UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE”

Asignatura: Biotecnología Animal. Fecha: 18/12/2022

Nombre: Carpio Cajas Pablo Andrés. Docente: Dr. Fredy Carrera Garcés Ph.D
Tema: Clonación de monos macacos por transferencia nuclear de células somáticas.

TAREA AUTÓNOMA

1. ¿Cuál fue el problema que resolvieron?

En los tiempos modernos, el avance tecnológico en el campo de la ingeniería genética ha permitido

desarrollar técnicas de clonación para ser aplicadas en animales, al ser técnicas que se encuentran en
constante modificación e investigación, el tiempo que dura el proceso de clonación y el manejo de
las técnicas permitirá que los resultados sean los que se plantean teóricamente basándose en la
expresión genética. En la investigación se ejecutó la clonación de Monos Macacos partiendo de
ARNm de H3K9me3 desmetilasa Kdm4d y empleando el inhibidor de histona desacetilasa tricostatina
A, la cual se aplica a la célula después de SCNT. Luego de aplicar los protocolos se evidenciaron
mejoras en el desarrollo de blastocistos y la tasa de embarazo de embriones los cuales se colocaron
en monos sustituto los cuales contienen ADN mitocondrial donante de ovocitos y ADN nuclear del
donante.

2. ¿Cuál fue el objetivo principal del estudio?

El objetivo principal del estudio fue aplicar técnicas de clonación de monos cynomolgus (Macaca
fascicularis), específicamente empleando la transferencia nuclear de células del fibroblasto a monos
que poseen modificaciones genéticas. De esta forma se puede llevar a cabo un análisis fisiológico de
enfermedades humanas desarrolladas en estos primates no humanos y así desarrollar posibles
tratamientos para estas patologías.

3. ¿Cómo mejoraron la reprogramación inadecuada del núcleo de la célula donante tras la

introducción en el óvulo?

Para mejorar la reprogramación inadecuada del núcleo, se partió desde la enucleación del óvulo para
luego transferir el núcleo con el gen foráneo, posteriormente se incubaron embriones SCNT usando
como inhibidor la histona deacetilasa tricostatina A y dentro del citoplasma se inyectó ARNm, el
mismo que expresó los moduladores epigenéticos Tri Metilación de histona 3 lisina 9 (H3K9me3)
Lisina desmetilasa 4D (Kdm4d), esto permitió mejorar la reprogramación celular insuficiente en la
etapa unicelular ya que se evidenció un descenso en la expresión de los moduladores epigeneticos
H3K9me3, de tal forma que el desarrollo de embriones SCNT se llevó con normalidad.
4. ¿Qué metodología utilizaron para generar estas especies?

La metodología aplicada fue la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), la cual estuvo
dividida en las siguientes etapas:

1. Preparación de células donantes nucleares.

Esta etapa consistió en la elaboración del cultivo de las células del fibroblasto, después se analizó su
genotipo Brain and Muscle ARNT-Like 1 (BMAL1) y el cariotipo.

2. Superovulación.

Se estimuló a las hembras de la especie Macaca fascicularis a que produjeran superovulación, luego
se recolectaron los ovocitos producto de ese proceso hormonal.

3. Método de SNCT

Para esta técnica se transfirió el núcleo de células del fibroblasto de un mono modificado
genéticamente mediante la edición CRISPR/Cas9 de un gen circadiano central ( BMAL1).
Posteriormente se preparó el cultivo embrionario de esas células en medio HECM-9, para luego ser
transferidos a un medio HECM-9+5% FBS.

4. Análisis de monos clonados

Se llevaron a cabo pruebas para identificar si la clonación de la especie fue acorde a lo planificado, en
primer lugar se analizaron las repeticiones cortas en tándem (STR) y los polimorfismos de un solo
nucleótido (SNP). También se realizó el análisis del mecanismo de transcripción mediante la técnica
de PCR de transcripción inversa.

5. ¿Señale los pasos más importantes de cada metodología?

● Cultivo de células de fibroblastos de tejido del muslo del mono A6

Para este paso, la muestra de tejido se lavó por 3 ocasiones con solución salina tamponada con
fosfato, luego se cortaron en trozos de 1 a 2 mm³ y se cultivaron.

● Análisis del genotipo de células de tejido del oído, células del fibroblasto y células
sanguíneas.

Para estas muestras se extrajo el ADN nuclear, se amplifico el BMAL 1 mediante cebadores de PCR y
se realizó la secuenciación.
 ● Análisis del cariotipo

Con las células del fibroblasto se procedió a incubarlas con tripsina-ácido etilendiaminotetraacético y
KCl. Para la fijación se usó metanol y ácido acético y se procedió al recuento de sus cromosomas.

● Superovulación y recolección de ovocitos

Para la superovulación se proporcionó folitropina humana recombinante y gonadotropina crónica

humana mediante inyección intramuscular. Posteriormente se recolectaron los ovocitos y se cultivó
un medio pre equilibrado (HECM-9) de embrión de hámster.

● Optimización de métodos SCNT

Primero se realizó la enucleación del ovocito del mono. Con láser, se perforó la zona pelúcida de la
célula del fibroblasto incubado para luego microinyectar el virus hemaglutinante de Japón (HVJ-E) en
el espacio perivitelino. Pasados 1 a 2 horas de la fusión, se activaron los ovocitos reconstruidos.
Luego se analizaron las células que se usaron para comparar las regiones resistentes a la
reprogramación (RRR) mediante PCR del ARN-seq de Kdm4d. También se identificó el sitio de
metilación de los embriones SCNT mediante la técnica de inmunotinción de H3K9me3.

● SCNT con fibroblastos fetales de mono

Los ovocitos ya modificados genéticamente se prepararon en fibroblastos fetales con un cultivo

primario que partió de un feto abortado de cynomolgus, 79 de esos ovocitos se insertaron en 21
madres sustitutas.

● SCNT con células cúmulus adultas de mono

Se emplearon células del cumulus adultas como donantes, las cuales se obtuvieron 192 embriones
partiendo de 290 ovocitos. Los 181 embriones óptimos en etapa celular 2 de blastocistos, se
transfirieron a 42 madres sustitutas.

● Análisis genéticos de monos generados por SCNT

Este proceso se realizó para analizar el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) y repetición corta
en tándem (STR) en 27 loci para examinar mitocondrias y ADN nuclear de bebés de mono obtenidos
mediante SCNT. Para el análisis STR se amplificaron mediante PCR ADN celular de tejido de la oreja el
cual contenía cebadores e indicadores fluorescentes, por otro lado, para el análisis de SNP se extrajo
ADN mitocondrial del mismo tejido y se procedió a realizar amplificación por PCR y secuenciación.
6. ¿Cuáles fueron los tratamientos utilizados y cuáles fueron los principales resultados?

Tratamientos y Resultados:

● Optimización de métodos SCNT

Para este tratamiento se consiguió la unión de la célula con el oviducto enucleado. Luego de esta
unión la tasa de blastocistos formados fue de 44.7% y una masa celular interna de 11/17. Los
blastocistos que se formaron de células del cúmulos de monos hembra adultos fue de 72.7% con una
masa celular interna de 15/24. En el caso de embriones aplicados SCNT, 8 de ellos del cumulus sin
inyección de Kdm4d se mostró 2465 RRR mientras que con inyección se registró 2178 RRR. De esta
forma se demostró la regulación de genes durante el desarrollo embrionario temprano. Por otro
lado, el análisis con ARN-seq mostró que algunos genes como Dppa2, Dppa4 y Myc que fueron
reprimidos por H3K9me3 generando así deficiencia en el desarrollo de los embriones SCNT.

● SCNT con fibroblastos fetales de mono

Con la técnica SCNT se obtuvieron 109 embriones a los cuales se les inyectó ARNm Kdm4d en
condiciones I/D/T. De esta forma se logró el embarazo de 6, 4 de ellas portaban 5 fetos incluido uno
mellizo, 2 abortaron en un periodo de dos meses mientras que las otras dos se desarrollaron más de
140 días, obteniendo dos bebés a los 155 y 141 días a mediante cesárea, llamados Zhong Zhong (ZZ)
y Hua Hua (HH). Las crías, al nacer, no mostraron hipertrofia del cordón umbilical y presentaron
condiciones ideales de desarrollo. En comparación con las células del cúmulos adultas, las células del
fibroblasto arrojó resultados mayoritarios, con un 66.7% en la tasa de embarazo con feto contra un
54.5% de las células antes mencionadas.
 ● SCNT con células del cúmulos adultas de mono

Para este tratamiento se obtuvieron 192 embriones SCNT de 290 ovocitos en el estadio MII en
condiciones I/D/T/K. Únicamente 22 monas consiguieron gestar, 12 de ellas portaron fetos; 2 llegaron
a 135 y 137 días de embarazo y dieron a luz bebés vivos mediante cesárea. Ambos bebés murieron
en un lapso de 3 y 30 horas, respectivamente.

En el análisis genético de los monos a los cuales se les aplicó SCNT, se comprobó que el ADN nuclear
del tejido del oído es idéntico al del tejido celular del fibroblasto fetal. También, los SNP del gen ND3
de ADN mitocondrial del tejido de oído coincidieron con el ADN de los ovocitos del donante. En el
caso de las células del cumulus de los bebés mono que murieron se empleó el mismo análisis y se
estableció que el ADN también es similar por lo que se concluyó que la técnica resultó efectiva para
la clonación de los monos.

7. Referencias
Liu, Z., Cai, Y., Wang, Y., Nie, Y., Zhang, C., Xu, Y., Zhang, X., Lu, Y., Wang, Z., Poo, M., & Sun, Q. (2018).
Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cell, 174(1), 245.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.01.036