A nivel de pre concentración que yo haya alcanzado.
Hay una concentración de 100ppm presentes en un volumen. O sea 15mL de leche están
contaminados de 100ppm de tetraciclina que yo agregue, PERO si cuando yo hago la
adición de mi muestra aquí, finalmente la eluyo en 1mL nada mas de disolvente. Significa
que toda la tetraciclina que estaba diluida en 15mL, ahora está en 1mL ¿gane concentración
o no? Si, o sea que en esa final, mi factor de pre concentración es de 15 veces , o sea estoy
hablando de que no voy a detectar 100ppm, voy a recibi una señal de 1500ppm (100ppm la
convierto en una señal de 1500ppm), ESTO significa que cuando yo estoy analizando mi
muestra en una SPE, yo no voy a tener una señal equivalente a 100ppm. Si yo preparara
un patrón de 100ppm y lo registro, mi patrón de 100ppm dará una señal como esta (pico
bajo) pero cuando yo aplico mi factor de pre concentración basado en la SPE, Y hablamos
de 1500ppm, mi señal no es eso, sino que (pico más alto) Y YO SIGO ESTABLECIENDO
QUE MI MÉTODO FUNCIONA para poder determinar tetraciclina que este a ese nivel de
concentración (100ppm), lo que pasa después de convertirla a 1500 es mi estrategia de
tratamiento de muestra.

Por ejemplo: cuando yo tengo un analito en altas concentraciones uno se pregunta para que
quiero pre concentrar, si luego es muy probable que me salga de intervalo dinámico lineal y
tenga saturación residual. Entonces uno dice: a menos que este en presencia de matriz
compleja, no lo elijo, a menos que este en una matriz compleja y no tenga en realidad una
baja concentración, entonces yo no me preocupo por pre concentrar. A que me refiero: en
lugar de trabajar por ejemplo con 15mL de ellos, solo trabajaría con 1mL y si yo cargo con
1mL y eluyó con 1mL NO PRECONCENTRO porque los 1000 de masa que tenía en 1mL
volverán a estar 1mL, o sea q ue lo que he hecho es MANTENER EL NIVEL DE
CONCENTRACIÓN, fíjense que lo que nunca se hace es DILUIRLA.

Como la diluiría?? La masa presente en 15mL, eluyó con 20mL. Ahora lo que hice fue
diluir. Entonces, NO HAY ninguna técnica de tratamiento de muestra bastada en estos
sistemas están dirigidos a diluir. PERO si ustedes dicen profe: Pero si yo trabajo con
menos de 20mL no logro eluir toda la tetraciclina que tenía presente en el cartucho, yo me
estoy dando cuenta que se me está quedando tetraciclina en el cartucho y BUENO: eso
habla de muchas cosas, por ejemplo: numero 1. El solvente que estás trabajando no es el
más indicado. PERO entonces ustedes siguen diciendo que lo es: entonces ustedes tiene
otra oportunidad de preconcentrar: si yo quiero reducir volumen ¿que técnica aplicaría?
CORRIENTE DE NITROGENO. Lo que hacemos es bombear una corriente de N a caudal
constante directamente sobre mi disolvente, siempre y cuando mi disolvente sea orgánico,
porque donde sea acuoso, eso no va producir nada. De manera que todo mi disolvente que
sea altamente volátil empezara a salir de mi solución y yo podre reducir volumen.
Actualmente existen muchas técnicas para esto.

(Expectativa)

EQUIPO: Turbovap

(REALIDAD)

Combina la corriente de nitrógeno. Tenemos una caja cuadrada y tenemos tantos pocillos
como el fabricante haya dispuesto. Esta caja internamente tiene una gradilla. Cuando yo
coloco mi tubo aquí , la gradilla posee un pequeño orificio porque estos tubos tiene esta
forma (formita de u:bulbo ), de modo que la gradilla tiene una perforación al final de modo
que solo puede pasar esta forma de bulbo . De esta manera mantengo mi tubo sin que se
caiga, sin que pase por la gradilla. Aquí abajo lo que hay es un baño de maría por tanto lo
único que estamos calentado es bulbo, NO estamos calentando todo el cuerpo. Si yo elui
con 20mL en este tubo tendre un volumen de 20mL y que va llegar al bulbo. Cuando
empieza a concentrarse, en la tapa de este sistema hay unas salidas de N que van a cada
puerto, de forma que cuando yo lo cierro automáticamente coincide la corriente de
nitrógeno sobre la boca de cada tubo. Y empieza a bombearse corriente de N al tiempo que
hago un calntamiento de baño de maria. La temperatura a la que caliento la establezco yo
acorde la estabilidad de mi analito y de esta manera yo rápidamente logro que el volumen
se reduzca al volumen que yo quiero. Es un equipo bien moderno, tiene sensores de
volumen, como programar, el pregunta qué tipo de solvente tiene, y en función de eso se
autoprogramarse para hacer el calentamiento. Él tiene una alarma por ejemplo que dice yo
quiero que me concentres hasta 0,5mL, tiene una alarma y cuando llegue ahí me pita.

El más convencional es el rotaevaporador. La diferencia del Turbovap es que no recuperas

disolvente en el rotaevaporador si recuperas disolvente. Cuando hacemos técnicas analíticas
trabajando en trazas y ultratrazas no es recomendable por la posibilidad de contaminación
cruzada.

LA ANALITICA ES UN MUNDO DE INFORMACIÓN… LEER…

Esta es turbovap, el specs vakium se utiliza mucho para proteómica pero es excelentísimo
porque preconcentra sistemas acuosos. Porque cuando voy a preconcentrar en turbovap no
me sirve, no arranca.

Nunca es recomendable que el disolvente que se está evaporando, lo recuperes aquí para
luego aplicárselo a otra muestra porque existe la posibilidad de contaminación cruzada. Por
eso el rotaevaporador para nosotros no existe, aparte no existe porque maneja una
“corvetees” muy altas, además tiene un serio problema. Trabaja a punta de vacío, de
manera que mi analito es volátil, voy a tener pérdidas. He cuidado mi analito durante todo
el proceso y justo en el último paso lo estoy perdiendo. Porque… porque si mi analito es
volátil y yo le meto alto vacío como el rota evaporador, estoy perdiéndolo, entonces el rota
evaporador en análisis instrumental NO EXISTE, nunca ha sido una opción para técnicas
instrumentales. El rotaevaporador sirve para purificación, separación de mezclas pero a
groso escala.

ENTONCES…

Yo tengo estos 3 tipos de muestra, a esta muestra (muestra 1) que yo la he contaminado,

antes de yo empezar mi proceso de tratamiento de muestra y mucho más antes de haber
realizado el análisis, a esta la llamo MUESTRA ENRIQUECIDA (muestras salpicadas,
enriquecidas) el 2 es mi blanco, a ese no lo voy a tocar para nada, simplemente como lo
recibo, lo someto a su tratamiento de muestra y a su análisis y a las 3. Lo he tratado igual
que al blanco pero justo antes de analizarlo es que yo lo enriquezco y OJO: ¿para qué creen
que yo necesito ese blanco enriquecido en el análisis? ¿Qué representa esta que no
representa la muestra enriquecida? ………..
Esto que yo represente aquí: vamos hablar que he añadido 2 tetraciclinas. Entonces lo que
está en gris (lápiz) es un cromatograma de patrones en disolventes puros, o sea, no
representa ninguna de esas muestras. Porque solo es disolvente puro, no es matriz de leche.
Entonces el azul es el blanco de muestra, (o sea la muestra 2), SUPONIENDO QUE EL
TRATAMIENTO FUNCIONA.

¿Qué se espera de un cromatograma de un blanco? El blanco no se esperaría ninguna señal

pero de todas maneras hay algunos componentes endógenos minoritarios que van a dar una
señal. El blanco es todo mi analito de interés. (POR ESO el cromatograma de marcela
estaba malo porque estaba dando señal donde están los analitos. Quiere decir que a la vaca
si le echaron tetraciclina y no hubiese servido como blanco de muestra.)

MUESTRA 3: Representación de la muestra en 100% de recuperación: puntos rojos.

Recordar que los picos tienen un máximo, por eso los picos de Erika prácticamente termina
en un punto prácticamente para caer esto es con el fin de saber cuánto es el máximo de
absorción porque si no cada vez que se moviera cambia la longitud de onda.

¿Por qué se está esperando esto en la muestra 3? ¿Porque se espera que el cromatograma
representa del 100%? R// porque a esta se le agrego el analito cuando se iba hacer la lectura
en cambio en la primera muestra se agregó analito al principio y como se sometió a
tratamiento pudo haberse perdido cierta cantidad. En cambio en esta no se va perder analito
porque no se le va hacer tratamiento sino que se va hacer la lectura enseguida.

Mi muestra enriquecida representa los puntos rojos.

Ahora necesito una muestra enriquecida cuya exactitud en términos del primer analito fue
de 80% y en términos del segundo analito fue un 40% (la raya verde) (MUESTRA 1)

Esto es claro, yo debo tener los preconceptos de los resultados que debo esperar. Si yo
analizara un blanco y el resultado me diera como el que dibujo Marcela, automáticamente
debo decir, uy no, no sirve. ¿Cómo hago para descartar completamente el blanco de
muestra? ¿Cuándo voy a emitir un resultado, que hace que yo este seguro de lo que estoy
dando como resultado?

Es una muestra, es una muestra. Ojo. Como hablamos de muestra si yo no tengo algo de
referencia en la muestra

Cicloproxacina en sangre, le dio 200ppm, tenía que haber dado 300ppm, hay que hacerle un
ajuste de dosis, paciente neonato, no nacido a término, menos de 1kilo. ¿Con que
seguridad le dice al pediatra… modifique la orden?

Vas para juicio legal, producto de tu análisis… defiéndete. Estoy hablando serio,
pregúntenle a Jairo cuantas veces la fiscalía lo ha llamado por un análisis.

Tienes un exportador que te mando unas muestras de alimento para que les determinaras
residuos de contaminantes en el alimento, porque con base en eso el lanzaba sus
contenedores en eso, con base eso lanzaba su exportación. Cada contenedor le está
costando 1millon de dólares en transporte. Si ese contenedor llega una costa de un país
europeo o americana, y ahí la aduana le analiza y determina si los residuos de
contaminación si están presentes y que están violando la normatividad internacional. Lo
que están determinado incinerar todo el cargamento y no solo sancionar al exportador sino
a todo el país, saben sobre quien esta esa responsabilidades? DE SU ANALISIS.
¿Qué le diría el exportador a usted? ¿Errar es de humanos?

O por ejemplo: con que seguridad le dice al médico, eleve la dosis? Efecto colateral
adverso: anemia cardiaca, en un paciente que ya tenía falla cardiaca. Producto de eso:
muerte. ¿Contra quién va el medico?.. defiéndase… o usted o el medico

Se preparara un juicio legal: grupo de abogados, acusador y acusado. Equipo acusador y

equipo que tendrá que defenderse.

Ustedes tienen deficiencia: Disoluciones, ajustes de pH, tampones. ESTUDIEN, no esperen

que yo me ponga a explicar esto.

SIGUE LA PREGUNTA… ¿Cómo se que el resultado que estoy obteniendo es el que es?

¿En que me baso pafa dar mi resultado y veracidad?

R// me baso en EL BLANCO. No hay posibilidad de validar un método si yo no tengo un

blanco

Si yo he desarrollado un método, si he validado, implícito esta el blanco. Por que si no

analizo el blanco, como tengo la certeza de que la señal que se esta generando para mi
analito es exclusivamente de mi analito y no de un contaminante endógeno persistente de
mi muestra? ¿Quién revela esto? EL BLANCO, el blanco determina todo esto.

Si yo no tengo un blanco. ¿Entonces como evalué la selectividad de mi método?

¿Exactitud? ¿Por qué es necesario que demuestre que no hay, para que demuestres que si
recuperas? Es imposible hablar de esto, sin que implícitamente este el BLANCO.

¿Si tu muestra queda por encima de los LDD que pasa? Ahora… ¿eliminaría un resultado
cuyo valor está en los LDD?

¿El LDD es un intervalo de valores?

¿Es cierto que yo puedo dar un intervalo de concentraciones en el LDD, LDC, exactitud,
recuperación… muchas cosas? Si es cierto porque nosotros hacemos replicas, y las réplicas
no dan los mismos valores y porque nosotros determinamos coeficiente de variabilidad o
desviación estándar relativa y significa esto? Un más-menos. Significa Que cuando sumo
tengo un valor y como también tengo que restar me da otro valor y esto que me da? Un
intervalo

ENTONCES SI ES UN INTERVALO DE CONCENTRACIONES, pero no como uno

creería, porque la variabilidad se espera que sea corta. No es que como me puede dar 10 me
puede dar 50, NO! La variabilidad se espera que sea corta.
¿Y cuál es el pequeño detalle que tiene el LDD? Se basa en su forma de cálculo. Se basa en
la relación 3veces señal /ruido y que pasa con esta relación ¿?

Entonces ¿es confiable que analice una muestra y lo reporte en el LDD?

LIMITE DE DETECCION. Si una muestra me da en su cuantificación alrededor del límite

de detección. Yo lo reporto, PERO con la salvedad que la incertidumbre es alta porque el
ruido cambia, el ruido no es constante en el equipo, el ruido dependerá de que no se le hizo
mantenimiento, de que hubo una fluctuación de energía, todos los equipos instrumentales
sufren con los cambios de voltaje. Por eso todos los equipos instrumentales si no tienen la
ups al lado, no se les ponen a funcionar. Jamás se le coloca a la corriente eléctrica directa.
Porque si viene un corrientazo, el cp lo siente, abanico lo siente pero allá!! Es una
enormidad. Se salió del lumbral, y justo paso cuando estaba analizando mi muestra.

¿Qué pasa en el LDD? Es una cuantificación que es irreproducible y ese es el punto crítico
del LDD, por tanto es la mayor variabilidad que encontramos en la validación del método
analítico. Es donde yo digo, la muestra está presente porque se encuentra entorno a los
valores del LDD del método, pero no tenemos una certeza de en qué valor de concentración
se encuentra por la incertidumbre que implica ese análisis. Por lo cual se le recomienda al
cliente que envie su muestra a analizar con otra técnica mucha más sensible. ES ASÍ DE
CLARO Y asi salvaguarda su responsabilidad

Cuando un cliente hace una solicitud de análisis. Sabe usted para que la quiere? Demanda
judicial, exportación, reajuste de dosis, eso NO LO VA SABER. Usted solo debe dar
seguridad del resultado que está emitiendo.

Y volvemos a la pregunta… ¿Cómo tengo seguridad del resultado que emito? REPLICAS.
Cuando analizamos una muestra, no hablamos de 3 réplicas, sino de 5. Porque con 5 tengo
una tendencia mucho más marcada.

¿Con que confiabilidad o que decisión tomarían si al analizar una muestra su variabilidad
en un caso de 3 réplicas: 5, 15, 25en sus variabilidades respectivamente? ¿Qué decisión
toman?

GIORGIO DIJO: Se dice que el CV debe ser máximo 2% según literatura. PROFE DIJO:
OJOOOO

Cuando usted adiciona muestra a una réplica. ¿Qué está haciendo con su réplica?
Supongamos a esta muestra de leche lo primero que le hare es precipitar la proteína,
agrego acido, precipito, agito, centrifugo y después separo sobrenadante, pero ese tiene
mucha grasa y le agrego desengrasantes: mezclas de hexano, pertano. Por separaciones
liquido-liquido, separo lo organico de lo acuoso, me quedo con lo acuoso que esta
desengrasado y desprotonizado (ETAPA: PRETRATAMIENTO), Ahora a tratarla con base
a SPE (sufre un poco de etapas), hasta que tengo un eluato finalmente que va para el
análisis. Ahora dame tu RCD,,, ¿es 2? –Erika le pregunta a Giorgio.

¿de dónde sale mis RCD? ¿Qué cosas van a incrementar su RCD? ¿Qué cosas contribuyen
a que la muestra 1 me de un valor, que la otra me de otro valor…?

R// depende de las etapas de tratamiento… pasa que la RCD del 2% es cierta solo bajo un
contexto: cuando yo leo en mi HPLC, hago una lectura de mi analito, tengo un vial, en el
vial tengo una solución de x concentración de mi analito de interés, realizo la inyección y
me genera este cromatograma. Vuelvo a inyectar. Replica de inyección. En el laboratorio
por norma se inyecta 3 veces. La RCD del 2% hace referencia es entre réplicas de lectura
instrumental. Y ese estándar está establecido para cromatografía liquida gracias a su alta
precisión. Que quiere decir?? Que cuando yo hago el análisis de un blanco, o muestra
enriquecida o una muestra del 100%. Yo no reporto el dato de la réplica sin haberlo leído
varias veces. FIJENSE. Cuando yo meto esta muestra enriquecida, que la inyecto desde el
principio que le hago todo ese proceso de pretratamiento y tratamiento basado en SPE, yo
tengo aquí mi mL, y ahora va para análisis. Yo nunca reporto el dato de esa replica que
estoy analizando basándome en una única lectura instrumental, yo tengo que hacer mínimo
dos inyecciones porque: por las fluctuaciones de corriente eléctrica.

Entonces yo quiero saber si cuando esta concentración pasa por el detector, trasciende su
lectura a 10, cuando lo repito me da 8, cuando lo repito me da 11 y entonces tú dices bueno.
Estamos ok. Pro por la distancia entre 8-11, se hace una cuarta inyección y yo espero que
la 4 este en torno al 10 y digo que el 8 no reconoce por la fluctuación de la energía o algo
paso en mi equipo y de esta manera yo verifico que mi RCD es menor a 2.

Pero cuando estamos realizando las réplicas de un análisis, decir que una la RCD está en 2
o menor que dos: NO ES ALGO TAN FACIL. Porque vendrán otras cosas que van afectar
ese RCD: como cuantas etapas de manipulación tengo que hacer antes de analizar la
muestra: tengo que precipitar, lavar, centrifugar, partición liq-liq. Con ampolla de
decantación, cuando dejo que la parte orgánica se vaya puede que se vaya un poquitos de
sobrenadante. Tengo otra cosa que se le suma a mi RCD. Cuando yo voy a mis SPE y le
meto lavado, si lo hice con mucho vacío, lo que no tenía que haberse ido, se fue y también
contribuye a mi RCD y esto es un replica, ahora hay que multiplicarlo por 5 … ¿será que
dará un RCD menor que 2? Ahora… súmale complejidad de la matriz, un matriz compleja
quiere decir que ella puede ser el blanco de la misma muestra, y el blanco lo inyectaste
ahora y dio esto: ( la de arriba)

Y el blanco de la siguiente replica pudo hacer esto…( la de abajo)

Entonces… cambio tu método? Vas a cambiar de método? NO, esto está dentro de la
variabilidad. Lo que yo siempre estaré vigilante es que ahí en la zona de retención no tenga
problemas. De forma que la complejidad de mi muestra altera mi bad ground, altera mi
matriz y por tanto siempre va alterar la lectura de mi blanco, eso contribuye también al
RCD.

Será lo mismo cuantificar ppb que ppt… NO, no puedo andar diciendo olímpicamente decir
que el RCD no puede ser mayor del 2 POR DONDE SEA QUE CUANTIFIQUE. Pues no!
Entonces le puedo decir: mira tienes una muestra compleja en concent. De ppt. Hay que
hace un pretratamiento basado en desprotonizar, desengrasar luego por SPE y como esta
eluyendo con mucho volumen metes en Turbovap para concentrar. Y tu RCD debe ser
menor que 2:ESTO ES FICCIÓN.

Asi que cuando se dice que RCD interior del 2% es entre réplicas de inyección y esto
traduce: cuando yo tengo mi vial de cualquiera de las réplicas, y la inyecto en mi HPLC
espero que mi equipo haga si está funcionando bien: y la fuente es el mismo vial. Espero
que mi cromatograma no sea diferente y las respuestas instrumentales no puedes ser
diferentes entre si… aquí si espero que no sea mayor del 2% porque esto depende del
funcionamiento de mi equipo, esta RCD no evalúa método sino el desempeño del equipo en
el que estoy trabajando. Porque si esto es una solución y si la estoy midiendo cada vez,
tendría lógica que la respuesta debe ser la misma porque la fuente es la misma. Asi que si
en este momento la lectura a mi me da: 10, luego 17 y luego 30. Yo digo: no puedo seguir
adelante y el problema aquí no es el método, porque sea lo que sea que hubiese hecho en mi
tratamiento de muestra, la solución es constante, y la respuesta instrumental debería ser
contante. Haga lo que haga me da igual porque la fuente que estoy metiendo al equipo es la
misma, es el mismo vial. Si la respuesta instrumental es diferente el problema no es mi
metodo porque aquí no estoy vareando de una réplica a otra. Porque es el mismo vial. CON
lo cual si cambia mi respuesta… PARA porque tienes un problema instrumental, es tu
equipo que no tiene capacidad para reproducir la misma lectura y en ese momento hay que
detenerse y empezar a buscar patrones y buscar que pasa con el equipo. Y entonces la RCD
mide el DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO, más no EL DESEMPEÑO DEL
METODO.

1. Si yo tengo una muestra de un inyectable que lo compone principio activo y agua y

alta concentración y esta en ppm.
2. Y aca tengo una muestra de lodo en la que quiero determinar un analito como
ciclofroxacina que es altamente soluble con lo cual automáticamente me dice:
prepárate porque esto es traza porque el lodo no es polar. Este se ancla,

¿ sera que el ejemplo 1 me genera los mismos retos analíticos que el ejmplo del análisis 2?
¿ entonces como exigir el mismo RCD? NO, exigir el mismo RCD es olvidarme de la
complejidad que implica cada análisis.

Con lo cual mi RCD en función del intervalo de concentración que yo este barriendo, en
función de complejidad de matriz que tenga mi muestra. Yo puedo tener RCD de 5,7, 10.
Hay análisis que resisten variabilidades del 15% demostrado.

Esto significa que los analistas cuando analizaron todos sus tipos de muestra por más que
trabajaran en preparación de muestra o pulir su técnica instrumental, nunca logran
encontrar una reproducibilidad mayor del 15% y claro que es posible: que muestras pueden
hacer esto ¿? Las medio ambientales, son las más complejas, son un verdadero reto, porque
aquí tengo de toda clase de cosas metida, materia orgánica, contaminantes distintos.. y esto
asegura un RCD de un 2%? Nada.

Cuando yo hablo de un análisis que esta entorno a mi límite de detección, yo tengo que
salvaguardar mi espalda porque yo sé que eso analíticamente generara mucha
incertidumbre en la determinación. Por lo cual no le puedo decir al cliente la concentración
es tanto y el RCD es tanto. Embuste!! Porque el problema del LDD es ese. Cada replica da
algo diferente que puede poner en riesgo cualquier cosa (juega en extremos: exportar- no
exportar// concent. Terapéutica- concentración toxica). INCERTIDUMBRE DEL LDD.
Y si vamos a ver cuándo se desarrolla un método, las RCD en las exactitudes cuando se
habla de simples. Cuando yo estoy hablando de una curva de concentración donde va
respuesta instrumental/concentración, yo tengo un comportamiento así…. Hasta aquí se
está cumpliendo ley de Beer, rta directamente proporcional a los cambios de concentración,
pero llega un momento donde la RI ya no vario en la misma proporción, ese cambio a
veces no es tan claro, tener claridad que cuando voy a cuantificar una muestra tengo que
asegurarme estar dentro de esta zona (la encerrada), ahora lógico: no siempre voy a estar
barriendo la zona completa porque de repente mi LDD va estar en las ordenes de 2ppm y lo
max. Cuantificable esta en 10milppm. Entonces puede construir una curva de calibrado en
ese barrido? No…porque yo lo construyo entorno al resultado que deberíamos tener y entra
el concepto de curva de calibrado, entonces si definiéramos en termino de conjuntos. Diria
que la curva de calibrado es un conjunto que esta contenido dentro de los conjuntos. El de
afuera seria el conjunto universal y adentro el subconjunto. La curva de calibrado debe
estar dentro del RDL y cuando yo describo que concentraciones voy a barrer me guio por la
muestra.

Que es: REPLICA, PARA QUE SIRVE, PORQUE EL APOYO DE UNA REPLICA,
COEFICIENTE DE VARIABILIDAD, LIMITE DE DETECCIÓN.

Entonces esto es una de las variaciones que podemos tener en la aplicación de una SPE, en
la aplicación de una SPE, puedo tener una cabina de vacío y meter el cartucho, meterlo en
una cabina de vacio. En los cartuchos yo soy quien va adicionando cada solvente, quien va
eluyendo, quien va recogiendo cada eluato. Cuando yo hago ese trabajo hay un pequeño
detalle. Cuando yo eluyo mi cartucho para que tenga mi naalito de interés lo meto en un
vial del HPLC o para cualquier análisis y mi equipo si yo elui con 1mL (1000microL), el
equipo no inyecta los 1000, sino una alícuota de 10microL (escala analítica) o sea que toda
la masa posible que este presente solo estoy analizando 10, o sea la decima parte. Esto es la
técnica off-line del SPE. Tiene esa desventaja, yo no estoy analizando toda la masa de mi
analito que he desorbido de mi cartucho, sino que solo es una alicuota que va a mil.

La versión on-line es esta: que pasa? El on-line yo hago mi acoplamiento en línea, es

automatizado, el analista puede hacer un sistema automatizado. Que se hace: en este caso
trabajamos con dos bombas y aquí nos vamos metiendo en temas de HPLC.

Los HPLC manejan bombas que son encargados de bombear FM, en este caso se trbaajan
con bombas cuaternarias: Porque hay 4 canales, en este caso es un sistema acoplado en
línea entonces 1 bomba: es la que esta proporcionando disolventes de acondicionamiento,
lavado, donde va tener la muestra que va ser depositada en mi columna, en este caso
cambio el cartucho practico de las jeringas de inyección por un sistema de acero inoxidable
en donde yo tengo la fase estacionaria que utilizo como agente para la limpieza de la
muestra (la precolumna va antes de la columna analítica). Eso de ahí es un cartucho de SPE
pero de modo online. Es acero inoxidable y no plástico porque los HPLC trabaja a altas
presiones y el plástico colapsa, este rellena de material adsorbente que puede tener un
cartucho de SPE.

(BOMBA 2)Entonces: en 1 primer momento lo que hago es: trabajar en paralelo todo el
sistema. Esta bomba pasa a traves de una válvula de 6 vías, esta bomba succiona la fase
móvil y a traves de la valvula (que hace un sistema interconectorio) va la FM hasta la
columna analítica y la salida de la columna analítica se conecta al detector y ese genenrara
la señal.

(BOMBA 1) Al mismo tiempo que está ocurriendo eso, paralelamente desde la bomba, si
estoy en fase de acondicionamiento, va tomar el canal correpondiente de acodicionamiento
y lo bombea también a través de la válvula, pero usando otro cuerpo instrumental conector
distinto al anterior. El disolvente de acodicionamiento pasa por la FE que contiene mi
cartucho y el desecho simplemente va a residuos. Cuanto tiempo? Uno acondiciona el
tiempo según criterios propios y de fabricantes y;en función del caudal que yo tengo,
calculo el tiempo ejemplo si va 1mL/min. En 4min habran pasado 4mL. Cuando termina
4min, se ejerce el siguiente reservorio ( es el que contiene el tampón) y lo manda.

Después de acondicionar, sigue cargar.

Carga de muestra. Si mi muestra esta ahí, muestras de aguas con pH adecuado. Entonces el
equipo según el volumen de muestra que yo quiero hacer pasar y según el caudal en el que
yo este trabajando, empezara a succionar mi muestra por este mismo canal. Aquí se trabaja
en forma secuencial. Durante todo ese tiempo sigo bombeado FM 0,1mL/min o 0,2 para
montener satura la columna analítica antes de hacer la inyección de muestra y entonces
cuando ya mi muestra fue cargada, que esta ocurriendo: donde esta mi analito? En la
columna MIP pero ahí también están las interferencias (todo el exceso de volumen qur
contenia a mi masa, esta en los desechos, yo me quedo con la molécula, los vehículos
afuera) si yo estoy trabajando porque estos sistemas funcionan muchísimo para aguas por el
efecto d la alta división de las muestras, entonces siempre estaremos pre concentrando altos
volúmenes para alcanzar a reunir una buena cantidad de masa (analito). 25, 50,150, 250 el
problema es que lo que yo preconcentro al analito, preconcentro al interferente también.
Por eso los análisis de muestra de agua de consumo no es tan sencillo porque la veo
transparente, sería mejor si la pudiera ver tal cual pero cuando preconcentro altos
volúmenes, ya eso dejo de ser limpio para convertirse en basura.

Cuando yo termino de cargar mi muestra, los analitos de interés han quedado aquí
retenidos. Durante todo este proceso también hemos seguido saturando la columna. Esto es
fase de carga, HE CARGADO MI MUESTRA.

LAVADO: aquí viene mi solvente de lavado (el 4 reservorio) y empezara a bombera y

sacar contaminantes endógenos y los manda a desechos y ahora ha quedado analito de
interés y algunos contaminantes endógenos persistentes
La bomba cambio, mientrs antes entraba aquí , salía aca y enseguida se iba para mi
columna ahora… cambio su recorrido y antes de llegar a la columna es irse a la columna
donde se encuentran retenidos mis analitos de interés. Si se dan cuenta la muestra fue
gargada en este sentido , pero esta desorbiendo en el sentido opuesto, esto tiene un
principio aplicado y es la FOCALIZACION, es cuando tengo FE, mi solido tiene centros
activos, cuando están los centros activos disponibles allí, viene la muestra y la
concentración será la que se metio mi muestra, cuando los analitos entran lo que harán es
irse anclando enseguida con los primeros sitios activos que van a encontrar, cuando esta
primera FE se satura, y no tiene mas capacidad de anclaje pero sigue habiendo analito
presente en la fase que esta pasando, ella se sigue desplazando hasta la siguiente zona de
FE. Como esa zona no han encontrado contacto con analito, están disponibles, pero a
medida que el analito empieza a llegar empiezan a ocuparse y así lentamente. Yo siempre
voy a tener mas centro activo disponible que muestra disponible para asegurarme no tener
perdida en la carga de muestra. Porque si hay mas muestra al demás analito que queda sin
centro activo se van para desechos. Entonces ocurre que los primeros sitios activos que se
están ocupando son los primeros, si yo al seguir pasando muestra ya no sigo teniendo nada
en el vehiculo, ya los centros activos van a estar desocupados, si yo desorbiera los analitos
utilizando este mismo sentido de via  la misma via que los cargue, desorber en el mismo
sentido, que pasa? cargarlos de la misma via, como este disolvente tiene capacidad para
reverter la interaccion intermolecular que haya establecido, el analito se desancla y viaja
ahora con mi FM. Pero este solvente de elución le dice al analito que se desorbio pero tiene
un camino MAS LARGO que recorrer y yo ddebo seguir bombeando y bombeando
disolvente hasta lograr no solo que se desorba sino que recorra todo el camino este y vaya
hasta la columna analítica. Que implica para mí? DILUCIÓN. Para salir le puede tomar un
tiempo muy largo porque es un camino innecesario. FOCALIZACIÓN: es decirle al
analito, tu estas ahí, quédate ahí que el recorrido voy hacerlo yo solo y con que encontró a
la salida. Justo a la salida están mis analitos de interés, por lo cual requiere poco tiempo
salir de columna. Esto es focalización en técnica analítica. Cuando hago desorción en
sentido opuesto, me estoy focalizando y estoy usando menos volumen de solvente de
elución para sacar los analitos y estoy ganando concentración.

Ventaja de la Off- line que les decía allá. Toda la masa de analito que se retuvo aquí, va
para mi columna, estoy inyectando todo el volumen y no una alícuota de ese volumen y por
eso todo esto va para el detector, por eso la señal que alcanzo en un sistema on-line es más
alta, pero si este análisis lo hago en off- line esto será mucho más bajo notoriamente y
decido quedarme con On-line.

RCD…esto todo lo hizo un equipo instrumental, el analista no hizo nada, todo lo hace un
equipo y por lo cual la precisión con la que trabaja mi equipo instrumental. Por eso los
equipos automatizados son los que alcanzan las RCDs más miniaturas, hice experimento
trabajando off-l con on-l. Hay un serio problema de entrada, la on-line me permite
preconcentrar altos volúmenes, la otra no. por lo cual es muy posible que estemos obligados
a decir: bajo las condiciones de este método no detecte nada. Pero en la on-line así
estuviera en ppc pudimos detectarlo con factores de preconcentración que casi me llevaron
a la concentración molar.

Entonces los sistemas On-line, cada vez den más auge. Siempre voy a poder hacer el
análisis en on- line por mas diluida que este la muestra.
 QUIZ

1. Cuáles son los componentes del sistema cromatografico. Defínalos

2. Identifique los componentes de un cromatógrafo liquido de alta presión
3. Defina los siguientes términos: tiempo de retención neto, área bajo la curva, ancho
del pico cromatografico, coeficiente de distribución
RESPUESTA
1. Componentes del sistema cromatografico: FE, FM y analito… defínalos
FE: es la fase en la cual se retienen los analitos y son interacciones intermoleculares
(entre analito/fe)

Es importante saber el tipo de interacción sabré si podre desorber porque se basa en reverter
la interacción. Pero si mi interacción es de tipo INTRAmolecular no podre desorber.

¿El mecanismo de la FE- analito puede ser intramolecular? Es muy difícil que se pueda
separar el analito de FE por la fuerte interacción, esta fuerte interacción se basa en enlaces
covalente de corto alcance.

Lo Intermolecular implica interacción de largo alcance, por eso es fácilmente revertida. Lo

intermolecular es una interacción de corto alcance.

Ejemplo: oxigeno-hidrogeno para formar agua ¿se puede reverter fácilmente? NO, pero
cuando yo hago puentes de hidrogeno ¿Qué paso entre las distancias de atomos? Aumento
y será de largo alcance, será mas débil y por eso es fácilmente revertida porque me están
halando del otro lado por mi FM, porque la FM no pelea desde un principio, sino desde
donde no esta anclado y por eso implica el largo alcance.

Sistema cromatografico está definido por: FE, FM y mi analito.

La FE tiene un tamaño de partículas en micras, significa que pueden pasar por cualquier
filtro, pero como la retengo en una columna? Con una membrana, o sea que las CC tienen
tapones para evitar que el material se salga.

Las interacciones intermoleculares analito – FE deben ser de largo alcance para poder
reverterlas, de lo contrario no. ¿esta interacción es necesaria? Si para que pueda estar
retenido, o sea que cuando interacciona con FE se quede el analito en la columna.
¿entonces como logro tener un análisis? La interaccion FM- analito es mayor que la
interaccion FE- analito, de esta manera logro desorber el analito y está migrando de la
oclumna hasta llegar al sistema de detección y generar una señal inrumental.

FE- Analito- FM… pongo el analito en la mitad porque esta en los dos lados
interaccionando en tiempos distintos pero necesarios para llevar a cabo proceso
cromatografico.
 2. Componentes de mi cromatógrafo liquido:

Que identifican:

Reservorio de disolventes que se utilizaran para la elución en un análisis. Si hablo de un

sistema SPE on-line simplemente es el contenedor de los disolventes. La finalidad cambiara
según la aplicación que esté cumpliendo.

Sigue: desgasificador en línea. ¿Por qué en CL lo necesito? Para quitarle las burbujas de
aire del líquido.

¿de dónde salen las burbujas de aire de un líquido?

El problema es que cuando yo hablo de alta presión, por diferencia de densidades el gas con
el líquido van a separarse y cuando las microparticulas de O2 disuelto en liquido empiezan
a separarse, generan una burbuja de aire, y esta funciona como una obstrucción en la
tubería del cromatógrafo líquido. Porque el lumen de esa tubería puede ser hasta de 2mm,
por eso, cualquier burbuja de aire ahí es como un peñón. Por eso se necesita un
desgacificador en línea, de hecho si todo lo demás funciona pero el desgacificador no, usted
no puede hacer el análisis porque ese aire le va provocar fluctuación en el caudal y que pasa
si tengo fluctuaciones.

Recuerden en que se basa el análisis cuantitativo en HPLC. Para cuantificar tengo que
empezar por cualificar. En HPLC se cualifica por tiempo de retención. Por ejemplo: si
tengo mi patrón, para tales condiciones este es tu tiempo, 8 min. Cuando yo tengo
problemas de desgacificador que no está funcionando, tendré burbujas de aire en el seno de
fase móvil, esto provocara fluctuaciones y significa que no siempre se va entregar el caudal
que digo que tengo.

¿Qué pasa si mi FM no esa viajando siempre al mismo caudal?

El transportador es la FM y se transporta por un caudal (Vel. A la que me muevo). Mi FM
lo primero que hará es desorber pero luego tiene que ser transportada moviéndose, o sea
que la velocidad cambiara y el tiempo de retención se dañó, dejo de reproducirse, porque
cuando mi caudal fue más alto, el tiempo de retención disminuye y no habrá
ensanchamiento.

Pero cuando mi caudal es más bajo, el tiempo de retención se incrementó porque la FM le

tomo más tiempo de salir de la columna y el t. de retención incremento.

Problemas de irreproducibilidad en el tiempo de retención: cuando el desgacificador no

funciona bien, y automáticamente me genera incertidumbre en la identificación, y si no
tengo certeza de lo que estoy cualificando no podre cuantificar.

Siguiente: BOMBAS. Tengo dos bombas, son bombas peristálticas.

Mi reservorio de FM pasó a la zona de desgacificacion. Fenómenos de osmosis inversa que

pasa en la zona del desgacificador, por la tubería que es permeable está entrando mi
disolvente, son 20cm de longitud que tiene la tubería, se tiene en espiral para que quepa en
el cubículo, se mantiene en una cabina protegida a alto vacío y de manera por permeacion
de esas membranas se empieza a extraer el oxígeno disuelto allí. En la zona de
desgacificador el disolvente entra puro al desgacificador y el vuelve a salir puro pero sin
gas. Esto quiere decir que en esta zona no hay mezclas, no combino a los disolventes. Por
lo tanto si entran 4 cabales, salen 4 canales.

Una vez desgacificado empieza su recorrido hacia las bombas peristálticas. Una bomba
peristáltica funciona como una caja de alto vacío. Esta es completamente llena con un
piston, estos pistones son de zafiro.

Cuando yo tengo mi bomba desgacificadora mi pistón entra, cuando entra ocupa todo su
volumen dentro de su caja contenida. Cuando el piston se sale del espacio, queda vacio aquí
y como esta bomba esa comunicada con el desgacificador, el vacio genera succion y asi el
disolvente desgacificado empieza a bajar a la cabina de la bomba. El piston esta afuera
hasta que se llene por completo la cabina. Una vez se logra, el piston se retrae y como el
piston tiene cierre hermético, cuando se retre, el liquido no tiene posibilidad de filtrarse
sino que esta obligado a bajar.

En una bomba peristáltica tenemos dos mvtos: retracción que bombea disolvente al resto
del equipo y el de salida del pistón que provoca succión del desgacificador. Es decir que
salimos y entra disolvente, retrocedemos y bombeamos disolvente.

Si tuviéramos una sola bomba sería muy difícil mantener constante el caudal de fase móvil,
porque cuando este niño está saliendo, quien bombearía? Nadie Y provocaría una
suspensión del caudal. Que pasaría dentro de la columna? La columna dice Vengo
corriendo pero de repente dejo de sentir impulso, me detuve. El pistón vuelve a retraerse,
vuelve a empujar y sigue corriendo, esto es PULSO CROMSTOGRFICO, es la suspensión
de la continuidad de mi caudal. Entonces. La respuesta tecnológica a esto es dos bombear:
mientras una bombea, la otra retrae y de esta manera mantenemos constante el caudal. Pero
si algún día hay equilibrio? Un pistón esta retraído y el otro esta succionando, en este
momento hay equilibrio, hay riesgos de pulso y la tecnología ha hecho: como cada bomba
está bombeando su propio caudal, entonces en lugar de mandarlos independientemente
hacia la inyección, lo que hacen es reunirlos en un solo caudal.

¿ como es la relación de flujo vehicular en cuanto a la disponibilidad de área bajo transito?

Mucho mayor y es muy difícil que me quede sin flujo vehicular porque yo estoy colocando
un represamiento y asi evito la posibilidad de pulso en la zona del equilibrio.

Entonces; disolvente del reservorio al desgadificador, desgacificado va a mi bomba

peristáltica, esta bomba, bombea mi sistema por un solo canal y baja por lo que se ve (estas
tuberías soy muy frágiles y traen un implemento especial para cortar. Se corta parejo y no
se colapsa. La tubería es de 2mm.

¿Que pasa cuando quiero que un disolvente pase por una tubería que es estrecha?

La presión es una respuesta a una necesidad observada. NO ES QUE LA PRESIÓN

AUMENTE. Una tubería de 2mm echo agua y se va por cualquier lado menos por La
tubería. Esto es debe…

¿Qué fenómeno físico explica porque cuando yo quiero que un disolvente pase por una
tubería estrecha, es mas probable que succione aire a que pase el liquido? Por
COEFICIENTES DE ROZAMIENTO, lo aplicamos todos los días q caminamos

Coeficiente de rozamiento es el que se opone a la dirección que yo llevo.

Entonces cuando yo tengo una tubería estrecha y un líquido al que le marco dirección ¿ qué
pasa en la medida que yo hago que esta tubería se haga más estrecha… el rozamiento es
una fuerza de igual magnitud pero de sentido opuesto.

¿Cuándo yo siento más la influencia de rozamiento? En la medida que yo estrecho el lumen

interno de una tubería. Hay que conducirla

Llega un momento que el HPLC en donde el diámetro estrecho es tan pequeño y la

oposición tan alta, que es imposible que por gravedad simple vaya a fluir, de forma que
necesito alta presión. La presión no es una causa, es una respuesta a un efecto.

Entonces, acorde a lo observado dice tengo que meterle una presión que vaya en el mismo
sentido que yo quiero para vencer rozamiento y para vencerlo su magnitud debe ser más
alta que el rozamiento. De esa manera venzo y empujo a mi FM
Que otra cosa se va oponer a ese mvto.? Viscosidad de los líquidos. Y quien dice eso? Sus
volatilidades de solvente, su densidad cambia y por ende su masa cambia por efecto de
volumen. Por eso hablo de viscosidad, viscosidad es tensión superficial, oposición que hace
el líquido a ser penetrado, medida en que el líquido tengo mayor adhesividad
intermolecular, mas oposición tiene a ser penetrado y hará mayor viscosidad. Entonces un
líquido que tenga mayor viscosidad hará meniscos convexos y no cóncavos.

Cuando voy a mi FM, porque cuando combino agua con acetonitrilo, tengo choques de
polaridades. El acetonitrilo es volátil y el agua no es volátil, pes mucho, tiene mucha
densidad, es mucha más viscosa, de forma que cuando lo combino con él, intento hacer una
nieva fase con una nueva viscosidad y esa nueva viscosidad va enfrentarse a un coeficiente
de rozamiento de tuberías de HPLC. De ahí que cuando yo cambio la FM en composición,
cambia la exigencia de presión porque viscosidad no es lo misma.

Si yo a esto le digo meterlo en un tampón, cada vez que yo adiciono un soluto en un medio
disolvente, lo que estoy haciendo es incrementar viscosidad de ese sistema. Por eso no es lo
mismo la viscosidad de agua pura que viscosidad un tampón aunque sea la concentración
que sea y evidentemente mayor concentración, mayor viscosidad porque tengo mas soluto
en el seno de ese líquido. Es importante tener en cuenta porque así este trabajando al mismo
caudal, si trabajo con un disolvente u otro, me dirá que la presión va cambiar de forma que
si el solvente es más viscoso yo voy a tener que trabajar mas presión el caudal. Pero el
disolvente es menos viscoso, con menos presión podrá mantener ese caudal.

Instrumental-Agosto 11

¿Qué fue lo último que hablamos la vez pasada?

Los componentes de un HPLC: reservorio, desgasificador, bomba,…

¿Qué importancia tiene el reservorio de fases móviles o disolventes? R/ Contiene las fases móviles
que se van a usar durante el proceso cromatográfico

¿Qué características tienen las fases móviles que yo utilizo en HPLC?

R/altamente puro, para que no haya interferencias durante la lectura; mejor sensibilidad; se
necesita trabajar con corrientes altamente puras, para así tener un análisis claro y sea lo más
exactamente posible

Entonces en pocas palabras la necesidad de un solvente puro es para no darle complejidad al

análisis y estar seguros completamente de lo que estamos identificando corresponde exactamente
a la muestra y no a cosas que estamos manejando nosotros

Ahora la pregunta es ante un sistema de detección UV, ¿es posible que tengamos disolventes que
no generen señal? R/ si, se puede usare un disolvente que no lea a la longitud de onda en la que se
genera la señal…bien y ¿qué pasa si los componentes que ustedes necesitan analizar coinciden con
el cut off de la fase móvil? ¿Qué harían? R/ un blanco ¿y qué tal que esa señal coincida con mi
zona de retención? No se puede cambiar el método

¿Qué harían ante la necesidad de tener que trabajar con una longitud de onda en donde su
disolvente no solo genera señal sino que además la retención que muestra ese pico coincide con la
zona de retención de mi analito de interés? ¿Cómo resuelven el problema? R/ Andrés: cambiar de
disolvente de polaridad similar… por ejemplo si estamos en cromatog. En fase reversa estamos
maniatados porque no tenemos reemplazo para disolvente… Omar: eso se puede arreglar
manejando las proporciones de la fase móvil… OJO yo puedo tener una mezcla de disolventes, si
yo tengo una detección en donde cualquiera de los disolventes que posee la mezcla posee su
máximo de absorción, ¿no va a dar una señal? La señal va a ser más intensa o menos
intensa…Karla: Hacer una derivatización…Erika: Muy buena opción… ¿qué otra opción
tendríamos? Ramiro: aumentar el tiempo de retención… Si se cambia el tiempo de retención seria
mezclando la fase móvil con otro componente para disminuir la fuerza de elución ¿A qué te
refieres? Ramiro: o disminuir la velocidad de retención…o cambiar el flujo para no remover el
analito de interés (esto lo dijo entre dientes no se entendió bien… creo que dijo eso), buena
opción… ¿qué más?...

Pregunto las moléculas se absorben al UV solo tienen un estímulo de absorción? R/ no… ¿Cuál es
el comportamiento que normalmente posee? ¿En que se basa la absorción UV? R/ en el efecto
fotoeléctrico… se leen en uv por los pares de electrones libres o un electrón libres (par electrónico
que no está utilizando electrones enlazantes), son pi…CONSULTAR CRITERIOS PARA QUE SE ME
ABSORBA EN UV LA MOLECULA… hay que ver cuantos núcleos son susceptibles de ser excitados
para que se me dé la absorción… las moléculas generalmente tienen dos longitudes de onda una
máxima y otra de menor absorción, casi siempre vemos que describe un espectro como esto (?)
una montaña más alta y una montaña más baja

La otra carta bajo la manga luego de derivatizacion y cambio de flujo es trabajar en la longitud de
onda en donde no voy a tener el máximo de absorción pero mi analito esta absorbido… cuando yo
estoy trabajando en la longitud de onda de máxima absorción, esa alícuota que inyecto de esa
solución me va a generar una buena señal, pero cuando yo me desplazo a una longitud de onda
que no es de máxima de absorción sino que trabajo en la zona de una absorción menor ¿Qué
esperan que ocurra con eso? Supongamos que estos 225 nm me interfiere el agua, me interfiere el
metanol, la mayoría de los disolventes, ¿qué hago para mantener mi confiabilidad en el análisis?
R/ moverme de longitud de onda

Cuando yo me desplazo a una longitud de onda que no es de máxima de absorción sino que
trabajo en la zona de una absorción menor… disminuye o sigue igual…R/ la señal va acorde con el
cambio de la señal

El área bajo la curva resulta de la sumatoria de la fase móvil con mi analito de interés cuando
están solapados… pero cuando se hace el ejercicio de poner otra longitud de onda debe aparecer
eso (¿) y ahora sé que el área es de mi analito

Que he perdido al hacer eso? R/ sensibilidad por tanto pago la consecuencia en el límite de
detección, límite de cuantificación, en el intervalo de la curva de calibración del rango dinámico
lineal, porque si esta es la altura que me dan 100 ppm y yo voy buscando límite de cuantificación
y bajo aquí, cuando yo baje esta es la señal y ahí estaré en 50 y si sigo bajando llego a 25 y si sigo
bajando ¿podre cuantificar? No, seguro ya estoy pasando en el efecto matriz de la muestra, por
esa razón siempre se lee a la longitud de onda de máxima absorción, ya que permite trabajar
métodos más sensibles, capaz de mirar concentraciones pequeñas, pero si yo tengo que trabajar
fuera de ese máximo automáticamente se sacrifica la intensidad de esa señal y por tanto va a
llegar rápidamente en donde hay un cambio de concentración y donde ya yo empiezo a tener una
relación señal ruido muy alta que me genera bastante incertidumbre, afectándome la precisión

El entorno de la aplicación de la fase reversa es el de la salud y el del medicamento, ya que el

cuerpo se basa en agua no en soluciones orgánicas, por tanto el medicamento se basa en analitos
polares… entonces esos analitos polares no se pueden trabajar en sistemas de fases normales sino
en fase reversa, entonces en el caso de fase reversa los disolventes por excelencia son acetonitrilo,
agua y metanol, luego de ahí los siguientes compañeros tienen que ser los tampones medios
ácidos o medios básico

Adsorción: que hay una adhesión química

Absorción: que hay reacción química y ya se modifica la naturaleza original del analito, ya ese
analito químicamente hablando le llamamos artefacto ya no es eso que tengo ahí porque la
estructura original es la reacción con mi centro activo, pierde interés mi análisis porque lo que se
está cuantificando no es lo que quiero cuantificar, la longitud de onda no sabe a qué
corresponderá y el análisis se acabara, por tanto jamás la interacción debe ser una absorción y la
residencia de mi analito será demasiado larga

Necesito un analito que migre dentro de la columna pero dentro de un tiempo razonable de
análisis

Luego de nuestro paseo de bomba llegamos al inyector

Según el modelo de inyector que tengamos puede ser para 100 pocillos o para 200 pocillos

Aquí se coloca la bandeja del automuestreador, hay que tener en cuenta su numeración
sencillamente porque el software va a preguntar dónde colocaste tu vial, entonces se debe tener
claro la ubicación del vial porque luego los resultados van a estar amarrados al vial

Tener un automuestreador es lo mejor que podemos tener en la vida, no como cuando tenemos
inyectores manuales en HPLC en los que si el analista no esta se frena el análisis

Estos equipos modernos tienen una gran ventaja y es que ya no necesito estar ahí pendiente, yo lo
único que necesito es tener claro cuánto tiempo dura mi cromatografía, debo calcular cuantas
inyecciones programadas

La ventaja es que desde mi computadora en casa la puedo programar

Cada bomba de estas tiene un sensor (*lo que esta anaranjado*) son sensores de fuga, entonces
de tanto trabajar, había un repuesto que ya estaba chueco y ese día de tanto trabajar se rompe el
repuesto generando la fuga de disolvente desde cualquiera de los módulos, entonces estas
plataformas todos los módulos van al desagüe y el desagüe los conduce hacia el sensor de modo
que cuando caiga, cae justo en el sensor, prende una alarma y le manda una señal al software que
le dice apágate o te consumes.

Aquí en esta parte esta una jeringa de inyección, lo que es visible solamente es la punta de la
jeringa, de forma que si esto es una jeringa normal según el volumen que estamos programando
en el computador esta jeringa desplaza su embolo si digo 10 microlitros, se va a desplazar para
tomar 10 microlitros, en ese momento en que ya se succiona la muestra hay un brazo robótico
que se desplaza hacia al vial lo lleva hasta un asiento y llega la jeringa succiona el líquido, el brazo
robótico devuelve el vial y la jeringa vuelve a bajar, porque en la misma zona de silla donde se
coloca el vial va a esta el orificio de entrada para inyección, simplemente cuando él se quita la
jeringa entra y succiona la muestra

Hay una entrada y una salida, la salida se dirige hacia el sistema de detección

En la columna no vamos a ver ninguna diferencia entre un extremo u otro de la columna, sin
embargo el fabricante va a señalar el sentido en que debe trabajar la columna: cabeza entrada de
muestra y cola salida de muestra, ¿porque eso? Para que retenga partículas que estén
suspendidas, esa es la única misión

La altura de fase estacionaria no es de más de 1 mm

Hay muchas variables que condicionan la presión con que se está trabajando en el HPLC

La P es paulatina, constante y automático del sistema

Cuando la P se aleja mucho del valor inicial de presión decimos uy hay algún daño o una
obstrucción en la pre columna y la elusión comienza a ser turbio

En la cabeza es donde yo puedo depositar mi pre columna y en mi pre columna lo única que
vamos a hacer es filtrar ante la posibilidad de tener un precipitado indeseable, de esta manera la
mugre no me pasa a la fase estacionaria y se queda en la pre columna

La pre columna tiene una vida útil corta, una pre columna según las características de complejidad
de su muestra, según el volumen de inyección, según el número de inyecciones, así se desgasta

En la precolumna hay dos tamices entre los cuales hay fase estacionaria de la misma característica
que tiene mi columna, porque si lo cambio de naturaleza de centro activo corro el riesgo de que
interaccione con mi analito y me lo retenga, me haga la separación o haga algo que yo no quiero.
Lo interesante de estos dos núcleos es que esto es un anillo, esto es otro anillo, esto es oro (18
quilates) y esto es plata (alta pureza)

Esto que llamamos cabeza de la columna cromatográfica tiene una característica que nos va a
llevar al siguiente tema

LA COLUMNA es considerada el motor de mi cromatograma, obvio sin columna no hay nada, de

forma que los procesos cromatograficos actúan en la columna como lo habíamos dicho un sistema
cromatografico está constituido por una fase estacionaria, una fase móvil y mi analito de interés.
Entonces por procesos de afinidades intermoleculares que van a estar ocurriendo entre los
componentes de la muestra (deseables y no deseables) van a efectuarse repartos o coeficientes de
distribución de estos componentes de la muestra entre mi fase estacionaria y mi fase móvil
Cuando yo cargo mi muestra a loa columna cromatográfica, estos analitos comienzan a
interaccionar con mi centro activo, por ejemplo si yo hablo de un centro activo en fase normal yo
lo que tengo son sistemas de dióxido de sílice que forman redes muy fuertes, de forma que esto
está generando la superficie de esa pelota, pero cuando yo digo esto es fase normal entonces yo
en lugar de seguir poniendo un sistema oxigeno silicio a alto oxigeno provoco a través de una
reacción química el reemplazo de ese silicio por un sistema y me viene un grupo funcional OH, en
un sistema fase normal es a través de interacciones intramoleculares tipo sulfhidrilo y el puente de
H se establece a través de pares de electrones que no hemos utilizado para enlazar y eso lo hace a
través de una coordinación. En este sistema hay pares de electrones que no utiliza para enlazarse,
cuando entra el analito, la especie deficitaria electrónicamente hablando va a sentir la atracción y
va a interaccionar, entonces si tenemos sistemas OH es un H, suponiendo que yo tengo una
estructura como eso, entonces la estructura de mi analito de interés va a estar interaccionando a
través de la crisis deficitaria electrónicamente, porque al tener el oxígeno una elevada
electronegatividad va a generar una desprotección de forma que aunque este enlace que se
supone que es compartido la órbita es deficitaria hacia oxígeno e incrementada hacia el H debida a
su elevada electronegatividad, por tanto este sistema va a encontrarse altamente desprotegido y
por eso a este sistema le queda fácil coordinar el par electrónico y enlazar, de esta manera este
sistema de centro activo de mi fase estacionaria ha proyectado una interacción intermolecular con
mi analito y que ha hecho? Ven para acá que tú no te vas.

De este modo cuando yo pongo mi muestra en contacto con mi fase estacionaria se establece la
interacción intermolecular y en ese momento la afinidad de mi analito por su fase móvil no es
tanta y tiene más afinidad con la fase estacionaria

Cuando yo digo que siembro la muestra lo que pasa es que cuando viene una muestra con el
analito disuelto en un sistema

Si la fase móvil es cloroformo y el analito viene en sistema acuoso (Choque de polaridades), como
los sistemas no son homogéneos se presenta precipitación y queda deposición de soluto en la fase
estacionaria, si esto pasa donde yo debo de ver la señal de alerta de lo que está ocurriendo? R/ en
la presión porque hay un taponamiento, el analito debe permanece soluble si precipita y las fases
estacionarias son porosas con muchos centros activos

La fase móvil migra por los espacios interparticulares de la fase estacionaria, para poder deslizarse
a través de la columna lo hace a través de esos espacios, no por los poros porque si no se queda
ahí… por eso se necesita meter presión para que pueda pasar la fase móvil

Cuando hay choque de polaridades hay precipitación en los espacios intermoleculares, es el

espacio que debe permanecer libre para que la fase móvil atraviese la columna, si llega la fase
móvil y los espacios intermoleculares están tapados, el sistema responde aumentando la presión
porque hay precipitado oponiéndose

Cuando hay choques de polaridades, se evita evaporando a sequedad el disolvente en que disolví
la muestra y se vuelve a disolver usando otro vehículo (Eso significa RESTITUIR), si no hay choque
de polaridades no hay problemas (miscibilidad entre disolvente y fase móvil)

Entonces mii muestra se siembra y a medida en el momento que se siembra arranca mi

cromatografía y es mi tiempo 0 en el análisis, fíjense que la fase móvil suelta las interferencias aquí
y ella avanza y llega al detector y genera la línea base, mientras que salga línea base, eso indica
que lo único que está llegando es solvente, porque no hay pico si el agua absorbe? Porque
estamos trabajando a una longitud de onda que no es del agua, entonces fíjense se registra paso
de fase móvil al detector, pero no del analito, eso indica que esta estático mi analito dentro de la
columna? R/ no en la medida que me está pasando fase móvil puede ser de la misma composición
(isocratica) o distinta (en gradiente)

NOTA: NO SE REUTILIZA F MOVIL

A medida que comienza mi fase móvil a pasar provoca que comience mi coeficiente de
distribución, que en función de afinidad comenzara a distribuirse el analito y entonces hablamos
de un coeficiente de distribución

La cromatografía se basa en equilibrios que se establecen en el sistema cromatograficos, esos

equilibrios estarán en función de…

Supongamos que esta fase estacionaria va a tener la capacidad de formar puentes de H en la

interacción intermolecular, el analito tiene dos grupos funcionales afín por la fase estacionaria por
ejemplo y otros grupos que no son afín, la fase móvil para competir por ese analito NUNCA usa
enseguida un disolvente que pueda arrastrarme el analito desde aquel núcleo sino que intenta
tomarlo desde las zonas libres de interacción que tiene el analito. Si en este caso el núcleo central
es alifático o un heterociclo, que tipo de interacciones se deben propiciar con la fase móvil: Van
der Walls (interacciones más débiles, son las únicas que puede hacer un sistema de arreglos)
entonces la fase móvil debe ser de mediana a baja polaridad. En el momento que el centro activo
llega libre, vuelve a quedar ocupado por otro analito

Cuando hay más moléculas de fase móvil dentro del espacio intermolecular de la fase estacionaria,
este empieza a competir con el analito para su interacción con la fase móvil

No solo el analito se puede unir a la fase móvil, sino también los interferentes endógenos
persistentes y el analito siguen retenido, se agrega fase móvil, se trasportan interferentes y el
analito retenido, se ha limpiado de contaminante y quedo el analito, entonces se quiere sacar
rápidamente al analito entonces se debe cambiar la fase móvil por una que sea más competitiva,
se le dan atributos para que la molécula siente más atracción y la fase móvil pueda dirigir más
puntos , entonces Pueden haber todos los centros activos que quieran pero el analito no va a
sentir atracción por él, en este momento mi coeficiente de distribución va hacia mi fase móvil y el
analito sale de ahí muy rápidamente

Que hice para darle más competitividad a la fase móvil? Se agregó un disolvente que pueda
arrastrar otros puntos funcionales con la polaridad (aumentar fuerza elutropica)

El fenómeno de la cromatografía se basa en conquistas

En realidad el sistema cromatografico se da en millones de moléculas

Necesito que mi analito tienda a interacción con los centros activos de mi fase estacionaria, para
que se pueda ir separando del contaminante
Pero si yo bien necesito esto yo no puedo permitirle al analito que se quede todo el tiempo en la
fase estacionaria… porque viene el fenómeno de la difusión longitudinal y en la difusión
longitudinal lo que ocurre es lo indeseable en la cromatografía es que si yo tengo 10 analitos y no
hay condición adecuada se quedan en distintas zonas generando una banda ancha (dispersión)

Lo que yo quiero en cromatografía es tener zonas de concentración y deseamos evitar zonas de

dispersión

Cuando yo tengo un disolvente al que le cuesta mucho sacar el analito de la columna, ese
disolvente tiene baja fuerza elutropica

No se puede decir que se baje o que se suba la polaridad, porque eso depende de la fase
estacionaria, entonces si yo quiero decir auméntale la polaridad eso no equivale a auméntale la
fuerza elutropica, porque si yo estoy en fase reversa y no en fase reversa y no en fase normal
aumentar la polaridad es bajar la fuerza elutropica

El analista de lo que debe tener más atención es lo siguiente:

Si yo tengo una molécula, ustedes recordaran que cuando hablamos de la polaridad de una
molécula nunca decimos que es totalmente polar o apolar, porque está definido en momentos, si
yo dijera que tengo una molécula como esta:

Ustedes elegirían una fase estacionaria polar como la fase normal para la separación de esa
molécula? R/ No, porque se harían fuerzas de atracción difíciles de romper: por puentes de H

El O va a hacer puentes de H y el Cl (3 pares electrónicos y altamente electronegativos) va a

intentar interaccionar

Esa molécula va a intentar hacer puentes de H por todos lados

Lo único viable son los sistemas pi deslocalizados quienes sufren un apantallamiento por los
grupos funcionales de forma q es muy poco probable que logren ese tipo de interaccione, de
forma que esa molécula es polar y si la fase estacionaria es polar puede haber una absorción y con
ello provoca una reacción química que no se puede reverter y no habría separación

Quien condiciona que se establezca puente de H es la electronegatividad

Porque necesito compactación en la columna

Cuando yo inyecto muestra en que vehículo va? R/ F móvil, osea en un líquido y este analito al
igual que sus interferentes va ávido de interaccionar con su fase estacionaria, de forma que ellos
buscan dispersarse

El volumen que usa el analito y sus interferentes debe ser la mínima cantidad de fase estacionaria
posible para anclarse, porque lo q me queda libre es aprovechado para formar un gradiente de
migraciones entre mis contaminantes y el analito

OJO DEBATE DEL JUEVES: BASE

Esta es mi columna, esto es mi cabeza y esta es mi cola… ¿Dónde siembro mi muestra? R/en la
cabeza, aquí hay analitos mas interferentes, cuando yo inyecto mi muestra, esos analitos siempre
intentan correr y anclarse a los centros activos, si tengo bajo caudal en la fase móvil ¿Qué está
ocurriendo? Esto es mi columna, además esta es mi partícula pequeñísima 3 micras o 5 micras (lo
cual significa estrechos espacios interparticulares) físicamente estoy tapando todas las zonas que
me hacen el soporte de acero inoxidable de esa columna que me ofrece coeficiente de
rozamiento, ósea si mi fase móvil pretende ir de este extremo a este extremo, el coeficiente de
rozamiento esta de aquí para allá. Si encima esa nena es viscosa, ¿Qué significa? Que más lento va
a moverse, entonces para compensarlo se ejerce más presión, pero se sigue oponiendo el
rozamiento por los espacios intermoleculares tan estrechos (tengo entonces rozamiento por el
soporte de acero y por los espacios intermoleculares). ¿Entonces que está ocurriendo? Que
cuando yo inyecto mi muestra si el caudal al que yo estoy inyectando esa muestra no es el mejor
que ocurre? A esa fase móvil le va a costar mucho tiempo poder avanzar, agregando el
rozamiento; esa lentitud de bajo caudal provoca una dispersión de la carga de la muestra

Y que traduce una dispersión en la cabeza de la columna? Traduce que deseando yo que la
muestra cuando se siembre use la menor cantidad de centro activo de fase estacionaria bajo la
condición de bajo caudal que tengo, termina usando el doble y hasta el triple

Y porque yo quiero que use la menor cantidad de fase estacionaria? Porque ahora todo ese centro
activo es el que voy a usar para generar la diferencia del analito que yo quiero que se separe

Cuando la muestra se me dispersa demasiada, me queda poca fase estacionaria, y me queda poco
espacio para que la fase estacionara se dé cuenta de la diferencia entre el interferente y el analito
y va a pasar un solapamiento

Cuando mi analito y mi interferente comienzan a dispersarse, es como tener conjunto en la

interacción de conjuntos (INTERSECCION)

Entonces, Si un pico cromatografico está definido por el área de un triángulo, entonces esto
proyectado hacia acá y esto proyectado hacia acá y teniendo en cuenta que esto es mi línea base,
me dice que esto es la zona de contaminación, ¿Qué me está diciendo implícitamente? R/ ojo que
durante esa preparación tuviste una zona mezclada de moléculas de analito e interferentes y
cuando llegaron y llegaron mezcladas

En una situación de estas no puedo asumir que es un área bajo la curva, porque desconozco la
sensibilidad y le puedo atribuir a mi analito señal que no le corresponde
Entonces ¿Qué hace mi fabricante de columna para ayudarme? R/ él me dice tranquila vamos a un
quite (no claro en el audio) al proceso de la dispersión, con presión. Mi fase estacionaria es la
misma a través de la columna y para que trabaje debe estar compactada a altas presiones,
entonces cuando el fabricante la está compactando en la zona que él define de cabeza le mete
más presión y la compacta a mayor capacidad para impedir que la muestra cuando entra siempre
se esté dispersando, de esa manera logro que el volumen que inyecto solo use una mínima
cantidad posible

Que dirán ustedes si producto de la compactación, de la viscosidad, de la composición, del caudal;

mi equipo tiene que trabajar 3600 PSI y el límite máximo de todas la columna es 4000 PSI y la
mayoría de las bombas logran trabajar hasta 6000, osea 4000 va a ser lo máximo que yo le permita
trabajar al equipo porque si no daño mi columna, que dirán ustedes si yo les digo ojo que cuando
esta fase móvil llega al detector y este solo soporta 40 PSI? Mi problema como provoco yo la caída
de presión de 3600 a 40? ¿Cómo los desaparezco si mi fase estacionaria es la misma y la columna
no cambia?

La razón de ser de la alta presión es la obstrucción que genera la fase estacionaria, los espacios
intermoleculares están estrechos y me obligan a trabajar en alta P

La longitud que conecta mi columna del detector debe estar estandarizada y optimizada

La presión a la que se bombea la fase móvil, es solo para vencer el inicio, luego que está dentro de
la columna, el flujo de bombeo es constante, pero la P disminuye porque empieza a vencerse el
coeficiente de rozamiento de la fase estacionaria y porque empieza a vencerse el coeficiente de
rozamiento? Porque se satura la fase estacionaria con fase móvil. Cuando yo meto fase móvil a
una columna la P es solo de ingreso y una vez dentro, la P empieza a caer porque yo tengo
saturado el lecho de fase estacionaria con fase móvil.

Nunca se carga una muestra sin antes haber saturado la columna y siempre lo hacemos a
bajísimos caudales, 0.1, 0.2; según la viscosidad que nos permita. Nunca lo hacemos a alto caudal,
porque cuando yo lo hago a bajo caudal la fase móvil va a entrando tan lentamente que puede
perfectamente inundar todos los surcos de fase estacionaria

Está demostrado que altos diámetros generan altas dispersiones de forma que e te vas a dar
cuenta que en analítica todas las columnas tienen el mismo diámetro de 4.6.

Agosto16
¿Qué es un Plato teórico?
Marcela: Es el equilibrio que hay entre la fase móvil y la fase estacionaria. Es la cantidad
de molécula que está separadas y no hay movilidad.
Ramiro: ella dice que es el equilibrio entre fase móvil y fase estacionaria y la medida
cuantitativa de la eficiencia se da en los platos teóricos. Entonces la eficiencia se
relaciona con la capacidad que tiene la fase móvil de interactuar con la fase estacionaria.
…Charlas de vida con erika…
Lo que han dicho es falso…
Andrés: lo que han dicho que los platos teóricos son el equilibrio entre la fase estacionaria
y fase móvil, pero lo que hace el plato teórico es medir la eficiencia de nuestra fase
estacionaria con respecto a la molécula que pueden separar.
Ramiro: Plato teórico es la medida de la eficiencia cromatográfica de la columna y se mide
en relación con el tiempo de retención de la columna y a la altura del pico
…
AHORA SI:

Esto me dice? MAyerlis: la forma de interacción de fase estacionaria con el analito.

Miren generalmente el analito va a estar interaccionando con la fase estacionaria con un
tipo de interacción distinto al que utiliza para interaccionar con su fase móvil.
Entonces si yo estoy trabajando por ejemplo una interacción polar a nivel de lo que sería
la cromatografía de fase normal por ejemplo, entonces para poder reverter mi analito,
debo utilizar una interacción van der Waals (bajas polaridades), transferencia de carga,
dispersión dipolo-dipolo inducido, electrones pi deslocalizados. La fase normal trabaja con
disolventes de baja polaridad, con lo cual un solvente de baja polaridad jamás me va a
hacer una interacción polar ni de puentes de H ni sistemas iónicos.
Entonces lo que se muestra aquí son las diferentes formas de interacciones
intermoleculares que mi analito va a estar utilizando para interaccionar con FEstacionaria
y Fmovil:
Recuerden la K de distribución, cuando yo hablo de ella estoy hablando de equilibrio,
osea siempre estamos jugando entre fase estacionaria y fase móvil y por eso se genera
un coeficiente de distribución o de reparto.
Evidentemente hay unas interacciones que son más fuertes y por tanto reverterlas nos va
a tomar más compromiso de la fase móvil y nos va a requerir trabajar con altos caudales
para ayudar a revertirla.
¿Qué es el tiempo de retención inerte?*
En cromatografía nunca puedo meter muestra en la columna sin antes haberla saturado
con mi fase móvil. Debe ser fase móvil porque si no se genera un choque de polaridades.
Cuando hablo de saturar: en la columna hago bombear con fase móvil a un caudal lento,
sino hago esto mi muestra no se desplaza porque la muestra viene cargada en un
vehículo de FM si mi fase estacionaria esta seca usa el disolvente como un agente de
hidratación y se da una quimio absorción /reacción química, no interacción de largo
alcance). Estas son las consecuencias que puedo tener sino saturo mi columna.
Cuando yo cargo mi muestra, previamente mi columna la he saturado en mi disolvente. Si
yo estuviera registrando con el detector en ese momento, lo que vería es una línea base,
entonces cuando mi muestra llega yo la inyecto en mi columna ella se ubica allí.
Entonces a punta de hacer bombear nueva fase móvil (acuérdense que la FM entra pasa
al detector y llega a desechos), la muestra queda bombeada y OJO mi fase móvil sigue de
largo va al detector y se genera mi señal de línea base

Eso significa que la fuerza elutropica de la fase móvil no tiene capacidad de provocar la
elución de mi analito de interés y eso es CLAVE, porque yo necesito que cuando la
muestra entre a la columna no salga enseguida, yo necesito colocar condiciones para que
mi analito comience a distribuirse con una fase estacionaria y después con una fase
móvil, pero si yo desde el principio utilizase una fase móvil que desde el primer instante
me saca la muestra y la lleve al detector, no va a pasar nada (fuerza elutropica demasiado
alta: ha usado componentes cromatograficos inapropiados para hacer la elución de la
muestra).
¿Entonces quien me dice a mi cual es el componente adecuado de fase estacionaria y de
fase móvil para mi muestra? R/ Pues la naturaleza del analito que tengo determinado, si el
analito es polar, ya yo sé que las interacciones que él va a intentar establecer son
polares, con lo cual si le coloco una fase estacionaria polar él va a hacer quimio absorción
porque lo igual disuelve en lo igual.
Entonces en la medida que yo sigo pasando fase móvil y esa fase móvil va seguir
teniendo capacidad de moverme los componentes de la muestra en la medida en que ella
va a travesando la columna, se alcanza a ver un gradiente de migración: se dan cuenta
que todos los componentes de la muestra no viajan a la misma velocidad sino que va a
ser más rápido, otro medio y otro más lento de salir y eso que me define las afinidades, el
que primero sale: menos afinidad por fase estacionaria y más con fase móvil, y así
sucesivamente. Esto quiere decir que para un cromatografista la buena elección de FM y
FE es la que determina el ÉXITO de la separación.

Entonces por lo tanto cuando tengo esto:

A lo que yo
llamo cromatograma, en donde en abscisa reflejo el tiempo en que se registra la señal
analítica y en ordenada la señal analítica (respuesta instrumental), en un cromatograma
tengo la respuesta instrumental de mi analito en el pico de un cromatograma.
¿Qué es un tiempo neto de retención?*
OJO hay dos tiempos: tiempo muerto y tiempo de retención
El tiempo cero del inicio de un cromatograma lo determina: el punto en el que se inyecta y
arranca el sistema, eso es automático, lo hace el equipo. El tiempo cero se asume como
el tiempo de inyección de la muestra.
Luego hay un tiempo desde que llega hasta que genera esta señal (la pequeñita que esta
entre 2 y 4), esta señal no es constante
Que no sea constante se refiere a que del hecho de que mis componentes y las purezas
de mi fase móvil yo puedo tener ese comportamiento así o así:

Mientras más picos haya en esa zona me quiere decir que más impura, contaminada esta
mi fase móvil, lo que me importa a mí que ese tiempo que se da ahí es el que está
generando mi fase móvil al salir de mi columna
Un tiempo muerto entonces significa el tiempo que le está tomando a mi fase móvil
bajo sus condiciones de viscosidad y de caudal en atravesar a la columna
Mi FE tiene espacios de 3.5 micras que tienen móviles en los que pasa la FM
Cualquier señal analítica que sale en el tiempo muerto dice que cambies la fuerza
elutropica o el caudal, porque algo que sale en el tiempo muerto es algo que no ha
logrado establecer interacciones intermoleculares con la FE
Cuando mi FM entra en mi columna me toma casi 3 min hasta que se aparece
El alto caudal me lo limita la presión
Con líquidos viscosos la limitación de caudal es chiquita, porque es obvio que a alta
viscosidad llego a los límites de presión
Pero cuando yo hablo de solventes orgánicos, por ejemplo cuando uso los menos
volátiles, son menos viscosos; cuando hablo de hexano (más volátil) en mucho menos
viscoso
Más volatilidad significa mayor adherencia, menos tensión superficial, más facilidad de ser
penetrado, con lo cual mi FM móvil tiende a vencer con más rapidez esa fuerza de
rozamiento
Cuando yo estoy hablando del tiempo muerto estoy diciendo ten en cuenta que para que
la FM salga de la columna y llegue al detector no es una cosa instantánea, hay un
recorrido. Lo que me cuenta el tiempo muerto me cuenta que tan pesado o sencillo es el
recorrido.
Si es sencillo es que los espacios interparticulares son más grandes, solvente volátiles
con baja polaridad y alto caudal. Contra eso: viscosidad o bajo caudal.
Una columna cromatográfica no tendrá un único tiempo muerto sino que depende de mis
condiciones cromatográfica.
Cuando se satura la columna tú no enciendes tu detector
Las teorías dicen este tiempo muerto es igual a un volumen de fase móvil que ha pasado
por la columna que ha rellenado tubería que conduce de la columna al detector y que se
considera que es de saturación del sistema, no se considera que participe en la
separación cromatográfica, porque salga muestra o no salga muestra este volumen no
tiene que volver a su retorno.
TIEMPO DE RETENCION NETO
Es el tiempo que se registra a partir del tiempo muerto hasta que se registra la señal de
máxima de absorción del analito que se está analizando
Es el tiempo que le toma a mi analito a partir del tiempo muerto hasta el tiempo en que se
genera su máxima absorción.
Tiempo de retención Total es el que incluye al tiempo muerto

Y como hay un pico cromatográfica estamos hablando de un área bajo la curva, Entonces:
El área bajo la curva del pico cromatografico, sencillamente es el área que se ubica
debajo de la campana gausseana que se genera cuando el analito llega al sistema
de detección, hablamos de un área porque desde que llega las primeras moléculas
al detector hasta que sale la última molécula se genera lo que llamamos una
ventana de retención.
El área bajo la curva está directamente relacionada con la concentración analítica que
estamos determinando
El área bajo la curva describe la respuesta instrumental que está generando mi analito
desde que la primera molécula llega al sistema de detección hasta que la última molécula
del sale del sistema de detección, lo cual va a describir una ventana de retención
analítica. ¿Que describe entonces la multiplicación de base por la altura? R/ el máximo de
absorción, la base es la ventana de retención y la altura es el máximo, el punto máximo
de lectura.
El ABC es directamente proporcional a la concentración bajo las mismas condiciones de
análisis
El tiempo de retención específico lo arroja el equipo
COEFICIENTE DE DISTRIBUCION
OMAR: Es cuando el analito se encuentra repartido entre dos fases. Ejemplo en dos
solventes inmiscibles entre si y que el analito se solubiliza en ambos y el coeficiente de
distribución me indica el reparto del analito en esas sustancias.
PAOLA: nos va a indica la cantidad de analito que se va a repartir en las FE y FM
teniendo en cuenta la afinidad que tenga con estas.
ERIKA contextualicemos entonces: si yo tengo un analito con más afinidad con la FE que
con la FM que tiempo de retención espero? ALTO y de lo contrario BAJO y si tengo un
analito con adecuado reparto y movido a bajo caudal, lo que espero es que se demore
(tiempo de retención alto). Entonces el coeficiente de distribución lo que está mirando es:
cuando entra 1 muestra, entran 10 componentes de la muestra ¿Qué hace el coeficiente
de distribución? R/ me indica de acuerdo a las características de mi analito cuál será su
afinidad con FM y FE
¿Qué hace que el sistema cromatografico se dé cuenta que en esa muestra habían 10
compuestos? Según el coeficiente de distribución o el reparto R/ la FE va a tener diferente
polaridad que mi FM y eso va a hacer que mi analito tenga cierta afinidad por la FE mayor
o menor a la de la FM teniendo en cuenta la naturaleza del analito y se va quedar más o
menos retenido en FE generando un mayor o menor tiempo de retención y se llama
gradiente de migración. OJO la FE y FM se dieron cuenta de que la estructura base de los
10 compuestos aunque sea la misma tienen distintos grupos funcionales, provocando que
se establezcan más o menos interacciones intermoleculares.
Entonces la distribución viene definida en los tiempos de retención, de modo que yo tengo
un valor específico donde debo estar moviéndome
Por eso en cromatografía liquida podemos tener separaciones de distintos componentes
con la misma base molecular, porque las pequeñas diferencias son capaces de ser
detectadas por el sistema: FACTOR SELECTIVIDAD: mi FE y FM retienen selectivamente
a uno con respecto a otros
Entonces allí van los números de platos teóricos
Plato teórico:
EJEMPLO CON PERSONAS
Esto es FM… Esto FE… ellas moléculas idénticas… lo que hace que allá más o menos
moléculas me lo define la concentración y el volumen de inyección (cuando hablo de
equilibrio químico no hablo de una molécula sino millones que van en función de
concentración y volumen de inyección). Esas moléculas idénticas tienen capaz de ejercer
las mismas interacciones, suponga que ella representa varias moléculas, cuando ella
llega aquí transportada por su FM y encuentra una FE, si yo elegí bien la FM va a tener
menos interacciones con su FM y va a tener más interacción con su FE, de modo que se
va a quedar ahí, ¿qué pasa? ella es una molécula espacial y aquí hay partículas esféricas
(espacios interparticulares) y ella pasa por esos espacios donde encuentra un sitio activo
y la FM pasa al detector a generar la línea base
Plato teórico: es el equilibrio que establece las moléculas de mi analito con mi
sistema cromatografico, además me dice que es un intervalo porque tengo muchas
moléculas que harán lo mismo con lo cual me siguen quedando moléculas que
seguirán entrando por aquí y seguirán interaccionando hasta que pasen todas.
Cuando todas lo hayan hecho me tome una distancia y Por eso en el plato teórico
hablamos de una altura (porque se genera un ancho de plato teórico o vam deemter lo
llama altura de plato teorico)
FM muy viscosa y bajo caudal hace que mis moléculas pasen muy lento, lo cual dificulta
que se dé el equilibrio, por lo cual la velocidad con la que la última molécula se ubica no
es igual a la de la primera, generando un gradiente de velocidad con que fue
restableciendo los equilibrios de la molécula y a eso van deemter me lo llama coeficiente
de dispersión. Hay mucha dispersión por la FM inadecuada y caudal, lo cual…

ha provocado que el tiempo cero en que la primera se retuvo hasta el tiempo n en que la
última lo hizo es muy alto  no es eficiente, porque la eficiencia habla de hacer los
equilibrios en el mínimo tiempo posible. Porque si se dice que mil moléculas deben
interaccionar en el mínimo tiempo posible, se está diciendo que la velocidad con que la
primera se retiene respecto a la última es baja  esto es eficiencia, se necesita que se
mueven todas al mismo tiempo, no va a poderse porque el contacto de la masa de la una
con la otra obviamente lo va a impedir, pero luego de esto no hay más nada que lo impida.
Esto es importante porque en la columna se necesita centro activo, FE libre para seguir
estableciendo equilibrio, se necesita seguir estableciendo equilibrio porque en la columna
se tienen 10 tipos de compuestos en los que la FE y la FM están enredadas, ellas solo han
interactuado con todo lo que se les ha pegado, en este momento no diferencian si tiene Cl,
OH...empiezan a diferenciar es en el momento en que empiezan a moverse y en este
momento (menos bulto más claro) la columna empieza a darse cuenta de los grupos que
están presentes y con cuales interaccionaría mejor.
Cuando se siembra una muestra, esta todo un mundo interaccionando…si se habla de un
solo analito a ese número equis de moléculas le toma una cantidad equis de centros activos
interaccionar por completo, ¿Qué se necesita? Se necesita seguir teniendo FE libre para
seguir interaccionando y que lentamente mi FM y FE se den cuenta de cuál es el analito y
cual la interferencia (en la medida en que se sigue migrando y se sigue estableciendo sola
con él se empieza a dar cuenta de sus cualidades).

Ejemplo:
 Se tiene un hombre super wao y hay 300 fanáticas de él que en cuanto se abra la puerta
van a tratar de interaccionar con él, con 300 compitiendo no habrá tiempo; si las 300
llegan saturan al tipo y le da ganas de salir corriendo, es posible que entre las 300 haya
una que sea el amor de su vida…lo que se esperaría es que cuando se quiera llegar a
donde ese hombre las posibles candidatas sean menos para que se tenga más tiempo de
interaccionar con el hombre para poderle mostrar la personalidad que se tiene.  esto
le pasa a la muestra  la muestra son las 300 mujeres y el hombre es la FE que está
saturada, en este momento no se puede hablar de factor de selectividad porque están
aguantadas todas al mismo tiempo, pero gracias a que se tienen muchos hombres que
son la FE y además se tienen otros hombres peleándose por mí que son la FM, entonces
en la medida en que se empiezan a mover ¿Qué se está diciendo? Que unas se quedan y
otras se siguen moviendo y se salen (unas se fracturaron el tobillo...) hasta que
solamente quedan 3 analitos que son similares en sus propiedades fisicoquímicas, ya se
necesita que la FM deje interaccionar bien para demostrarle que tengo un OH que ella
no lo tiene de forma que cuando interaccione con la FE se dé cuenta que hay más
afinidad entre él y yo, que lo que puede haber entre ella y él porque es una fase en
reversa y aquel niño es una fase polar.
¿Qué ocurre?
Cuando están al principio las 300 mujeres detrás del tipo ¿Qué se tiene? Un gran
ensanchamiento porque se saturo a la FE y se tiene una elevada dispersión, en este
momento el plato teórico es alto porque desde que interacciono la primera y la última ha
pasado mucho tiempo (hay mucha altura)  esto es malo porque si somos 300 y el tiempo
que se tiene para interaccionar con el hombre son 2horas, yo tengo pocas posibilidades. 
entonces las 2horas que se tienen para interaccionar con el hombre se traducen en la
columna a la longitud de FE libre que siguen teniendo el grupo de moléculas para seguir
estableciendo las interacciones. ¿Dónde tiene la mujer más posibilidades de interaccionar
con el hombre? Mientras más tiempo tenga para compartir con él. ¿Dónde tienen más
oportunidad este tipo de moléculas de diferenciarse entre sí? Mientras más FE tengan libre
dentro de la columna.
Se dice que las columnas más largas son las más eficientes  se ha establecido que el
diámetro de las columnas debe ser constante (4,6cm); porque se podría decir que se
necesita cargar bastante FE y se podría compensar diámetro de columna con longitud de
columna  se ha demostrado que cuando el diámetro de la columna se hace más ancho la
dispersión es terrible porque hay demasiada área superficial, de forma que…imagínense, es
como si se tuviese el auditorio de la salud para graduar a 4 estudiantes y se les dijera que se
ubicasen en cualquier sitio  me tomaría tiempo ubicarlos donde están porque hay
demasiada área donde ellos pudieron distribuirse  esto pasa cuando se tienen columnas
de demasiado diámetro, cuando se tienen un analito con baja concentración, él tiene tantos
sitios donde distribuirse que se genera un factor de dilución de demasiado de mil platos
teóricos  y este factor de dilución tan elevado de platos teóricos impide que se tenga un
pico con una buena zona de concentración.
Entre más alto el plato teórico se tienen más dispersión  mientras más alto significa que
se ha consumido demasiada FE de la columna para establecer un primer equilibrio, con lo
cual se ha bajado la eficiencia.
Si se tienen 300 mujeres, se tienen demasiadas mujeres con respecto al hombre  el
hombre se satura rápidamente  la opción que se tiene para poder seguir reteniéndolas es
proporcionarles más hombres (FE)  esto quiere decir que las 300 van a requerir
demasiada FE para establecer su equilibrio.  Elevada dispersión. Mientras más FE se
consume colocándoles a esas mujeres, ¿Qué merma? FE libre para que empiecen a
diferenciarse que hay 300 mujeres y no una; porque 300 mujeres tienen que establecer sus
equilibrios ellas, recuerden: serian 300 tipos de analito diferentes y cada analito va a tener
un numero de Avogadro de moléculas  se necesita que cada uno de esos analito empiecen
a establecer sus propios equilibrios y además a diferenciarse, a distanciarse de las otras
moléculas  se requiere mucha FE para hacer esto.
Entre menor sea el tamaño de partículas se aumenta el número de platos teóricos  son
más eficientes si se habla de un diámetro y una longitud constante.
El número de plato teórico describe los sitios de equilibrio que van teniendo las moléculas
de un mismo analito, de modo que, cuando se tienen muestras con elevada complejidad con
muchos interferentes o se quieren identificar analito simultáneamente es muy critica la
selección de la columna porque si se eligen columnas con tamaño de partículas grandes,
ellas van a tener menos eficiencia que columnas con tamaño de partículas más pequeñas
porque cuando se disminuye el tamaño de la partícula se incrementa área de superficie y la
superficie tiene que estar funcionalizada con el centro activo  de modo que cuando se
reduce tamaño de partículas se incrementa el área superficial y por tanto se incrementan los
centros activos, por eso es que son más eficientes estas columnas.
Cuando se van a separar muestras complejas y el análisis de desarrollo es multiclase se
hace con columnas largas de 25cm no de 10 0 15cm.
El plato teórico es el sitio de equilibrio que se va dando.
Cuando un primer grupo de moléculas (hablando de una especie analítica), llegan y
establecen su equilibrio  sigue pasando más FM, la cual empieza a interaccionar con el
analito y lo arrastra  para arrastrarlo lo que está haciendo es desplazándolo de sitio  y
lo saca hacia centros activos que no tenían interacción con nada, o sea, que estaban
disponibles  de esta manera el analito empieza a trasladarse de una zona a la siguiente
hasta que sale de la columna.  Esto quiere decir que un grupo de moléculas establecen
muchos equilibrios antes de salir de la columna. Y por normatividad en la cromatografía
liquida un analito que se considere bien retenido debe tener al menos mil platos teóricos
antes de salir de la columna; es decir, que al menos deben haber mil platos teóricos para
considerarse que ha habido suficiente interacciones en el sistema. Dato clave!

Cuando se tiene una columna cromatografica y estas son las moléculas del analito que esta
interaccionando  lo que se está esperando…
Se tiene un plato teórico que ha dispuesto todas las moléculas de un mismo analito, cuando
pinte menos moléculas al frente de la banda cromatografica lo que quiero decir es que el
siguiente concepto del plato teórico son las zonas de gradiente de concentración.
Cuando se está hablando de plato teórico se está hablando que desde el momento en que se
disponen las primeras al que se disponen las ultimas, se gana altura del plato teórico  esta
altura del plato teórico me está diciendo ojo porque vienen dos zonas de concentración
claramente establecidas en un plato teórico, una zona de baja concentración y una zona de
mayor concentración hasta llegar a una zona de alta concentración para volver a salir a una
zona de menor concentración y una zona de mayor dilución.
Cuando se tiene un analito que está bajando por una sola columna delante de este hay FM y
detrás también hay FM que está entrando que está en sentido que va al sistema de
detección.  Se dice que cuando se habla de las primeras partículas que están retenidas en
la columna, estas partículas ¿Qué tienen delante de ellas? FE saturada con FM, ¿en qué
proporción encontramos moléculas del soluto de mi analito con respecto a moléculas de
FM? Hay muchas menos del analito de interés que de la FM  esto hace que se diga que
en esta primera zona hay una zona de alta dilución por la relación de la proporción que
encontramos de moléculas de FM con respecto a moléculas de analito.
En la medida que nos hemos internado dentro del plato teórico encontramos que cada vez
van a haber más y más moléculas porque cuando se tienen espacios interparticulares la FM
para permear a la FE lo que utiliza son esos pequeños espacios interparticulares, pero a la
vez estos espacios interparticulares empiezan a estar obstruidos por el analito que esta
interaccionando, o sea, que cada vez se estrecha más.  Esto es lo que provoca que llegue
un momento en que las moléculas no siguen atravesando porque encuentran más y más
obstrucciones y provoca que empiecen a represarse las moléculas. En la medida que siguen
llegando empiezan a encontrar, hasta que se deja de inyectar…pasa el último volumen de
muestra y va llegando con mayor factor de dilución porque encontró una FM nueva que
está entrando y ocurre aquí la misma proporcionalidad de moléculas que ocurre allá. 
Esto hace que se diga que en esta zona hay también otro factor de dilución.
Esto es importante porque se va a entender que cuando se llega al sistema de detección,
¿Qué es lo primero que está entrando?, cuando la FM sale y va entrando al sistema de
detección ¿está aportando analito en este momento? No  me da la línea base y se genera
el tiempo muerto; se sigue generando línea base. ¿Cuándo deja de generar línea base?
Cuando la primera banda se ha deslizado suficientemente y ahora no se encuentra en el
principio de la columna sino al final de la columna (de arriba hacia abajo); es decir, ya está
llegando al sistema de detección.  Cuando llega al sistema de detección lo que se venía
leyendo era línea base. Cuando llega entonces el analito al sistema de detección ¿Qué llega
primero? Una zona diluida, por eso es que lentamente se va generando la elevación de la
línea base.  Llegan las primeras partículas del analito, hacen una absorción y empiezan a
generar señal, por esto se eleva la línea base. ¿Por qué se sigue elevando? Porque cuando ya
paso la primera zona el sistema de detección, ¿Qué le sigue? Una zona que cada vez es más
concentrada en analito de interés; o sea, es lo que explica que la línea siga elevándose;
¿hasta cuándo se va a elevar? Cuando ya pasa esta zona, ¿Qué sigue? La zona de la máxima
concentración  aquí lo que sucede es que en ese momento ella está recibiendo el mayor
número de moléculas por unidad de volumen que puede encontrar; o sea, en ese momento
está recibiendo la mayor concentración en la celda del sistema de detección  esto provoca
el máximo de absorción. ¿Cuánto tiempo va a durar el máximo de absorción? Según la
altura que tenga la zona de máxima concentración.  Una vez sale de allí, ¿hacia dónde
va? Otra vez a una zona de concentración pero con respecto a la anterior es menor  por
eso no sigue subiendo sino que ahora cae porque ahora son menos moléculas que están
dando respuesta instrumental. ¿En qué medida va a caer? Va a seguir cayendo en la medida
en que sale de la zona de alta concentración y cada vez se aproxima a las de menor
concentración. Su caída es exponencial hasta que ya lo que llega a aparecer en el sistema de
detección es la FM y en este momento se recupera la línea base  Por eso en el sistema de
cromatografía liquida la respuesta instrumental…hablamos de intervalo de retención
porque las moléculas no llegaron todas en tropel al detector, no llegaron todas al mismo
tiempo al detector. Porque durante su separación en la columna ellas sufren un factor de
dilución que lo describe la ecuación Van Deemter y que es necesario para que ellas puedan
seguir moviéndose dentro de la columna, de modo que, si recordamos que las celdas de
detección tienen un volumen limitado, entonces es fácil de entender que la celda de
detección no es capaz de contener de una vez todo el volumen en que el analito fue diluido
a través de su separación  por eso tiene que llegar, ir bajando y vaciando y se genera el
sistema.
Hay autores que definen el plato teórico como un sándwich: se tiene zona de baja
concentración, alta concentración y baja concentración, y es lo que delimita que se recupere
la línea base.
¿Como el analito está distribuido de tal forma en la columna, afectaría la cuantificación del
analito porque solamente se está teniendo en cuenta el área donde hay mayor
concentración? Jamás y nunca, porque cuando se lee la respuesta instrumental se lee el área
bajo la curva, se lee todo; esto es lo que se correlaciona con la inyección y concentración.
No se cuantifica teniendo en cuenta solamente el tiempo de retención se cuantifica con el
área bajo la curva.

Cuando se habla de la eficiencia cromatografica, si bien la columna cromatografica está

condicionada por la columna, el tamaño de partícula, por la FE y condiciones de la FM 
no se puede decir que cuando se tiene una columna equis movida con un sistema de FM ye
entonces los platos teóricos que se me describen son constantes, esto es FALSO, porque el
plato teórico lo está definiendo también un analito de interés y por el factor de selectividad
se sabe que todos los analito de interés no se van a mover en la columna a la misma
velocidad  por eso el número de plato teórico se establece como un:

( )

Esto significa que bajo una misma condición cromatografica pero en presencia de un
análisis multianalito o multiclase…se pueden tener diferentes descriptores de platos
teóricos.

N1, N2 y N3; ¿Qué significa?

Si se tienen tres picos cromatograficos significarán tres tipos de especies analíticas, el
factor de selectividad me lo está diciendo y la diferencia de tiempos de retención también
me lo está diciendo.  Si eso me está diciendo que los equilibrios que establece el primer
pico lo hacen en su momento y así sucesivamente…y son diferentes entre sí.  Quiere
decir que cuando se aplica la formula el tiempo de retención es diferente y por tanto N
también lo será. Conclusión: bajo una misma condición cromatografica se puede tener la
separación analítica de todos los componentes utilizando una eficiencia cromatografica
distinta según la característica del analito que se quiera separar.

Eficiencia y selectividad no son las mismas cosas, que se tenga eficiencia no quiere decir
que haya selectividad.
Los tiempos de retención y eficiencia son individuales.

Una forma sencilla de relacionar la eficiencia cromatografica es:

Si se tiene una longitud de columna específica y un cálculo de platos teóricos realizados a

través de los datos del cromatograma, se puede calcular H; lo que nunca se podrá es
calcular directamente a H utilizando directamente la formula anterior.

Cuando se tiene una línea base así…se tienen problemas para describir allí el ancho de la
base, porque si los fuese a describir lo lógico sería proyectar el triángulo y en ese momento
diría que el ancho de la base es este (¿?), ¿Cómo estoy segura de que eso pasa así? Las
elevaciones de bad Graw que se están dando, me está hablando de interferentes que se están
metiendo en la zona de absorción.  Si no se puede trabajar con el ancho de base no se
puede trabajar con esa fórmula, porque es ancho a la base.
Cuando no se puede hacer por problemas de selectividad del sistema cromatografico 
toca trabajar a la mitad de la curva porque genera un nuevo ancho en la base. Problema de
esto: la cuantificación, genera elevada incertidumbre en cuanto a la cuantificación porque
todo lo que está abajo no es tomado en cuenta en el área bajo la curva sino que el área bajo
la curva se describe solamente por el área de la zona de arriba. Lo lógico es seguir peleando
con el tratamiento de la muestra, porque me está diciendo que todavía tengo muchas
interferencias endógenas que están afectando la señal instrumental.

La fórmula se da porque cuando se tiene un cromatograma, este no me va a dar H, me da es

un tiempo de retención y un ancho de base porque es un piso. En el laboratorio para
determinar cuántos N se utilizaron para separar equis compuesto…lo único que se pueden
usar son los datos anteriores que si los arroja el equipo  por tanto se debe aplicar la 1ra
formula  a partir de la 2da se llega a H  H me lleva a Van Deemter.

En la ecuación Van Deemter simplemente lo que se está intentado es describir como es el

fenómeno de separación dentro de la columna, tomando en cuenta la partícula del lecho de
la FE: como es su porosidad, su geometría, su diámetro…tomando en cuenta entonces que
eso me describe un coeficiente de rozamiento que va a limitar la movilidad de la FM y por
tanto la del analito; tomando en cuenta que tenemos necesariamente que diluir: fíjense
cuando yo inyecto, inyecto 20microL, 10 o 5microL…de una disolución de la muestra;
pero cuando la eluyo la puedo estar diluyendo en 1 o 2 mL  esto significa que a aplique a
la muestra través de su paso por la columna sufre un proceso de dilución y este proceso de
dilución es necesario que ocurra porque es lo que va a estar necesitando ella para poder
desplazarse de su FE e irse a su FM.
Cuando meto FM a la columna no meto en microL sino en mL  quiere decir que a lo
largo de un tr equis yo he mandado suficiente volumen de FM, por ende, esos 20microL ya
no son 20microL dentro de la columna, son mL.
En la ecuación van deemter hay dos conceptos claves:
 Los ensanchamientos de banda intracolumnar: Son los necesarios.
 Los ensanchamientos de banda extracolumnar: Los indeseables, estos ocurren en
cualquier sitio fuera de la columna.
Ejemplo: Cuando se está hablando a partir del sistema de inyección hasta el de la columna,
¿Qué pasa aquí? Del sistema de inyección hasta el de la columna se tienen tuberías que
conectan; cuando se elige un diámetro interno de tubería demasiado alto se provoca un
factor de dilución indeseable; si se elige una tubería demasiado larga para conectar inyector
con columna también se provoca un factor de dilución indeseable, porque sencillamente
esas tuberías están saturadas de FM, entonces cuando vengan los 20microL de la muestra se
van a encontrar con todo ese volumen que está en la tubería, de forma en que: mas alto este
el diámetro o más larga este la longitud de la tubería  quiere decir que hay más volumen
de FM presente allí y generara automáticamente una dilución. En la zona de tubería de
inyector a columna se busca que la longitud sea la mínima necesaria para alimentar la
columna porque o de no se puede dar el factor de dilución indeseable.
Otro factor de dilución indeseable se produce en la salida de la columna que va al sistema
de detección.
Cuando se separan los componentes de la columna, lo que impide que se mezclen en la
tubería que conduce hacia el sistema de detección es una longitud y un diámetro adecuado;
porque estando allí no tengo una FE que me impida que la una alcance a la otra.
Un ensanchamiento de banda total va a darse entre los que suceden en la columna con
respecto a los que suceden fuera de la columna.

Volumen de la celda de detección  Se está hablando de una única celda de detección, de

que esta va a estar en función de la finalidad del análisis: Si se habla de una escala analítica
puede ser de un volumen de 3microL y si es una escala semipreparativa puede ir alrededor
de los mL.  Es importante porque si se está trabajando en la escala analítica no se puede
tener en la celda de detección una de escala preparativa; porque hasta que la celda no se
llene, el sistema no se descarga, de forma que, si mi volumen de elución de mi analito era
de apenas 0,5 pero el volumen de mi celda es de 5mL, ella va a quedar esperando a que
llegue más FM y si llega más FM transportando a otro analito, se me pega a la celda de
detección.

La ecuación Van Deemter de lo que me habla es:

 Ecuación de Eddy (A)  Cuando se tiene una FE compactada dentro de una columna,
se tienen una serie de partículas allí comprimidas a alta P; esas partículas son constantes
en la columna porque cuando se están haciendo los análisis cromatograficos, la
columna no se está cambiando, es cte a través de todo el análisis; lo que se está
cambiando es la composición de la FM, del caudal…pero nunca la columna.
Por tanto se considera que la contribución que hace la característica del lecho de FE es cte
en la ecuación van deemter y se refiere al termino A.  A es cte.
La difusión de Eddy me está hablando entonces de que cuando se tienen todas esas
partículas de FE acomodadas en la columna, los espacios interparticulares son muchísimos,
de forma que cuando la FM empieza a pasar a través de los espacios interparticulares no
tiene una única trayectoria para llegar al detector sino que puede recorrer múltiples
trayectorias.
De forma que la difusión de Eddy es la contribución que me está haciendo la partícula de
FE al ensanchamiento de la banda cromatografica, se dice entonces que cuando la partícula
de FM se mueve en la parte más interna del lecho de FE su tiempo de residencia dentro de
la columna tiende a ser alto; mientras que si lo hace surcando la zona de la pared lo va a
hacer más rápido porque frente a él tiene muchas partículas que le ofrecen rozamiento (en
el interior), en la pared tiene una superficie lisa de contacto  entonces el desplazamiento
por aquí lo hace a mayor velocidad que si lo hace al atravesarse por las zonas de mayor
compactación de la FE.

 Difusión longitudinal (B): Esta lo que dice es que quiere bandas estrechas, o sea,
quiere que lo del sándwich se libere pero haciendo uso de la altura de plato teórico lo
más estrecha posible; es decir, me está diciendo: busca una condición de FM, una
composición, un caudal adecuado que haga que todas estas especies analíticas de mi
sustancia de interés viajen haciendo uso de una misma velocidad, que la diferencia con
la que se mueve la primera partícula con respecto a la última, sea lo menos distante
posible.  cuando se hace esto se tiene básicamente alineado el sistema  se pueden
generar picos como el primero (delgados), los cuales me están diciendo que el mismo
ancho que se encuentra en la columna acostada al levantarla se está diciendo que es la
altura del plato teórico.  esta altura del plato teórico va a coincidir con el ancho de la
base del pico cromatografico  este último nos da noción de que tan alto es el plato
teórico con el que se separó mi grupo de moléculas.

Siempre se deben estar buscando sistemas kausianos como los delgados de la foto porque
me está diciendo que cada vez que se hace eso se garantiza seguir teniendo FE libre para
que se sigan dando interacciones y aportarle altas probabilidades de factores de selectividad
a la separación cromatografica; cuando se trabajan con condiciones que me alejan de eso
(FM muy viscosas, tampones de altas concentraciones, caudales inapropiados…) en lugar
de que las partículas intenten moverse a la misma velocidad o mismo ritmo todas, unas van
a ir más rápido, otras tratando de llegar a ese ritmo pero otras se retrasan  se genera la
altura de plato teórico gordita  este ensanchamiento de plato teórico se traduce en un alto
ancho de la base.
No se quieren altos anchos en la base porque siempre va a haber una incertidumbre, ¿Cuál?
Si este es un pico cromatografico y empezó a subir en el min 2 y dejo de subir en el min 5,
dentro de ese intervalo de retención caben muchas opciones y se están describiendo todas
dentro de la misma ventana de retención.  No se puede garantizar la pureza de ese pico
cromatografico, no se puede garantizar que en el análisis no haya habido solapamiento de
otras sustancias que no eran analito de interés.  Se genera una sobrecuantificacion. 
Este es el problema de tener altos platos teóricos en la separación cromatografica.
La difusión longitudinal es necesaria pero hay que controlarla para que tenga una
disminución de picos kausianos.

 Transferencia de masa (C): Hacia la FM y luego a la FE.

Hacia la FM: La FM también es una película; es decir, que en el seno de ella viajan
muchas moléculas de la naturaleza del disolvente de interés, ¿Qué ocurre con la partición o
transferencia de masa? Esta partícula que era de la FE tiene la funcionalización en la
superficie, con lo cual mi analito de interés se encuentra en la superficie. ¿Qué necesito
hacer? Necesito romper la película para que se establezca el equilibrio entre el analito que
tenía en la superficie y mi FM  por eso se tiene un coeficiente de reparto (L-L).
La película de FM necesito que al migrar a través del sistema interparticular vaya haciendo
la punta de lanza y lo va haciendo por los coeficientes de rozamiento que se van oponiendo
a su movimiento, si la película de FM es muy viscosa con más razón tiende a formar la
película con punta de lanza; esto hay que controlarlo porque demasiada viscosidad afecta
totalmente a la difusión longitudinal y genera los ensanchamientos.
En la transferencia de masa se necesita que la partícula que esta absorbida en la superficie
de la FE empiece a transferirse hacia la película de la FM  cuando lo hace, pasa de la
parte más superficial y empieza a internarse a la parte central de la película de FM; es decir,
se genera un gradiente de concentración dentro de la película de FM.  Porque a medida
que ella sigue trasladándose (es como si fuese un transportador) si mi analito de la parte
superficial migro hacia la capa interna de la película, lo que se tiene entonces es FM libre y
disponible para seguir interaccionando con más analito que se ira encontrando. ¿Hasta
cuándo va a seguir transportando? Hasta que todas las moléculas de la película ya se
saturen.  En este momento no sigue transportando sino que sigue desplazando.  Si
adelante hay centro activo disponible libre entonces como la FM está saturada  el analito
empieza a migrar de esa película hacia la FE.  Dinámica del equilibrio del plato teórico.

Desde la FM estancada y la FE:

FM estancada: Esta es una partícula de FE, puede tener surcos interiormente porque es una
estrategia tecnológica que funcionaliza la partícula aún más; cuando se satura un sistema de
estos dentro de esos surcos se tienen FM y cuando vienen viajando el analito en su FM
como lo hace a un caudal adecuado, empezaran a bajarse de la película de FM en que
venían y a empezar a trasladarse a las zonas de surco; evidentemente hay un gradiente de
velocidad de movimiento en las partículas del soluto porque no es lo mismo la velocidad
con que se va a mover una partícula que viene de la superficie que la de la partícula que le
toca salir desde adentro del poro, llegar a la superficie y ser arrastrada, por eso se dice que
aunque las partículas son idénticas entre sí, no viajan todas a la misma velocidad porque
todas no están ubicadas en el mismo sitio de exposición.
Cuando se habla de ecuación Van Deemter estamos diciendo que tenemos tres
componentes que contribuyen al ensanchamiento de una banda cromatografica:
 El coeficiente A que es constante y está cubierto de FE.
 El B que es difusión longitudinal.
 Las transferencias de masa desde FE y FM.
B y C están delimitados por un caudal y a su vez el caudal estará delimitado por una
viscosidad.
A solo depende de la columna, mientras que B y C dependen de la columna pero también
de FM.  Aunque se haga un análisis siempre basándose en la misma columna que se
tiene en el laboratorio, no quiere decir que siempre la composición y el caudal de una FM
sea la misma para darme la mayor eficiencia de la columna, sino que va a depender ahora
de la FM.
Aquí tenemos las contribuciones individuales de cada uno de los componentes y la
resultante de la contribución de todos los componentes.  Esto significa que no siempre
que se mueva una FM a alto caudal se va a tener siempre un plato teórico estrecho porque
se está disminuyendo o favoreciendo una dispersión  me está diciendo que si bien es
cierto en la medida en que incremento el caudal yo puedo ir consiguiendo alturas de platos
teóricos más pequeñas, hay un punto en donde se describe el mejor caudal para conseguir el
menor valor de H  cuando se dice el menor valor de H, como la relación H es
inversamente proporcional a N entonces el menor valor de H me está diciendo que tengo el
mayor valor de N (-_-!)  el mayor valor de N es lo que se busca en una análisis
cromatografico; por eso es necesario que bajo cualquier análisis lo primero que se hace en
cromatografía es describir el comportamiento de la ecuación Van Deemter para el sistema.
La curva es experimental, ella cambia en cuando se cambia la naturaleza de la FM, del
caudal, al analito, a la columna.

AUDIO DE INSTRUMENTAL (Agosto 18)

MECANISMOS DE SEPARACIÓN

Cuando se habla de mecanismos de separación se está hablando de cómo esta

interaccionando el analito-FE y analito-FM.

Dentro de los mecanismos de separación, encontramos:

 Separación por adsorción: Es el principal mecanismo que funciona cuando se habla de
fase normal y en reversa, y se refiere es a la adherencia a la superficie. De allí que sea
tan sencillo hacer el revertimiento de la interacción.

Esto representaría la partícula compacta de la fase sólida y la cadena carbonada seria el

sistema C18.  La interacción entonces dependerá de las funcionalidades que existan entre
los analitos y el centro activo.

 Separación por reparto: La interacción puede ser dipolo-dipolo, dipolo

inducido…dependerá de la naturaleza química del centro activo y los grupos
funcionales de la estructura química del analito de interés.

Cuando se habla de la separación por reparto, en el reparto no se está hablando de

adherencia a la superficie ni de adsorciones, se está hablando de distribuciones entre
líquidos, ya no se está hablando de una cromatografía S-L, sino de una L-L  entonces por
eso se habla de un reparto.

¿Cómo hago para que salga la FM pero que la FE se quede?

Para que no se pierda ese líquido lo que se tiene es un núcleo solido  ese núcleo solido
interacciona con el líquido que va a estar en la FE a través de fuerzas iónicas, de modo que
la película se va a quedar adherida entorno a ese núcleo y es lo que se llama líquidos
iónicos (¿?).

El soporte es una partícula sólida y que por el tipo de interacción tan fuerte que tiene con el
líquido establece una interacción completamente iónica  esto impide que esa partícula
tienda a salir, porque el volumen que adquiere es más alto y no va a permear a través de la
membrana, de forma que cuando viene la película liquida que está transportando al analito,
recuerden que la película liquida va a tener un grosor y a medida que el analito entra en
contacto a través de migrar a la superficie del líquido, va a establecer la interacción hacia la
FE liquida.  Se habla de un reparto porque habrá moléculas que se quedan en la película
liquida de la FM y otras que pasen a la película liquida de la FE  ya aquí no se está
hablando de adherencia a la superficie, se está hablando de entrar en la película liquida, por
eso se habla de reparto. De esta manera esa partículas que están en la película liquida pasan
a estar dentro de la película del sólida. Como en el experimento en orgánica: ¿Cómo pasa?
Migrando la película de la zona acuosa hacia la fase orgánica.

Cuando se tiene una película y se ve macroscópicamente, esa película tiene una altura, un
grosor y según la concentración y solubilidad que tenga el analito se empieza a saturar esa
película, ¿Cuándo el analito va a transferirse de esta película a otra que se tenga encima que
también sea visible? Cuando el analito logre salir de la parte más interna de la película y
exponerse en la superficie; porque será allí cuando sienta la influencia de la atracción por la
película del seno del líquido que está arriba y que es inmiscible con él. Se habla siempre de
que para que un soluto pueda ser extraído de la matriz, se necesita que migre a la superficie
 esta es la razón por ejemplo que cuando se habla de homogenizar sólidos, lo primero
que se hace es macerarlo para incrementar el área superficial, cuando se rompe y se
transforma en partículas más pequeñas lo que se está haciendo es incrementar área de
superficie  cuando se hace esto, se hace que el analito que estaba en la zona más interna
de ese solido este ahora expuesto.

La característica de los liquidas es tomar la forma del recipiente que los contiene  por eso
se habla de reparto.  Sigue viajando en su rio que es la FM y el otro en su rio que es su
FE y por mecanismos de solubilidad va a estar transfiriéndose.

Cromatografía en fase reversa

Entre los mecanismos de separación más usados encontramos la cromatografía en fase

reversa.

En la cromatografía en FR la nemotecnia está aquí:

 FE  baja polaridad.
 FM  alta a mediana polaridad.
 Polaridad muestra (analito)  alta a mediana polaridad.

¿Qué pasaría si yo a la FE de baja polaridad le colocara un solvente también de baja

polaridad?

Se disolvería el centro activo de la FE.

Lo que se está desapareciendo a la FE es su funcionalización, o sea, el centro activo, que

mediante la acción química había colocado para funcionalizar la FE, es el que va a sentir la
atracción de disolverse en la FM porque en la química lo igual disuelve a lo igual  de
modo que un centro activo de baja polaridad va a tender a disolverse con solventes de baja
polaridad.Y la intención de la cromatografía no es disolver el centro activo, es usarlo para
que interaccione con mi analito, la otra desviación que viene entonces es que cuando uso un
disolvente del mismo carácter de polaridad que el centro activo  ese disolvente ha
perdido interés por la muestra  destrucción centro activo  como implica rxns químicas
se ha destruido la muestra, el analito, se están generando artefactos y no se sabe que se ha
formado.

Siempre en una cromatografía mi muestra va a estar en el mismo orden de polaridad que la

FM que se utiliza para esa cromatografía, porque quien hace que la muestra salga de la
columna es la FM y quien hace que se retenga es la FE, por tanto, si metiese una muestra de
baja polaridad en una columna cuyo centro activo es de baja polaridad va a haber rxn
química.  Ya no se habla de interacción intermolecular sino de un grado de intimidad
mayor y se da una reactividad química  hay una quimioabsorcion (ya se ha generado una
rxn química con el centro activo). El extremo opuesto es la FM, cuando se trabaja con una
de baja polaridad y provoca la destrucción de centros activos  sangrado de la columna (se
está disolviendo el centro activo).
Esto que se muestra aquí es una base de sílice  en esta base de sílice, esta es la materia
prima de partida que se utiliza para la obtención de FE de carácter reverso. ¿Qué ocurre en
estos sistemas? Al ser sistemas sílices tienen grupos funcionales OH que llamamos
sistemas sinanoles.  el sistema sinanol es el sistema de fase normal  llama la atención
que utilicen un sistema de FN que es lo opuesto a esto para producir sistemas de FR.  lo
que ocurre es que un sistema sinanol en donde los grupos que no han sido reemplazados
perfectamente se encuentran bloqueados con sistemas voluminosos como el metilo  este
sistema de materia prima viene a ser utilizado como punto de partida para la obtención de
un sistema de FR.

Se tiene un C18 en donde si este es un sinanol lo que se está metiendo en un sistema como
este es funcionalizar el sistema con un OH, este oxigeno tiene un H por lo cual la rxn es una
deshidratación de una molécula de agua y a cambio entra este grupo y queda funcionalizado
el sistema OH.  Ya quedo reemplazado el OH original de la matriz por un sistema C18; o
sea, mi centro activo es el sistema C18, pero la polaridad del sistema C18 es de baja
polaridad (no se dice apolaridad porque el carácter apolar es para moléculas mononucleares
diatomicas).
¿El OH tendrá capacidad de interaccionar como lo haría un sistema C18? No, C18
interacciona con sistemas van der Waals; mientras que el OH lo hace con puentes de H
(agua y aceite).

Cuando se tiene la rxn química como se ve allí, no todos los sistemas OH de la FN son
reemplazados eficientemente por el sistema funcionalizado que se quiere que es el C18,
sino que como cualquier rxn en química orgánica va a proceder en un porcentaje
determinado, quiere decir que solamente un número limitado de grupos OH efectivamente
van a ser reemplazados y otros permanecerán.  lo indeseable de esta situación es que
cuando un analito esta interaccionando con la FE se necesita que se establezca únicamente
un tipo de interacción; ¿si un analito hace dos interacciones, como se contrarresta eso?
Difícilmente puede contrarrestarse a nivel de una FM  no se puede permitir al analito que
haga diferentes tipos de interacción.  Aquí lo que se hace es que para evitar estas
situaciones en donde el analito de interés que es de alta a mediana polaridad y que
perfectamente puede interaccionar con el sistema C18 y al mismo tiempo con el OH quiere
decir que no le van a quedar grupos funcionales libres desde donde puede interaccionar con
su FM, por lo tanto, para que no me haga estos dobles mecanismos de interacciones, lo que
se necesita es bloquear estéricamente por voluminosidad de estos grupos funcionales,
bloquear e impedir la posible entrada del analito de interés. Se ve como sistemas metilos no
se utilizan en estas funcionalizaciones sino sistemas isobutilos que a nivel espacial son
mucho más voluminosos y que tienen impedimentos estéricos para que la molécula del
analito de interés tenga la posibilidad de interaccionar ahora con el sistema C18.  De esta
manera se está cambiando que una cromatografía de FR que la carga de C
sorprendentemente no va más allá del 10 o 15%, sin embargo la columna es de FR, se llama
FR porque aunque están disponibles los OH están bloqueados.  Por lo cual no existe la
probabilidad de la doble interacción.

Dentro de lo que se considera FR, las más comunes son:

 Octadecilo. (18C)
 Octilo. (8C)
 Fenilo. (9C)

Según aumenta el número de C en la cadena carbonada se está bajando la polaridad y según

disminuye se está amentando el carácter polar.

Se puede decir que el sistema octilo es de mayor carácter polar que el sistema
octadecilsilano porque el primero tiene 8C y no 18C como el segundo; pero jamás será de
la misma característica polar que un sistema sinanol.
Típico caso de laboratorio: un analito se está enfrentando a la separación de los
componentes presentes en una muestra, esa muestra tiene 8 compuestos, el reto del analista
es separar esos 8 compuestos en una columna cuyo centro activo es un sistema C18, con un
tamaño de partículas de 5micras, un diámetro interno de 4,6mm y 25cm de longitud, está
trabajando a un caudal de 1mL/min y 22 ; este señor está trabajando una separación de
inicialmente dos componentes: tampón sulfato y Acetonitrilo.

Separación socrática: A (PB); B (ACN).

Lo primero que hace este señor es hacer la inyección de su muestra utilizando el 90% de B,
¿es alta o baja fuerza eluotropica?

FM en FR:

 MeOH.
 ACN.
 Agua.
 H+ (Tampones en medio acido).
 OH- (Tampones en medio básico).

Orden: Tampones, agua, metanol, ACN.

Considerando este grupo de solventes, ¿cuál se considera de ellos que es el de mayor fuerza
eluotropica? El ACN, porque en FR se considera que el solvente con menor polaridad es el
que tiene una mayor fuerza eluotropica, este va a competir por el analito sin que haya un
riesgo de sangrado.

Todos esos disolventes son miscibles entre sí, una inmiscibilidad de la FM

obligatoriamente me habla de varios mecanismos de interacción con el analito, por lo cual
son indeseables. Cuando se elige algo para ser usado como disolvente de FM es porque se
tiene la seguridad de completa miscibilidad.

En un sistema de FR mi solvente que tenga polaridad más aproximada al carácter de

polaridad que maneja mi FR  solvente de mayor fuerza eluotropica. Tener en cuenta que
es el que más se aproxime, no debe ser igual porque hay sangrado en la columna.

Cuando se habla de ACN, cuando dije que son miscibles entre si quise decir que el ACN no
es hidrofóbico, forma diluciones completamente miscibles con el agua en cualquier
proporción (no hay ningún grado de inmisibilidad), quiere decir que su polaridad aunque es
menor que la del agua tampoco es opuesta a esta como para que genere una partición de
líquidos.

Mientras más se aleje de la polaridad, se dice que no puede competir de tú a tú con la FE 

se está diciendo que lo más polar es el tampón y lo menos parecido a mi centro activo  no
puede pelearse de tú a tú con el analito, va a constituir el componente débil (no tiene
capacidad de pelearse de tú a tú). En la medida en que se combina un tampón con un
componente orgánico  se está haciendo que el sistema baje su polaridad en tanto que en
el lado del orgánico se está diciendo que aumenta su polaridad  se le está concediendo
fuerza eluotropica al tampón y se le está disminuyendo al componente orgánico.

Se aprovechan las asociaciones para llegar a polaridades intermedias.

ACN es lo menos polar pero fíjense que en ningún caso es de baja polaridad  si fuese de
baja polaridad no sería miscible en cualquier proporción con el agua.

En el ejemplo anterior se está trabajando con una alta fuerza eluotropica, porque se está
viendo que los analitos están saliendo demasiado rápido.

Cuando se explicó ecuación de Van Deemter se habló de la transferencia de masa en

función de la velocidad lineal de la FM y de la composición del solvente de la FM, la
transferencia de masa del analito es desde la película liquida o desde la FE  cuando se
está hablando de que el solvente ACN tiene mayor fuerza eluotropica se está diciendo que
el ACN no se va a contentar con tener para el grupos funcionales que no están uniéndose a
la FE sino que lo que ocurre es que el ACN como tiene sistemas pi de electrones
deslocalizados electrónicos de no enlace está diciendo que puede jugarse con varios
sistemas de interacciones tipo van der Waals simultáneamente  por lo cual el ACN ataca
por el lado que se está interaccionando y compite de tú a tú  ventaja: compite de tú a tú
sin dañarte; es decir, sin producir un sangrado, por eso se dice que el ACN es de mayor
fuerza eluotropica, alto poder para inhibirme al analito de interés.

Como es centro activo C18 las interacciones son van der Waals, si queda algo libre sin
interaccionar debe ser de carácter polar para que quede libre y la FM tenga sentido de ser
de alta o mediana polaridad.

Cuando se tiene agua ¿Qué hace como FM en FR? No tiene capacidad de interaccionar con
el C18 porque el agua no hace van der Waals sino puente de H, por lo cual el agua jala pero
no puede hacer nada, por lo cual el analito se sigue quedando en la FE, por eso se dice que
es de débil fuerza eluotropica.

Cuando yo tengo agua, que hace el agua como FM en una FR. Solamente me interacciona por aquí,
jamas me va interaccionar por aca, ¿por qué? Porque el agua no me hace Van der Waals, el agua me
hace es P de H. por lo cual el agua queda aquí hale, hale y no puede hacer nada más. Por lo cual ese
ion sigue quedando en su fase estacionaria, por eso digo que es débil. Por eso la alta polaridad de
fase reversa es de débil entropía, pero cuando yo tengo baja polaridad en fase reversa es alta
entropía y llega y agarran y sacan.

Jairo te aclaro… mi ACN es de la mayor fuerza elutropica, por lo cual si yo lo comparo con mi
centro activo, quien se aproxima más al 5 es el. Cuando se aproxima mas al 5 es cuando lo agarra
por los dos lados porque en el ACN yo tengo una amina cuaternaria con pares de electrónicos libres
de no enlace con lo cual ella me puede coordinar libremente e interaccionar con P de H. pero
también en un sistema de sp, pares electrónicos del sistema pi deslocalizados que hacen
interacciones por el sistema Van der Waals, me polariza las nubes y me hacen efectos conjuntivos.
Por lo cual, por los dos lados y ganan la pelea.

Lo que el analista ha hecho es sencillo, él trabajo de entrada con un 90% del componente fuerte de
elutropía. ¿Por qué les hable de Van der Waals? Porque este esta diciendo mira: yo necesito que en
el plato teorico ( que finalmente es el que me describe la altura, y el que me esta deficiendo
eficiencia y todo lo demás) yo necesito que haya un reparto, la difusión longitudinal se esta dando
en función de afinidades, de distribuciones, y luego el factor C de la ecuación me esta hablando de
transferencias de masas. Cuando yo veo eso. Como lo dijo la mona: 8 analitos en menos de 5min,
será real? Usted ve 8 picos en la primera grafica? Yo veo solo la montonera de cosas ahí y no
puedo diferenciar los 8 picos ¿Qué significa entonces que estaba sucediendo en la columna? Va
haber una difusión de bandas, quiere decir que aunque este analito es A y este es B. el factor de
selectividad fue MALO, a este sistema cromatografico no le dio tiempo de entender que eran dos
moléculas diferentes y entonces las quiso separar asi, y cuando llegaron al sistema de detección
donde generaron picos superpuestos. En ningún momento hubo un gradiente de velocidad de
migración, en ningún momento la FM y la FE tuvo la capacidad de darse cuenta que esta tenía una
estructura química que podía diferenciarla de la otra y que de repente podía ser más a fin con una
que la otra. ¿ quién no se lo permitió? La alta fuerza elutropica de la FM, en este caso es demasiada
fuerza elutropica, esto significa: que en lugar de haber un equilibrio de distribuciones, mitad FM y
mitas FE. Las moléculas en este caso estuvieron todo el tiempo metidos en la FM. Por lo cual el
coeficiente C de la ecuación Van Deemter se vio alterado, en lugar de tener un pico que fuera
distribuyéndose hacia una fase y hacia la otra. Estos analitos vivieron prácticamente en una sola
fase, quiere decir que la transferencia de masas casi siempre tendió hacia su fase móvil. Y así NO
PODEMOS HABLAR DE CROMATOGRAFIA. Porque la cromatografía habla de la distribución
entre dos fases. No se va residenciar en una sola.

Entonces cuando yo les diga en el laboratorio: ha empleado demasiada fuerza elutropica, ya saben
lo que les estoy hablando. No le dieron tiempo a esta niña (analito) que fuera conquistada por su FE
y por lo tanto decidiera vivir un tiempo allá y otro acá. Sino que todo el tiempo vivió en una y no en
la otra.

Yo: profe pero entonces relacionado con la FN, en FR yo tendría que empezar con los solventes de
mayor polaridad, por ejemplo tampones, mezclar y así ir aumentando la fuerza elutropica?

R// si, pero cuando yo voy a desarrollar un método no puedo empezar con la FM de menor fuerza
elutropica ¿Por qué? Cuando yo tengo baja fuerza elutropica, la trasferencia de masas esta hacia la
FE. El analito tiende afinidad por la FE y habrá retención, y yo digo 20,30 min o una hora y no veo
el primer pico, SE QUEDARON VIVIENDO EN LA COLUMNA. Este es el peligro cuando
desconozco como se comporta mi analito en mi columna, lo que hago es: METERLE UNA
FUERZA ELUTROPICA ELEVADA, porque lo que quiero asegurar es que entra y que sale, no
que se me queda viviendo. Porque si yo trabajando con el 100% de ACN y la retención de ese
analito me lleva a un Tr de 40min. ¿Qué opinan? Que hay que trabajar en FN. O sea: estas
equivocándote de FE, porque ese analito aunque aquí sale, le cuesta!!! Y puede tener el riesgo de
estar ensuciando la columna: ¿Por qué? Porque si yo estoy trabajando con lo máximo que puedo,
después de ACN al 100% yo no tengo nada más que agregarle a la fase reversa, lo que no me sale
con ACN al 100%, se quedó viviendo en la columna. Medida desesperada: metale, acetona- acetato
de etilo, si OK. Pero prefiero perder la columna que perder el DETECTOR. Porque un sangrado de
columna puede generar un daño al detector.

¿Por qué? Porque la saturación. Yo tengo demasiado centro activo en La FE, con respecto al
volumen de FM que en un momento especifico puede estar viajando dentro de la columna, de modo
que en algún momento puedo estar hablando de soluciones saturadas en concentración (en el
sangrado). El problema es que todo esto está ocurriendo a alta presión, pero cuando llega al detector
se tiene que registrar una caída de presión que es casi igual a la presión ambiente. Lo que parecía
insoluble allá, en la región ambiente se puede precipitar, entonces si este solido se precipita en la
zona del detector: LO ROMPE. Entonces este es el riesgo del sangrado, la persona prefiere decir
que prefiere perder los 2millones de la columna y no los 16 del detector.

Clave: meto de entrada mi muestra en alta fuerza elutropica, para tener la certeza que realmente
sale de la columna, porque de lo contrario estoy perdiendo la columna. Porque cuando hace eso,
estoy trabajando en la alta elutropía, 90%, quiere decir que el 10% es PB, (observamos que 1,2,3,4
es la primera montonera, 5,6,7 la otra montonera y el ultimo es 8) ¿Hubo factor de selectividad?
NO. ¿Podemos hablar de resolución? NO. Podemos hablar de ¿eficiencia cromatografica? NO,
sencillamente no hubo nada, no hubo separación. No le permitio al grupo de analitos que hiciera
transferencia de masas a su FE.

¿ se ensancho mi plato teórico? Si solo hay dos bases y cada uno representa 4 analitos ¿creen que
eso es ancho? NO! No hubo ensanchamiento. Por eso no puedo hablar de eficiencia porque tengo
una sumatoria de platos teóricos porque no hubo diferenciación de los platos teóricos.

¿ que hace ahora el analista? Baja de un 90 a un 80% del componente fuerte elutropico, o sea 80 de
ACN. Regla de laboratorio; cuando estamos haciendo una optimización de una corrección
cromatografía hacemos cambios del 10%, para barrer rápidamente y asimismo encontrar la mejor
condición para nuestro trabajo. Si yo en lugar de trabajar con la alta fuerza elutropica directamente,
me metiera con el 100% de la baja fuerza elutropica: esta cromatografía me tomaría eternidades, y
llegar a las condiciones adecuadas me tomarían eternidades más el riesgo de
QUIMIOABSORCIONES. Por eso nunca arrancamos una optimización en baja fuerza elutropica,
sino en alta fuerza elutropica. ACLARACION: Y esto si y solo SI: desconozco el comportamiento
de mi analito en esta columna, sistema. ¿Por qué? Porque si yo lo que estoy analizando un
ibuprofeno en una tableta, yo tengo ahí la UCP que me dice que FM puedo utilizar. Que gracia yo
de ponerme a optimizar un medicamento que ya está súperhipermega reportado. Pero si ahora por
ejemplo digo: no mira, yo estoy trabajando en separaciones de plaguicidas, estos por excelencia se
trabajan en CG, no en C. normal. Por lo cual hasta los últimos 10 años ha habido solo dos papers
donde han intentado separación por CL. Significa que solo tengo dos fuentes y ninguna de las 2 me
sirvió. Que me toca? Implementar la mia, y empezar a jugar con estas fases. Pero si yo tengo una
guía utilizo una guía, no voy a perder tiempo en eso.

Entonces lo que hizo el señor fue pasar del 90 al 80%, y cuando baja este 10% miren como el
sistema cromatografico parace que comienza a identificar que ya hay un grupo distinto, que no es lo
mismo todo, empieza abrirse por un poco mas la separación, pero aun no tengo NI RESOLUCIÓN,
NI UN BUEN FACTOR DE SELECTIVIDAD. Con lo cual se sigue bajando a un 70%, aquí
aunque seguimos encontrando un tiempo mayor de retención de la cromatografía y hay una mayor
diferenciación, la verdad no sirve aun. Pero si sirve para darse cuenta que (enfóquense en el numero
8) de todos modos por problemas de selectividades y resoluciones se sigue bajando a un 60%,
aunque ya se han diferenciado el 8, 5, 4 del resto de picos, ahí SIGUE HABIENDO MEZCLA DE
LOS 3 PRIMEROS y de los intermedios. Por lo cual es señor se da cuenta que ya quiere un cambio
al 20% y no al 10%, y ahora encuentra que: (pico cromatografico del analito 8 al principio, y como
con un cambio de fuerza elutropica, me cambia su perfil cromatografico), esto significa que ¿? Y
esto es la razón del porque cuando yo voy a cuantificar una muestra tengo que hacerlo en las
mismas condiciones que fue desarrollado mi método, porque la respuesta instrumental se ve
afectada por el ambiente químico que rodea mi molécula, en este caso estamos hablando del 40%
ACN, sigue jugando la mezcla (ACN: Tampón), pero cuando yo empiezo a bajar la proporción del
uno o el otro, ya el juego del ambiente químico CAMBIA. El ambiente quimico esta cambiando, y
ahora como consecuencia hace que esta estructura ahora responda de un modo distinto al sistema de
detección.
Si aplicáramos Ley de Beer y yo te mostrara este cromatograma (80%) y este cromatograma (40%)
con respecto al analito 8, me dirías que el analista cambio la concentración del analito 8?

¿a qué responde ley de Beer? Suponga usted está en el laboratorio desarrollando un método
utilizando 70% ACN y 30% tampón. Pero hoy se encontró que: en función con el número de
cromatogramas que iba a tener que hacer y de la cantidad de solvente que tiene en el laboratorio,
usted dijo NO, si yo recorro al 70% en el cromatograma número 4, me quedo casi sin ACN y no
voy a poder terminar analizar los demás. Con lo cual vamos a bajar el ACN y poder realizar todos
los cálculos, hacer todo. ¿esto es una buena solución, tú lo harías? Anotar: VA PA EL PARCIAL

Andrés pregunta a la prof: ¿cuándo puedo usar una separación isocratica con ACN? y usted
respondió, o sea que yo lo uso para tener certeza que saldrá mi analito de la columna en FR. Y otra
pregunta

¿Yo hago mi separación con ACN y obtengo mi cromatograma de varios analitos, por ejemplo el
del 90% ACN y entonces voy a tener 4 picos que contienen esos analitos… pero que me garantiza a
mí que en la columna no se me está quedando analito que si tiene más afinidad por la FE que por mi
FM. ¿? … Erika dice: ¿adivina quién me va responder esa pregunta? TÚ, ¿Cómo le dirías a Andrés
contundentemente, claro que salieron todos?

……

Esto es absorción, esto se relaciona con concentración. Que paso aca para que este pico me haga
estoy y acá lo otro (se refiere a los mismos picos 8: el alto y delgado, y el bajo pero ancho)

Jaime dice: va estar eluyendo a menor concentración hasta el paso que ya no hay analito número 8
y no se pueda registrar.

Erika dice ¿el ABC de este es igual a este (sigue comparando los mismos dos picos)? El ABC es
directamente proporcional a la concentración (Omar pregunta si esta diluida: Erika dice diluida la
muestra, puede tener un mayor factor de difusión longitudinal porque te lo está diciendo el
ensanchamiento a la base)

Este señor baja de un 60 a un 40% y encuentra que se diferencia muy bien el 8, 7, 6, 5, 4, pero el
problema es que 7 eluye a 27min, y el siguiente es 8 y eluye a 65min, o sea que casi 40min de
espera hasta que salga el número 8, esto significa que DESPERDICIO DE FM, esto esta diciendo
que: usted se puede estar empeñando en que todos salgan, ISOCRATICO, pero esto me esta
diciendo que al 8 a esa concentración (40%) le cuesta mucho competir en transferencia de masas a
este analito, este analito con su elevado tiempo de retención, me está diciendo que su afinidad esta
tendida hacia la FE.

Cuando yo veo ensanchamiento de base, tengo que trasladarlo en ancho, en ancho del plato teórico.
¿Qué paso para que este pico (8) pasara del ancho en base (1) a semejante desproporción en su
base(2), que pasara en estar en los primeros 10min a más tardar 12, y de repente se convierte en
65min?

Variable, correlación, pensar… hablar

El ancho se traduce en la altura del plato teorico, si yo vengo siguiendo el rastro al pico número 8.
¿Qué paso? Pase de un ancho a la base tan chiquito como esto (1) a un ancho a la base grande(2),
SE ENSANCHO MI PLATO TEORICO, esto es Van Deemter, difusión longitudinal, demasiada
diapersion, en lugar de marchar todo a una misma velocidad, empezaron a dispersarse en la FE, y
para que esto sucediera (distracción de moléculas), esto lo permitio la fuerza elutropica, y el
responsable de esto es la composición de mi solvente. Cuando yo digo se dispersaron mucho,
significa que se quedaron mucho tiempo transferidas en la FE. Lo estoy confirmando en mi
TIEMPO DE RETENCIÓN.

UN CROMATOGRAMA HABLA TODO! VARIABLES: TIEMPO DE RETENCION, tiempo de

retención es directamente proporcional con afinidades, altor TR, alta afinidad por la FE, la
transferencia de masas dice que está muy tendida hacia FE. Automáticamente dice fuerza elutropica
no adecuada

Fíjense: Este pico 8 pasa de tener 12min en el 60%, con un 20% que ha cambiado el analista,
incrementamos de 12 a 65min. ¿ que me esta diciendo la fuerza elutropica? Que no es adecuada
para el analito 8 porque se está reteniendo. Pero con el demás conjunto de moléculas no sucede lo
mismo.

7 Se separa muy bien de 6 pero tengo ensanchamiento en bases y lo digo porque siempre me voy a
las referencias anteriores, 6 y 7 tienen un poco de ensanchamiento en bases, hay una buena
resolución entre ellos, lo cual me está diciendo hubo un buen factor de selectividad en el sistema
cromatografico, porque cuando yo veo entre un pico y otro hubo recuperación de línea base, estoy
diciendo que hubo gradiente de velocidad de migración

Cuando voy a 5 (fíjense que pasaba en el 60% 5, la altura que gababa), el ancho a la base de 5,
retención de 5. (Cuanto bajamos el 20% que le pasa a este 5 ¿?) se aumenta demasiado su retención
y se traduce en que tiene más afinidad por FE y se traduce en ensanchamiento y se traduce que hay
difusión, que hay dispersión y la fuera elutropica me está diciendo que no es adecuada para 5.
Entones ok, no va bien.

Supongan que esta algura es la lectura equivalente para una cocentracion de 20ppm (dentro del
RDL) eso quiere decir que cunado inyecte 10ppm, estará en la mitad. Cuando intente 5 estara en la
mitad, cuando este en 2,5 a la mitad del anterior, y cuando inyecte 1,25 en la mitad del pasado. ¿lo
voy a ver? Aun si, pero cuando cambio la fuerza elutropica. Miren en lo que se combiente 8 (8
seria la altura del 100 del ejemplo). Cuando voy a 50 (reduje la mitad) y asi sucesivamente. Se
atreverían en bajarlo mas del 25? NO. Tradúzcanlo en la validación del método, como les daña el
no tener la fuerza elutropica adecuada en mi analito. Lo dana en el LDD y LDC de mi método, ahí
se daña todo. Si yo fui un analista descuidado que no quise trabajar en la optimización de mi mejor
composición de FM, la diferencia será que la sensibilidad de este método va ser mala, que en cuanto
al analito lo minimo que va llegar a cuantificar es hasta 25. Mientras que si llego al ejemplo que se
puso en el tablero (el analito llego hasta 1,25 y aun todavía se podía ver) trastaledomolo al sistema
regulatorio, estoy diciendo 1,25 son 1250ppb, eso es un mundo, toneladas. Entonces mira que: yo
estoy diciendo: en el SR le estoy permitiendo el contaminante al alimento en orden de 1300ppb.
Necesito analizar un contenedor que tengo afuera. Si yo tengo este método digo: búsquese a otro
porque mi método no es competitivo, no es sensible, mi método requiere minimo 25000ppb, para
atreverse a cuantificar. Y cuanto es 25000 respecto a lo que quiere el señor: TONELADAS.
Entonces, esto es un problema de sensibilidad instrumental? NO, el detector es capaz de de ver esa
molecula, pero ocn cuanta sensibilidad el la vea, en cromatografía esta dependiendo de eluirla con
la FM adecuada. El concepto de LDD y LDC es más complejo que un mero 3 o un mero 10 relaicon
señal/ruido.

Entonces ven porque la preocupación de los analistas, lo primero es optimizar la mejor composición
de FM, mi punto ideal es llegar a la mejor. Porque donde tengo la mejor altura de plato teorico, la
máxima eficiencicia, la menor altura de plato teórico me esta diciendo que me esta recogiendo
cualquier posibilidad de difusión longitudinal, de dispersión de la molecula, esta obligandolas que
las moléculas viajen en un gradiente de migración bastante próxima las unas con las otras

Entonces fíjense que este analista cuando baja a 40 miren como pierde sensibilidad en la
cuantificación del 8 y todo lo demás (difusión, dispersión, mucha trasferencia a la FE) y asi
podemos seguir viendo los demás analitos. En conclusión se dice que esta F. elutropica es muy mala
para el 8, pésima, el 6 y 7 mas o menos, el 5 definitivamente puede resistir algo mas alto y lo digo
´prqie en la longitud de línea base en el que el deja de aparecer en el detector hasta que aparece el
siguiente analito es de casi 5min, eso quiere decir que el resiste que yo haga un cambio de caudal o
un cambio de composición y esto no me va comprometer la selectividad que yo haga aquí. Sigo
para 4 y 5, una resolución bestial, no es buena, es excesiva lo cual esta diciendo; estas perdiendo el
tiempo. Miren que en lo que termina de salir el 4 y después sale el 5 hay 10 minutos perdidos de
línea base ahí , eso es desperdicio de disolventes, perdida de tiempo útil de vida de lámparas de
detección. Esto me esta diciendo que para estos puedo trabajar con mayor FE. Y para los primeros
3 analitos me esta diciendo que para los demás podrá ser muy mala pero para nosotros todavía no ha
llegado: en analítica yo puedo hacer muchas inferencias ahí, una es que hay demasiada similitud en
la estuctura química de estas moléculas, si esto es FR, evidentemente son las moléculas mas polares
presentes, de modo que pasa ellas mucho componente organico esta impidiéndoles que hagan una
buena residencia en FE, fenómeno opuesto al 8, mientras 8 vive casi todo el tiempo en FE, ellas
viven casi todo el itempo es en FM. Ojo: ellas no están saliendo en su tiempo muerto, pero están
muy próxima al tiempo muerto, con lo cual dice requiero mas residencia, baja fuerza. De forma que
cuando llega al 30% funciona para estos primero, pero ya no funciona para los demás, miren 5,
ahora 5 sale en 47 minutos, o sea faltan 6, 7 y 8, o sea que 8 es demasiado.

Cuando el aumenta 35 para mirar cuanto es lo máximo que resiste esta resolución encuentra que hay
una ligera resolución entre 2 y 3. ¿Por qué este analista no decide quedarse aquí? Porque a medida
que una FE se ensucia, cuando estoy inyectando una muestra compleja, ella tiene componentes
endógenos de matriz persistentes y ahí si es verdad que no tengo seguridad que están saliendo de la
columna, que significa ensuciar: que están usando los centros activos(CA) para anclarse, de modo
que un CA utilizado por el endógeno es un CA menos para la separación. Que ocurre cuando yo
inyecto 70, 80, 90 replicas. Sigo ensusciando. De modo que estoy mermando la eficiencia
cromatografica, entonces ante separaciones de bandas cromatograficas que están asi de próximas,
en el momento que se ocmprometen muchos CA porque se ensucio por muestra, yo puedo tener el
riesgo de solapamiento, por eso el analista sabe que no puede seguir por aca.

Ahora si. Armo el rompecabezas: 1 conclusion: no lo puede hacer isocratico, toca hacerlo por
gradiente de elución 2. Empieza con 30% porque son los primeros analitos en salir, 40 no sirve, 35
tampoco, lo mejor es 35 (cuanto tiempo lo programa y asi es como se programa en equipo: en el
minuto 0, arranca con 30% del ACN, ¿Cuánto tiempo demora en salir? Hasta los 8 y medio mas o
menos le dice hasta ahí me mantiene el 30%, asegurando que todos esto salen) sigue 4, 5 y 6 se va
a un 45%, esto me mostro un indicio que no estamos tan cerca de 60, sino 40, pero el sube f.
eltutropica hasta 45. El le dice a la bomba. Desde el minuto 8 hasta el minuto 13 de la
cromatografía para que cambies de 30 a 45% de ACN ESTO ES LO QUE LE LLAMA
RAMPA.(la primera en amarillo), esto es una rampa cromatografica, le ha dado 5min a la bomba
para que haga el remplazdo de 30 a 45. Que pasa en ese tiempo. No hay analito, durante ese cambio
de composiciones nadie se siente movido a salir de columna

Despues lice que va mantener una concentración de ACN del 45% constante, o sea aquí maneja una
concentración constante desde el minuto 13 hasta el 28 se matiene en esa composición: salieron 4 y
5. Luego vuelve a hacer una rampa este analista en 2 minutos pidiendo a la bomba que cambie de
un 45 a un 80% de ACN(llama la atención del analista que hace un cambio de ocmposicion mas
brusco en menos tiempo) en el tiempo de rampa sale 6 y 7. Si se dan cuenta esto sale a los 31min y
aquí en el 29min esta en el punto medio de rampa. Si yo quiero saber composición, aplico
matemáticas, de 28 a 30 en dosminutos pasa de 45 a 80, en 2min hay un cambio de 35%, divido mis
segmentos en minuto y asi calculo cuanto se me está incrementando por minuto.

En 62,5 esta eluyendo mi componente 6. 7 esta eluyendo a 31min en concentración de zona de

meseta que es 80% de ACN. en la meseta eluye 7 y 8. El va a 80% porque aquí tenia la mejor
separación para 8, y en 80 ganaba mas sensibilidad que en 60, por eso tiene un pico estrecho aquí
igual de bueno aca, el elige 80. Porque esta apuntando a la sensibilidad instrumental.

Sin embargo este cromatograma se puede seguir optimizando desde 8 y medio hasta 19 tengo
11minutos muertos ahí, no era necesario gastar 5min en la primera rampa, si cambie el 2 en dos
minutos, como el primero lo hago en 5minutos. Esto se hace cuando en la zona de rampa coinciden
analitos retenidos. Esto dice que del 30 al 45 me podría ir en mucho menos tiempo.

Hay equipos que no tienen capacidad de amortiguar la diferencia de viscosidades, porque mandar
de un 30 a un 45% es aumentar un 15% de un componente, no solo agua, solido disuelto en agua
porque es un tampoco, viscosidad mas pesada. Los choques de viscosidades y tensiones
superficiales tienen que ser amortiguadas en las bombas. Que ocurre? Cuando tenemos sistemas
como merk, abrobi… son isstemas que tienen baja capacidad para amortiguar esos cambios,
requieren que se hagan rampas espaciosas porque de lo contrario la presión se vuelve una locura, se
dispara.

Pero cuando trabajamos el equipo alyilen. Capacidad de hacer transformación de composición en

0,1s. y pueden hacer un cambio de un 30 a un 80 % en 0,1s. y no es solo que lo haga, sino que es
capaz de reproducir la separación cuantas veces la haga. Entonces que me esta diciendo que este
cromatograma es suceptible a ser mejorado: demaiada línea base, desperdicio de tiempo, esto
resistia mas fuerza elutropica porque el esta usando desde 9 hasta 35 (24min para sacar 4 analitos)
en cambio en 8 minutos saco 3. Por eso resistía mayor fuerza elutropica. Esto es puro razonamiento
lógico.

Si yo no entiendo que puede estar pasando en la columna según el cromatograma que veo, yo no se
hacia donde moverme. Esto no es ensayo error, porque puede perder columna, detector. Cuando yo
tengo esto se para dónde estoy yendo.

Pregunta nayeli: Cuando 8 cae mucho la línea base esto no afecta en nada? No pero de hecho
ocurre: la FM es como una zona de bad ground, est generada por la composición de forma que
cuando estoy haciendo los cambios bruscos de composición, la línea base comienza a oscilar,
mientras más choques de polaridad haces. Mientras más cambios bruscos de composición ella oscila
con más razón, porque date cuenta que en la zona del detector que está llegando, está llegando un
55% de tampón , pero cuando me voy a esta zona 80% de ACN o sea 20% de tampón. El ambiente
químico cambia por lo cual la respuesta instrumental va cambiar.

No todos los quipos dejan hacer cambios de caudal. En lugar de trabajar a cuadal constante, trabajo
con rampa de caudales, es decir que puedo decir mantener composición pero a partir de minuto 8,
no trabajo a 1 sino a 1,5. Se trabaja sin cambiar composición sino cambiando caudal

CROMATOGRAFIA EN FN. Opuesta a FR:

FE: polar

Muestra: baja polaridad

Fase móvil: baja polaridad

Que pasaría si yo trabajo con metanol en FN. ¿? Mucha fuerza elutropica y consecuentemente
habrá sangrado en la columna.

MEDIDAS DESESPERADAS. Cuantos trabajan con productor naturales… bla bla bla.

Planta: se extrajo con etanol: obtención de extracto etanolico. ¿ que se espera que este en el tracto
etanolico? Compuesto polares y de mediana polaridad, que tengan de baja polaridad es por un
efecto de apantallamiento o efectos inducidos.

¿El etanol tiene la capacidad para disolver componentes de baja polaridad? Si tengo un sebo de
cerdo, en un beacker y le meto etanol. Se disuelve? Si no los disuelve , entonces el va ser capaz de
extraerlos si están presentes en una muestra? Ven..

¿el hexano es capaz de disolver esa grasa? Porque la grasa es de baja polaridad y el hexano es de
baja polaridad y en química lo igual disuelve lo igual (semejante a lo semejante).

Entonces si el etanol es de alta polaridad y la grasa de baja polaridad ¿cómo es que el etanol me
saca la grasa? ¿Cómo algo soluble en hexano, puede ser extraído por etanol? Donde el principio
hexano y etanol son inmiscibles
Teoría: si yo pido etanol y hexano y lo mezclo, son inmiscibles, esto traduce para mi que lo que
extrae etanol no lo extrae el hexano. Entonces como s explica que cuando utilizo etanol para
obtener un extracto vegetal luego puedo monitorizar componentes de baja polaridad, si el etanol es
disolvente de alta polaridad y no de baja polaridad y de hecho es inmiscible con disolventes de
baja polaridad…

¿Entonces?… si ustedes ven la serie elutropica y la serie de miscibilidad de disolventes. Etanol y

hexano son miscibles? EN NINGUNA PROPORCION SON MISCIBLES. Esto me lleva a concluir
que lo que extrae uno, no lo extrae otro.

Por ejemplo si quiero extraer acido tricloroacetico, solido. ¿podria disolverlo en hexano? Y tener
disolución de hexano ..NO. PERO SI PUEDO tener una disolución de este acido en etanol

Entonces cual es el concepto de miscibilidad…

Es muy claro lo que es el concepto de miscibilidad y por eso existe el diagrama triangular que les
pinte, es asi de triangular… (¿) y de hecho, en eso nos basamos para hacer las combinaciones

La demastracion entre nosotros: erika dice: Giorgio este es el componente de mas baja polaridad
que son las grasas, esta grasa para que una molecula este dentro de un sistema ¿Qué necesita para
permanecer dentro del sistema? Interaccionar. Si ella es grasa, con que sistema interacciona? Van
der Waals. Que quiere decir? Si aquí tengo un alcaloide que es de alta polaridad (NO se unira con la
grasa) y este alcaloide hara P de H, fuerzas electrostáticas. Si es baja polaridad hace Van der Waals,
V. d W. combina con alta polaridad? No. Ojo, no combina. Entonces como se explica el fenómeno
de mi producto natural, como ell etanol puede extraerme metabolitos que luego son insolubles en
etanol pero solubles en hexano. Porque llama la atención que después que lo extraes y lo purificas,
se vuelve insoluble en lo que inicialmente lo había extraido. ¿Qué ocurre? (profe seria como otros
compuestos de mediana polaridad y hacen que interacciones con ellos y se los llevan.) exacto. El
EFECTO DETERGENTE. Este efecto detergente, la molecula de grasa hace este efecto, es decir
que esta molecula ya no es baja polaridad, ya es de mediana polaridad, tiene capacidad de
interaccionar con la molecula de baja polaridad y tener grupos funcionales polares.

(OTRA MOLECULA que ya no es grasa) Ella con estos grupos no se va unir a esta(grasa), pero si
va tener capacidad de unirse con moléculas polares a través de su grupo polar, lo que le queda libre
a esta señorida por el otro lado, son grupos fucionales polares porque sencillamente se saturaron los
receptores alla y quedaron libres receptores para seguirse uniendo. ¿ cierto? Entonces

Ella se imagino una planta: Tallo, corteza, capa mas superficial de este material y esta es la capa
mas interna de este material. Cuando Giorgio muele su material, lo homogeniza, lo que esta
haciendo es incrementando su área superficial, haciendo que la película altamente gruesa, empiece a
ser mas fina para cuando venga el etanol, intente disolver la máxima capacidad posible, entonces el
etanol lo ayudan para que haga su trabajo. (como Giorgio empieza ayudar al etanol para que haga su
trabajo. Giorgio frente a 100g de material vegetal, de etanol se mete 3 veces mas o menos con
respecto al material vegetal (300mL). 3 veces porque el esta jugando que no haya una saturación
para que cuando haya saturación, este niño deja de solubilizarse y vuelve a quedar dentro del
material vegetal. Cuando agrego mas cantidad de etanol que de material vegetal ocurre un
fenómeno de competencia, hay muchas mas moléculas disponible de etanol que de material vegetal.
De modo que este niño siente atracción a extraerse, Giorgio no llega agita y deja ahí con etanol y lo
que saco ahí quedo. Eso no, eso se deja ahí al menos por un dia, si hablamos de una extracción
exhaustiva puede ser hasta meses. Significa que estoy dejando el etanol, aquí en frente a ellos para
que este ambiente apantallado comience a modificarse de forma que cada vez esta señorita (la que
no es grasa) siente atracción hacia etanol y su equilibrio va hacia etanol, pero a la vez esta niña
arrastra a la (grasa), a lo que tiene pegado a ella. De esta manera un disolvente polar como este,
termina extrayendo una moleucla como ella (grasa) y no es porque ella sea soluble en el, es porque
ella esta apantallada.

Cuando la tiene unida la polar con la de baja polaridad, en realidad es como si hablaramos de un
floculo, en el floculo que pasa? En el seno tengo el cristal y alrededor tengo la pantalla, la cortina de
humo que está modificando el comportamiento, entonces en ese momento ella apantalla y esta
señorita no expresa su polaridad, la que se está expresando es la polaridad que no es grasa. Pero lo
que pasa con esta es que tiene capacidad de unirse, se abrazan y cuando la abraza, la saca. Es asi
como el etanol termina sacándome componentes de baja polaridad. Porque Giorgio cuando está
haciendo fraccionamientos (purificar), esta que estaba apantallada, quedo sola y demostrar su
verdadero yo. Y cuando ahora se intenta solubilizar con etanol, no deja porque ya no esta
apantallada por nadie, no se deja solubilizar porque en la purificación el queda solo y muestra su
verdadera identidad química. Esto no tiene discusión porque sino en que se basan las particiones
liq-liq que se hacen en organica. Correlacionen las cosas.

Entonces: Giorgio tiene duda: profe pero cuando yo estoy trabajando y tengo la muestra de analito
total, lo que se hace para fraciconarlo es meter placa en una cromatografía de FN. Y se rompe lo
que explica erika de los esquemas. Porque yo dije que en Cromat. en FN la muetra debe tener
cracter de polaridad entre baja a mediana polaridad.

El etanol tiene de baja a mediana polaridad? NO.

Cuando giiorgio monta una column, antes de montar el material vegetal,, la FE es blanca. El
extracto etanolico de Giorgio tiene compuestos de naturaleza polares, mediana polares y algunos de
baja polaridad, el empieza a eluir ocn disolvnete de baja polaridad, y poco a poco incrementa hacia
alta colaridad. Los que primero salen de la columna son los que menos afinidad sientes por la FE,
(los de baja polaridad) ¿ poruqe? Porque el centro activo es un OH, con lo cual si no siente
capacidad de hacer P de H, sale.

Cuando Giorgio busca aumentar a CH2Cl2, lo que esta haciendo es migrando a buscar la mediana
polaridad, yesos anaalitos que han sido los que se se han quedado ahora, me los saca con estos
componentes, pero Giorgio sabe que metio una muestra polar con cual debería esperar mas analitos
polares y Giorgio mete metanol y despues etanol : los dos dos tienen capacidad de hacer p de H,
pero el etanol es mas polar y mientras y asimismo mas semesjante del centro activo de la FE y
mayor riesgo de sangrado. Cuando usted le mete etanol a una columna es una medida desesperada
para no perder lo analitos de alta polaridad pero a costa de perder centros activos en la FE

¿Cuantitativamente lo has sacado de la columna? NO y quien dice contundentemente que te

quedaron analitos. ¿? Color de la columna, queda amarillita, paso de blanca a amarilla, porque se
retuvieron e hicieron quimiabsorcion
Conclusión: es correcto que sea un extracto etanolico total en FN? NO. Y se hizo la luz.

Lo que pasa al otro lado del charco: cuando yo compro FE en punto como la compra Harold. Con lo
que se compra 10kg de fase normal, compra 100g de FR. Esto se debe a que la síntesis procede en
un 10%.

Para yo tener seguridad que saque todo lo que metí, la columna debe volver a su estado original, o
sea blanca. A usted le enseñan un protocolo para recuperar FE: coja y prepare una solución de HAc
glaseado al 5%. Ese HAc proporciona iones hidronio en solución, se anclan a los OH y se anclan de
modo irreversible de modo que bloquean capacidad del centro activo para interaccionar con un
analito. De modo que después de sangrado, se ha bloqueado. Entonces eso después se somete a
400° con el fin de carbonizar todo el carbono orgánico, neutralizo columna y la recupero. Y
después le dicen otra vez, Giorgio ve a buscar material vegetal y bingo. Giorgio aisló un metabolito
que nadie había aislado y entonces le dicen que otra vez busque material vegetal para que lo vuelva
aislar al analito de interés. Ahora Giorgio no está trabajando con la misma FE del principio, ahora
está trabajando con una silicagel activa: esta adida de quimioabsorber porque me la has dejado
reactiva. Entonces el dice que ya no le baja, antes le bajaba con tal disolvente y ahora ya va por mas
y no le ha bajado, ya he metido 4L y está bajando lentísimo y lo peor es que ese compuesto que está
buscando Giorgio, NO VA SALIR, y lo que quedaba amarillito, sino café.

Una forma de quitarle la reactividad: si lo que hace: cuando se tiene un extracto en etanol, se hace
es una partición solido-liquido, lo llevo a sequedad, lo seco y ahora que tiene el sólido se extrae con
acetato de etilo, no se vuelve a extraer con etanol para que lo que definitivamente es polar se quede
como residuo y ahora solamente se ha disuelto lo de mediana a baja polaridad y eso es lo que se
monta en FN y los rendimientos abren.

Problema de productos naturales: estaban haciendo mucho daño a la naturaleza, a partir de 10Kg
de corteza, despues 3Kg y el 6% es el final, o sea 180g, de los 180g, cuantos mg bajan? No vale la
pena matar un árbol que dura 15 años crecer para esto.

Hay un mundo de cromatografías, que la gente no sepa aplicar la muestra correcta en FE correcta.
Lo igual disuelve lo igual. Y si la FE es de la misma naturaleza de polaridad que el analito,
NUNCA ME LO VA SOLTAR y para que lo suelte (cuando se mete metanol o etanol he
modificado la estructura final del analito y se obtendrá analitos hidrolizados.

Las demás cromatografías: intercambio iónico, intercambio Sephadex o exclusión por tamaño
(LEANLA) y durante el transcurso de practica pueden preguntar.

AUDIO DEL 27 DE SEPTIEMBRE (INSTRUMENTAL)

El potencial de reducción es específico para cada reacción, esta expresado en términos de
reducción y sirve para expresar la diferencia de potencial de una celda, dicha diferencia es
.
Cátodo  el que se reduce (+).

Ánodo  el que se oxida (-).

Teniendo en cuenta la tabla de potenciales de reducción se sabe cuál es cual por el signo,
pero la característica principal es:

Ánodo  menor potencial de reducción (el más negativo).

Cátodo  mayor potencial de reducción (el más positivo).

Ejemplo: Si se tienen como potenciales de reducción -3,2 y -2,5; ¿cuál es el ánodo y cuál es
el cátodo?
Ánodo  -3,2
Cátodo  -2,5
En la tabla de potenciales de reducción todos los valores están expresados en términos de
reducción, por tal razón entre menor sea el valor del potencial, este tiende a la inversa (la
oxidación).  Si tiende a la oxidación va a ser el ánodo.
Dependiendo con quien se esté formando la semicelda se va a comportar como ánodo o
como cátodo, esto no depende siempre del signo.

¿Cuál es el elemento que presenta el valor de potencial de estándar de reducción más

positivo (mayor)?
El Fl, E= +3,05V. Si el potencial es mayor que cero, la reacción es espontanea.
Si el potencial es negativo ocurre la inversa, como es el caso del Li= -3,05V.

¿De qué depende la cantidad de voltaje que se produce en la semicelda?

De la diferencia de potenciales de reducción, recuerden: el potencial de la pila va a ser la
diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo.  Los signos no se cambian, siempre
permanece el mismo signo pero se debe tener en cuenta cual es el cátodo y cuál es el ánodo.

¿Por qué se da el movimiento de los electrones?

Por la diferencia de potencial (voltios), la cual está representada...
El carro se mueve hacia la derecha, se tiene la certeza de eso porque la línea potencial en el
punto a con respecto a la energía potencial en c es mayor  la energía potencial depende
principalmente de la posición, pero si se habla de una celda la energía de potencial está
representada en los , por medio de una rxn de oxidación donde se producen electrones en
el ánodo y estos son aprovechados en el cátodo  esto garantiza el flujo de electrones.
Puente salino  Neutraliza cargas.

A medida que avanza la rxn, si se tiene una conc de la sal 0,1M y una de 1M, en el ánodo
aumenta la conc del Zn2+  por cuestiones de equilibrio la rxn tiende a la inversa; es decir,
el proceso de oxidación no se va a seguir dando porque hay un excesos de cargas positivas
provenientes del Zn2+.

Condiciones para que sea puente salino: Uno de los principales puentes salinos es el nitrato
de potasio.
 Que sea totalmente soluble.
 Que tenga cargas que compensen las dos semirxns.
 Que no influya con la rxn.

El puente salino lo que hace es garantizar el equilibrio, los electrones se aprovechan porque
del otro lado se está dando una rxn que está requiriendo esos electrones.
El puente salino lo que hace es garantizar la semirxn: Cu 2+ + 2e  Cu0; al cabo de un
tiempo lo que se espera es que la masa 2 sea mayor, ya que, se aceptan los electrones y esto
conlleva a que se dé un exceso de Cu2+ y este al entrar en contacto con el electrodo va a
pasar al estado cero y se van a precipitar.
Se depositan en la superficie del mismo cobre porque los electrones circundantes al entrar
en contacto con los electrodos pasan a Cobre (0) que es el estado sólido 
electrodeposición, donde los compuestos que estaban en solución mediante una rxn de
reducción van a hacer parte del electrodo.
El Zn disminuye porque los que están en estado cero que hacen parte de esa lámina del
electrodo pasan a la solución  en cuanto a masa hay un desgaste de este electrodo
principalmente porque los átomos que estaban en forma metálica pasan a forma iónica y
quedan en la solución. Al final de la rxn si se mide la conc. Inicial de Zn y Cu en la
semicelda después de un tiempo la conc. De Zn va a ser muchísimo mayor en la solución.
Para que se dé esto se debe garantizar el puente salino, que a través de diferentes cargas
puede neutralizar las cargas negativas y positivas que quedan.
Las cargas eléctricas fluyen hacia donde haya la menor energía de potencial eléctrica 
donde haya más electrones hacia allá van.
El sentido del flujo va de A a B.
La energía es mayor en el ánodo que en cátodo  porque en la primera hay producción de
electrones y en la 2da requerimiento de estos.

La diferencia de potencial de los dos electrodos proporciona la fuerza electromotriz

(diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo  permite que se muevan los electrones
a través del circuito externo  entre mayor sea la diferencia entre el cátodo y el ánodo
mayor va a ser la cantidad de flujo.)

Calcule el potencial de una celda:

Fl= +3,05V (cátodo).
Li= -3,05V (ánodo).

E°catodo – E°anodo

+3,05 – (-3,05)

6,1V  potencial producido por esa celda.

Entre más positivo sea  más tiende a la reducción  cátodo.

Potenciales estándar
No es de la celda, es la comparación de cada una de semirxns con el de H que se sabe que
es cero; no tiene que ver con cátodo – ánodo.
La FEM es la diferencia entre el cátodo y el ánodo.
El potencial fue desarrollado teniendo en cuenta al electrodo estándar de H, la semirxn que
se da en el electrodo estándar de H es de reducción.  Se da la reducción y a la semirxn se
le da un valor de cero.

FEM= Eoxidacion – Ereduccion

El H dependiendo de con quien se enfrente se va a comportar como ánodo o como cátodo
 esto determina el signo del potencial para ese elemento. Los que se oxiden van a tener
un mayor potencial de oxidación que el H  el H en presencia de los oxidantes va a ser + y
los que se reducen (tienen mayor potencial de reducción que el H)  -.
Estos potenciales que fueron hechos de forma experimental fueron comparados con el
electrodo de H, el cual está conformado por La celda es de platino
Apenas vean una barra de platino, HCl, hidrogeno gaseoso, estamos hablando del electrodo
estándar de H

El puente salino puede ser de KCl, la flecha indica el potasio hacia el cátodo y el Cl- hacia
el ánodo, porque el Cl- neutraliza al Zn 2+ y el K+ neutraliza al Cl- que resulta de la
disociación de HCl
En presencia de una sustancia que se oxida, el electrodo estándar de H se comporta como
cátodo (Se reduce), en presencia de una sustancia que tiende a reducirse se comporta como
ánodo.
Es importante recordar saber si se comporta como cátodo o como ánodo*
Si se saca una diferencia de potencial: Los cátodos que tienden a reducirse dan positivo (se
comportan como cátodo) y los negativos tienden a oxidarse (ánodo)

El profe quiere que saquemos esta conclusión:

Los metales que tienden a oxidarse no te garantizan que siempre se comporte como ánodo,
el cobre a pesar de ser un metal tiene un potencial de reducción positivo, llevando a
concluir que este señor en la mayoría de los casos va a comportarse como cátodo (tiende a
reducirse).
Hay que mirar el valor del potencial

Entre más positivo es el potencial tiende a reducción (cátodo) y entre más negativo (más
alejado del cero) es el que tiende a oxidarse (ánodo)
Delta de e conformado para una pila de Ag (0.799) y Cu (0.377) seria 0.462. Si el potencial
es positivo: la celda es galvánica y si es negativo electrolítica (necesita una corriente
eléctrica para que se lleva a cabo la rx- no son espontanea).
En algunos casos no se encuentra el metal libre. Ejemplo ion dicromato. Tiene un valor
potencial estándar de 1.33, que indica: hay presencia de H y otros iones, todos eso iones
deben estimarse para aplicar la ecuación de Nerst.

El signo negativo me indica que el trabajo eléctrico lo realiza el sistema sobre los
alrededores.
El signo negativo indica, Wmax= fuerza de los electrones= -nf . E° (E°: potencial estándar
de la celda en C.N.)
Por lo tanto las celdas galvánicas siempre me tendrán ese signo negativo.
La energía libre es la energía disponible para hacer trabajo. Realmente la energía que se
está produciendo en una celda galvánica, es la energía libre del sistema que cuando es
negativa me indica que la energía es del sistema sobre los alrededores
Cuando el delta G es negativo se dice que la reacción es espontanea (ojo delta G, no delta
E. si delta E= + =rx espontanea), si delta G positivo: Rx. no espontanea (celdas
electrolíticas). El delta G negativo aplica para celdas galvánicas.
La unidad de la carga se mide en coulomb

1faraday es igual a 96470 C/mol de electrón

n: número de electrones intercambiables entre el agente oxidante y agente reductor
1:23… JAIRO
Por ejemplo para la celda cobre zin n viene siendo dos, ahora, para… celda de dicromato
cuanto es n? seria seis electrones
La fem es la medida del voltahje máximo que la celda puede alcanzar, quiere decir que ese
voltaje va a ir disminuyendo, está expresado como trabajo máximo es igual a –n
intercambiables
Cond. Estadares: 1 M, 25C° y 1 atm y si quiero expresar el potencial de celda en función de
k , k viene siendo?? La constante de equilibrio o la constante de la ecuación o el cociente de
la ecuación.
Si el delta g es neg k es mayor que uno y el delta e es positivo. Si el potencial de la celda es
negativo es porque el delta e es positivo y en ese caso se favo a la formación de reactivos y
quiere decir que la rx no es espontanea. La función del puesnte salino favorece a la
compensación de cargas.

El cociente de reacción esta expresado como los productos sobre los reactivos.
El coeficiente lleva su potencia.
El delta g de la celta que no esta en condiciones normales va a ser igual al delta g en
condiciones normales que son con los potenciales de estándar de reducción mas el log
negativo de Q., entonces teniendo en cuenta que el potencial de una celda va a ser igual al
potencial estándar( catodo menos anodo) menos 0,0257 el n es constante y depende de la
rx, y es el cociente de rt sobre la constante de Faraday.
En el equilibrio no hay transferencia de electrones y el potencial es igual a cero y por lo
tanto Q es igual a K donde ka es la constante de equilibrio, entonces tenemos nuevamente
el sit cobre zinc, y ya ustedes habían calcualdo cuanto era el cond estandar el potencia??
Catodo –anodo- 05252 nobre en que es dos eletrecones y multiplicado por el log de la
concentración de iones zinc mas iones cobre. En condiciones estándar es concentración
molar ojo, molar!!! Si yo les doy la concentración en % ustdes deben pasarla a molarr
Molaridad es igual al numero de moles por litro, entonces qué pasa en las condiciones
estándar donde la molaridad es igual a uno, si en el catodo y anodo la molaridad es uno, es
cero, por es el log de 1 en base 10 y por eso es que las condiciones estándar… por tanto si
nosotros tenemos igual concentración se va a parecer mucho al potencial estándar, porque
las sales van a tener mas o menos la misma concentración.
Bueno entonces, aparece algo que también es de examen, las celdas galvánicas, deben ser
de elementos diferentes y también hay una celdad de concentración… ( ver diapistivva) y
es posible tener una celda del mismo material con concentraciones diferentes y esto anque
sea la misma semireaccion, una se va a comportar como catodo y como anodo, quien me
explica esta pare?? Tienen el mismo elementopor supuesto tienen la misma semireaccion,
lo único que cambia es el potencial quimico, y el equilibrio se va a desplazar donde haya
mas concentración, en ese caso el anodo es el de menos concentración y el catodo es de
mas concentración, por una cuestión de equilibrio si nosotros tenemos mas concentración
de zn hacia donde se se va a dirigir ¿? A la inversa y si la concentración de cu es menos se
desplaza a la inversa- y estariamoa hablando de oxidaciones y reducciones. Estas
diferencias dan origen a la diferencia de potencial.
Como hay mayor concentrcion tiende hacia la reducción, o sea es catodo. Si hay menor
concentración se favorece el sentido de la oxidación.
El catodo es el que recibe los electrones y es donde se esta dando la reducción y hay mas
concentración de la sal, porque es el mismo elemento. Y con la ecuación de nerst se calcula
el voltaje de esa celda.
Cuando se igualan las concentraciones se hacen igual a uno y no hay flujo de electrones.
Porque la diferencia es igual a cero, a diferencia de las otras celdas, cuando se igualana las
concentraciones no da cero.
Para la próxima clase mandar los ejercicios del taller las diapos d ela 1 y 2 clase y que
mas… el articulo.