Instituto Profesional Santo Tomás

Ingeniería Química Industrial

Antofagasta

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ALTA RESOLUCION:
HPLC

Profesora Andrea Reyes Bastías

Email: contactoprofeandrea@gmail.com
 INTRODUCCION

• Cromatografía liquida de alta resolución es un herramienta poderosa en el análisis.

• Es de alto rendimiento y alta velocidad, comparado con otros métodos tradicionales
cromatográficos de columna, debido a la fuerza con que es bombeada la fase móvil.
• Puede separar una mezcla de componentes.
• Es usada en bioquímica y química analítica para identificar, cuantificar y purificar, de forma
independiente, los componentes de una mezcla.

HPLC es una tipo de cromatografía liquida donde la muestra es

forzada a través de una columna que está empaquetada don una
fase estacionaria, compuesta de forma irregular de partículas, o una
capa monolítica porosa, u una membrana porosa por un liquido (fase
móvil) a alta presión.
 Clasificación de la Cromatografía de Líquidos

 Cromatografía Líquido-Sólido,(adsorción)
 Cromatografía Líquido-Líquido, (partición)
 Cromatografía de Fase (normal y reversa)
 Cromatografía de Intercambio iónico.
 Cromatografía de Exclusión por Tamaño (cromatografía en gel)
 Fase Estacionaria
• Si la fase estacionaria es un sólido y la fase móvil un líquido la Cromatografía se denomina CLS.
• Análogamente existirán una cromatografía CLL, CGL y CG.
• Así, la Cromatografía puede clasificarse en modalidades de afinidad y por tamaño molecular.

CALSIFICACION POR AFINIDAD

a) Cromatografía en fase normal.

b) Cromatografía en fase ligada.
c) Cromatografía de intercambio iónico.
 COMPONENTES PRINCIPALES

En el caso más simple, el cromatógrafo líquido está

constituido por:
• Solvente
• Bomba de alta presión 1) Un reservorio de solvente que alimenta al sistema con la
fase móvil.
• Inyector
• Columna 2) Un sistema para forzar el pasaje de la muestra por la
columna: Bomba.
• Detector
• Graficador 3) Un sistema que permite la introducción de la muestra:
Inyector.
4) Un sistema de monitoreo de la solución que emerge de
la columna: Detector.
5) Un sistema de registro de los datos proveniente del
detector.
SOLVENTES PARA HPLC Los solventes en HPLC se utilizan
como:

•Fases Móviles
•Para disolver la muestra
•Para preparar las muestras

El uso como Fases Móviles es de principal

importancia puesto que sus propiedades
han de mantenerse en límites estrechos
de aceptabilidad. Además esas
propiedades también influyen en la
elección del solvente de disolución y el de
preparación de la muestra.
En la TABLA 1, se muestran varias propiedades que son importantes al seleccionar el o los solventes en una
aplicación de HPLC:
La elección final del solvente más adecuado se basará en los siguientes principios básicos:

•Compatibilidad con el detector

•Polaridad y Selectividad
•Seguridad

Solventes más utilizados para la fase móvil:

Características del solvente:

• Disponible comercialmente
• Precio
• Pureza y Estabilidad: En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza
cromatográfica (bajo contenido de impurezas)
• Disolver la muestra
• Miscible con otros solventes para formar mezclas útiles
• No degradar o disolver la fase estacionaria
• Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
• Ser compatible con el detector utilizado: Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV)
• Se prefieren solventes de punto de ebullición intermedio.
• Algunos solventes más utilizados:
1. Compatibilidad con la Detección

1.1. Detección UV

La fase móvil debería tener una absorbancia A < 0.2 AU en la longitud de onda seleccionada para
la detección de la muestra: una menor absorbancia permite una mayor precisión del ensayo y
mejores resultados en condiciones de elución por gradiente, aunque una absorbancia mayor
puede resultar aceptable en algunas separaciones isocráticas.

1.2. Detección por Índice de Refracción

En condiciones isocraticas la selección de eluyentes no resulta crítica y la sensibilidad puede

incrementarse con fases móviles cuyo Índice de Refracción (IR) sea lo más diferente posible que
el de los componentes de la mezcla.

Los detectores de IR no pueden utilizarse en condiciones de gradiente por la gran diferencia de

respuesta que pueden tener el solvente A y B.
2. Polaridad y Selectividad

En la TABLA 4 se muestran los propiedades

de los solventes que afecta a la fuerza,
selectividad y solubilidad. La «Selectividad
Normalizada» incluye tres contribuciones a la
interacción soluto - solvente:  La Acidez y la
Basicidad de Enlace de Hidrógeno y la
Dipolaridad.

Estos tres parámetros son la base del

triángulo de la selectividad:
3. Seguridad

Los solvente usados generalmente en

HPLC son muchas veces inflamables y
moderadamente tóxicos, y por lo tanto
han de almacenarse en una armario
metálico de seguridad.

En la TABLA 7 se muestran los valores

de Flash Point que indican la
inflamabilidad del solvente. La
experiencia indica que el metanol (FP
12 ºC) es moderadamente inflamable
por lo que productos con FP por
encima de ese valor no debería
presentar ningún problema en
términos de seguridad frente al fuego.
Los solventes con FP inferiores son
más peligrosos y deberían tratarse con
la cautela adecuada.
Por cuanto respecta a la toxicidad los solventes deberían
manipularse en campana exceptuando el agua.
La indicación de su toxicidad viene dada el valor LD50 que
es la cantidad en mg/Kg de cuerpo que causa un 50% de
mortandad de la población. Sin embargo los solventes
usados en el laboratorio muy raramente se ingestan y su
peligro más inmediato es por contacto o inhalación. La
Acetona con un LD50 no es claramente un problema
aunque su FP de -18ºC requiere atención por cuanto
respecta al riesgo de fuego.
 Filtración y Desgasificación de solventes

• Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en
general causar desgaste del sistema de HPLC.

• Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre
(0.45 o 0.22 micras) y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.

• El Oxígeno Disuelto puede producir mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y

electroquímicos.

• El Nitrógeno Disuelto es el otro componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la

columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la
línea base.

• El Dióxido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el
sistema de solvente.
Para evitar flujos inestables, la
formación de burbujas o la
interferencia de partículas
extrañas los disolventes deben
estar filtrados y desgasificados.
Esto puede realizarse mediante un
tratamiento previo que elimine los
gases y la materia en suspensión
(filtros milipore) o bien
integrando sistemas de filtrado y
desgasificación en el equipo de
HPLC.
La elución se puede realizar de dos maneras:

•Elución isocrática: cuando se emplea un único disolvente o una mezcla de disolventes de

composición constante.

•Elución en gradiente: cuando se emplea una mezcla de disolventes cuya concentración se

hace variar a largo del proceso, con el fin de modificar la polaridad de la fase móvil y disminuir el
tiempo de separación (es un efecto semejante al que se produce cuando modificamos la
temperatura en cromatografía de gases).

Los instrumentos modernos están equipados con válvulas de alimentación que permiten

controlar de manera programada la velocidad de flujo de cada disolvente en cada instante.
Métodos de Filtración de Solventes en HPLC

Hay tres(3) métodos comunes que se

utilizan hoy para la filtración previa de los
Solventes en HPLC :
• Filtro a la Entrada del Solvente
Filtración al Vacío Filtración en Línea.

Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC

Existen cuatro métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:
Sonificación, Burbujear Helio, Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo,
Desgasificación al Vacío en Línea y Temperatura.
 RECIPIENTES PARA HPLC

• Los recipientes a menudo se equipan con un

sistema de desgasificación para eliminar los gases
disueltos que interfieren formando burbujas en los
sistemas de detección. Puede consistir en un
sistema de bombeo al vacío, un sistema de
destilación, un dispositivo para calentar y agitar los
solventes o con frecuencia estos sistemas también
contienen un dispositivo para la filtración del polvo y
de las partículas solidas en suspensión de los
disolventes.

• No es necesario que los desgasificadores y filtros

sean partes integrantes de HPLC, por ejemplo, una
forma conveniente de tratar los disolventes antes de
introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos el
vacío a través de un filtro de poro muy pequeño.
 SISTEMAS DE BOMBEO

Todos los sistemas HPLC incorporan un sistema de

bombeo, con las siguientes características:

•Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta

400 atm.
•Mantener un flujo libre de pulsos
•Proporcionar caudales constantes y reproducibles
•Permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido
•Ser químicamente inerte y resistente a la corrosión

Las más empleadas son las bombas recíprocas, que

consisten en una pequeña cámara en la que el disolvente
es impulsado por el movimiento de vaivén de un pistón
accionado por un motor. Las entrada y salida del disolvente
se regula mediante dos válvulas antiretorno que se abren
y cierran alternativamente, permitiendo el paso de fluido en
un solo sentido.
Entre las ventajas que presentan se encuentran: pequeño volumen interno, altas presiones de
salida, caudales constantes y compatibilidad con la elución en gradiente. Sin embargo, generan
un flujo pulsado, que se ha de amortiguar para evitar la generación de ruido.

Tipos de bombas:

Tres tipos:

• Recíprocas (90% HPLC las utiliza).

• De Jeringa o de desplazamiento.
• Neumáticas o de presión constante.
Bombas recíprocas
Bombas de jeringa o
desplazamiento
Bombas neumáticas o presión
constante
SISTEMAS DE INYECCION
DE LA MUESTRA

La inyección de un volumen de muestra

preciso, y muy pequeño (5-500 μL), debe
hacerse a la entrada de la columna en un
breve periodo de tiempo para perturbar lo
menos posible el régimen de circulación de la
fase móvil y evitar el ensanchamiento de
banda. La reproducibilidad de la
inyección va a condicionar la precisión de las
medidas.

El sistema de inyección está formado

por válvulas rotatorias de alta presión de
varias vías manuales o automatizadas.
Constan de un doble circuito, uno de los
cuales está conectado al exterior y el otro al
propio sistema, pudiendo intercambiarse de
forma rápida y simple entre las dos
• Con la válvula en la posición
de llenado de la izquierda la
fase móvil pasa de la bomba a
la columna mientras que la
muestra se inyecta en el otro
circuito con forma de bucle.
Cuando la válvula gira hacia
la posición de inyección de la
derecha, la fase móvil arrastra
la muestra hacia la columna.

• El objetivo de utilizar este tipo

de válvulas es de no interrumpir
el flujo de fase móvil a través de
la columna e introducir en el
flujo de la misma un volumen de
muestra que estará contenida
en un tramo de tubería de
volumen fijo.
COLUMNAS PARA CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS

COLUMNAS

Son columnas rectas, fabricadas habitualmente de acero, aunque también se emplean columnas

construidas de vidrio y materiales poliméricos. La mayoría de ellas tienen una longitud entre 5 y 30
cm, y su diámetro interno varía entre 3 y 10 mm. Los rellenos más comunes son de 5 a 10 μm y se
mantienen en el interior del tubo mediante cierres porosos de metal o de vidrio. Actualmente existen
columnas de mayor eficacia y dimensiones más reducidas, que superan los 100.000 platos/metro
con un consumo mínimo de disolvente (lo cual abarata considerablemente el proceso).

PRECOLUMNAS

Las columnas son delicadas y caras, por lo que se emplean precolumnas, de composición similar

a la de la columna (aunque con un diámetro de partícula de mayor tamaño para minimizar la caída
de presión). Las precolumnas eliminan los contaminantes, la materia en suspensión y
aquellos componentes que se unen de manera irreversible a la fase estacionaria, de manera
que cuando está muy contaminada, se vacía y se rellena de nuevo o se reemplaza por otra nueva.
COLUMNAS TERMOSTATIZADAS

En algunas ocasiones se obtienen mejores resultados calentando la columna, ya que la

viscosidad del disolvente disminuye (se consigue un mayor caudal o se reduce la presión
requerida) y se acortan los tiempos de retención. Sin embargo, un aumento de la
temperatura también puede degradar la fase estacionaria y reducir el tiempo de vida de la
columna, por lo que se deben emplear hornos que controlen la temperatura de una manera muy
precisa (de décimas de grado).

RELLENO DE LA COLUMNA

El relleno empleado en las columnas de HPLC debe ser químicamente inerte, mecánicamente

resistente y poseer un tamaño de partícula bien definido. Habitualmente está formado
por partículas esféricas microporosas de sílice muy puro, que son permeables al disolvente y
presentan una elevada área superficial (no puede emplearse con fases móviles cuyo pH sea mayor
que 8). También se emplean rellenos de alúmina (u otros óxidos metálicos), grafito poroso o
materiales poliméricos (como estireno-divinilbenceno).

El relleno puede actuar como mero soporte de una fase estacionaria líquida o, convenientemente
tratado, puede intervenir directamente en el proceso de separación.
Fuentes de daño de una columna de HPLC:

• Obstrucción por partículas pequeñas en los solventes o fases móviles.

• Obstrucción por materiales no eluídos en las muestras.
• Variación de las características de retención por incremento de materiales no eluídos.

• Son generalmente de acero ó plástico, de una

longitud de 5-30 cm y con diámetros interiores de
1-5 mm.

• Las convencionales tienen un diámetro interno

de 4.6 mm. (L=15 ó 25 cm y 5μm tamaño
partícula).

• Son caras y se degradan con facilidad (polvo,

partículas de la muestra o disolventes).

• La entrada de la columna se protege con una

precolumna y que se reemplaza periódicamente.
Partes de la
columna:
Pre- columnas:
 DETECTORES PARA HPLC

A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores

universales tan fiables como lo son el detector FID o el TCD. Sus características (sensibilidad,
estabilidad, reproducibilidad, respuesta lineal, tiempo de respuesta corto, fácil manejo) son similares
a éstos, aunque no es necesario que sean sensibles en un intervalo de temperaturas tan
elevado y deben tener un volumen interno mínimo para reducir el ensanchamiento de banda
extracolumna.

DETECTORES EMPLEADOS EN HPLC

Los detectores empleados en HPLC se han diseñado, adaptado y perfeccionado con el fin de
incorporar celdas de flujo que permitan medir las bajas concentraciones de analito que hay
en el líquido. Los distintos detectores se clasifican según se encarguen de medir una propiedad
del soluto o de la disolución.
Tipos de detectores:

• Detector de absorción uv vis.

• Detector de absorción infrarroja.
• Detector de fluorescencia.
• Detector de índice de refracción.
• Detector de dispersión de luz.
• Detector electroquímico.
• Detector de conductividad.
• Detector acoplado a espectrómetro de masa.
 MUESTRA

• Antes de inyectar la muestra en el equipo, hay que tenerla en estado líquido o en solución, y
tener en claro que sea compatible tanto con la fase móvil como con la fase estacionaria.

• Se pueden inyectar cantidades que varían entre 1 μl a 100 μl; generalmente se inyectan entre
5 μl y 10 μl.

• Las cantidades inyectadas varían dependiendo de la sensibilidad y el rango dinámico del

detector.

• El tiempo de análisis puede variar entre 5 min y 2 hs dependiendo del tiempo de preparación
de la muestra, entre otras cosas.

• La preparación de cada muestra es totalmente diferente, y puede consistir en una

hiperfiltración, dilución, preconcentración, extracción, etc.
 Problemas más comunes encontrados en HPLC
Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus posibles causas
posibles, y cómo solucionarlos.

Presión Alta:

• Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partículas.

• Solución: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del
detector. Si esto no funciona reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si la presión
sigue alta reemplace la columna.
• Solución a largo plazo: Asegurase que todas las fases móviles se filtren apropiadamente
antes que entren a la bomba de HPLC . También filtre todas las muestras antes de inyectarlas.
Pérdida de la Resolución

• Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC ó del Guarda Columna por partículas.

• Solución: vea la sección de Presión Alta

• Solución a largo plazo: Filtrar todo antes de que se introduzcan las fases móviles en el
sistema de HPLC.

Picos Hendidos
• Posible causa : Obstrucción de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partículas.

• Solución: La columna se desatornilla. Si es necesario reemplazar la columna.

• Solución a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema
de HPLC.
Variación en los Tiempos de Retención

• Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil.

• Solución: Desgasificación de la Bomba.

• Solución a larga plazo: Asegurase fase móvil este propiamente y adecuadamente

desgasificada. Si usa desgasificación electrónica en la línea asegurarse de que la cadencia del
flujo no es demasiado alto.

Variaciones de la Línea Base

• Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala
desgasificación de los solventes de la fase móvil.

• Solución: Asegúrese que todas las fases móviles estén debidamente desgasificadas y
considerar el uso de un restrictor de la presión a toma de corriente del detector.
Línea Base con mucho Ruido

• Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.

• Solución: Enjuague el sistema y purgue la bomba de HPLC . Use Solventes desgasificados
adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase móvil del sistema.

Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de Fluorescencia)

• Posible causa: Oxígeno Disuelto

• Solución: Desgasificar adecuadamente las fases móviles para reducir la concentración de
oxígeno disuelto.
• Solución a largo plazo: Agregar un sistema de filtración al vacío en línea. Periódicamente
chequear el nivel de oxígeno disuelto.

Baja ó Ninguna Presión

• Posible causa: Trabajar con bombas, sellos ó pistones expuestos por mucho tiempo a
partículas en suspensión en la fase móvil.
• Solución: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.