Tema 5

Cinética enzimática

0. Nociones de cinética química.

1. Deducción de la ecuación de Michaelis-Menten.
2. Aproximación de estado estacionario de Briggs y Haldane.
3. Interpretación de la ecuación de Michaelis-Menten.
4. Obtención de los parámetros cinéticos Vmax y Km: procedimientos
de linealización de la ecuación de Michaelis-Menten.
5. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten.
6. Reacciones bisustrato.
7. Factores que afectan a la cinética enzimática.
✓ Enzimología. Núñez de Castro I.
2001. Ed. Pirámide. ISBN:
84-368-1468-1
Velocidad instantánea, unidireccional, total e inicial

vo1

productos
[concentración]

reactivos
vo1 vt=0

tiempo
 Orden cero Orden uno Orden dos

Velocidad
Velocidad

Velocidad
[S] [S] [S]

[S0] ln[S0]

m=-k ln[St] m=-k 1/[St] m=k

[St]

1/[S0]
t t t
Ejemplo de orden mixto y determinación de v0
Leonor Michaelis (1875-1949) Maud Menten (1879-1960)

k1 k2
E + S k-1
ES E + P
Rápido equilibrio Paso lento (limitante)
Aproximación de estado estacionario de
Briggs y Haldane
• ↑kcat y ↓Km ↑kcat / Km alta eficiencia
• ↓kcat y ↑Km ↓kcat / Km baja eficiencia
[Producto] [P]2

∆[P] [P]2-[P]1
v0 = =
∆t t2-t1
[P]1

t1 t2
tiempo

[S] S1 S2 ..... Sn v0

v0 v01 v02 ..... v0n

[S]
Linealización de Lineweaver-Burk

1 KM 1 1
= +
v0 Vmax [S] Vmax

Km 1 1 −1 K 1 1 −1
y=0 0= + = m =
Vmax [S] Vmax Vmax Vmax [S] [S] K m

1 K 1 1 1
x=0 = m 0+ =
v0 Vmax Vmax v0 Vmax
Inconvenientes del método de
Lineweaver-Burk
 Representación de Eadie-Hofstee

v0
Vmax
v0
v0 = Vmax − K m
[S]
pendiente: -KM

y=0
v0 v0 Vmax
Vmax = K m =
[S] [S] K m
Vmax/Km
x=0 v0 = Vmax

v0/[S]
 Reacciones bisustrato
E E
A + B P + Q Habitualmente: P–X + B P + B–X

• mecanismo ordenado
• Secuenciales
Reacciones bisustrato • mecanismo al azar
• Desplazamiento doble (ping-pong)
 Reacciones secuenciales con
mecanismo ordenado
✓ Reacciones secuenciales → todos los sustratos se combinan con la enzima antes
de que se dé la reacción y se liberen los productos. Desplazamiento simple.

Mecanismo ordenado

Ejemplo
 Reacciones secuenciales con
mecanismo al azar
Mecanismo al azar

Ejemplo
 Reacciones de desplazamiento
doble (ping-pong)
✓ Reacciones ping-pong → uno o más productos se liberan antes de que todos los sustratos
se hayan combinado con la enzima. Bisustrato ping-pong: desplazamiento doble.

Bisustrato ping-pong

Ejemplo
 Factores fisicoquímicos que afectan a la
cinética enzimática: fuerza iónica, Tª y pH
1 n
✓ Fuerza iónica → puede alterar pKa de aAs e incluso estructura 3D. I = ∑ ci Zi2
I óptima ≈ 100 mM 2 i=1

✓ Temperatura → existe un intervalo óptimo (25-40 ºC); >50 ºC → desnaturalización

Ecuación de Arrhenius para reacciones Representación de Vmax vs T para Representación de lnkcat vs 1/T para
no catalizadas por enzimas reacciones catalizadas por enzimas reacciones catalizadas por enzimas

Ea 1
ln k = ln A −
R T
lnA

m=-Ea/R

lnk Vmax lnkcat

1/T T 1/T
 
E+S 
 ES ⎯⎯
→ E+P
๏ efecto sobre la conformación
nativa de la enzima +
la enzima H+
๏ efecto sobre el estado de


 
protonación de los aAs


✓ pH → puede afectar al estado implicados en la catálisis
EH+ ⎯⎯
→P
de protonación de

el sustrato ๏ se puede alterar la cinética

enzimática, pues el pH puede
afectar la unión E-S o incluso
condicionar el mecanismo catalítico

Enzimas ácidas Enzimas neutras Enzimas básicas

Vmax Vmax Vmax

2 4 6 8 10 12 14 2 4 6 8 10 12 14 2 4 6 8 10 12 14
pH pH pH
Inhibición competitiva
 Inhibición competitiva


E+S 
 ES ⎯⎯
→ E+P +I
+ 1/v0
I
[E][I ]


Ki = -I


Ki


[EI ]


EI ⎯⎯
→P

[E]t = [E] + [ES] + [EI ]

1/Vmax

1/[S]

-1/Km -1/Kmap
Inhibición acompetitiva
 Inhibición acompetitiva

E+S 
 ES ⎯⎯ → E+P
+ 1/v0
+I
I [ES][I ]
Ki =

-I

[ESI ]
Ki



ESI ⎯⎯
→P

1/Vmax-iac

1/Vmax

1/[S]

-1/Kmap -1/Km
Inhibición mixta
 Inhibición no competitiva

E+S 
 ES ⎯⎯
→ E+P +I
+ + 1/v0
I I



-I


Ki  Ki





EI ESI

[E][I ] [ES][I ] 1/Vmax-inc

Ki = =
[EI ] [ESI ]

[E]t = [E] + [ES] + [EI ] + [ESI ]

1/Vmax

1/[S]

-1/Km
 Inhibición por exceso de sustrato

NH2
O C Ureasa CO2 + 2 NH3
v0
Vmax NH2

[S]óptima
NH2
[S]
O C
NH2
Ureasa
NH2
O C
NH2
 Descarboxilación de ornitina por ODC

Lehninger Principios de Bioquímica, tercera edición

Inhibición suicida de
ODC por DFMO