1 UI es la cantidad de enzima que transforma 1 µmol de S (P) en 1 min en unas

condiciones de trabajo definidas

20 mmol NO 2- 1
= 40 mmol/min ml E = 40 UI/ml E
5 min 0,1 ml E

b) La actividad específica de la muestra

Es la relación entre la cantidad de enzima (unidades de actividad) y el contenido en

proteína (mg) de la muestra

40 UI 1ml E
= 80 UI/mg
ml E 0,5mg
 c) La actividad total de 100 ml del preparado expresada en katal

1 katal es la cantidad de enzima que transforma 1 mol de S (P) en 1 segundo en las

condiciones de trabajo

40 UI 40 mmols S 1mol S 1min

= 100ml E = 6,67 10-5 molS/s = 6,67 10-5 kat
ml E min ml E 106 mmol S 60 s

d) El valor de la kcat (número de recambio o actividad molar ) del enzima

k1 k2
E+S ES E+P
k-1
Vmax = k2 [ET]
[E]T = [E] + [ES]

Vmax [S]
v0=
Km +[S]
 c) La actividad total de 100 ml del preparado expresada en katal

1 katal es la cantidad de enzima que transforma 1 mol de S (P) en 1 segundo en las

condiciones de trabajo

40 UI 40 mmols S 1mol S 1min

= 100ml E = 6,67 10-5 molS/s = 6,67 10-5 kat
ml E min ml E 106 mmol S 60 s

d) El valor de la kcat (número de recambio o actividad molar ) del enzima

Vm = kcat [ET] Vm Preparado puro → toda la proteína es

enzima
[E]
80 UI/mg
50000 g/mol
80 µmol S 1 mol S 103 mg 50.000 g
= 4.000 min -1 = 66,66 s -1
min mg prot 106 µmol S 1g 1 mol E
mol S
s mol E
e) El valor de la kcat por centro activo, si se sabe que la nitrato reductasa tiene dos
centros de unión y de transformación del substrato que son idénticos e independientes

4000 mol S 1 mol E

= 2000 min -1 = 33,33 s -1
min mol E 2 mol CA

f) El tiempo necesario (en s) para que un mol del enzima transforme un mol
de nitrato en un mol de nitrito

1 min mol E 60 s
= 0,015 s
4000 mol S 1 min
 Determinació dels Paràmetres cinètics : Km i Vm
En general, les dades cinètiques (v0 i [S]) s’analitzen per regressió no-lineal

Vm [S]
v0 =
Km + [S]

V
Vmax * *
*

Plotting V against S is an unsatisfactory plot: it is *

* * *
*
*
difficult to draw a rectangular hyperbola Vmax/2 * *
*
accurately *

S
Km

Lineweaver and Burk (1934) preferred to rewrite the Michaelis-Menten equation in a

way that allow the results to be plotted as points in a straight line.
Determinació dels Paràmetres cinètics : Km i Vm
•S’obtenen equacions derivades que representen una recta i són més fàcils d’analitzar

v0 KM + v0 [S] = Vm [S]
Vm [S]
1/v0 = (Km+ S)/Vm[S] v0 =
Km + [S] v0 [S] = - v0 KM + Vm [S]

1 Km 1 1 v0
= . + v0 = - Km . + Vm
v0 Vm [S] Vm [S]

1/v 0 v0

X Vm
Km
pendent =
Vm
pendent = -Km
X 1
Vm
X 1/[S] X v 0/[S]

LINEWEAVER-BURK
EADIE-HOFSTEE Vm / Km
-1/ Km (DOBLE RECÍPROCA)

Linearitzacions
4) La fumarasa cataliza la hidratación del fumarato en L-malato según la reacción:

-
OOC-CH=CH-COO- +H2O  -OOC-CHOH-CH2-COO-

Este enzima está constituido por cuatro subunidades idénticas y tiene un peso molecular de 194.000 Da.
Para calcular los parámetros cinéticos de la reacción se determinaron las velocidades iniciales del sistema
enzimático a pH 5,7 y 25°C, trabajando con [Fumarato] variables y una [Fumarasa] = 2mM. Los
resultados obtenidos fueron:

Fumarato (mM) v (mM / min)

0.8 1.43
1.3 1.97
2.0 2.50
3.3 3.10
5.0 3.60
10.0 4.08

Calcular los valores de la Vmax, de la KM (fumarato) , de la kcat y de la kcat por centro activo.
 1/1/Fumarato (mM-1-1) )
Fumarato(mM 1/v (mM
1/v min)-1-1
(mM // min)
1,25
1,25 0,700
0,700
0,77 0,510
0,77 0,510
0,50 0,400
0,50 0,400
0,30 0,320
0,30 0,320
0,20 0,278
0,20 0,278
0,10 0,245
0,10 0,245

1 KM 1 1
= . + 1/v (min/mM) y = ax + b
v0 Vm [S] Vm
0,5

Vm = 1/0,2 = 5 mM/min
b= 1/Vm
KM = 1/0,5 = 2 mM
pendent= a =KM/Vm

-0,5 0,5 1/S mM-1 1,0

Vm = kcat [ET] 5 mM/min = kcat 2 µM (10-3 mM/1 µM)

1 min
kcat = 2.500 = 41,67 s-1 kcat/centro activo = 41,67 / 4 = 10,417 s-1
min 60s
5- Se estudió el efecto del pH sobre la actividad de la 6- fosfogluconato deshidrogenasa de hígado de
rata, enzima que cataliza la reacción:

6-fosfogluconato + NADP+  ribulosa-5-fosfato + CO2 + NADPH + H+

Para ello, se trabajó a 25ºC con dos tampones de pHs 7.6 y 9.0, re spectivamente, de la mis ma fuerza
iónica, utilizando [6-fosfogluconato] variables y una [NADP] + constante y saturante. La reacción se
siguió espectrofotométricamente a 340 nm ( NADPH = 6.22 mM-1 cm-1) utiliza ndo cubetas de 1 cm de paso
de luz. La t ransformación de los substratos en productos se inició por adición de 0.1 ml de la muestra
enzimática convenientemente diluída a la cubeta del espectrofotómetro (volumen final de la mezcla de
reacción = 1 ml) de modo que pudieran obtenerse incrementos lineales de la absorbancia durante los 5
primeros minutos de la reacción. Los resultados obtenidos fueron:

[6-fosfogluconato] (A / 5 min) (A / 5 min)

(mM) pH 7.6 pH 9.0
17.4 0.073 0.0337
26.7 0.085 0.0470
52.6 0.100 0.0750
166.6 0.114 0.1280
400.0 0.117 0.1670

Qué conclusiones pueden deducirse al comparar los valores de los parámetros cinéticos de la 6-
fosfogluconato deshidrogenasa obtenidos a pH 7.6 y 9.0, respectivamente.
 Dividiendo por 5

[6-fosfogluconato] (A /5 min) (A / min) UI/mlE (A / 5 min) (A /min) UI/mlE
(mM) pH 7.6 pH 9.0
17.4 0.073 0,0146 0.0337 0,0067
26.7 0.085 0,0170 0.0470 0,0094
52.6 0.100 0,0200 0.0750 0,0150
166.6 0.114 0,0288 0.1280 0,0256
400.0 0.117 0,0234 0.1670 0,0334

Conversión de ΔA en UI

Ley de Lambert y Beer: explica la relación entre absorción de luz por una
sustancia en solución y la concentración de ésta, y la longitud del cuerpo que
la luz atraviesa

A = ε·c·l
A = absorbancia de la disolución a una longitud de onda data (adimensional)
ε = coeficiente de extinción molar (mM-1·cm-1) ( = 6,22 mM-1·cm-1)
l = longitud de paso de la cubeta (cm)
c = concentración de la disolución (mM)
 Dividiendo por 5

[6-fosfogluconato] (A /5 min) (A / min) UI/mlE (A / 5 min) (A /min) UI/mlE
(mM) pH 7.6 pH 9.0
17.4 0.073 0,0146 0,0235 0.0337 0,0067 0,0108
26.7 0.085 0,0170 0,0273 0.0470 0,0094 0,0151
52.6 0.100 0,0200 0,0321 0.0750 0,0150 0,0241
166.6 0.114 0,0288 0,0366 0.1280 0,0256 0,0412
400.0 0.117 0,0234 0,0376 0.1670 0,0334 0,0537

Conversión de DA en UI

A/min = (c/min)  l c/min = (A/min) /  l  = 6,22 mM-1 cm-1

Ejemplo de transformación:

0,0146 1mmol cm 1 1L cubeta 1ml cubeta 0,0235 mmol 103 mmol

=
min 6,22 1L cubeta cm 103ml cubeta 0,1mlE 103 min mlE 1mmol

= 0,0235 mmols/min mlE = 0,0235 UI/mlE

1/[6-fosfogluconato] 1/v (min ml/ mmol) 1/v (min ml/ mmol)
(mM)-1 pH 7.6 pH 9.0
0,0575 42,55 92,59
0,0374 36,63 66,22
0,0190 31,20 41,49
0,006 27,32 24,27
0,0025 26,60 18,62

1/v pH = 9

pH = 7,6

25,5 pH=7,6 pH=9

Vm = 0,0392 m mol/min ml Vm = 0,0625 m mol/min ml

16 KM = 11,63 mM KM = 83,33 mM

-0,086 -0,012 1/S

Globalmente ¿es mejor o peor a uno de los dos pH?
Para saber a qué pH es globalmente mejor calculamos la eficiencia enzimática kcat/KM

Como para ambos pH se ha utilizado la misma [ET] y kcat = Vm/ [ET]

(Kcat/ KM) pH 7,6 (Vm/KM) pH 7,6 0,0392/11,63

= = = 4,493
(Kcat/ KM) pH 9 (Vm/KM) pH 9 0,0625/83,33

La eficacia enzimática de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa en estas condiciones

es aproximadamente 4,5 veces superior a pH 7,6 que a pH 9
 MANERA DE DIFERENCIAR ELS INHIBIDORS

COMPETITIU ACOMPETITIU NO COMPETITIU MIXTE

E + I EI E + I EI E + I EI
ES + I ESI ES + I ESI ES + I ESI

Vmax [S] Vmax [S] Vmax [S] Vmax [S]

v0 = v0 = v0 = v0 =
[I] [I] [I] [I] [I]
KM 1 + + [S] KM + [S] 1 + ( KM+ [S] ) 1 + KM 1 + K + [S] 1 +
Kip Kii Ki i Kii
p
[I] [I] [I]
Vmax(I) = Vmax Vmax(I) = Vmax 1+ Vmax(I) = Vmax 1+ Vmax(I) = Vmax 1 +
Kii Ki Kii
[I] [I] [I] [I]
KM(I) = KM 1 + KM(I) = KM 1 + KM(I) = KM KM(I) = KM 1 + 1+
Kip Kii Kip Kii
1 1 1 1
v v v v

[I]  [I] 
[I]  [I] 

[I] = 0 [I] = 0
[I] = 0
[I] = 0

1 1 1 1
[S] [S] [S] [S]
6- Se analizaron las constantes cinéticas de la succinato deshidrogenasa utilizando diferentes
concentraciones de substrato y determinando, en cada caso, los valores de la velocidad inicial de la
reacción. Se realizó un segundo experimento en las mismas condiciones, pero en presencia de una
concentración constante (10 µM) de un inhibidor reversible total del enzima. Los resultados obtenidos se
presentan a continuación:

[Succinato] v (mkatal / ml) v (mkatal / ml)

(mM) Sin inhibidor Con inhibidor
0.125 0.28 0.11
0.166 0.34 0.14
0.250 0.43 0.20
0.500 0.63 0.33
1.180 0.81 0.56
3 0.94 0.78

Se pide:
a) Calcular los parámetros cinéticos del enzima en ausencia del inhibidor
b) Cuál es el tipo de inhibición que ejerce el inhibidor y el valor de la KI
c) Calcular la concentración de substrato que satura al enzima en un 80%, tanto en ausencia del inhibidor
como en presencia de éste a concentraciones de 1 µM y de 10 µM, respectivamente.
 -1 -1
1/ [Succinato] 1/v (mkatal / ml) 1/v (mkatal / ml)
(mM)-1 Sin inhibidor Con inhibidor
8,00 3,57 9,09
6,00 2,94 7.14
4,00 2,32 5,00
2,00 1,59 3,03
0,85 1,23 1,78
0,33 1,06 1,28

1/v

COMPETITIVO
K M(I) = 1/0,97 = 1,03 mM 8

K M(I) = KM (1 + I/Ki) 6

I/Ki = (K M(I) / KM ) - 1 4
1/Vm = 0,95 Vm = 1,05 µkat/ml
Ki = 5,15 mM 2

0,95
1/KM = 2,85 KM = 0,35 mM

-6 -4 -2 2 4 6 8 10 1/S

-2,85 -0,97
 Vmax. [S]
Sin inhibidor v0 =
KM + [S]
S80
v/Vm = 0,80 = S80 = 4KM = 1,40 mM
KM + S80

Equació: IC Vmax S
v=
Con inhibidor competitivo Km (1 + I/Ki) + S

S’80
vi/Vm = 0,80 = S’80 = 4KM (1+I/Ki)
KM(1+I/Ki) + S’80
E I S

Si I =1 mM S’80 = 1,68 mM INHIBICIÓ COMPETITIVA

Si I= 10 mM S’80 = 4,12 mM si I augmenta
augmenta la concentració de S
necessària per saturar un 80%
7- En un experimento se estudió la actividad enzimática de la papaína, utiliza ndo como substrato el
hipurato de p-nitrofenilo, encontrándose que este proceso era inhibido de modo reversible por el N-
benzoilamino- acetaldehído:

[Substrato] v (mM / min) v (mM / min)

(mM) Sin inhibidor Con inhibidor (33 mM)
0.040 0.070 0.038
0.066 0.096 0.0568
0.098 0.118 0.075
0.310 0.172 0.137
0.400 0.180 0.150
0.710 0.200 0.175

A partir de la información que aparece en la tabla adjunta se pide:

a) Calcular la KM para el substrato y la Vmax en ausencia del inhibidor
b) Establecer el tipo de inhibición y obtener el valor de la KI.
 7- En un experimento se estudió la actividad enzimática de la papaína, utiliza ndo como substrato el
hipurato de p-nitrofenilo, encontrándose que este proceso era inhibido de modo reversible por el N-
benzoilamino- acetaldehído:

[Substrato] v (mM / min) v (mM / min)

(mM) Sin inhibidor Con inhibidor (33 mM)
0.040 0.070 0.038
0.066 0.096 0.0568
0.098 0.118 0.075
0.310 0.172 0.137
0.400 0.180 0.150
0.710 0.200 0.175

A partir de la información que aparece en la tabla adjunta se pide:

a) Calcular la KM para el substrato y la Vmax en ausencia del inhibidor
b) Establecer el tipo de inhibición y obtener el valor de la KI.

1/substrato (mM)-1 1/v (min/mM) 1/v (min/mM) 1/v

I = 33 mM
______________________________________________________ (min/mM) 20 -
25,00 14,29 26,32
15,15 10,42 17,60
10,20 8,47 13,33 I =0
3,23 5,81 7,30
2,50 5,56 6,67
1,41 5,00 5,71
______________________________________________________
4,5
I=0
1/Vm = 4,5 min/mM Vm = 0,22 mM/min -11 -5 20
1/S (mM-1)
-1/Km = -11 Km = 0,091 mM
KM(I) = KM(ap) = 1/5 mM-1 = 0,2 mM
 b) Establecer el tipo de inhibición y obtener el valor de la KI. [I]
Km (I) = Km . (1 + )
KI
KM(I) = KM(ap) = 1/5 mM-1 = 0,2 mM
INHIBIDOR COMPETITIVO
KM (ap) = KM (1 + I/KI)
(KM (ap) / KM ) - 1 = I/ KI
KI = I/ ((KM (ap) / KM ) - 1) = 27,5 mM

c) Cuanto valdría la kcat de la reacción en ausencia y en presencia de N-benzoilamino-acetaldehído 0.1 mM,

si se sabe que en ambos casos en el medio existe una concentración saturante de substrato y que la
concentración de papaína utilizada en el experimento es de 1,2 .10 -7 M.

= Vm =ordenada = 1/Vm
[I]
Km pendent = (Km/Vm) (1 + )
KI
Al ser un inhibidor competitivo no se modifica el valor de la Vm

VM = kcat [E]T 0,22 mM/min = kcat x 1,2 10-7 M x 103 mM/M

kcat = 1830 min-1 = 30,5 s-1

d) Calcular la fracción de enzima unida al substrato en ausencia de inhibidor, cuando la concentración de

hipurato de p-nitrofenilo es de 0.066 mM
El valor de v para [S] = 0,066 mM en ausencia de inhibidor aparece Vmax. [S]
en la tabla del enunciado y es v = 0,096 mM/min v0 =
KM + [S]

En estas condiciones la fracción de enzima unida al substrato será: v/Vm x 100

(0,096/0,22) x 100 = 43,64% del ET
8- La UDP-glucosa pirofosforilasa cataliza la reacción reversible:

glucosa-1-fosfato + UTP  UDP-glucosa + PP i

Se comprobó que el pirofosfato inhibía reversiblemente la síntesis de UDP-glucosa, por lo que se estudió
la cinética del enzima para conocer el comportamiento de este inhibidor. Los resultados obtenidos
trabajando con [UTP] variables, en presencia de una concentración constante y s aturante de glucosa-1-
fosfato, se presentan en la tabla siguiente:

[UTP] v (nmol / min.ml) v (nmol / min.ml)

(mM) Sin inhibidor Con inhibidor (4 mM)
0.025 2.00 0.67
0.050 2.97 1.02
0.1 4.00 1.37
0.2 5.00 1.67
0.5 5.56 1.89

a) Calcular la Vmax del sistema y la KM del UTP en ausencia del inhibidor

b) Identificar el tipo de inhibición ejercido por el pirofosfato y calcular el valor de la KI.
 8- La UDP-glucosa pirofosforilasa cataliza la reacción reversible:

glucosa-1-fosfato + UTP  UDP-glucosa + PP i

Se comprobó que el pirofosfato inhibía reversiblemente la síntesis de UDP-glucosa, por lo que se estudió
la cinética del enzima para conocer el comportamiento de este inhibidor. Los resultados obtenidos
trabajando con [UTP] variables, en presencia de una concentración constante y s aturante de glucosa-1-
fosfato, se presentan en la tabla siguiente:

[UTP] v (nmol / min.ml) v (nmol / min.ml)

(mM) Sin inhibidor Con inhibidor (4 mM)
0.025 2.00 0.67
0.050 2.97 1.02
0.1 4.00 1.37
0.2 5.00 1.67
0.5 5.56 1.89

a) Calcular la Vmax del sistema y la KM del UTP en ausencia del inhibidor

b) Identificar el tipo de inhibición ejercido por el pirofosfato y calcular el valor de la KI.

1/[UTP](mM) 1/v (min ml/nM) 1/v (min ml/nM)

-1

-I +I
______________________________________________
40 0,50 1,49 1/v I = 4 mM
20 0,34 0,98 min ml/nM
10 0,25 0,73 1
5 0,20 0,60
2 0,18 0,53 0,47
___________________________________________ I=0
0,5
I=0 0,16

1/VM = 0,16 VM = 6,25 nM/min ml -40 -20 20 40

1/KM = 18,5 KM = 0,054 mM -18,5 1/S ( mM) -1
b) Identificar el tipo de inhibición ejercido por el pirofosfato y calcular el valor de la K I.

El PPi es un inhibidor NO COMPETITIVO PURO

INHIBIDOR Vm
No COMPETITIU =K
m

Vm
Vm (I) =
KM(I) = K M = 0,054 mM [I]
(1+ )
KI
1/VM(I) = 0,47 VM(I) = 2,13 nM/min ml

2,13 = 6,25/(1 + 4/KI)

4/KI = (6,25/2,13) -1

KI = 4/ (6,25/2,13) -1

KI= 2,07 mM
9- El enzima ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa cataliza la reacción de fijación del CO2 a la ribulosa-
1,5-bisfosfato. Utilizando una preparación de este enzima purificado a partir de hojas de espinaca, se
comprobó que el cianuro (a concentración 10 µM) inhibía reversiblemente al enzima. Los estudios
cinéticos realizados para identificar el tipo de inhibición proporcionaron los siguientes resultados:

[Substrato] v (mmol 14CO2 fijado/min) v (mmol 14CO2 fijado/min)

(mM) Sin inhibidor Con inhibidor (10 mM)
0.47 2.35 2.10
0.67 3.00 2.63
0.94 3.77 3.15
1.33 4.50 3.68
2.00 5.40 4.25
8.00 7.70 5.55

a) Calcular la Vmax de la reacción y la KM de la ribulosa-1,5-bisfosfato en ausencia del inhibidor

9- El enzima ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa cataliza la reacción de fijación del CO2 a la ribulosa-
1,5-bisfosfato. Utilizando una preparación de este enzima purificado a partir de hojas de espinaca, se
comprobó que el cianuro (a concentración 10 µM) inhibía reversiblemente al enzima. Los estudios
cinéticos realizados para identificar el tipo de inhibición proporcionaron los siguientes resultados:

[Substrato] v (mmol 14CO2 fijado/min) v (mmol 14CO2 fijado/min)

(mM) Sin inhibidor Con inhibidor (10 mM)
0.47 2.35 2.10
0.67 3.00 2.63
0.94 3.77 3.15
1.33 4.50 3.68
2.00 5.40 4.25
8.00 7.70 5.55

a) Calcular la Vmax de la reacción y la KM de la ribulosa-1,5-bisfosfato en ausencia del inhibidor

1/S (mM)-1 1/v (min/µmol) 1/v (min/µmol)

________________________________________
2,13 0,42 0,47 1/v (mim/µmol)
1,49 0,33 0,38 0,4
1,06 0,26 0,32
0,75 0,22 0,27
0,50 0,18 0,23
0,12 0,13 0,18

0,2

1/ Vm = 0,11 Vm= 9,1 µmol/min

0,11
1/Km =0,75 Km = 1,33 mM
-2 -1 1 2 3
-0,75 1/S (mM) -1
b) Cuál es el tipo de inhibición inducida por el cianuro y el valor de la K I.

1/KM(I) = 1,10 KM(I) = 0,91 mM 1/v (mim/mmol)

0,4
1/VM(I) = 0,16 VM(I) = 6,25 µmol/min

INHIBIDOR VMAX 0,16

ACOMPETITIU 0,2
KM

0,11
Lineweaver-Burk I AC
1 1 I Km 1 -2
-1,10
-1
-0,75
1 2 3
1/S (mM) -1
= (1 + )+
v Vm Kii Vm S
Es un inhibidor ACOMPETITIVO

VMAX
VMAX (I) =
[I]
(1 + )
KI 6,25 = 9,10 / (1 + 10/KI) 6,25 (1 + 10/KI) = 9,10

KM 1+ 10/KI =1,46 10/KI = 0,46 KI = 10/ 0,46

KM (I) =
[I]
(1 + )
KI K’I = 21,74 µM