BIOLOGÍA DEL DESARROLLO 2023-02

MODIFICACIÓN DEL
GEN DE Β-GLOBINA
(HBB) MUTANTE
MEDIANTE
CRISPR/CAS9
EN CIGOTOS DE Mus musculus TRANSGÉNICOS
ENFERMEDAD DE CÉLULAS FALCIFORMES (ECF)
CON

Catherine Muñoz, Sara Urbano, Jason Pantoja, Freisy Delgado

Trabajo final integrativo

 CONTENIDO
del proyecto
1.Introducción 5. Objetivos

2. Problemática 6. Metodología

3. Pregunta de investigación 7. Resultados esperados

4. Hipótesis 8. Reflexión ética

Introducción
https://www.23andme.com/en-int/topics/carrier/sickle-cell-anemia/
La ECF es una enfermedad grave causada por una mutación
en el gen HBB, para la que se considera el uso de
CRISPR/Cas9 como una metodología para evitar esta
enfermedad hereditaria.

https://www.reproduccionasistida.org/autorizacion-de-modificacion-de-embriones/sistema-crispr-cas9/
 PROBLEMÁTICA

La ECF es una enfermedad hereditaria que provoca

deformaciones en los glóbulos rojos, causando
obstrucciones vasculares, dolor, anemia y otros
problemas médicos. Afecta a muchas personas en todo
el mundo y representa una carga significativa para el
sistema de salud y las familias.

https://magazine.medlineplus.gov/es/art%C3%ADculo/anemia-de-celulas-falciformes-lo-que-usted-necesita-saber
 Para esto...

Nuestro estudio busca desarrollar un método

preventivo, haciendo uso de cigotos del ratón con la
prospectiva de realizar un escalamiento a pruebas in
vitro en humanos
 Pregunta de investigación
¿Puede corregirse mediante CRISPR/Cas9 la mutación de la
HBB en cigotos de Mus musculus con ECF?

Hipótesis
La técnica de edición genética CRISPR/Cas9 permitirá la
sustitución de la base mutada por la secuencia correcta en el
gen HBB en células hematopoyéticas y en un cigoto
transgénico de Mus musculus sin la enfermedad ECF
 Objetivos
General Específicos
1 Diseñar los primers y la secuencia de
inserción para una corrección de la mutación
del gen HBB en Mus musculus usando la 3 Determinar la viabilidad del proceso
Evaluar un método preventivo de técnica de CRISPR/Cas9. preventivo en cigotos de Mus musculus
modificación de la mutación del gen modificados a partir de la presencia de la
mutación en pruebas PCR con secuenciación
HBB a partir del uso de CRISPR/Cas9
de Sanger y reconteo de eritrocitos mutados.
en cigotos parentales de Mus musculus Evaluar la modificación con CRISPR/Cas 9
2
por PCR con secuenciación de Sanger a
transgénicos con ECF. partir de la presencia del gen HBB mutado en
células hematopoyéticas de Mus musculus
 METODOLOGÍA
Diseño del modelo experimental:
Fase 1:
• Factor único de estudio: presencia o no de la
cultivos de células Fase 2:
mutación de la HBB en los individuos
hematopoyéticas de individuos cigotos parentales de estos
de Mus musculus con la mismos individuos.
mutación
• Se evaluará en : PCR, secuenciación Sanger y
recuento de eritrocitos mutados (0- 5%)
 METODOLOGÍA
01 Obtención de individuos de Mus musculus con la mutación del gen HBB

HB
B
02 Diseño del complejo proteico CRISPR/Cas9 con el ADN de unión específica a la mutación del
gen HBB para β-globina

Primers
mRNAs
 METODOLOGÍA
Edición genética de cultivos celulares de células madre hematopoyéticas de ratones Mus musculus
03 mediante CRISPR
Electroporación

Primers
mRNAs

04 Análisis de la efectividad del tratamiento a partir de métodos moleculares

primers-código-CRISPR Extracción de ADN Electroforesis

Sanger
 METODOLOGÍA
Corrección de la mutación HBB en cigotos de ratones Mus musculus con la enfermedad de células
05 falciformes
Electroporación

CRISPR/
Cas9 –
primers
Cigoto modificado Fertilización in vitro
 METODOLOGÍA
Seguimiento de la mutación del gen HBB en los individuos tratados y su evaluación por métodos
06 moleculares
Progenie
Extracción de ADN Electroforesis

0-5% de los eritrocitos mutados

 RESULTADOS ESPERADOS
1 2 3
Identificar el loci exacto de la Obtener un correcto ensamblaje de la Correcta modificación de la
mutación del gen HBB en los estructura de CRISPR/Cas9 con el mutación del gen HBB con el uso del
individuos de Mus musculus y mRNA para una correcta unión a la complejo CRISPR/Cas9-mRNA en
diseñar los primers correspondientes secuencia de la mutación, la deleción células madre hematopoyéticas.
al SNP (18-24 pb) para una óptima del SNP y la inserción de la base
inserción de la secuencia sin la correcta.
mutación del gen HBB.
 RESULTADOS ESPERADOS
4 5 6
Se espera no encontrar la secuencia Se busca la correcta introducción del Porcentaje de entre 0-5% de
del gen HBB mutado (células complejo CRISPR/Cas9 – primers. eritrocitos falciformes .
hematopoyéticas) (cigotos)
En caso de no obtener los resultados
esperados...

Se realizará una revisión exhaustiva de cada paso de la metodología y el

proceso experimental, apoyado de literatura científica, para dilucidar las
problemáticas que llevaron a resultados inesperados, a su vez que
incorporar cambios a la metodología propuesta para lograr cada uno de
los resultados esperados.
REFLEXIÓN
ÉTICA
Principios bioéticos:
• Principio de Autonomía
• Principio de beneficiencia/no maleficencia
• Principio de justicia

Comité Institucional de Ética para el Cuidado y el

Uso de Animales en Experimentación (CIECUAE)
REFLEXIÓN ÉTICA:
Normatividad en Colombia
• Ley 84 de 1989. capítulo VI: “Del uso de animales vivos en
experimentos e investigación”
• Resolución 1164 de 2002 emitida por el Ministerio de Salud y la
Protección Social.

Peligrosos
infecciosos,
Anatomopatol
ógicos y
animales
 REFERENCIAS
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GRACIAS