Los efectores CRISPR-Cas9 facilitan la

generación de camadas de un solo sexo y

fenotipos específicos de sexo.

Charlotte, Maciulyte,, Zohren, Snell, Mahadevaiah, Ojarikre, Ellis &

Turner (2021)

Presentado por:
Ashly Amaya
Stiven Chapuel
Ángela Fajardo
INTRODUCCIÓN
 La agricultura, la industria láctea requiere hembras.
Los animales y sus productos se Cada año se sacrifican alrededor de 95 000 terneros
utilizan en todo el mundo machos en el Reino Unido 200 000 en Alemania y
500 000 en Australia

Se necesitan con urgencia métodos para generar camadas de un solo sexo en

investigación y agricultura.

La selección de embriones a través de la letalidad M y F

OBJETIVO
Crear un sistema de selección de sexo bicomponente que genere
camadas de ratones solo machos o hembras.
METODOLOGÍA
 ❏ mantuvieron bajo las Regulaciones del Ministerio del Interior del
METHODOLOGY
Mantenimiento de Reino Unido
líneas de ratón ❏ ventilacion , accesoa alimentos,T° 20-22 °C, siclos de luz de 12
horas
❏ se mantuvieron en condiciones libres de patógenos

Derivación y mantenimiento de células madre embrionarias

Recolección de Embriones
Por lavando el útero con (FHM) Medio de retención de folículos
y se colocaron en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos con 500 μl de 2i/LIF

centrifugación a 200 g durante 3 min, las

Las mESC se pasaron
Los crecimientos se mESC se resuspendieron y sembraron en
eliminando 2i/LIF, lavando
separaron y las mESC placas nuevas s
con PBS y pipeteando en
se sembraron en una
una suspensión de
placa de 4 pocillos en mantuvieron en 2i/LIF en material de
células individuales.
2i/LIF. para cultivo de tejidos

mESC: células madre embrionarias de raton macho

2i/LIF: método de cultivo con suero con factor inhibidor de leucemia
 Primer diseño → Primer3

Todos los pares de cebadores utilizados se diseñaron con Primer3

Toda la amplificación por PCR se llevó a cabo utilizando ADN polimerasa de

alta fidelidad en condiciones de termociclado recomendadas

Para amplificar los exones objetivo Top1 y Atm para el análisis de MiSeq, se
diseñaron cebadores utilizando Primer3

Diseño de sgRNA

Se seleccionaron sgRNA individuales con una alta actividad predicha en el objetivo y una
baja actividad fuera del objetivo. Los oligonucleótidos con salientes de BbsI se hibridaron y
ligaron en el vector relevante,
METHODOLOGY Clasificación celular activada por
fluorescencia

Disociación de embriones y citometría de

flujo

Generando la línea del ratón XTop1

Generando la línea del ratón H11Top1

Generando la línea del ratón XCas9

METHODOLOGY Clasificación celular activada por
fluorescencia

Disociación de embriones y citometría de

flujo
METHODOLOGY Clasificación celular activada por
fluorescencia

Disociación de embriones y citometría de

flujo

Generando la línea del ratón XTop1

Generando la línea del ratón H11Top1

Generando la línea del ratón XCas9

METHODOLOGY Generando la línea del ratón YCas9

Genotipado

Análisis indel y secuenciación de alto

rendimiento miseq

Secuenciación de paso bajo del genoma

completo

Análisis PCR cuantitaivo

 20 μl de volumen total con 20 ng de ADN
qPCR de gota digital en una máquina de PCR de Bio-Rad y se
analizó con QuantaSoft v1.7.4.0917

Extracción de proteínas y
western blot

Mancha del sur

Electroporaciones de
embriones

Sección de ovario e
inmunofluorescencia
Cuantificación de folículos

Inmunofluorescencia de testículos

Histologia testicular

Cuantificación del tamaño de la camada

Analisis estadistico
Resultados
 Un sistema bicomponente CRISPR-Cas9 in vitro induce mutaciones en Top1

Sistema letal para generar camadas de un solo sexo.

sgRNA →Top1 provoca la letalidad embrionaria
prematura antes de la implantación

- Clonación de guías dirigidas a codones en

vector mCherry
- Transfección a mESC que expresan
constitutivamente Cas9 y un marcador
eGFP. 48 h después células doblemente
positivas de mCherry-eGFP frente a las
células de control solo de eGFP se
clasificaron mediante FACS y se evaluó la
presencia de mutaciones Top1
● Eficiencia de mutación: sgRNA2 → 52 %
de las secuencias observadas que
presentaban mutaciones Top1; sgRNA1
→ 22 % y sgRNA3 →29 %
● La transferencia de Western confirmó la
pérdida de la expresión de la proteína
TOP1 en mESCs doblemente positivos
transfectados con sgRNA2
 La herencia conjunta de sgRNA autosómico y transgenes Cas9 induce mutaciones Top1 y
letalidad embrionaria

En embriones de ratón hembra, el cromosoma X

1° inducir la letalidad en las hijas
mediante la combinación de un transgén
de sgRNA integrado en X paterno. con
un transgén Cas9 autosómico materno
Para que el transgén paterno X Top1 cause
letalidad en las hijas, tendría que
expresarse durante el desarrollo del
embrión femenino X Top1 X
paterno es silenciado desde la etapa de 4 a 8 células
por el XCI impreso
El XCI impreso se retiene en el trofectodermo, pero
se invierte en el epiblasto, después de lo cual se
produce un XCI aleatorio .
En las hembras X Top1 X, el transgén
sgRNA2-mCherry se expresó a partir del día
embrionario y posteriormente se sometió a XCI
impreso y aleatorio

Como el sgRNA2-mCherry paterno ligadoa X era detectable en el embrión previo a la implantación, nos
preguntamos si este transgén induciría la letalidad en las hijas en presencia de Cas9 materno

. Cruzamos machos X Top1 Y con hembras homocigóticas autosómicas R26 Cas9 y genotipamos la progenie al
nacer. todas las crías eran machos ., por lo tanto, induce la letalidad femenina con una eficiencia del cien por
cien.
 Fig. 2: Generación y examen de la funcionalidad del mouse H11 Top1

● A: un esquema del locus transgénico H11

Top1 .
● B: Imágenes in vivo de mCherry que
muestran el ratón H11 Top1 (extremo
derecho). Imágenes de datos sin procesar
proporcionadas como un archivo de datos
de origen.
● c Estrategia de apareamiento.
● d Descendencia de apareamientos entre
machos H11 Top1 /+ y hembras
homocigóticas R26 Cas9 (las dos
primeras columnas) o hembras control de
tipo salvaje (columna derecha). n  =
número de descendientes. El valor p
muestra la importancia de la desviación
de la relación 1:1 (prueba de
chi-cuadrado).
● e Eficacia de la mutación Top1 en E3.5 de
tipo salvaje (+/+) y H11 Embriones Top1 /
R26 Cas9
 Generación de camadas de un solo sexo utilizando transgenes Cas9 ligados a
cromosomas sexuales

Restringir la letalidad embrionaria a un sexo específico Transgen Cas9 Secuencia T2A - eGFP

CRISPR-Cas9 - Cas9-eFGP Recombinación

Locus transgénico Cas9-eGFP ligado a X Locus transgénico Cas9-eGFP ligado a Y

 Los transgenes Cas9 ligados al sexo pueden generar fenotipos postnatales específicos del sexo

Modelos Cas9 vinculados al sexo

podrían reutilizarse para crear Gen Atm → meiosis
fenotipos posnatales específicos
del sexo?
Mutantes Atm Mutantes Atm
masculinos femeninos

recombinación y la punto de control de

formación de cruces la recombinación de
en los cromosomas ovocitos

Restriccion de Atm a un
sexo especifico
Electroporación con un
cigotos de apareamientos
sgRNA dirigido al dominio
entre hembras de tipo
Atm quinasa y los
salvaje y machos X Cas9 Y
transferimos a madres
o XY Cas9
pseudoembarazadas.
Los transgenes Cas9 ligados al sexo pueden generar fenotipos postnatales específicos del sexo

apareamientos con Mutaciones de Atm solo en las

padres XY Cas9 hijas
No produjeron
descendencia
apareamientos con Mutaciones de Atm solo en las
padres XY Cas9 hijos

Hembras Machos

Ovarios Células
Utilidad en la generación de atrofiados sin germinales
camadas de un solo sexo, las X ovocitos detenidas en
Cas9Los modelos Y o XY Cas9 se testículos
pueden usar para crear otros
fenotipos específicos del sexo.
DISCUSIÓN
→ Gen esencial Top1 en un sistema letal sintético produce camadas de ratones
de un solo sexo
→ Beneficios inmediatos para la investigación de laboratorio
→ Transgenes Cas9 vinculados a X e Y se pueden usar junto con otros ARN guía
para generar fenotipos específicos del sexo, como con Atm
→El uso de Cas9 cargado genéticamente en embriones previos a la implantación
es más eficaz para generar mutaciones específicas que la provisión mediante
inyección o electroporación, y permite una mejor supervivencia del embrión
 ÉTICA

→ Modificación transgenica de ambos padres → selección sexo descendencia

→ No hay riesgo de que esta tecnología se aplique incorrectamente para la
selección del sexo humano
APLICACIONES

Dada la función altamente conservada de Top1 , nuestro enfoque también

podría ser adecuado para el desarrollo y la implementación de la selección de
sexo en otros mamíferos

Otra área de aplicación es la avicultura, donde el requisito específico de las hembras en la industria de
la puesta de huevos da como resultado el sacrificio de 6 a 7 mil millones de pollitos

El gen Cas9 debe integrar en el cromosoma Z o W.

Si la proteína Cas9 derivada de Z o W se expresa en el ovocito, se
hembras heterogaméticas
depositará por vía materna en el cigoto.
(ZW) y los machos
Esto podría desencadenar potencialmente la letalidad incluso en
homogaméticos (ZZ)
embriones que no portan el cromosoma sexual materno portador
de Cas9.
 01 OBJECTIVES
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METHODOLOGY
Se logró un método 100% efectivo para lograr la selección de
la proporción de sexos de la descendencia y/o la generación de
fenotipos específicos del sexo en la descendencia, que en

CONCLUSIÓN
principio es aplicable a cualquier especie con cromosomas
sexuales diferenciados. Las implicaciones de nuestra
03 RESULTS ANALYSIS
tecnología deben ser ampliamente consideradas a nivel ético y
regulatorio.
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04 CONCLUSIONS
Referencia

Douglas, C., Maciulyte, V., Zohren, J. et al. Los efectores CRISPR-Cas9 facilitan la
generación de camadas de un solo sexo y fenotipos específicos de sexo. Nat
Comun 12, 6926 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-27227-2
 GRACIAS
THANKS

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