CRISPR-Cas

¿Qué es el CRISPR/Cas9, para qué se utiliza, qué se espera

que se logre con esta aplicación?
 CRISPR
¿Qué es el CRISPR/Cas9, para qué se utiliza, qué se espera que se logre con esta aplicación?

L
as bacterias se exponen frecuentemente a re-
sistencias como la infección por bacteriófagos y
otros elementos genéticos. Estos eventos pue-
den dar lugar a la transferencia horizontal de genes
(HGT), que está mediada por transducción, transfor-
mación o por conjugación de elementos móviles, ta-
les como plásmidos.

La HGT puede ser beneficiosa para la adaptación y

la supervivencia mediante la rápida promoción de la
transferencia de genes que codifican la resistencia a
los antibióticos, los factores de virulencia, o la capa-
cidad de degradar compuestos tóxicos. Sin embargo,
en ausencia de cualquier ventaja selectiva, cualquier
elemento genético extraño puede tener un coste
de acondicionamiento físico. Esto es más evidente
cuando los procariotas son infectados por fagos vi-
rulentos.

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Dichas bacterias poseen múltiples métodos para re-

gular el flujo genético y resistir la infección de los
fagos. Estos mecanismos incluyen la mutación o el
enmascaramiento de los receptores de la superficie
celular, la restricción de la modificación, la infección
abortiva y los sistemas CRISPR (the clustered regu-
larly interspaced short palindromic repeats). Los sis-
temas CRISPR son un mecanismo generalizado que
equipa a las bacterias con un “sistema inmune adap-
tativo” hereditario específico de secuencia que tiene
una memoria genética de incursión genética pasada.

Los sistemas CRISPR utilizan pequeños RNAs no co-

dificantes para la defensa y la función en conjunto
con CRISPR asociado a proteínas (Cas). El mecanismo
de interferencia CRISPR / Cas implica tres fases. En
primer lugar, la resistencia se adquiere mediante la
integración de secuencias cortas de elementos gené-
ticos extraños (denominados espaciadores) en ele-
mentos genéticos repetitivos conocidos como matri-
ces de CRISPR. En segundo lugar, las matrices CRISPR
son luego transcritas y procesadas en ARN pequeños
(CRRNAs) por las proteínas Cas. En la tercera y última

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etapa, el direccionamiento del fago o plásmido inva-

sor está mediado por un complejo de proteína Cas
que contiene CRRNAs. Durante esta etapa, el com-
plejo de proteína crRNA-Cas entonces interfiere, de
una manera específica de la secuencia, con los áci-
dos nucleicos extraños.

A pesar de compartir similitudes mecánicas, existe

una diversidad significativa entre los sistemas CRIS-
PR / Cas. Existen tres tipos principales de sistemas
CRISPR / Cas (I-III), que cada uno se caracteriza por
una proteína de firma. Los tipos principales se divi-
den además en subtipos (por ejemplo, I - A a I - F) ba-
sados principalmente en la presencia de un conjunto
específico de subtipos de proteínas Cas y para algu-
nos tipos también se tiene en cuenta la secuencia de
repetición de la matriz CRISPR asociada.

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El descubrimiento de los sistemas CRISPR/Cas fue

con el primer informe de secuencias repetidas palin-
drómicas intercaladas por Ishino et al. quienes de-
tectaron cinco repeticiones de 29 Pb a 32 Pb espacia-
dores cerca del gen de Escherichia Coli. Se hicieron
otros informes para Mycobacterium tuberculosis,
Haloferax spp y Archaeoglobus fulgidus, sin embar-
go, no se detectó en eucariotas o en secuencias de
virus. Hasta la fecha, tres variantes diferentes de la
nuclease Cas9 se han adoptado en los protocolos de
edición del genoma.

El primero es Cas9 de tipo “salvaje”, que puede es-

cindir específicamente el ADN de doble cadena, lo
que da como resultado la activación de la maquinaria
de reparación de rotura doble (DSB). DSBs puede ser
reparado por la unión no-homóloga celular (NHEJ),
dando lugar a inserciones y/o supresiones que per-
turban el destino del locus. Alternativamente, si se
suministra una plantilla de donante con homología
con el locus elegido, la DSB puede ser reparada por la
vía de reparación dirigida por homología (HDR) que
permite mutaciones precisas de reemplazo.

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Cong et al. llevaron al sistema Cas9 un paso más allá,

desarrollando una forma mutante, conocida como
Cas9D10A, con actividad solo de desgaste . Esto sig-
nifica que escinde sólo una cadena de ADN, y no ac-
tiva el NHEJ. En cambio, cuando se proporcionan con
una plantilla de reparación homóloga, las reparacio-
nes de ADN se llevan a cabo a través de la alta fideli-
dad solo por vía HDR, lo que resulta en la reducción
de las mutaciones. Cas9D10A es aún más atractiva
en términos de especificidad de destino cuando son
dirigidos por pares Cas9 complejos diseñados para
generar surcos adyacentes de ADN.

Desde el 2012 se han hecho aplicaciones molecula-

res importantes gracias a los avances en las proteí-
nas Cas de los sistemas CRISPR. Una de las múltiples
aplicaciones de esta nueva tecnología es en una gran
problemática mundial, la resistencia a los antibióti-
cos. Existen alternativas a ésta difícil condición, la fa-
goterapia es una de ellas. Actualmente se considera
la mejor opción en un estudio publicado en la Acade-
mia Nacional de Ciencias donde sugiere que la fago-
terapia podría ser útil explicando cómo se utilizaron

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los fagos lambda y T7 para administrar una nuclea-

sa de ADN programable y agruparon las repeticio-
nes palindrómicas cortas intercaladas regularmente
(CRISPR) para eliminar la transferencia de resistencia
entre las diferentes cepas.

En la investigación Qimron et. al. Resumiendo, trans-

firieron en el genoma de bacterias resistentes a los
antibióticos un sistema de edición de genes CRIS-
PR-Cas que fue programado para buscar y romper los
genes que codifican las enzimas β-lactamasas, que
confieren resistencia a los antibióticos de última ge-
neración, es decir, los de último recurso. Los autores
también insertaron cadenas idénticas de β-lactama-
sa codificando secuencias CRISPR-Cas con objetivo
en los fagos T7, que son letales para las bacterias.
Cuando se cultivaron en placas de agar recubiertas
con los fagos T7 modificados, se encontró que las
bacterias que contenían el fago lambda modificado
eran sensibles a los antibióticos dirigidos y 20 veces
más resistentes a los fagos T7 modificados en com-
paración con las bacterias control, que permanecie-
ron resistentes a los antibióticos.

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Este método restauró la sensibilidad a los antibióti-

cos resistentes a las bacterias, y apoyó en la preven-
ción de la transferencia de genes entre bacterias que
crean resistencia a los antibióticos. Qimron comen-
tó en la declaración: “Creemos que ésta estrategia,
además de la desinfección, podría significativamente
hacer que las infecciones vuelvan a ser tratables con
antibióticos comunes”.

En el presente año, los cultivos modificados genética-

mente (GMOs) son objetivo de avances por los siste-
mas CRISPR. Un patólogo especializado en plantas de
la Universidad Estatal de Pensilvania corrigió genes
dentro del hongo blanco común para resistir el tipo
dorado. Eliminando pares de bases en el genoma de
la seta, el patólogo de plantas redujo la actividad de
la enzima que causa el dorado en un 30 por ciento. El
Departamento de Agricultura de los Estados Unidos
(USDA) declaró que debido a que estos hongos gené-
ticamente modificados no contienen un “organismo
donante”, no requieren la supervisión de la USDA.

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Actualmente, el método más popular para llevar a

cabo las pantallas de todo el genoma utilizando CRIS-
PR / Cas9 implica el uso de bibliotecas lentivirales
CRISPR “agrupadas”. Son una población heterogé-
nea de vectores de transferencia lentivirales, con-
teniendo cada uno un gRNA individual dirigido a un
único gen en un genoma dado. Los ARN de guía se
diseñan en silico y se sintetizan, luego se clonan en
un formato agrupado en vectores de transferencia
lentivirales.

Las bibliotecas CRISPR han sido diseñadas para la

mayoría de las aplicaciones comunes de CRISPR in-
cluyendo el knock-out genético y la activación o re-
presión para los genes humanos y de ratón. Aunque
cada biblioteca es diferente, hay varias característi-
cas comunes en la mayoría de las bibliotecas CRISPR.
Cada biblioteca contiene típicamente ~3-6 gRNAs por
gen para asegurar la modificación de cada gen diana.
Las bibliotecas pueden dirigirse desde cualquier cla-
se de genes hasta todos los genes del genoma. Por lo
tanto, las bibliotecas CRISPR contienen miles de gR-
NAs únicos dirigidos a una amplia variedad de genes.
Las bibliotecas pueden dirigirse desde cualquier cla-

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se de genes hasta todos los genes del genoma. Por lo

tanto, las bibliotecas CRISPR contienen miles de gR-
NAs únicos dirigidos a una amplia variedad de genes.

Con estos estudios en constante mejoramiento, de

manera molecular, podemos decir que esta herra-
mienta se podrá utilizar para regular la expresión
génica, etiquetar sitios específicos del genoma en
células vivas, identificar y modificar funciones de ge-
nes y corregir genes defectuosos. También se está ya
utilizando para crear modelos de animales para estu-
diar enfermedades complejas como la esquizofrenia,
para las que antes no existían modelos animales.

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La especificidad individual de determinadas secuen-

cias de DNA permite que éstas una vez detectadas
puedan utilizarse como marcadores genéticos indivi-
duales, como auténticas “huellas dactilares” situadas
en el genoma. Estos marcadores genéticos se deter-
minan ya antes de practicar un trasplante de órgano
y en los estudios sobre la propagación de tumores.
El uso de estos marcadores para la identificación del
parentesco ofrece una precisión mucho mayor que
las técnicas hasta ahora habituales.

Así, por ejemplo, el alto poliformismo del DNA saté-

lite en la región de los genes de la globina permite el
establecimiento seguro de la maternidad. Igualmen-
te estos marcadores permiten establecer con gran
certeza la paternidad. Por este motivo se utilizan ya
en algunos países para dirimir problemas relacio-
nados con la inmigración de indivíduos que alegan
razones de parentesco. También han comenzado a
usarse en los laboratorios forenses.

Para un futuro con la tecnología CRIR/Cas9, las posi-

bilidades son casi inimaginables. Servirá para curar
enfermedades cuya causa genética se conozca y que
hasta ahora eran incurables. Ya se está trabajando
con esta tecnología en estas enfermedades como la
Corea de Huntington, el Síndrome de Down o la ane-

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mia falciforme. Además de estas implicaciones sani-

tarias, también se puede utilizar para mejorar los ali-
mentos transgénicos (desarrollar nuevas variedades
de plantas y animales con características genéticas
concretas), modificar bacterias y otros microorganis-
mos de uso industrial y alimentario.

De forma general el desarrollo de la tecnología CRIS-

PR-Cas ha inaugurado una nueva era para la inge-
niería genética en la que se puede editar, corregir y
alterar el genoma de cualquier célula de una mane-
ra fácil, rápida, barata y altamente precisa. El rápi-
do progreso en el desarrollo de Cas9 en un conjunto
de herramientas para la investigación de la biología
celular y molecular ha sido notable, probablemente
debido a la simplicidad, alta eficiencia y versatilidad
del sistema.

De los sistemas disponibles para la ingeniería de ge-

noma de precisión, el sistema CRISPR / Cas es de lejos
el más fácil de usar. Ahora también está claro que el
potencial de Cas9 alcanza más allá de la división del
ADN, y su utilidad para el reclutamiento específico de
genoma en el locus de proteínas probablemente solo
estará limitada por nuestra imaginación.

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