T. P.

Nº 7 – Biología Celular - 2022

Detección de microdeleciones del cromosoma Y

En el brazo largo del cromosoma Y se encuentran tres loci conocidos como factor de
azoospermia (AZF). Estas regiones, denominadas AZFa, AZFb y AZFc, contienen algunos
genes como DAZ, RBMY, USP9Y y DBY que regulan la espermatogénesis. Entre el 10 y el
15% de los varones infértiles presentan reordenamientos cromosómicos submicroscópicos
en estas regiones que afectan a algunos de los genes mencionados.Las microdeleciones en
AZF son la segunda causa de origen genético de infertilidad masculina luego del síndrome
de Klinefelter, afectando aproximadamente a un 10% de los pacientes azoospérmicos y a un
15% de los pacientes con oligozoospermia idiopática severa. La detección de estas
microdeleciones permite determinar si es posible recuperar espermatozoides mediante
biopsia testicular o TESE (extracción de espermatozoides del testículo) para tratamientos de
reproducción asistida mediante ICSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides).
Además, puesto que todos los pacientes con una microdeleción transmiten la misma y la
esterilidad a su descendencia masculina, la detección de microdeleciones del cromosoma Y
es importante para el consejo genético.
El estudio de cariotipo no es capaz de revelar la presencia de las microdeleciones del
cromosoma Y ya que, si bien abarcan una extensión considerable, no son lo suficientemente
grandes para ser detectadas mediante este procedimiento. La evaluación de
microdeleciones en regiones AZF en pacientes infértiles con cariotipo normal se realiza
mediante la técnica de PCR. Debido a la heterogeneidad de las mismas (no se eliminan
siempre los mismos genes), se emplean cebadores específicos para secuencias específicas
de las regiones AZF denominadas STS (SequenceTaggedSites). Las STS son secuencias
que se utilizaron para el mapeo cromosómico, por lo que están perfectamente identificadas y
se denominan con un código alfanumérico. Solo existe una copia de cada una de ellas en
todo el genoma, es decir que representan un locus único y pueden ser amplificadas
mediante PCR por un par de cebadores específicos. La Academia Europea de Andrología
(EAA) y la Red Europea de Calidad en Genética Molecular (EMQN) recomiendan utilizar
reacciones de amplificación por PCR múltiple utilizando un conjunto de cebadores para
amplificar diferentes regiones AZF en cada muestra, lo que permite disminuir la probabilidad
de falsos negativos.
Los marcadores STS recomendados para el análisis de microdeleciones del cromosoma Y
son los siguientes:
● AZFa: sY84, sY86
● AZFb: sY127, sY134
● AZFc: sY254, sY255 (ambos en el gen DAZ)
● Controles de Reacción: ZFX/ZFY y SRY

A continuación se muestran los cebadores utilizados para las reacciones de amplificación y

el tamaño de producto de PCR esperado.
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STS Secuencia Tamaño

Forward: 5’- ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C - 3’
ZFY 495 pb
Reverse: 5’- GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAG T - 3’
Forward: 5’- GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA - 3’
SRY 472 pb
Reverse: 5’- GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG – 3’
sY84 Forward: 5’ - B. AGA AGG GTC TGA AAG CAG GT - 3’
320 pb
(AZFa) Reverse: 5’ – GCC TAC TAC CTG GAG GCT TC - 3’
sY86 Forward: 5’ – GTGACACACAGACTATGCTTC – 3’
326 pb
(AZFa) Reverse: 5’- ACACACAGAGGGACAACCCT – 3’
sY134 Forward: 5’ – B. GTC TGC CTC ACC ATA AAA CG – 3’
301 pb
(AZFb) Reverse: 5’ – ACC ACT GCC AAA ACT TTC AA – 3’
sY127 Forward: 5’ – GGCTCACAAACGAAAAGAAA – 3’
274 pb
(AZFb) Reverse: 5’ – CTGCAGGCAGTAATAAGGGA – 3’
sY255 Forward: 5’ - B. GTT ACA GGA TTC GGC GTG AT – 3’
126 pb
(AZFc) Reverse: 5’- CTC GTC ATG TGC AGC CAC– 3’
sY254 Forward: 5’ – GGGTGTTACCAGAAGGCAAA – 3’
400 pb
(AZFc) Reverse: 5’ – GAACCGTATCTACCAAAGCAGC – 3’

En la práctica de laboratorio se amplificarán mediante PCR múltiple los 6 marcadores STS

recomendados de manera individual junto al marcadores ZFX/ZFY como control interno.
Cada producto de amplificación tiene un tamaño distinto de los otros, por lo que la ausencia
de una banda puede ser visualizada mediante electroforesis en geles de agarosa y es
indicativa de una microdeleción.

Procedimiento
1. Se utilizarán muestras de ADN genómico obtenidas a partir de muestras de sangre
periférica según protocolos descriptos en Trabajos Prácticos anteriores.

2. Amplificación por PCR de secuencias STS

Se realizarán reacciones de PCR para estudiar la presencia o ausencia de secuencias STS
de las tres regiones AZF utilizando los cebadores recomendados por la EMQN, incluyendo
como control a los cebadores que amplifican ZFY en una muestra de ADN de un individuo
con cariotipo normal pero que presenta problemas de fertilidad.

3. Reacción de PCR
Se realizarán 6 reacciones de PCR (una reacción por cada STS estudiado) para una
muestra de ADN genómico. Para esto en un tubo de 0,2 ml medir los siguientes reactivos
para preparar la Mezcla de Reacción de reactivos comunes:
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Mezcla de RX 1 RX 6,6 RX
Buffer + Taq 2,1 ul 13,9 µl

dNTPs 1,6 ul 10,6 µl

Mg++ 0,8 ul 5,3 µl
H2O esteril 5,5 ul 36,2 µl
Vol Final 10 ul 66 ul

Una vez preparada la Mezcla de Reacción, separar 6 tubos de 0,2 ul, rotular y agregamos a
cada tubo los siguientes reactivos:

RX 1 RX 2 RX 3 RX 4 RX 5 RX 6
sY254 (AZFc) sY86 (AZFa) sY84 (AZFa) sY134 (AZFb) sY127 (AZFb) sY255 (AZFc)
REACTIVO VOL REACTIVO VOL REACTIVO VOL REACTIVO VOL REACTIVO VOL REACTIVO VOL
Mezcla de Mezcla de 10 Mezcla de 10 Mezcla de Mezcla de 10 Mezcla de
Reacción 10 ul Reacción ul Reacción ul Reacción 10 ul Reacción ul Reacción 10 ul
CebsY254 R 1 ul CebsY86 R 1 ul CebsY84 F 1 ul CebsY134 R 1 ul CebsY127 R 1 ul CebsY255 R 1 ul
Ce sY254 F 1 ul Ceb sY86 F 1 ul Ceb sY84 R 1 ul CebsY134 F 1 ul CebsY127 F 1 ul CebsY255 F 1 ul
Ceb ZFY R 1 ul Ceb ZFY R 1 ul Ceb ZFY R 1 ul Ceb ZFY R 1 ul Ceb ZFY R 1 ul Ceba ZFY R 1 ul
Ceb ZFY F 1 ul Ceb ZFY F 1 ul Ceb zFY F 1 ul Ceb ZFY F 1 ul Ceb ZFY F 1 ul Ceb ZFY F 1 ul
ADN 1 ul ADN 1 ul ADN 1 ul ADN 1 ul ADN 1 ul ADN 1 ul
H2O 5 ul H2O 5 ul H2O 5 ul H2O 5 ul H2O 5 ul H2O 5 ul
Vol final 20 ul Vol final 20ul Vol final 20ul Vol final 20 ul Vol final 20ul Vol final 20 ul

Las reacciones se han ordenado de manera tal que luego en la electroforesis los productos
sean sembrados y corran de mayor a menor tamaño de amplificación. Los tubos
conteniendo todos los componentes para las reacciones de PCR se llevan al termociclador
para su amplificación.

Programa de PCR

Etapa de PCR Temperatura Tiempo

Desnaturalización inicial 94 °C 5 minutos

Desnaturalización 94 °C 20 seg
Hibridación 55 °C 30 seg 35 ciclos
Extensión 72 °C 1 minuto
Extensión final 72 °C 2 minutos
Mantenimiento 10 °C indeterminado
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4. Visualización de los productos de PCR
Preparar un gel de agarosa al 1,5% en 20 ml de buffer TAE 1X. Calentar hasta ebullición
para fundir la agarosa. Dejar reposar unos minutos y agregar 1,2 µl del colorante SYBR
Safe. Volcar en el soporte y dejar enfriar. Una vez listo el gel, sacar el peine y colocarlo en la
cuba de electroforesis. Sembrar 10 µl de cada reacción en los pocillos. En la primera calle
sembrar 5 µl de marcador de peso molecular, de 100 pb. Correr el gel a 70 V. Observar en
transiluminador.

Fig. 1: Electroforesis en gel de agarosa de productos de amplificación con

cebadores para microdeleciones de cromosoma Y de un hombre normal
(sin microdeleciones)

Se sembrará en el siguiente orden las muestras:

Calle 1: RX 1 Calle 2: RX 2 Calle 3:RX 3 Calle 4: RX 4 Calle 5:RX 5 Calle 6:RX 6

sY254 (AZFc) sY86 (AZFa) sY84 (AZFa) sY134 (AZFb) sY127 (AZFb) sY255 (AZFc)
Prod PCR 495 pb Prod PCR 495 pb Prod PCR 495 pb Prod PCR 495 pb Prod PCR 495 pb Prod PCR 495 pb
400 pb 326 pb 320 pb 301 pb 274 pb 126 pb

Anotar los resultados obtenidos y discutir en clase la interpretación de los mismos.