Cinética Enzimática e

Inhibición

Dr. José Luis Cárdenas López

Enzimas de Productos Marinos
Semestre 2014-1
 E+S ES E+P

¿Qué medimos en una rx

enzimática?
[Producto] vs tiempo
O… desaparición de reactante
El steady state (eq. dinámico)
E+S ES E+P
Equilibrio dinámico

d [ ES ] d [ ES ]
=− =0
dt dt
En términos de tiempo…
 k1 k2
E+ S ES E+P
k-1

Usando el enfoque de steady

state
d [ ES ] d [ ES ]
=− =0
dt dt
0=[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)
Requisitos:

1) Cantidades catalíticas de E ( [S]>>[E] )

2) Solo la velocidad inicial (t casi 0), por lo
que P es casi nulo, k-2 es despreciable
3) Steady state (equilibrio dinámico)
 0 =[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)
ET= [E]+[ES]
[E]=ET-[ES]

0 =[ET-[ES]][S]k1 -[ES](k-1+k2)

[ET-[ES]][S]k1 =[ES](k-1+k2)
ET [S]k1 -[ES][S]k1 =[ES](k-1+k2)

ET [S]k1 =[ES](k-1+k2)+ [ES][S]k1

ET [S]k1 =[ES](k-1+k2+[S]k1)

ET [S]k1 =[ES]
(k-1+k2+k1[S])
 ET[S]k1
[ES] =
(k−1 +k2 +k1[S])

ET [ S ]
[ ES ] =
k −1 + k 2
( ) + [S ]
k1

k 2 ET [ S ]
k 2 [ ES ] =
k −1 + k 2
( ) + [S ]
k1
 k 2 ET [ S ]
k 2 [ ES ] =
k −1 + k 2
( ) + [S ]
k1

k2 ET= Vmax

k2[ES]= v
k −1 + k 2 V max[S ]
Km =
k1 v=
Km + [ S ]
 V max[S ]
v=
Km + [ S ]
ecuación Henri -Michaelis- Menten

V max v 1
v= =
Km V max Km + 1
+1 [S ]
[S ]
Victor Henri, francés de padres rusos
(6 Junio 1872 – 21 Junio 1940)

1903
 Leonor Michaelis, alemán
(Enero 16, 1875 – Octubre 8, 1949)

Biochemische Zeitschrift (1913;49:333–

369) Maud Leonora Menten, canadiense
(Marzo 20, 1879 – Julio 26, 1960)
 Michaelis-Menten
100 Velocidad maxima (Vmax)
Velocidad(mmol/ml/seg)

80

60

40

20

0
0 50 100 150 200 250

[Substrato] mmol/ml
Km=1/2 Vmax
 Transformación de Lineweaver
Burk
V max[S ]
v=
Km + [ S ]
Invirtiendo:

1 Km 1 1
= * +
v V max [ S ] V max
 Lineweaver-Burk
0.7

1/Velocidad (mmol/ml/sec)
0.6

0.5

0.4

0.3
1/Vmax
0.2

0.1

-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

1/[Substrato] mmol/ml

-1/Km
 Gráfica Eddie Hoffste
V max[S ]
v=
Km + [ S ]

( Km + [ S ])v = V max[S ]

v[ S ] = V max[S ] − Kmv
v
v = V max − Km
[S ]
Vmax1
2 enzimas?

Vmax2
-Km1

Vo
-Km2

Vo/[S]o
 Parámetros importantes
• Vmax= velocidad máxima
• Km= Constante de Michaelis Menten
(afinidad con el sustrato)
• Vmax/Km=eficiencia fisiológica
• Turnover number (o kcat)= “numero de
recambio” es la cantidad en mol de
sustrato (S) que seran convertidos a
producto (P) por segundo
• Velocidad = conc de enzima (inicio de la
rx)
 Molecularidad
• Cúantas moléculas hay en ambos lados
de la reacción
• A
P 1 reactante, 1 producto (UNI-UNI)
• A+B
P BI-UNI
• A+B+C
P+Q TRI-BI
• Etc.
 Velocidad (Tasa)
• Cantidad (en concentración en un
momento dado)
• A+B
2P
− d [ A] − d [ B]
v≅ ≅ Desaparición de reactivo
dt dt
d [ P]
v≅ aparición de producto
dt
En: concentración/tiempo = M seg-1
 Orden de la reacción
Michaelis-Menten
100
Orden “cero”
Velocidad(mmol/ml/seg)

80

60
Orden mixto
40

1er orden
20

0
0 50 100 150 200 250

[Substrato] mmol/ml
 Orden de la reacción
• Relación entre velocidad y concentración
• A+B
P

v ∝ [ A] n

v ∝ [ B] m

v ∝ [ A] [ B]
n m

v = k[ A] [ B ]n m
k= constante de la tasa (rate constant)
Representa la proporcionalidad
 Orden de la reacción
• Indican la relación de la velocidad de
aparición de producto o desaparición de
reactantes y las concentraciones de
reactantes a un tiempo determinado
• Integrando ecuaciones diferenciales se
llega a ecuaciones que nos pueden decir
la relación a cualquier tiempo de la
reacción
 Orden 0
• La aparición de producto o desaparición
de reactantes (según se mida la actividad)
es independiente de la [reactantes]
k dA dP
A→ P − =k =
dt dt
 Gráficamente
[producto] (M)

Pendiente = k = 0.22 M seg-1

Tiempo (seg)
 1 er Orden
• La aparición de producto o desaparición
de reactantes (según se mida la actividad)
depende de la [reactantes]
k dA dP
A→ P − = kA =
dt dt
( A0 )
Integrando: 2.3 log = kt
( A0 ) − ( P)
Donde Ao es la concentración inicial de reactante y P es la concentración de producto a tiempo t
 Para calcular k
Tiempo (seg) So-P = S (mM) P (mM) So/S ln So/S

0 9.00 0 -
300 8.55 0.45 1.052 0.0506
600 8.12 0.88 1.108 0.1025
900 7.71 1.29 1.167 0.1544
1200 7.32 1.68 1.229 0.2062
1500 6.95 2.05 1.294 0.2577
1800 6.60 2.40 1.363 0.3096
 Gráficamente
0.16

0.14

0.12

0.10
Ln (So/S)

0.08

0.06

0.04

0.02
Pendiente = k= 1.7 x 10-4 seg-1
0.00
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

Tiempo (seg)

OJO: Unidades
 Reacciones multisustrato
E+S ES E+P

• Nomenclatura Cleland (U Wisconsin)

S P

E ES EP E
 2 sustratos 2 productos
E+A+B E+P+Q

VARIAS POSIBILIDADES

1)primera

A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E

Dos entran, dos salen, 2 sustratos, 2 productos (Bi-Bi)

A entra primero, P sale primero “BI-BI ORDENADO”
2) A B P Q

EA EQ

E EB EAB EPQ EP E

B A Q P

El orden de entrar salir es aleatorio

BI-BI ALEATORIO
3) Tercera posibilidad

A P B Q

E EA FP F FB EQ E

La Enzima se convierte (F) durante la rx

Los sustratos no se unen al mismo tiempo,
un producto sale antes de que el segundo entre
BI-BI PING-PONG
 ¿Cómo distinguirlas?
• Union secuencial
– Ordenada
– Aleatoria
– Ping-Pong
• Graficar 1/v vs 1/A a varios niveles de B
 Secuenciales

B
1/v

1/[A]
 Ping-Pong

1/v B

1/[A]
 Inhibición
• Irreversible
• Reversible
– Competitiva
– No competitiva
– Acompetitiva
– Parcial
• Competitiva
• No competitiva
– Mezclada
• 3 Tipos (β=0, β=0 y α=β)
Inhibición Competitiva

Et = E+ES+EI
 Km´ [I ]
= (1 + )
Km Ki

1 Km [I ] 1 1
= (1 + ) * +
v V max Ki [ S ] V max
Inhibición no competitiva

Et = E+ES+EI+EIS
 pendiente _ inh [I ]
= (1 + )
pendiente _ o Ki

Grafica Dixon

1 Km [I ] 1 1 [I ]
= (1 + ) * + (1 + )
v V max Ki [ S ] V max Ki
Inhibición acompetitiva

E+S ES E+P
+I

ESI

Et = E+ES+ESI
 >[I]
1/Vmax (1+[I]/Ki)
[I]2
1/Vo
[I]1

control

1/Vmax

1/[S]
-1/Km

1 Km 1 1 [I ]
= * + (1 + )
v V max [ S ] V max Ki
 Inhibición parcial
Et=E+EI+ES+ESI
[ E ][ S ]
• Competitiva Ks =
[ ES ]
Ks
E+S ES E+P
+I +I [ E ][ I ]
Ki =
Ki αKi [ EI ]
EI +S ESI EI+P
αKs

[ EI ][ S ] [ ES ][ I ]
αKs = αKi =
[ ESI ] [ ESI ]
 Parcial competitiva
• El sustrato y el inhibidor se unen en
diferentes sitios activos, ES, EI y ESI
• El sustrato se une mejor a la enzima sola
que a la EI
• Tanto ES como ESI van a producto…
 Gráfica diagnóstica
[I]=∞ pendiente α Ks/Vmax
I
1/v

[I]=Ki

[I]=0 pendiente Ks/Vmax

-1/Ks

-1/αKs
1/[S]
 [ S ] [ S ][ I ]
+
v
= Ks α KsKi
V max 1 + [ S ] + [ I ]
Ks Ki
v [S ]
=
V max [I ]
(1 + )
Ks Ki + [S ]
[I ]
(1 + )
v [S ] αKi
=
V max Ksaparente + [ S ]
 Inhibición parcial
Et=E+EI+ES+ESI

• No Competitiva
Ks kp
E+S ES E+P
+I +I
Ki Ki

EI +S ESI EI+P
βkp
Ks
 Parcial no competitiva
• El sustrato y el inhibidor se unen en
diferentes sitios activos, ES, EI y ESI
• El ESI va a producto pero no tan
efectivamente como ES
 Gráfica diagnóstica
[I]=∞ pendiente Ks/βVmax
I
1/v

[I]=Ki

[I]=0 pendiente Ks/Vmax

-1/Ks 1/[S]
 v [S ]
=
V max [I ] [I ]
(1 + ) (1 + )
Ks Ki + [ S ] Ki
β [I ] β [I ]
(1 + ) (1 + )
Ki Ki

v [S ]
=
V max Ks + [ S ]
 El resto
• No es tan complicado…como parece…
• Consultar capítulo 4 del libro
– Enzyme Kinetics. Segel, I (1975) Wiley Int.
• Si alguien gusta consultarla, yo tengo una
copia del libro, o buscarla en la biblioteca
Inhibición irreversible
 Inhibición irreversible
• No específicos
– Modificación química, son importantes para detectar
los grupos que están presentes en el sitio activo:
– Lys DNFB (dinitrofluorobenceno), Cys iodoacetato,
bromo, MMTS (sulfonato de metilmetanotiol)
• Etiquetadores de “afinidad” o reactivos dirigidos
al sitio activo
– Reactivos que tienen afinidad por el sitio activo
– TPCK, glicidolfosfato, FSBA (benzoil-adenosina de
fluorosulfonilo)
• Etiquetadores de fotoafinidad (activados con
UV)
– 8 azida ATP, 5 azida UTP

• Reactivos suicidas (se activan con la catálisis)

– Anhidrido isatoico, ciclopropil benzilamina
– También se les llama “basados en el mecanismo”
 Algunos ejemplos de
modificaciones químicas
Clase/grupo Rx reactivo Propósito
nucleófilo
Lys –NH2 Sustitución O-metilsourea Bloquear -NH2
nucleofílica Dinitrofluorobenceno
(DTNB)
Cys-SH alquilación Iodoacetato No específicas para
Iodoacetamida Cys, sino para nuc:
bromo
His imidazol acilación dietilpirocarbonato Lys, Tyr
Arg guanidino Adición a carbonilos 2,3 butano diona
electrófilo
Asp, Glu Formación de amida Amina +
carbodiimida
aromáticos Yodinación I2, I3-, ICl His, SH,
 Algunos ejemplos de etiquetas de
afinidad
Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada
Tosilfenilalaninaclorocetona Serina Serina del sitio activo
(TPCK) proteasas
Glicidol fosfato Triosafosfato Etiqueta nucleófilos o bases
isomerasa, generales en el sitio activo
enolasa
Fluorosulfonilboenzoiladenosina deshidrogenas NAD(P)H del sitio activo
(FSBA) as
 Algunos ejemplos de etiquetas de
foto-afinidad
Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada
8 azido ATP recA proteina tirosina
8 azido cAMP Ribonucleasa A treonina
pancreática
bovina
5 azido UTP UTP glucosa
pirofosforilasa
 Algunos ejemplos de reactivos
suicidas
Reactivo suicida Enzima Cadena lateral modificada
Anhidrido isatoico quimiotripsina Serina del sitio activo
Ciclopropil benzilamina Monoamina oxidasa flavina

Adenosina 2,3, riboepóxido β galactosidasa metionina

5 trifosfato
Cooperatividad y alosterismo
 Alostería
Alo (otro) Steria (forma)

Se presenta en enzimas multisubunidades los sitios activos se comunican

Las enzimas cambian de forma, cambian su reactividad

Bajo [S] Alto [S]

Cambio de conformación

Kd1
Kd2
Kd1 > Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen mejor
por lo que sera cooperatividad positiva
Kd1 < Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen peor
por lo que será cooperatividad negativa
 ¿Como medirla?

Rs = Factor de cooperatividad
[ S ]queproduzca _ V = 0.9V max
Rs =
[ S ]queproduzca _ V = 0.1V max

Cooperatividad positiva Rs < 81

Cooperatividad negativa Rs > 81
Comportamiento MMenten Rs 81

Ejercicio:
Demostrar esto
 Michaelis Menten
v = 0.1V max
v = 0.9V max
v [S ]
v [S ] = 0.1 =
= 0.9 = V max Km + [ S ]
V max Km + [ S ]
0.1[ S ] + 0.1Km = [ S ]
0.9[ S ] + 0.9 Km = [ S ]
0.1Km = 0.9[ S ]
0.9 Km = 0.1[ S ]
1
9 Km = [ S ] Km = [ S ]
9
9 Km
Rs = = 81
1
Km
9
 Otra forma de determinar el Ki
• El Ki es sumamente importante
• Es análogo al Km, concentración de
inhibidor tal que da la mitad de la
inhibición (mitad de la velocidad máxima)
• Si es una droga nueva ¿qué se buscará
con respecto al Ki?
• Ki>Km…?
• Dixon buscó maneras gráficas de
determinarla
Inhibición competitiva
Variar la [I], manteniendo fijas las [S] (en varios niveles)
Inhibición no competitiva
 IC50
• El IC50 es una medida muy usada en
diseño de drogas
• Corresponde a capacidad inhibitoria al
50% (mide potencia del inhibidor)
• que tanta cantidad del inhibidor es
necesaria para reducir a la mitad el
proceso (Rx enzimática, aunque es más
amplia su aplicación)
• Tiene relación con el Ki
 Para los diferentes casos de
inhibición

competitiva

No
competitiva

acompetitiva
 pIC50
• A veces se usa un valor p análogo al pH o
al pKa, es:
• pIC50 = -log10 (IC50)
• Se usa para expresar la potencia de la
droga en valores exponenciales y
generalmente es en M (molar)
 Inhibición por sustrato
• A [S] altas se inhibe la rx enzimática
• La gráfica de HMM, no da una hipérbola
sino una campana
• La gráfica de LB por lo tanto no da una
recta
1/v

1/[S]
[S]
 Explicaciones posibles
1. La Enzima puede tener 2 sitios de unión
para el mismo S
– El sitio catalítico y el sitio de inhibición
2. Hay dos configuraciones reversibles
entre sí
– Activa (Ea) e Inactiva (Ei)
 Mecanismo

Ea Ei
+ +
<S >S

Ea + P EaS EiS X
 ejemplo

hexoquinasa
Glucosa 6 fosfato +ADP Glucosa +ATP

Si la G6P está en alta concentración, se inhibe la rx