EXTRACCION ACIDA Y

ALCALINA DE TOXICOS -
CROMATOGRAFIA EN CAPA
FINA

Q.F. AMADEO COLLADO PACHECO

DOCTORANDO EN FARMACIA Y BIOQUIMICA
ESPECIALISTA EN IND. FARMACEUTICA
MAGISTER EN TOXICOLOGIA
PERITO FORENSE
 Introduccion
• Los tóxicos orgánicos constituyen, sin duda alguna, el grupo más
numeroso entre las diferentes sustancias tóxicas.
• Esa gran variedad determina que, en el caso de los tóxicos
orgánicos, la extracción -primera fase de todo análisis toxicológico-,
sea realmente de la máxima importancia. En función del tipo de
análisis que se vaya a realizar (estudio específico de un
determinado tóxico o bien un screening general también
denominado cribado o tamizaje) habrá que utilizar unas condiciones
concretas para la extracción.

• Por ello, el objetivo es la investigación general de tóxicos orgánicos

utilizando procedimientos de extracción generales, ya que cuando
comenzamos un análisis toxicológico, en principio, no sabemos qué
tipos de tóxicos podrían estar presentes en la muestra.
 REACTIVOS Y MATERIAL:
• HCl concentrado
• Éter etílico
• Solución saturada de CO3HNa: 10 g/100 ml agua destilada
• Solución de NaOH 0,45N: 1,8 g/100 ml agua destilada
• NH4OH 30%
• SO4H2 1N
• Metanol
• Acetona
• SO4H2 concentrado
• Furfuraldehído
• Tampón borato 0,5 M (pH 10)
• SO4Na2 anhidro
 Materiales
• Embudo de decantación de 250 ml
• Soporte / pinzas / aro
• Probetas graduadas de 50 ml (2)
• Papel indicador de pH
• Vasos de precipitado de 50 -100 ml (2)
• Pipetas graduadas 5 -10 ml (4)
• Tubos de ensayo graduados de 10 ml (10)
• Gradilla
• Papel de Filtro de 10-15 cm diámetro
• Embudo de vidrio
• Cápsula de porcelana
• Placa calefactora
• Pipetas graduadas de 2 ml (5)
• Pipetas graduadas de 1 ml (2)
• Pipetas Pasteur de plástico (2-3)
• Varilla de vidrio
 Maceración de las muestras
biológicas
• Las muestras biológicas que pueden ser hígado,
cerebro, mucosa gástrica y su contenido, orina,
sangre, humor vítreo, etc, son maceradas con
acido clorhídrico al 10% durante 24 horas en
baño maría
 Filtrado del macerado
• Una vez macerado por 24 horas las
muestras biológicas deben ser filtradas
con papel filtro hasta obtener una solución
límpida y traslucida, no debe haber restos
orgánicos
Fraccionamiento del extracto
• Introducir la muestra problema biológica,
filtrada (20 ml) en el embudo de
decantación, comprobar con papel
tornasol el pH acido (color rojo)
 Extracción acida

• Extraer con 50 ml de éter etílico: medir en una probeta 50 ml de éter y

agregarlos al embudo. Tapar el embudo y agitar por inversión durante dos
minutos. De vez en cuando abrir la llave para dejar escapar los gases que
se pueden originar durante la agitación. Finalmente, dejar en reposo para
que se separen las fases (la fase orgánica etérea en nuestro caso, quedará
en la parte superior).
 Extracción acida

• Recoger la fase acuosa inferior (fracción

B) en el “contenedor del frasco que la
contenía inicialmente” y guardar para
continuar posteriormente la extracción.
 Extracción acida
• Recoger en un tubo de ensayo graduado
5 ml de la fase etérea inferior.
Obtendremos así la fracción ácida con los
posibles tóxicos solubles en medio acido,
trasvasarla a una capsula y concentrarla.
 Extracción alcalina
• La alícuota acuosa recibida anteriormente
volver a ponerla en el embudo de
decantación y sobre ella agregar hidróxido
de amonio concentrado, verificar el pH
con papel tornasol (color azul)
 Extracción alcalina
• Extraer con 50 ml de éter etílico siguiendo
proceso habitual. Recoger toda de la fase
acuosa inferior y desecharla. El sobrenadante
contiene a los tóxicos solubles en medio
alcalino, recogerla en un tubo de ensayo y
concentrarla de igual manera que lo anterior.
 Extracción de Tóxicos Orgánicos
• Los tóxicos orgánicos se extraen con disolventes orgánicos. Entre los más
frecuentes para una extracción general se encuentran: éter etílico, cloroformo,
diclorometano, etc.
• En este proceso es fundamental el pH del medio en el que se realiza la
extracción
• Los tóxicos en medio acuoso (como es el caso de las muestras biológicas) se
comportan como ácidos, bases o sustancias neutras.
• El equilibrio fundamental del que hacemos uso en la extracción con disolventes
es el siguiente:

• Las formas NO IONIZADAS son más solubles en disolventes orgánicos. Por

tanto, en cada caso tendremos que utilizar el pH idóneo para que el tóxico que
buscamos se encuentre mayoritariamente en forma NO IONIZADA.
 Extracción de Tóxicos Ácidos

• En el caso de los tóxicos ácidos, si consideramos un medio ácido,

implica una elevada concentración de H+ , por lo que según el
principio de Le Chatelier, la reacción se desplazaría para
compensar dicho aumento hacia la izquierda, es decir, hacia la
formación de AH, aumentando así la cantidad de ácido que está en
forma No Ionizada. La forma No Ionizada es mas soluble en
disolventes orgánicos que la Ionizada. Por lo que concluimos que:
Los tóxicos de naturaleza ácida se extraen con disolventes
orgánicos en medio ácido
Proceso de extracción acida
Proceso de extracción alcalina
 Extracción de Tóxicos Básicos

• En el caso de los tóxicos básicos, si consideramos un medio alcalino,

implica una elevada concentración de OH-, por lo que según el principio de
Le Chatelier, la reacción se desplazaría hacía la izquierda para compensar
ese aumento, es decir, hacia la formación de BOH, aumentando así la
cantidad de base que está en forma No Ionizada. La forma No Ionizada es
más soluble en disolvente orgánico que la Ionizada. Por lo que concluimos
que:
Los toxicos de naturaleza basica se extraen con disolventes orgánicos en
medio alcalino
 RESUMIENDO

• Los ÁCIDOS débiles (por ej.: barbitúricos) o fuertes (por ej.:

salicilatos) se extraen con disolventes orgánicos en medio ácido.
• Las BÁSES débiles (por ej.: alcaloides, antidepresivos tricíclicos,
fenotiacinas, etc.) se extraen con disolventes orgánicos en medio
básico.
• Los NEUTROS (por ej.: sulfas, meprobamato, carbamacepina, etc.)
se extraen con disolventes orgánicos independientemente del pH
del medio (ácido o básico).
 Conclusión
• En esta práctica se va a utilizar un esquema general de
extracción y posterior fraccionamiento del extracto de
acuerdo a los principios anteriores. Sin embargo, hay
que tener en cuenta que con este procedimiento se
obtienen “fracciones enriquecidas” en cada uno de los
grupos de tóxicos, lo cual no excluye que algunos
tóxicos puedan estar presentes en más de una de
aquellas. No obstante, con fines de screening, esta
metodología cubre perfectamente las necesidades de un
análisis cualitativo inicial.
 CROMATOGRAFIA EN CAPA
FINA ( CCF )
• La cromatografía se define como la separación de una mezcla
de dos o más compuestos por distribución entre dos fases
inmiscibles : Fase Móvil y Fase Estacionaria
• Fase Móvil, llamada también activa, que transporta las
sustancias que se separan y que progresa en relación con la
otra y pueden ser líquidos o gas
• Fase Estacionaria, lugar donde se separan los principios
activos, puede ser un sólido o un líquido.
 CROMATOGRAFIA EN CAPA
FINA ( CCF )
• Técnicas Cromatográficas dependen de la distribución de los
componentes de la mezcla entre esas dos fases.
• Tipos de cromatografía, dependiendo de la naturaleza de las
dos fases involucradas: pueden ser sólido-liquido (capa fina,
papel o columna), o bien liquido-liquido o gases liquido (fase
vapor).
• Todos los sólidos finamente pulverizados tienen el poder de
adsorber en mayor o menor grado otras sustancias sobre su
superficie; y, similarmente, todas las sustancias pueden ser
adsorbidas, unas con más facilidad que otras. Este fenómeno
de adsorción selectiva es el principio fundamental de la
cromatografía
 CROMATOGRAFIA EN CAPA
FINA ( CCF )
• Concepto de Rf
• El símbolo Rf significa “Relación de frentes”, es una relación de
distancias, y se expresa como el cociente entre la distancia recorrida
por la sustancia y la distancia recorrida por el disolvente hasta el
frente del eluyente:
Rf = (a) / (b)
• Donde :
• (a) = distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación
• (b) = distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente
 CROMATOGRAFIA EN CAPA
FINA ( CCF )

• El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la

muestra:
• Por tipo de adsorbente
• Por tipo de eluyente
• Condiciones de la placa
• Temperatura
• Vapor de saturación, etc.
• Tiene una reproducibilidad de + o - 20%, por lo que es mejor correr
duplicados de la misma placa.
 CCF
c) Cromatografía en capa fina
• En la cromatografía en capa fina (CCF), se utiliza una placa
recubierta con el adsorbente (fase estacionaria) en forma de una
capa delgada, de espesor constante, adherida sobre un soporte
rígido, que puede ser una placa de vidrio, aluminio o poliéster. Hay
adsorbentes que contienen un indicador de fluorescencia para
facilitar la identificación de muestras. Si no se usa indicador y los
componentes no son coloridos, se requerirán otras técnicas de
revelado.
• El eluyente (fase móvil) ascenderá por capilaridad por la placa y
arrastrará los componentes en forma diferenciada a lo largo de ésta,
produciendo “manchas” de los componentes. El grado de elución de
las sustancias dependerá tanto de su propia polaridad como de la
polaridad del eluyente utilizado.
 CCF
• h) Gel de sílice.
• Es una forma granular y porosa de dióxido de silicio, hecho a
partir de silicato sódico. Es un gel sólido y duro, de aspecto
cristalino, poroso, inerte, no tóxico e inodoro. Su fórmula
molecular es SiO .nH O, casi insoluble en agua y en cualquier
2 2

otro disolvente. Es químicamente estable, sólo reacciona con

ácido fluorhídrico y con álcali.
• Si OH O O O Si Si OH O O Si Si OH O O Si Si O O O O O O
O Si O O OOH O
• El gel de sílice, también conocido como Silicagel, es un
producto absorbente que puede diferenciar la adsorción de
diferentes moléculas, actuando como un adsorbente selectivo
en procesos de cromatografía, tanto en columna como en placa
 CCF
• Para el Informe. -
•  Para mayor claridad de los resultados, incluya en su
informe los dibujos de las cromatoplacas a tamaño natural de
todos los experimentos.
•  Conteste también las siguientes preguntas en cada
experimento:

• I. Preparación de cromatoplacas y capilares.

• a) Explique cómo se preparan las cromatoplacas.
• b) Diga cómo se prepara la cámara de elución.
• II. Aplicación de la muestra y efecto de la concentración.
• a) ¿Cuál es la relación existente entre la intensidad y tamaño
de las manchas con la concentración de la sustancia aplicada
MUCHAS GRACIAS