PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN

DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL
CONTRA LA SIALIDASA DE
GARDNERELLA VAGINALIS
INTRODUCCION
La vaginosis bacteriana (VB) es una infección vaginal común que afecta a
mujeres de todas las edades y puede estar asociada con la adquisición de
enfermedades de transmisión sexual (Buve et al. 2014; Gillet et al. 2011;
Heno 2017; Dulce 2000; Thurman et al. 2015). El diagnóstico de VB se
basa en la sintomatología clínica y la morfología celular observada en los
pacientes; entre estos, el Amsel y Nugent son los criterios más utilizados
(Amsel et al. 1983; Nugent et al. 1991). La sialidasa de Gardnerella
vaginalis es un biomarcador clínico potencialmente involucrado en
infecciones y colonizaciones vaginales (Ferreira et al. 2015).
En este sentido, se ha propuesto la producción y evaluación de
un eficaz monoclonal contra la sialidasa de Gardnerella vaginalis
como una herramienta útil para el diagnóstico y tratamiento de la
vaginosis bacteriana (Bordeaux et al. 2010). El presente estudio
aumentó la tecnología de hibridomas para producir los requisitos
y lo caracterizó mediante diversas pruebas inmunológicas
(Briselden et al. 1992).
Los resultados sugieren que este fundamento podría ser una
herramienta útil para el diagnóstico y tratamiento de la vaginosis
bacteriana (Amsel et al. 1983; Ferreira et al. 2015). Además, el
documento también abordó otros temas relacionados con la vaginosis
bacteriana, como la fiabilidad del diagnóstico a través de la tinción de
Gram y la detección de la sialidasa como marcador para la microflora
vaginal (Cauci y Culhane 2011; Buve et al. 2014) .
 Metodologia
Gardnerella vaginaliscepa
La cepa se cultivó en agar
Columbia suplementado con
10% de sangre humana (de
donante sano con
consentimiento previo)
incluyendo identificacion de
cocobacilos gramnegativos,
oxidasa y catalasa negativas e
hidrólisis positiva de hipurato
Producción de anticuerpos
Selección de péptidos policlonales
Se inmunizaron semanalmente,
El péptido se seleccionó
ratones hembras de ocho semanas
según sus características
de edad con 30 µg del péptido
previstas de
SLDMAP8 usando adyuvantes
inmunogenicidad y
completos e incompletos de Freund.
antigenicidad (necesarias
Las muestras de sobrenadante de
para la inducción de la
cultivo se controlaron mediante
respuesta inmunitaria),
ensayo inmunoabsorbente ligado a
tenía una longitud de diez
enzimas (ELISA) indirecto utilizando
aminoácidos e incluía una
el péptido SLD-MAP8 como
porción de la región amino
antígeno, y los hibridomas que
terminal de SLD, y se
secretan anticuerpos monoclonales
disolvió a una
(mAb) se subclonaron dos veces
concentración final de 1
mediante dilución limitante y se
mg/mL.
mantuvieron en medio de cultivo
celular DMEM
 Metodología Ensayo Precipitación de proteínas deg
inmunoabsorbente ligado vaginalis sobrenadante de
Purificación de mAb y pab a enzimas cultivo

La evaluación de las respuestas

Para un control positivo, Para el análisis
inmunitarias en los ratones
inmunizamos un conejo con cuantitativo, se
inmunizados, la selección de
la bacteria completamente purificaron mAbs y
híbridos, la clase de
inactivada usando el g pAbs a partir de medio
inmunoglobulina mAb, el
vaginalisATCC 14018 como de cultivo celular y
reconocimiento de SLD en células
inmunógeno se inmunizó por suero de conejo,
HeLa, los antígenos y la titulación
vía subcutánea usando respectivamente,
de mAb se determinaron mediante
adyuvantes completos, e utilizando proteína A
ELISA indirecto.
incompletos de Freud sepharose. Las
Se recubrieron placas de
concentraciones se
microtitulación con el antígeno
determinaron
(SLDMAP8, sobrenadante de
midiendo la DO a 280
cultivo celular HeLa o muestras
nm en un lector de
deG. vaginalis agregando 100 μL de
microplacas
solución de proteína en un tampón
de recubrimiento y se incubó
durante la noche a 4 °C.
METODOLOGIA
Western y manchas de Aislamiento y cultura deg
Biotipado
puntos vaginalis
El caldo de cultivo se inoculó
Para la transferencia de Aislamiento deg vaginalisa
en una alícuota que contenía
Western, 20 μg del lisado partir de muestras clínicas
400 μL de reactivo de
de proteína total de g se realizó en agar Columbia
hipurato de sodio al 1 %, que
vaginalisLa cepa se suplementado con sangre
se incubó a 37 °C durante 2 h
desnaturalizó en un humana al 10 % y el agente
y luego 200 μl de ninhidrina y
tampón de carga a 98 °C selectivo SR119RE. Se
la solución se homogeneizón ,
durante 10 min luego se inocularon muestras de
La prueba se interpretó como
separó mediante SDS- hisopos vaginales y se
positiva cuando el medio se
PAGE al 12 % y se incubaron a 37 °C en una
tornó púrpura, indicando la
transfirió a una atmósfera de CO al 5 %.
presencia de glicina en la
membrana de 2ambiente durante 24 h. La
mezcla como resultado de la
nitrocelulosa, Las identificación microbiana se
hidrólisis del hipurato, y
transferencias puntuales realizó mediante tinción de
negativa cuando el reactivo
utilizaron de manera Gram y reacciones negativas
no cambió de color
similar lisados de de catalasa y oxidasa. Las
proteínas totales, bacterias aisladas se
bacterias completas o inocularon en caldo de
sobrenadante de cultivo tioglicolato y se incubaron a
inmovilizado en 37 °C en CO2 al 5 %.2
membranas de ambiente durante 24 h
nitrocelulosa.
METODOLOGIA
g vaginaliscinética de Producción de SLD durante Cultivo de células HeLa e infección cong
cultivo y crecimiento el crecimiento deg vaginalis vaginalis

g vaginalisLa cepa ATCC La producción de SLD en Se cultivaron células HeLa, a

14018 se cultivó cultivos bacterianos se (derivadas de una mujer con
anaeróbicamente a 37 °C evaluó utilizando mAb y un adenocarcinoma de cuello
en 5 % de CO2durante 24 método ELISA indirecto. uterino e infección por VPH 18)
h en (TSA). Para Para esto, las bacterias en placas de Petri, en medio de
establecer la cinética de (dilución
1:200), los crecimiento compuesto por
crecimiento deg sobrenadantes de cultivo y DMEM/F-12, bajo un 5% de
vaginalis,se inoculó una las bacterias completas de CO2atmósfera a 37 °C, y 24 h
colonia bacteriana en 5 cada punto de tiempo antes de la infección cong
ml de caldo de infusión monitoreado (0,5 a 72 h) se vaginalis,las células se
cerebro corazón (BHI) y fijaron en placas de 96 cultivaron en medio libre de
se incubó a 37 °C con 5 % pocillos durante 2 h a 37 °C, suero sin antibióticos.
de CO2y 180 rpm La reacción se desarrolló Después de la infección, se
agitación, durante la utilizando diclorhidrato de recolectaron los sobrenadantes
noche, La absorbancia Ofenilendiamina, y se detuvo de cultivo y se usaron para
se midió a 595 nm en un con ácido sulfúrico 2 N. ELISA indirecto y
espectrofotómetro y se transferencias puntuales.
utilizó caldo no
inoculado como control
negativo.
 RESULTADOS
Primero, seleccionaron SLD-MAP8 basado en los resultados considerando la
inmunogenicidad y la antigenicidad.
El péptido se usó para la inmunización de cinco ratones.
Realizaron evaluaciones de respuesta inmune en todos los ratones
inmunizados. De acuerdo con los resultados, el ratón con el título más alto fue
seleccionado para la producción de hibridomas
 RESULTADOS
Posteriormente, se sacrificó el ratón y se usó el bazo para la fusión con células
de mieloma para la generación de hibridomas
Imágenes representativas de las hibridomas producidas
 RESULTADOS
Después de la fusión, se seleccionaron siete clones productores de anticuerpos
anti-SLD diferentes; seis de estos produjeron anticuerpos IgM, mientras que el
clon 1H12 produjo esencialmente anticuerpos IgG

Se seleccionó el clon 1H12 y se denominó mAb anti-SLD. Este clon se cultivó en

DMEM y se obtuvo mAb anti-SLD y se usó para los siguientes experimentos.
 RESULTADOS

Después de la fusión, se seleccionaron siete clones productores de anticuerpos

anti-SLD diferentes; seis de estos produjeron anticuerpos IgM, mientras que el
clon 1H12 produjo esencialmente anticuerpos IgG
 RESULTADOS

Evaluación de purificación de mAb anti-SLD. SDS-PAGE al 12% y tinción con

azul de Coomassie. MWM, marcador de peso molecular; HC, cadena pesada;
LC, cadena ligera
 RESULTADOS

La caracterización adicional incluyó la determinación de la concentración

óptima de anticuerpo y antígeno utilizando el péptido sintético SLD-MAP8.
La concentración óptima de anticuerpos fue de 10 μg/mL y la concentración de
antígeno a detectar fue de ~ 0,16 μg/mL
 RESULTADOS
A continuación, se evaluó la especificidad del mAb anti-SLD en g vaginalis
cepa ATCC 14018, para determinar si el anticuerpo podía reconocer la forma
completa e intacta de SLD.
Por Western blot, se determinó que el mAb anti-SLD reconoció la proteína
completa en forma desnaturalizada
 RESULTADOS
Para corroborar los resultados obtenidos previamente, realizamos
evaluaciones por ELISA indirecto utilizando extracto de proteína total y
sobrenadante de cultivo, y los resultados fueron similares.
 RESULTADOS
Se especulo si el mAb anti-SLD podría usarse para predecir de manera
semicualitativa la cantidad de SLD producida por g vaginalis durante las
diferentes fases del crecimiento bacteriano.
Para esto, las bacterias se cultivaron durante 72 h y las muestras se
recolectaron en diferentes tiempos.
 RESULTADOS
Observamos que después de los primeros 30 min, las bacterias comienzan a
producir SLD, y el aumento fue proporcional a la fase de crecimiento
 RESULTADOS
Evaluaron la producción de SLD mediante dot blot en 67 aislamientos clínicos
de g vaginalis de mujeres con microbiota normal (NM; n = 45) y vaginosis
bacteriana (BV; n = 22) pertenecientes a cuatro (1, 2, 5 y 6) de los ocho
diferentes g vaginalis biotipos. Los resultados mostraron que la cantidad de
SLD producida varió entre aislados, e incluso entre bacterias completas y
sobrenadantes.
 RESULTADOS
Utilizando los blots anteriores, analizamos de forma semicualitativa la
cantidad de SLD en las muestras aisladas de mujeres con NM y VB,
observando resultados similares en ambos grupos
 RESULTADOS
Además, las muestras se separaron según biotipo; 1 (n = 15), 2 (n = 6), 5 (n = 11) y
6 (n = 35), y observamos que los biotipos 2 y 5 secretaron menos SLD en
comparación con los biotipos 1 y 6
 Sialidasa (SLD)
Enzima asociada con la
destrucción de tejidos y la
obtencion de nutrientes
relacionados con el crecimiento
bacteriano

Anticuerpo
monoclonal
Dirigido contra la sialidasa
 ANTÍGENO
Péptido sintético
en formato MAP8
(SLD-MAP8)
con

EPÍTOPO
Región amino terminal de
la enzima SLD
Extracción del
bazo (células B)
Estimula la producción de
anticuerpos
 Fusión

Bazo
Células de mieloma

Anticuerpos IgG Anticuerpos IgG

ANTICUERPO
 ¿De que sirve obtener el anticuerpo?

Estandarización de nuevas técnicas para la deteccion de sialidasa (SDS) en

muestras clínicas de mujeres con y sin vaginosis bacteriana

Mejora el diagnóstico temprano y evitar complicaciones asociadas

 FUNDAMENTO DEL PORQUE SE HIZO ESTE
EXPERIMENTO

La VB es la principal infección vaginal en mujeres en edad reproductiva

y se ha asociado con complicaciones clínicas que afectan la calidad de
vida. La enzima SLD, juega un papel importante en la obtención de
nutrientes, la colonización y la evasión de la respuesta inmune del
huésped (Harvey et al.2001; Lewis et al.2012; Marconi et al.
2013).
Dada la importancia de la SLD en el desarrollo de la VB, se hace
necesaria la producción y caracterización de unanticuerpo monoclonal
contra esta enzima.
BIBLIOGRAFIAS
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