UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

LIC. EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

LA ENTREGA DE NANOPARTÍCULAS DE
RIBONUCLEOPROTEÍNA CAS9 Y ADN DONANTE IN VIVO
INDUCE LA REPARACIÓN DEL ADN DIRIGIDA POR
HOMOLOGÍA

INTEGRANTES: MATERIA:
● APODACA BACACEGUA MELANI BIOTECNOLOGÍA MÉDICA
● MEDINA REÁTIGA KENIA SINAHÍ
● MOLINA TORRES HÉCTOR ANDRÉS DOCENTE:
● ROCHIN DEL CAMPO ITZEL GERALDINE DRA. KENIA LÓPEZ LÓPEZ
● RODRIGUEZ NIEBLA RODOLFO
● SAÑUDO LÓPEZ YUNITZIA LIZZETH GRUPO:
● URIAS ACOSTA MARÍA JOSE 5-2
 INTRODUCCIÓN

Las terapias a base de proteínas Cas9 asociadas a CRISPR, especialmente

aquellas que pueden corregir las mutaciones genéticas a través de la
reparación dirigida a la homología, tienen el potencial de revolucionar el
tratamiento de las enfermedades genéticas. Sin embargo, es difícil desarrollar
terapias basadas en la reparación dirigidas a la homología porque requieren la
administración simultánea in vivo de la proteína Cas9, el ARN guía y el ADN
del donante.
 METODOLOGÍA
Espectros de
Expresión y Transcripción T7 in Síntesis de Síntesis de absorbancia, tamaño de
purificación de vitro de ARN de guía PAsp(DET) CRISPR–Gold partícula (DLS y TEM) y
Cas9 única (sgRNA) análisis de potencial
zeta

Análisis de Actividad Cultivo primario de

electroforesis en gel de Cultivo de Cultivo de células dendríticas
enzimática de Cas9
CRISPR-Gold para células HEK que células madre derivadas de
liberada de
determinar el contenido expresan BFP médula ósea de
CRISPR-Gold
de proteína Cas9 ratón

Aislamiento y cultivo Análisis de

de mioblastos Transfección citometría de flujo y
Nucleofección Lipofección
primarios de ratones celular microscopía de
mdx fluorescencia
 METODOLOGÍA
Amplificación por Análisis de la eficiencia Secuenciación de
Secuenciación de edición del genoma
Ensayos de Sanger de células
PCR de ADN viabilidad
de Sanger del con digestión con madre embrionarias
genómico de células enzimas de restricción y celular humanas editadas
gen BFP/GFP
transfectadas ensayo Surveyor con CRISPR-Gold

Análisis de Imágenes
transferencia Entrega in vivo automatizadas de Entrega in vivo de
Estudios de Western para la de CRISPR-Gold alto rendimiento de CRISPR-Gold en
inhibidores con producción de en ratones Ai9 una sección de ratones mdx
CRISPR-Gold proteína distrofina músculo completo tratados con CTX

Análisis de Inmunofluoresc Amplificación por

Entrega in vivo de secuenciación encia de PCR de ADN
CRISPR-Gold en profunda de tejido Tinción
distrofina, CD45 genómico de tejido
ratones mdx sin muscular tratado tricrómica
y CD11b muscular editado
tratamiento con con CRISPR-Gold
CTX
con CRISPR-Gold
Ensayo de citoquinas Análisis de secuenciación
Análisis
Bio-Plex y pérdida de profunda fuera del
estadístico peso objetivo
Figura 1 |CRISPR-gold puede entregar Cas9 RNP y ADN donante in vivo e inducir HDR

A) CRISPR-Gold se compone de GNP de 15 nm conjugados con
oligonucleótidos modificados con tiol (DNA-Thiol), que se hibridan con
oligonucleótidos donantes monocatenarios y posteriormente forman un
complejo con Cas9 RNP y el polímero disruptivo endosomal PAsp(DET),
donde 'DET' es dietilentriamina.
B) CRISPR-Gold es internalizado por las células in
vitro e in vivo a través de la endocitosis. Esto
desencadena la
interrupción endosómica y libera Cas9 RNP y el ADN
del donante en el citoplasma. La entrega nuclear da
como resultado HDR.
Figura 2 |Síntesis y caracterización de CRISPR–gold

A) Síntesis de CRISPR–Gold.
B) Análisis de espectros de
absorbancia.
C) Análisis del potencial zeta.
D) Análisis de carga Cas9.
Figura 3 | CRISPR-Gold induce HDR in
vitro
Figura 4 | CRISPR-Gold induce HDR y
promueve la expresión de la proteína
distrofina en mioblastos primarios
Figura 5 | CRISPR-Gold induce la
edición de genes en el tejido muscular
de ratones Ai9
Figura 6 | CRISPR-gold promueve HDR
en el gen de la distrofina y la expresión
de la proteína distrofina, y reduce la
fibrosis muscular en ratones, con
estimulación CTX.
Figura 7 | La edición de distrofina
inducida por oro CRISPR mejora la
función muscular con efectos
secundarios mínimos y sin elevación
de las citocinas inflamatorias
sistémicas.
 MENSAJE A CASA

CRISPR-Gold puede entregar proteína Cas9, gRNA y ADN de

donante, tanto in vitro como in vivo, y editar genes a través de HDR.
CRISPR-Gold ofrece una nueva estrategia terapéutica para tratar la
DMD causada por mutaciones puntuales y pequeñas deleciones.
Se demuestra que los vehículos de administración no virales
pueden generar HDR in vivo y tienen un gran potencial para el
tratamiento de enfermedades genéticas.