Cinética de las reacciones enzimáticas

y factores que afectan la actividad de

las enzimas
Substrato: molécula(s) sobre la(s) que actúa la enzima

Actividad enzimática: velocidad a la que cursa la reacción

enzimática
Velocidad: variación de la concentración de producto en la unidad
de tiempo
Unidades:
katal: moles.s-1
U.I.: moles.min-1 (a 25ºC)

La velocidad es directamente proporcional de la concentración

de enzima; por tanto, la velocidad es una medida de la concen-
tración de enzima en una preparación.
 Concepto de velocidad inicial

d[ ]
[ ] v = dt , t -> 0
p

t
Variables que influyen en la velocidad de una
reacción enzimática

1. Concentración de enzima

2. Concentración de substrato

3. pH

4. Temperatura

5. Efectores (Activadores e Inhibidores)

Efecto de la concentración de enzima: relación lineal

. . .
. .
. . .
.. .
[E]
 S
Una cinética lineal implica
un proceso regenerativo,
cíclico
ES
E

EP

Ciclo catalítico
de una enzima

P
 Efecto de la concentración de substrato

. . . .
v
.
.
.
.
[s]
Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hay un número limitado de sitios en la enzima

para fijar substrato; una vez que están ocupados
todos, por mucho que aumente la concentración
de substrato, la velocidad permanecerá constante
tendiendo a un valor asintótico

k+1 k+2
E+S ES E+P
k-1
Hipótesis de Michaelis - Menten

k+1 k+2
E+S ES E+P
k-1
- La primera parte del mecanismo,

k+1
E+S ES
k-1
Tiene lugar mucho más rápidamente que la segunda:

k+2
ES E+P
 Hipótesis de
Michaelis-Menten
 E  S  es e 0  x s
Km   
Equilibrio rápido
ES  x x

e0 s k 2 e 0 s
x v  k 2 x v k 2 e 0  V m ax
Km  s Km  s

V m ax s
v
Km  s
 Hipótesis de estado estacionario

hay un tiempo relativamente prolongado en el curso de la

reacción en el que la variación de complejo [ES] es prácticamente
igual
a cero:
dx/dt = k+1es - (k-1 + k+2) x = 0

A partir de esta expresión podemos llegar a obtener una

expresión que nos da la velocidad para la concentración
de substrato
dx
 0  k 1 es  k 1  k 2 x
dt

k 1 es  k 1 e 0  x s  k 1  k 2 x

e0 s e0 s
x 
k 1  k 2 Km  s v  k 2 x k 2 e 0  V m ax
s
k 1

V m ax s
v Hipótesis de
Km  s estado estacionario
Tanto con las suposiciones de Michaelis-Menten como con
Las de estado estacionario, llegamos a la ecuación

Vmaxs
v=
Km + s

La única diferencia radica en el significado de Km:

Km = k-1/k+1 en mecanismo de M.M.

Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.

Significado de la constante Km

1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES

(en condiciones de equilibrio rápido)

2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato

(en condiciones de equilibrio rápido)

3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)

4. Concentración de substrato para la que la velocidad se hace

igual a la mitad de la máxima (s0.5)

5. Se define para una pareja enzima-substrato

6. Se mide en unidades de concentración

Significado de la constante Vmax = k+2 e0

1. Velocidad asintótica para s 

2. Directamente proporcional a la concentración de enzima

(hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k +2)

3. Mide función de transformación catalítica

4. Se expresa en unidades de velocidad

 Representación directa

v
100
Vmax
80

60
Vmx s
v
40 Km  s

20

s
0
0 20 40 60 80 100

Km
 Representación recíproca doble
(Lineweaver - Burk)

0.04

1/v
0.03

1/Vmax
0.02

1 Km 1 1
-1/Km   
0.01 v Vmx s Vmx

0.00
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/s
 Representación s -s/v
(Eadie - Hofstee)

1.2

s/v
1.0

0.8

0.6 x
ma
1/V
s 1 Km
-Km
0.4
 s 
v Vmx Vmx
0.2

0.0
-20 0 20 40 60 80 100 120

s
 Representación v/s - v
(Wong - Hanes)
Vmax

v 100

v
v   K m   Vmx
80
-K s
m

60

40

20

v/s
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Efecto del pH

pH
Efecto del pH

1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:

- Grupos disociables de la enzima
- Grupos disociables del substrato

2. Sobre la transformación catalítica del substrato

3. Sobre la estructura de la proteína enzimática

 NH Arg
C
-
+
H 3N NH
COO
CH2 CH
CH2
COO-
+ Lys
H 3N

CH

Succinato y
centro activo de SDH
pH 7
 NH
C
+
H 3N NH
COOH
CH2 CH
CH2
COOH
+
H 3N

CH

Succinato y
centro activo de SDH,
pH 2
 NH
C
H 2N NH
COO-
CH2 CH
CH2
COO-
H 2N

CH

Succinato y
centro activo de SDH,
pH 13
Efecto del pH en la velocidad de reacción enzimática
Tipos de catálisis en
Cinética Enzimática

CATALISIS
ENZIMATICA
 Catálisis ácido-básica
Catálisis por la transferencia de un protón (H 3O+)
al sustrato.
A) General
B) Específica
Catálisis ácida general: producida tanto por ácidos fuertes como
débiles, que pueden donar también protones al reactivo o sustrato
Catálisis ácida específica: producida en presencia de ácidos fuertes, el
catalizador es el ión hidronio, que está en una concentración
elevada solo en las disoluciones de ácidos fuertes
 Catálisis básica general
Ocurre en soluciones tamponandas, por lo que la reacción química
no se ve afectada por la concentración de hidrogeniones o
hidroxilos.
En la catálisis general, tanto el OH- como las bases débiles pueden
aceptar el protón.
KH y KOH se consideran despreciables
Las constantes de velocidad son principalmente dependientes de la
concentración del par acido básico conjugado a fuerza iónica
constante.
 Catálisis básica específica
• En la catálisis específica hay transferencia del
protón del sustrato hacia el ión OH-
• Ocurre en el caso en que la velocidad de
reacción química es proporcional solamente a la
concentración de protones e hidroxilos
 Constantes de velocidad observadas en las
reacciones catalizadas
• Para estudiar la catálisis se miden las velocidades de
reacción frente a catalizadores diferentes, y para un
catalizador a distintas concentraciones, calculándose así
la k obs
• Al graficar la kobs vs la concentración del catalizador,
se obtendrán rectas cuya pendiente es la constante de
velocidad para un sistema dado siendo
k obs= ko + k cat (catal)n
• La ordenada en el origen es ko
 Proceso de la catálisis
• En la catálisis heterogénea se pueden
distinguir 5 etapas:
- difusión de los reactivos hacia la superficie del
sólido
- quimisorción de al menos uno de los reactivos
- reacción química
- desorción de los productos
- difusión de los productos desde la superficie
 Catálisis covalente
Implica la formación de un enlace covalente transitorio. Consideremos la hidrólisis de un
enlace entre los grupos A y B.
• A-B ⁺ H2O ⁼ A + B
• En presencia de un catalizador covalente (una enzima con un grupo nucleofílico X:)
la reacción se transforma en:
• A-B + X: → A-X + B ⁺ H2O → A + X: + B

Esto altera la ruta de la reacción y sólo produce catálisis si la nueva ruta tiene una energía de
activación inferior que la ruta no catalizada. Los dos nuevos pasos han de ser más rápidos que la
reacción no catalizada.
• Ciertos grupos funcionales de algunos cofactores sirven como nucleófilos en algunas enzimas
para la formación de enlaces covalentes con los sustratos (acil-enzimas, fosforil –enzimas,
glucosil-enzimas, bases de Schiff)
• Grupos nucleófilos: H2O, OH-, SH, NH2-
 Características de un buen
catalizador covalente
• Buen nucleófilo
• Buen grupo saliente
• Grupos con elevado grado de polarización
(con electrones altamente móviles)
 Papel de los metales en la catálisis

• Catálisis por iones metálicos: son captados de la solución junto con otros
reactivos.
• Pueden participar de diferentes maneras en la catálisis:

 Interacciones iónicas entre un metal fijado a la enzima y el sustrato

 Ayuda a la orientación a un sustrato para que reaccione o para
estabilizar estados de transición de la reacción que estén cargados.
 Los metales también pueden facilitar reacciones de óxido reducción
mediante cambios reversibles en el estado de oxidación del ión metálico.
 Puede unir moléculas de agua más acídicamente que ésta y se convierte en
fuente de hidroxilos (OH-) aún por debajo del pH neutro.

M₊ en presencia de H2O es M ⁺(OH-)

Efecto de la temperatura

T
En el efecto de la temperatura hay dos componentes:

1. Aceleración de la reacción según la ecuación

de Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT)

2. Desnaturalización térmica de la proteína

Efecto de la temperatura en la actividad enzimática
En condiciones de saturación:
A T bajas: v = k2 [ET] Actividad: k2 = A2 exp (-Ea / RT)
A T altas: E  D KD = [D] / [E] inactivación térmica reversible
[ET] = [E] + [D] = [E] (1 + KD)
Actividad : k2 = v / [ET] = k2 / (1+KD)
Actividad: A2 exp (-Ea / RT) / ( 1 + AD exp(-ED/RT)
E  D  I inactivación térmica irreversible d[ I ]/dt = kI [D]
[ET] = [E] + [D] + [ I ] = [E] (1 + KD) + [ I ]
d [ET] /dt = 0
d [E] /dt = - kI KD [E] / ( 1+KD)
La [E] depende del tiempo

Actividad residual de peroxidasa de hojas de

Dependencia del tiempo de la medida de actividad en la
determinación de la temperatura “óptima”