Técnicas de secuenciación

Luzelena Gpe. Mendoza de la Peña

 Secuenciación del ADN

 La secuenciación del ADN es un conjunto de métodos y técnicas

bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos
(A, C, G y T) en una molécula de ADN.
 La secuencia de ADN constituye la información genética heredable que forman la
base de los programas de desarrollo de los seres vivos.
 En la doble hélice de ADN, las cuatro bases químicas se unen siempre con la misma pareja para
formar "pares de bases".
 Este emparejamiento es la base para el mecanismo mediante el que las moléculas de ADN se
copian cuando las células se dividen.
 El genoma humano contiene alrededor de tres mil millones de pares de bases que detallan las
instrucciones para crear y mantener a un ser humano.
 Secuenciación de Sanger

 Consiste en hacer muchas copias de una región blanco de ADN. 

 La muestra de ADN que se secuenciará se combina en un tubo con el cebador ( fragmento
pequeño de ADN monocatenario que se une al molde de ADN y actúa como un "iniciador" de la
polimerasa), la ADN polimerasa y los nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dGTP y dCTP). 
 Se añaden los cuatro nucleótidos didesoxi, terminadores de la cadena, cada uno marcado con
pigmentos de color diferente.
 Primero se calienta la mezcla para separar las cadenas de ADN y luego se enfría
para que el cebador pueda unirse al molde de cadena sencilla.
 Se eleva la temperatura para que la ADN polimerasa pueda sintetizar ADN a
partir del cebador.
 La ADN polimerasa añadirá nucleótidos a la cadena hasta que aleatoriamente
agregue un nucleótido didesoxi en lugar de uno normal.
 Este proceso se repite cierto número de ciclos, los
fragmentos pasan por electroforesis capilar en gel.
 La secuencia del ADN se lee a partir de los picos en el
cromatograma.
Método de degradación química (Maxam and
Gilbert)
 El método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación
del fragmento de ADN que se desea secuenciar.
 El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos
de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T).
 Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en
gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas,
pero una al lado de la otra.
Método enzimático de terminación de cadena

 Se deben realizar en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción, cada

mezcla contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP y dGTP),
ADN polimerasa , un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido didesoxi.
 En cada mezcla de reacción se producen una serie de moléculas de ADN de nueva
síntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucleótido y
marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo
5' el cebador utilizado).
 Los fragmentos de ADN obtenidos en cada mezcla de reacción se separan, los productos de cada
una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro carriles diferentes del gel.
 Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película fotográfica de
autorradiografía.
 La aparición de una banda en una posición concreta de la autorradiografía en una de las cuatro
calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al
ADN molde) está la base correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de
reacción correspondiente.
 Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5' a 3', comenzamos a leer
el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamaño de
los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva síntesis en la dirección
5' a 3'.
Método de secuenciación automática

 Se utiliza fluorescencia y se realizan 4 mezclas de reacción, cada una con

nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto.

 La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a

cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de
ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel,
permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden
determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.