UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

Facultad de Ciencias
Escuela Profesional de Ciencias Biológicas

INFORME DE LABORATORIO: EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

EN BACTERIAS Y NEMATODOS

PRESENTADO POR:

Pasapera Palacios Viviana Pierina

Reto Zapata Sixto Javier

Roman Veintimilla Emanuel

Sánchez Céspedes Diego Alonso

DOCENTE:

Blgo. Henry Robles Cueva

CURSO:

Biología Celular y Molecular

PIURA, PERÚ

2022
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN BACTERIAS Y NEMATODOS

I. Introducción
Los ácidos nucleicos son biomoléculas inorgánicas importantes en los seres vivos

debido a que constituyen la materia prima de la evolución y permiten transmitir

características de una a otra generación. Los dos tipos más conocidos son el ácido

desoxirribonucleico y el ácido ribonucleico.

El ADN se encuentra en los cromosomas de todos los seres vivos, codifica la totalidad

de la información genética del organismo; y el ARN se encuentra principalmente en el

nucléolo y en los ribosomas, contiene información copiada del ADN.

En las bacterias su ADN está constituido por una sola molécula circular muy alargada,

su función es almacenar la información genética y dirigir el funcionamiento de la bacteria.

A especies de nematodos se les puede aplicar y estandarizar técnicas de biología

molecular como extracción, amplificación y secuenciación de ADN, que son utilizadas para

conocer su género.

Las técnicas que se emplean en el estudio de bacterias del suelo son la extracción del

ADN por congelación, maceración, la extracción directa por lisis con lisozima y la posterior

congelación-maceración de las muestras, seguida con la extracción son sodio dodecilsulfato y

fenol-cloroformo; entre otras.

En el presente informe describiremos el procedimiento y cómo funciona la técnica de

extracción de lisis utilizada tanto para la extracción de ADN de bacterias como para la

extracción de ADN de nematodos, y a partir de esto se realizarán las respectivas

conclusiones.
 II. Marco Teórico

2.1 QUÉ ES UN ÁCIDO NUCLEICO

Los ácidos nucleicos son macromoléculas o polímeros biológicos presentes en las

células de los seres vivos, es decir, largas cadenas moleculares compuestas a partir de la

repetición de piezas más chicas (monómeros). En este caso, son polímeros de nucleótidos

unidos mediante enlaces fosfodiéster.

Existen dos tipos conocidos de ácido nucleico: ADN y ARN. Dependiendo de su tipo,

pueden ser más o menos vastos, más o menos complejos, y pueden presentar diversas formas.

Estas macromoléculas están contenidas en todas las células (en el núcleo celular en el

caso de los eucariotas, o en el nucleoide en el caso de las procariotas). Incluso agentes

infecciosos tan simples como los virus poseen estas macromoléculas estables, voluminosas y

primordiales.

2.1.1 IMPORTANCIA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos son fundamentales para la vida tal como la conocemos, ya que son

imprescindibles para la síntesis de proteínas y para la transmisión de la información genética

de una generación a otra (herencia). La comprensión de estos compuestos representó en su

momento un enorme salto adelante en la comprensión de los fundamentos químicos de la vida.

Por eso, la protección del ADN es fundamental para la vida del individuo y de la

especie. Agentes químicos tóxicos (como la radiación ionizante, metales pesados o sustancias

cancerígenas) pueden causar alteraciones en los ácidos nucleicos, y ocasionar enfermedades

que, en ciertos casos, pueden ser transmisibles a las generaciones venideras.

2.2 EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO:

Actualmente, la identificación de bacterias se realiza con técnicas clásicas basadas en

caracterización fenotípica a nivel macroscópico y microscópico, sin embargo, este método no

es fiable y no permite conocer la verdadera identidad del microorganismo en estudio. Por esta

razón es necesario realizar una identificación a nivel molecular que permita conocer con

seguridad el género y especie.

Toda la información genética esencial para la vida de la bacteria está contenida en una

única molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por

enlace covalente. Dicha molécula se denomina cromosoma bacteriano. Muchas bacterias

poseen además ADN extra cromosómico, también circular y cerrado, denominado ADN

plasmídico por estar contenido en los plásmidos. Éstos, portan información génica para

muchas funciones que no son esenciales para la célula en condiciones normales de

crecimiento.

La variación entre los nucleótidos que constituyen la cadena de ácido nucleico, está

dada por sus bases nitrogenadas; para el ADN son: adenina (A), timina (T), citocina (C) y

guanina (G) y para el ácido ribonucleico (ARN) son en lugar de timina, el uracilo (U). La A y

G se denominan bases púricas o purinas, mientras que T, U, y C se denominan bases

pirimidínicas o pirimidinas. Así, una cadena o hebra de ácido nucleico, tendrá una estructura

primaria determinada por la secuencia de las bases que la componen.

El ADN, como macromolécula, está compuesto por dos cadenas nucleotídicas o

hebras antiparalelas que se enlazan entre sí formando una doble hélice. Los enlaces entre

ambas hebras de ADN están determinados por puentes de hidrógeno entre las purinas de una

cadena, con las pirimidinas de la otra. Entonces, la A forma dos puentes de hidrógeno con la

T, mientras que la C forma tres puentes de hidrógeno con la G. Dicho fenómeno se conoce
como complementariedad de bases, es decir que la A es complementaria a la T y la C lo es

para la G. Estos enlaces mantienen estable la estructura de doble hélice de ADN.

En esta estructura de doble hélice de ADN se pueden distinguir pares de nucleótidos o

pares de bases (pb). Estas pb pueden usarse como unidad de tamaño o longitud para las

moléculas de ADN, de esta manera podemos decir por ejemplo que el ADN cromosómico de

Escherichia coli tiene un tamaño de 4,2 millones de pb o lo que es lo mismo de 4.200

kilobases (Kb) Todas las células deben enfrentarse al problema de cómo lograr contener en su

estructura moléculas tan grandes como el ADN. Volviendo al ejemplo de E.coli, los 4.200 Kb

de su genoma implican una longitud de 1,3 mm es decir unas mil veces la longitud de la

célula.

Las bacterias no poseen histonas asociadas a su genoma y en consecuencia no tienen

la posibilidad de compactar su ADN en estructuras tipo nucleosomas como las células

eucariotas. Por lo tanto, deben compactar su ADN de otra manera. Esto se logra porque el

ADN circular cerrado es capaz de adoptar una estructura terciaria denominada

superenrollamiento, que implica el enrollamiento del eje de la doble hélice sobre sí mismo.

Este superenrollamiento se dice que tiene sentido negativo porque tiene el sentido contrario al

enrollamiento de una hebra de ADN sobre la otra.

Esta estructura de superenrollamiento también supone para la bacteria una fuente de

almacenamiento de energía para ser usada en muchos procesos fisiológicos que la requieren,

por ejemplo, la separación de las dos hebras de ADN necesaria para la replicación y la

transcripción. El cromosoma bacteriano es suficientemente largo como para formar muchos

lazos circulares, que como tales pueden superenrollarse formando una serie de dominios

topológicos independientes. Esta organización en dominios colabora a la compactación

general del genoma bacteriano e impide que, con la ruptura de una hebra (en cualquier sitio

del cromosoma) se pierda el superenrollamiento total, manteniendo la energía almacenada.

2.3 MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE ADN EN NEMATODOS

Los métodos morfométricos para identificación de especies de nematodo muy

cercanas son sumamente difíciles de reconocer, además de ser un trabajo muy arduo y

desarrollado por expertos. Los avances moleculares son métodos que permiten comprobar los

análisis morfométricos y han facilitado la identificación de algunas especies muy complejas

que anteriormente no se habían podido caracterizar. A especies de nematodos relacionadas

muy cercanamente, pero con ecología muy diversa, se les puede aplicar y estandarizar

técnicas de biología molecular como extracción, amplificación y secuenciación de ADN, que

son utilizadas para conocer el género del nemátodo de interés.

La determinación morfológica y morfométrica de nematodos fitopatógenos en los

laboratorios de diagnóstico, dado el amplio rango de especies existentes, resulta complicada.

En los últimos años, se han desarrollado técnicas moleculares, sobre todo para la

identificación de las especies más importantes, que facilitan enormemente el diagnóstico,

por lo que se están implantando para su uso rutinario. Antes de caracterizar un determinado

nematodo mediante un marcador molecular apropiado, es necesario extraer su ADN, por eso

se considera este paso como el más crítico a la hora de aplicar técnicas moleculares. Se han

descrito distintos métodos de extracción para distintos géneros. Dada la complejidad que

supone, para un laboratorio de diagnóstico, utilizar protocolos específicos de extracción para

cada nematodo el objetivo de este trabajo fue evaluar la eficacia de un único método de

extracción de ADN para los principales géneros de nematodos fitopatógenos.

 III. Metodología

EXTRACCIÓN DE ADN DE BACTERIAS

Esta práctica permite aislar el ADN cromosómico de células bacterianas de E.coli, estas

bacterias son Gram (-) así que no se necesita el tratamiento con lisozima que si necesitan las

bacterias Gram (+) que son más difíciles de lisar y necesitan para ellos enzimas líticos

3.1. Protocolo rápido

Este protocolo permite una rápida extracción del ADN cromosómico de forma que se

puede realizar de una forma rápida en una clase práctica con alumnos. Las células bacterianas

se han obtenido por centrifugación de 1.5 ml de un cultivo “overnight” células de E.coli y se

suministran en forma de pellet bacteriano.

El primer paso es la incubación del pellet bacteriano con una solución de lisis que

romperá las membranas celulares y liberará los ácidos nucleicos. Luego se eliminarán las

proteínas y restos celulares con la adición de una solución de precipitación de proteínas.

Después de una centrifugación nos quedaremos con el sobrenadante y haremos precipitar los

ácidos nucleicos con isopropanol, seguido de un lavado con etanol 70% y finalmente la

hidratación del ADN.

Lisis celular

1. Añadir 1.5 ml de un cultivo overnight a un tubo de 1.5 ml.

2. Centrifugar a 14.000 x g durante 30 segundos. Eliminar el sobrenadante.

3. Añadir 600 ml de Solución de Lisis al pellet celular y pipetear para resuspender y lisar las

células.
4. Incubar las muestras a 80ºC durante 5-10 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.

Precipitación de proteínas

1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.

2. Añadir 300 ml de Solución de precipitación de proteínas.

3. Vórtex vigorosamente durante 20-30 segundos.

4. Centrifugar a 14.000 x g durante 5 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma

un pellet.

Precipitación del ADN

1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600ml de

isopropanol Mezclar por inversión varias veces.

2. Centrifugar a 14.000 x g durante 3 minutos.

3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 ml de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el

pellet de ADN.

4. Centrifugar a 14.000 x g durante 2 minutos. Cuidadosamente eliminar todo el etanol. Vigilar

no perder el pellet de ADN.

5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos.

Hidratación del ADN

1. Añadir 500-750 ml de Solución de Hidratación del ADN. Resuspender mediante micropipeta

el pellet blanco. La incubación a 55ºC con periódicas agitaciones con vortex ayudará a la

disolución del ADN.

EXTRACCIÓN DE ADN DE NEMATODOS

Para la extracción de ADN de los nematodos se utilizaron tres protocolos de

extracción diferentes. Los nematodos fueron aislados de tejido vegetal y de babosas enfermas

por medio del lavado con agua estéril en un tamiz de 40 micras.

➢ Primer protocolo

Se utilizó el kit de extracción de PlantDNAzol (tomado de Kit de extracción para

plantas, por GIBCORL-LIFE TECHNOLOGIES). Para este procedimiento fue necesario

tomar el tejido de una babosa enferma, el tejido vegetal y 1.000 nematodos puros, esto se

filtró en un tamiz de 40 micras Se adicionaron 300 μl de reactivo de lisis DNAzol gibco

10978-021, 300 μl Cloroformo sigma C-2432, 225 μl de Etanol 100% baker analyzed.

➢ Segundo protocolo

Se utilizó el kit de extracción de ULTRACLEAN TM, SOIL DNA ISOLATION KIT,

(catálogo # 12800-50). En este protocolo se utilizaron como muestras nematodos

provenientes del tejido de una babosa enferma, tejido vegetal y 1.000 nematodos puros.

➢ Tercer protocolo

Para esta extracción, las muestras que se usaron fueron de 3, 6, 10, 100 y 1.000

nematodos, que fueron tomados individualmente con pincel y al estereoscopio, y se

sometieron a un proceso de lisis por el método de extracción de Floyd, propuesto en 2002, el

cual fue modificado en este trabajo debido a la influencia de la temperatura, la altura y otros

factores no controlables.
Procedimiento

A cada tubo se le adicionó NaOH en una concentración de 0.25 m en tubos de 200μl,

pero a cada uno se le añadió una cantidad diferente, dependiendo del número de nematodos.

Se mantuvo en la incubadora a 25° C por 3-16 horas. Posteriormente el lisado fue calentado

en un baño maría en un beaker de 500 ml, por cuatro minutos y a una temperatura de 920 C.

Se le agregaron cuatro μl de HCl, 10 μl de Tris –HCl a un pH 8 (para neutralizar la base) y 5

μl de Tritón X-100 al 2%, Por último se calentó a 92° C en un baño maría, durante cuatro

minutos y se llevó a una temperatura de almacenamiento a –20° C.

 IV. Resultados

EXTRACCIÓN DE ADN DE BACTERIAS

M: Marcador peso molecular. 1. Pellet bacteriano E.coli. 2. Pellet bacteriano E.coli.

Se puede observar 2 bandas por encima de la última del marcador de peso molecular

que corresponden al ADN cromosómico. En este método rápido no se utiliza el uso del

enzima RNasa que eliminaría el ARN degradado que podemos observar como una o dos

bandas en la parte inferior del gel de agarosa.

EXTRACCIÓN DE ADN DE NEMATODOS

En el gel se observa que los dos protocolos utilizados (kit Soil Mo BIO, KIT

PlantDNAzol) para la extracción de ADN fueron efectivos, ya que se puede divisar la banda

para los dos métodos usados en las diferentes muestras (tejido babosa enferma, tejido vegetal,

1000 nematodos) en el gel se puede distinguir que algunas bandas son más fuertes que otras,

lo cual puede estar relacionado con distintos factores, entre ellos: que la muestra no tenía

impurezas como ADNasas, además el kit de extracción es una buena alternativa para la
obtención de ADN puro, perteneciente al del nematodo (carril 6), comparado con el ADN

extraído con los demás tipos de extracción donde se puede divisar dos bandas en el mismo

carril, lo que significa que en esa muestra se encontraría ADN vegetal y ADN de babosa

(carril 1, 2, 5 ).

Extracción de ADN. Los carriles 1, 2 y 9 corresponden al ADN extraído con el kit

plant DNAzol, y a su vez corresponden a las muestras babosa, vegetal (lechuga), y

1000 nematodos respectivamente. Los carriles 4, 5 y 6 corresponden al ADN

extraído con el kit Soil; cada carril corresponde a 1000 nematodos babosa y vegetal

(lechuga).

➢ Protocolo 1

En la sección a de la siguiente figura se observa el gel de electroforesis y la

amplificación de dos bandas, que corresponden al segundo par de primers universales

utilizando el programa del termociclador NEMA60. La extracción de ADN se obtuvo de

1000 nematodos, con un tamaño de 650 pb aproximadamente. La secuencia de los ácidos

nucleicos de rápida evolución de los segmentos de expansión del gen 28S del rADN
puede distinguir taxa hasta el nivel de especie, por esta razón se utilizaron los primers

D2A y D3B (Thomas et al, 1997).

En la sección b de la figura, se observa la amplificación de las bandas utilizando

los primers universales y el programa de amplificación NEMA60. Para los análisis

moleculares se utilizaron dos pares de primers, estos primeros correspondían a primers

universales de la región ITS1. La región ITS1 fue utilizada para estimar la filogenia y

para identificar las distintas especies de nematodos, incluyendo las especies animal,

vegetal e insectos parásitos (Campbell et al, 1995).

En la sección c se observa la amplificación de ADN con primers universales

SSU18A y SS26R, de una banda aproximadamente de 1000 pb, con ADN extraído de

tejido de babosa enferma. También se utilizó tejido de babosa sana para observar si estos

primers eran específicos para el nematodos, y para este kit se utilizó el tejido vegetal y

1000 nematodos, pero las últimas tres muestras no amplificaron. Posiblemente este ADN

se degradó o la cantidad de templado (ADN) no fue la adecuada, por lo cual pudo haberse

inhibido la PCR. El ADN utilizado en la master mix fue extraído a través del kit.

El ADN utilizado en la master mix, fue extraído a través del kit PlantDNAzol. Es

importante saber que con este protocolo la cantidad de templado a utilizar es de 5 μl. La

reacción de PCR no se vio inhibida por los compuestos utilizados en la extracción; la

pequeña secuencia de la subunidad rARNs (SSU O 18S) de los nematodos es ocurrentemente

única para el phylum porque las secuencias están disponibles para un gran número de

especies identificadas y conocidas a través de la diversidad filogenética, en este trabajo se

utilizaron los primers tomando en consideración estudios realizados por otros investigadores.

➢ Protocolo 2

Este corresponde al kit Soil DNA. En la siguiente figura se observa la amplificación

de la banda que corresponde a la muestra de tejido vegetal (lechuga), ya que este tejido sirvió

como refugio durante la incubación de los nematodos, debido a que el tejido de la babosa se

desintegraba totalmente, esparciéndose por todo el tejido vegetal. El ADN utilizado en esta

amplificación fue extraído del kit Soil DNA de Mo BIO, lo que significa que ningún

compuesto del kit inhibió la reacción de PCR, pero es importante saber que el templado

utilizado en la master mix no puede ser mayor de 2 μl ya que si se utiliza una cantidad mayor

la reacción de PCR se inhibiría. No se amplificó el ADN del tejido de la babosa enferma ni

de los 1000 nematodos, posiblemente la cantidad de templado no era la adecuada y esta

reacción fue inhibida. Se utilizó la pequeña subunidad ribosomal ARN (SSU). Dicho gen es

un MOTU para identificar nematodos del suelo, por ello se utilizaron estos primers en el

trabajo ya que C. elegans presenta un ciclo de vida libre.

 ➢ Protocolo 3

Corresponde al utilizado por Floyd en 2002 para extraer ADN de los nematodos. En

la siguiente figura se observa que este gel amplificó los productos de PCR con primers

específicos y con el programa NEMATOCA. El ADN que se observa en los carriles 2, 3, 4 y

5 se extrajo de 3, 6, 10 y 1000 nematodos respectivamente con el método utilizado (Floyd,

2002) y modificado en este trabajo. Es importante saber que la cantidad de templado utilizado

en la master mix fue de 4μl ya que si se utiliza un cantidad menor o mayor a ésta la banda no

amplifica. La banda tiene un tamaño de 1000 pb. Estos ensayos también se realizaron para

estandarizar una técnica de extracción de sus nematodos desde el método de extracción en el

papel hasta la lisis de la pared del microorganismo, ya que era importante obtener un buen

ADN para que compuestos como el tritón, el NaOH y el HCl no inhibieran la PCR.
 V. Conclusiones

● El proceso más óptimo para la extracción del ADN del E. coli es lisis celular,

ya que este proceso rompe las membranas y así liberar los componentes

celulares.

● Los tres protocolos de extracción de ADN del nematodo sirvieron para obtener

buenas cantidades de este producto. El mejor protocolo utilizado en este trabajo

para la obtención de un ADN de alta calidad fue el utilizado por Floyd con tres

nematodos ya que se ha empleado la técnica de lisis para dicha extracción.

 VI. Referencias bibliográficas

BIOTED. (s.f.). EXTRACCIÓN ADN BACTERIANO. Recuperado de.

https://www.bioted.es/protocolos/EXTRACCION-ADN-BACTERIANO.pdf

Concepto. (2021). Ácidos Nucleicos. https://concepto.de/acidos-nucleicos/

Lopez, J. M. (2017). Método de extracción de adn en nematodos para su aplicación en el

diagnóstico por técnicas moleculares.Silo.Tips. https://silo.tips/download/metodo-de-

extraccion-de-adn-en-nematodos-para-su-aplicacion-en-el-diagnostico-po

Maceto Celemín, B; Becerra, D. C.; Rodríguez Villamizar, F. (2009). Identificación

molecular de un nematodo parásito de la babosa plaga Derocera reticulatum (müller

1774). Revista Tumbaga 1(4)149-167