Introducción.

Como componente del ciclo del ácido cítrico, el ácido L-málico (L-malato) se encuentra en todos los
organismos vivientes. Su determinación cuantitativa es especialmente importante en la elaboración
del vino, cerveza, pan, fruta y productos vegetales, así como en productos de cosmética y
farmacéuticos. Es uno de los ácidos más importantes de la fruta, y tiene la concentración más alta de
todos los ácidos en el vino. En la industria vinícola, el nivel de ácido L-málico se supervisa, junto con el
ácido L-láctico, durante la fermentación malo-láctica. El ácido L-málico tiene muchas aplicaciones
como conservante alimentario.

Principio.
La detección del ácido L-málico requiere dos reacciones enzimáticas. En la primera reacción catalizada
por L-malato deshidrogenasa (L-MDH), el ácido L-málico se oxida en oxaloacetato por la nicotinamida-
adenina dinucleotido (NAD+).

Sin embargo, dado que el equilibrio de la reacción cae en favor del ácido L-málico y NAD+, se requiere
una reacción adicional para “atrapar” el NADH, lo cual se consigue convirtiendo el oxaloacetata en L-
aspartato y 2-oxoglutarato, en presencia de un exceso de L-glutamato, por glutamato-oxaloacetato
transaminasa (GOT).

La cantidad de NADH que se forma en la doble reacción anterior es esquiométrica con la cantidad de
ácido L-málico. Lo que se mide es el NADH, por el aumento de la capacidad de absorción a 340 nm.

Fundamento de la espectrofotometría.
En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona del
ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro
y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía
radiante. En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda
utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura
de las moléculas, y es característica de cada sustancia química. Esta medición también puede usarse
para medir la cantidad de un producto químico conocido en una sustancia

Reactivos utilizados.
• NAD.
• Extracto de corazón (GOT).
• Buffer de pH 10.
• Buffer Tris-Clorhídrico.
• MDH.

Preparación de los reactivos.

Preparación de Buffer pH 10: Pesar 4,0 g de NaOH en un matraz Erlenmeyer. Con una pipeta
volumétrica medir 20 ml de agua y agregara en el matraz Erlenmeyer e ir agitando para una mejor
disolución. Pesar 0,88g de de ácido L-Glutámico en un vaso de precipitado. Agregar un poco de la
solución de hidróxido de sodio hasta formar una pasta, simultáneamente ir agitando con una varilla
de vidrio. Esto debido a que el glutámico es insoluble en agua. Pesar 4,75g de glicilglicina en un vidrio
de reloj. En el vaso de precipitado con glutámico trasvasar la glicilglicina con la espátula e ir agregando
agua al vidrio de reloj para terminar de traspasar restos del compuesto. Agregar 50ml de agua
destilada. Ajustar a pH 10 con la solución de hidróxido de sodio. Aproximadamente utilizamos 13 ml.
de NaOH. Una vez ajustado a pH 10 llevar en un matraz Erlenmeyer o aforado y cerrar con un tapón.

Preparación de Buffer Tris-Clorhídrico: Pesar 0,6g de tris(hidroximetil)amino metano en un matraz

Erlenmeyer Agregar 40ml de agua y 50ml de glicerina al 87% al matraz. Medir 7ml de agua destilada
en un tubo de ensayo, agregar 3ml de ácido clorhídrico en el tubo. Regular a pH entre 7,5 a 8 (lo ideal
7,8) agregando de a gotas la solución HCL 10 M al matraz Erlenmeyer con tris. Poner un tapón a la
solución para su conservación.

Preparación de GOT: Se traen un pedazo de miocardio (músculo del corazón) cortado recientemente
porque o si no se pierde la enzima por contacto con el aire. En el miocardio están presentes los
cardiomiocitos que son las células productoras de GOT. Se cortan en trozos más pequeños del músculo
y se licua el miocardio luego de que se haya dejado reposar por al menos 3 minutos hasta que quede
una pasta, posterior a eso se centrífuga la mezcla por 10 minutos velocidad. Se extrae con una pipeta
la parte líquida y la parte sólida se desecha, se deja en un matraz Erlenmeyer y agrega el 87 % de
glicerina, almacenar en refrigeración hasta la hora de uso. Nota: Antes de utilizar dejar atemperar al
ambiente.

Preparación de MDH L-malato deshidrogenasa: Se pesan 0,025 g de MDH, agregar la pesada en un

tubo de ensayo y adicionar al tubo de ensayo 1 ml del Buffer 7, 8.

Preparación de NAD Nicotinamida Adenina Dinucleótido: se pesan 0, 11 g de NAD, agregar en un tubo

de ensayo, adicionar 4 ml. de agua al tubo de ensayo.

Técnica operatoria método espectrofotométrico.

-Se prepara un baño maría a 30°c para dejar reposar las muestras en una temperatura fisiológica.

-Se enciende el espectrofotómetro y con las funciones básicas se lo setea en método por absorbancia
con una longitud de onda de 340nm. Se lo deja realizar las labores de calibración. Se le agrega una
cubeta con agua desmineralizada para llevar al equipo a 0 de absorbancia.

-Preparar una solución de ácido málico estándar, en nuestro caso ya estaba preparada, por ende,
usamos málico 0,005% para esta determinación además de 3 tubos de ensayos con diferentes
muestras para poder comparar con las siguientes cantidades;

Reactivo. Muestra blanca. Muestra Vino. Muestra Málico.

Agua desmineralizada. 1,0ml 0,9ml 0,9ml
NAD. 0,2ml 0,2ml 0,2ml
 Buffer pH10. 1,0ml 1,0ml 1,0ml
GOT. 0,04ml 0,04ml 0,04ml
Muestra. Volumen ocupado por 0,1ml 0,1ml
0,1ml agua

-Con cada una de las adiciones hay que agitar un poco para que los reactivos se mezclen, así hasta
llegar a la adición de la muestra de, vino o málico sea el caso necesario en la cual una vez después de
la adición se dejará reaccionar por 3 minutos en el baño maría.

-Cuando pasen esos 3 minutos automáticamente vamos a tener que medir la absorbancia sin dejar
que pase tiempo, una vez medida luego de los tres minutos se procede a añadir la solución de MDH
en un volumen de 0,04ml y se lo deja en el baño maría nuevamente hasta pasen 7 minutos y realizar
la siguiente medición.

Resultados obtenidos de las primeras 3 pruebas.

Se realizaron en total 3 pruebas de las cuales 2 salieron mal por lo cua