PRINCIPIO DE SECUENCIACIÓN

de Sanger

PRINCIPIO Y OBJETIVO ¿QUÉ UTILIZÓ?

Desarrollado por Frederick Sanger
en 1977, y fue la base de las
técnicas utilizadas para secuenciar
el genoma humano. Es un método
rápido
Didesoxinucleótidos trifosfatados
(ddNTP), iguales que los dNTP
pero sin el grupo hidroxilo en el
carbono 3’ de la desoxirribosa.
Pueden incorporarse a una cadena de
ADN en crecimiento por medio de la
ADN polimerasa, pero actúan como
terminadores porque, una vez
incorporados a la cadena, y al no
contar con el OH en el extremo 3’,
no permiten que se una otro
nucleótido.

¿EN QUÉ CONSISTE EL PROCESO?

En encontrar diferentes cadenas, tantas como número de bases

tenga el fragmento que son copias de la cadena de ADN que se
va a secuenciar, cada uno de un tamaño diferente y terminado
con la incorporación de un 2’ 3’ didesoxinucleótido.
 PRINCIPIO DEL MÉTODO "DIDEXOSI"
1.Se aísla y se clona el ADN que
se desea secuenciar; este ADN se
desnaturaliza y se emplea una sola
hebra en la secuenciación.
2.En la secuenciación se utiliza un
iniciador o primer marcado
radiactivamente, el cual usualmente
es un fragmento de restricción,
que suministra el extremo 3’ OH
que necesita la ADN polimerasa
para continuar la adición de
nucleótidos.
3. El iniciador y el molde de
ADN se alinean para formar un
complejo iniciador-molde y la
mezcla resultante se divide en
cuatro partes. Con estas mezclas
se preparan cuatro tubos de
reacción, cada uno con el ADN
molde de hebra sencilla que se
desea secuenciar, la ADN
polimerasa, el iniciador marcado
radiactivamente y los cuatro dNTP.
4. A cada tubo se le añade uno de
los ddNTP en exceso, es decir, en
mayor proporción respecto a su
dNTP convencional.
5. En cada uno de estos tubos se
producirán cadenas de ADN de
distintas longitudes, terminando
todas en el lugar en el que se
incorporó el “didesoxi”
correspondiente (ddATP, ddTTP,
ddGTP, ddCTP) añadido al tubo.
 CONCLUSIÓN

1. Sanger utilizó didesoxinucleótidos para provocar la terminación de la cadena durante la síntesis de ADN in
vitro.
2. La electroforesis de los productos en cada tubo de reacción clasificaría las cadenas terminadas por tamaño.

3. El análisis de la posición de los fragmentos en el gel revelaría la secuencia. El nucleótido en el extremo 3'
del fragmento recién sintetizado más largo sería complementario al primer nucleótido en el extremo 5' de la
plantilla desconocida. El siguiente fragmento más largo terminaría con el complemento del siguiente
nucleótido, y así sucesivamente.