PRACTICA 04

EFECTO DE LA TEMPERATURA, COFACTORES E INHIBIDORES SOBRE LA

ACTIVIDAD DE AMILASA SALIVAL

OBJETIVO:
 Analizar y verificar los diferentes factores que afectan a la actividad de amilasa
salival.
 Realizar experimentos en diferentes temperaturas, el efecto de un activador e
inhibidor sobre la enzima estudiada

INTRODUCCION
Las enzimas son proteínas específicas que poseen funciones catalíticas, las mismas que
participan en procesos químicos de los organismos vivos, constituyendo la esencia del
metabolismo.
Las características de las enzimas, como su especificidad, su sensibilidad al cambio de
temperatura, la influencia del pH, así como la presencia de activadores e inhibidores, son
determinantes en la actividad de las enzimas.
Las enzimas al actuar sobre un determinado sustrato, lo hacen a una determinada
temperatura, que en anímales oscila entre 36 y 41°C si se sobrepasa la temperatura óptima,
empieza gradualmente la desnaturalización.
Al bajar la temperatura la enzima disminuye su actividad inactivándola más no
desnaturalizándola. La regulación de la actividad de las enzimas se realiza tanto en la célula
como fuera de ella, mediante la fijación sobre molécula de enzima de una serie de
sustancias de bajo peso molecular, tales sustancias pueden causar efecto positivo o
negativo. Los que causan efecto positivo se denominan activadores, estos pueden ser iones,
Na+, K+ Mg+2, Cl-, etc. Los que causan efecto negativo se denominan inhibidores, por
ejemplo, los iones metálicos pesados como el Pb, Ag, Hg.

FUNDAMENTO:
La actividad de la amilasa de la saliva en presencia de activadores e inhibidores puede
verse favorecida o desfavorecida, a la vez que la máxima actividad de la amilasa debe ser a
la temperatura óptima.
La actividad de la alfa amilasa presente en la saliva es de catalizar la hidrólisis de los
enlaces alfa 1,4 glicosídicos del almidón (amilasa más amilopectina), lo que puede
comprobarse con el reactivo de lugol.

MATERIALES Y REACTIVOS:

 Tubos de ensayo, pipetas, goteros, vasos de precipitados, termómetro baño

isotérmico, refrigeradora.
 Solución de saliva.
 Solución de almidón al 1%.
  Solución de NaCl al 0.9%.
 Acetato de plomo.
 Reactivo de lugol (solución de yodo y KI)
 Solución Buffer fosfato PH = 7.

PROCEDIMIENTO:
1. Preparar solución de saliva: enjuagar la boca 2-3 veces con bastante agua.
2. La saliva secretada se vierte en un vaso de precipitados, luego filtrar y guardar en un
tubo de ensayo.
3. Rotular 10 tubos de ensayo y proceder de acuerdo al siguiente cuadro:

Temperatura 37oC 0oC Ebull 37oC 0oC ebull

Reactivos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tubos de ensayo

Sol. de almidón 1 % (mL) 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 --- --- --- --- ---

Buffer fosfato pH 7.00 (mL) 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 --- --- --- --- ---

NaCl al 0.9% (mL) --- --- --- --- --- --- 0.5 --- --- ---

Acetato de Pb al 1% (mL) --- --- --- --- --- --- --- 0.5 --- ---

Agua destilada (mL) 1.00 0.50 0.50 1.00 1.00 --- --- --- --- ---

Sol. de saliva (mL) --- --- --- --- --- 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

4. Homogenizar los tubos 1, 2, 3, 4 y 5.

5. Colocar a un baño isotérmico regulado a 37°C los tubos 6, 7 y 8. El
tubo 9 a 0°C y el tubo 10 a temperatura de ebullición. Todos por un tiempo de 5 min
6. Luego trasvasar el contenido de los tubos 6, 7, 8, 9, y 10 a los primeros tubos
respectivamente y volver a colocar a 37°C los 3 primeros, el 4to a 0oC y el 5to a
ebullición por el tiempo de 10 min.
7. Sacar del baño isotérmico, añadir a todos los tubos 2.00 mL de HCl 0.1N y 1
gota de lugol.
8. Observar las coloraciones que presentan con el lugol después de la hidrólisis
enzimático.

CUESTIONARIO
1. Que otras enzimas participan en la digestión de los carbohidratos. Explique la
función de cada una.
2. Explique los resultados de la hidrólisis del almidón por la enzima amilasa salival en
cada uno de los tubos de ensayo
3. Escriba la estructura del complejo almidón-lugol, color azul.
 PRACTICA Nº 05

HIDRÓLISIS ÁCIDA ESCALONADA DEL ALMIDÓN

OBJETIVO
 Realizar la hidrólisis ácida del almidón.
 Verificar la presencia de monómeros con los reactivos respectivos.

INTRODUCCION
En el curso del calentamiento del almidón con ácido clorhídrico concentrado, el almidón se
descompone con la formación de los fragmentos de diferentes tamaños llamados
dextrinas. La hidrólisis de un polisacárido como el almidón produce azucares de peso
molecular cada vez menor, hasta convertirse íntegramente en monosacárido (s) y la forma
de distinguirlos es cuando toma diferentes colores al reaccionar las dextrinas con el reactivo
de lugol.
Método de Wislow: Se basa en la propiedad de la amilasa de descomponer al almidón.

FUNDAMENTO
Una vez hidrolizado el almidón en glucosa en medio ácido y por efecto de temperatura se
comprueba la presencia de este carbohidrato simple mediante la reacción de Fheling:

MATERIALES
 Tubo de ensayo (20 tubos)
 Un tubo de ensayo 25 mL
 Dos gradillas
 Hornilla eléctrica
  Pipetas 1, 5 y 10 mL
 01 Vaso de precipitado de 100 mL
 Frasco lavador
 Baño isotérmico
REACTIVOS
 Cloruro de sodio al 1%
 Solución de almidón al 0,1 y 1%
 Solucion de NaOH al 10%
 Lugol
 Reactivo de Fehling o Reactivo deTollens
 HCl concentrado
 Solución de NaOH al 10%

PROCEDIMIENTO
Preparar en una gradilla 10 tubos de ensayo previamente enumerados con 5 mL de agua
destilada y 2 gotas de lugol.
En un tubo de ensayo se vierten 5 mL de solución de almidón y se añade 1 ml de HCl (c),
se mezcla y se hierve. Luego de 1 a 2 minutos de iniciada la ebullición se toma una
muestra y se vierte al primer tubo de ensayo y se observa la coloración, luego se toma
muestras a cada minuto y se hace la prueba del lugol hasta que la reacción sea negativa
(color amarillo).
El hidrolizado del almidón se neutraliza con solución de Hidróxido de sodio y se realiza la
prueba de Fheling o Tollens. La aparición de un precipitado rojo indica la presencia de
azucares reductores producto final de la hidrólisis acida del almidón.

CUESTIONARIO
1. Indicar la escala de coloraciones que se producen en cada tiempo al hacer la prueba
con lugol
2. Mencione el tiempo que demora la hidrólisis completa del almidón.
3. La hidrólisis acida del almidón en caliente y en frió producirá los mismos
resultados. Justifique su respuesta
4. Cuál es la diferencia entre hidrólisis acida y enzimático del almidón.
 PRÁCTICA 06

CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA EN SUERO

OBJETIVO

 Cuantificar la cantidad de glucosa en el suero sanguíneo por el método

enzimático espectrofotométricamente.

INTRODUCCIÓN

La glucosa es el principal carbohidrato de la dieta, se forma como producto final de la

digestión de los hidratos de carbono. Al ser absorbida, la glucosa pasa a la circulación
sanguínea y la homeostasis de ésta es regulada por los niveles hormonales de insulina y
glucagon.

Normalmente no se excreta glucosa por vía urinaria, esta pasa libremente al filtrado
glomerular donde alcanza la misma concentración que en la sangre, pero es absorbida
completamente por el epitelio tubular, de esta manera el riñon contrarresta la acumulación
excesiva de glucosa y cuando alcanza niveles entre 160 y 200 mg/dl en sangre, se produce
la glucosuria.

La glucosa se polimeriza a glucógeno en el hígado y músculos y se almacena en dichos

órganos. Durante los períodos de hambre y de ayuno se degrada la reserva energéticas de
polímeros a monómeros que después son captados por los diversos órganos para la
obtención de energía.

FUNDAMENTO

La cuantificación de la glucosa por el método enzimático se desarrolla en base a las

siguientes reacciones

GOD
Glucosa + O2 + H2O —————> Acido Glucónico + H2O2

POD
2H2O2 + 4-AF + Fenol —-—-——> Cromógeno + 4H20
(quinona coloreada)

GOD Glucosa Oxidasa

POD Peroxidasa

Valores de referencia
Suero o plasma 0.7 – 1.10 g/L (70 – 110 mg x 100 mL)
MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivo de trabajo: GOD, POD, 4- aminofenazona, fenol.

Estándar: Solución de glucosa 1.00 g/L
Muestra: Suero o plasma

PROCEDIMIENTO

En tres tubos fotocolorímetro colocar:

Blanco Sol. Stándar Desconoc

Sol. Estándar (mL) -- 0.02 --
Muestra (mL) -- -- 0.02
Reactivo de trabajo (mL) 2.00 2.00 2.00

Incubar 10 minutos en baño de agua a 37 grados. Luego leer su absorbancia en

espectrofotómetro a 505 nm, llevando a cero el aparato con el blanco.

CÁLCULOS

Glucosa g/L = Abs. Desconocido * 1.00 g/L

Abs. Estándar

CUESTIONARIO

1. Determine la concentración experimental de glucosa en la muestra y compare

con los niveles normales que indica en la referencia.
2. Explique las vias metabólicas de los carbohidratos que contribuyen a la
produccion de energía en forma de ATP y NADH en el organismo.
3. Indique la razon por la que se requiere desproteinizar la muestra para la
deterninacion de glucosa y su funcion en el organismo.
4. Explique el fundamento de determinacion de glucosa mediante reacciones
quimicas.