Interchangeable Roles for E2F Transcriptional Repression by the Retinoblastoma Protein and p27KIP1– Cyclin-Dependent Kinase Regulation in Cell

Cycle Control and Tumor Suppression

Introducción.

En mamíferos, la transición de fase de G1-S está controlada por las fuerzas opuestas de las cinasas dependientes
de ciclina (CDK) y la proteína de retinoblastoma (pRB).
El control a de la detención del ciclo celular mediante la regulación pRB-E2F y p27-CDK.
Al introducir un alelo mutante puntual de pRB que es defectuoso para la represión de E2F (Rb1G) en un fondo
nulo de p27KIP1 (Cdkn1b-/-), tanto la represión transcripcional de E2F como la regulación de CDK se ven
comprometidas.
En estos Rb1G / G doble mutante; los ratones Cdkn1b-/- son viables y los ratones Rb1-/- fenocopia en el
desarrollo de adenocarcinomas pituitarios, a pesar de que ninguna cepa mutante es propensa al cáncer.
La pérdida combinada de la regulación transcripcional pRB-E2F y p27KIP1 conduce a un control proliferativo
defectuoso en respuesta a varios tipos de daños en el ADN.
Rb1G/G; Cdkn1b-/- fibroblastos se inmortalizan más rápido en cultivo y con mayor frecuencia que cualquiera de
los genotipos mutantes individuales.

Michael J. Thwaites et al 1
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Introducción.

La regulación del ciclo celular es fundamental para mantener la homeostasis celular y prevenir el desarrollo de
cáncer.
La división celular de los mamíferos se controla principalmente en la transición de fase G1-S, y el momento de
compromiso a menudo se describe como el punto de restricción.
El compromiso de ingresar al ciclo celular está controlado por dos fuerzas opuestas, la familia de proteínas de
retinoblastoma (incluida pRB), que bloquea la entrada, y las quinasas dependientes de ciclina (CDK), que
impulsan el avance a la fase S.
La proteína RB antagoniza la entrada de la fase S reprimiendo los genes regulados por E2F necesarios para la
replicación del ADN.
Trabajando en oposición a pRB están las CDK, en particular las quinasas asociadas a ciclina D y ciclina E, que
fosforilan e inactivan los reguladores aguas arriba de la entrada del ciclo celular, incluidos pRB y p27KIP1, así
como estimulan la activación de los efectores aguas abajo de la replicación del ADN.
Si bien esto sugiere que las CDK controlan pRB, un gen objetivo clave es reprimido por pRB-E2F es CCNE1,
que codifica la ciclina E, y esto crea un ciclo regulador por el cual la ciclina E / CDK2 se vuelve máximamente
activa casi al mismo tiempo que pRB se fosforila al máximo finalmente lanza todos los E2F

The biology of cancerRobert A. Weinberg. 2

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Objetivo.

Identificar una relación única entre pRB-E2F y el control de p27-CDK y

ofrecer evidencia in vivo de que pRB es capaz de controlar el ciclo
celular a través de efectos independientes de E2F.

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Metodología.
Métodos de cultivo celular.

Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) se derivaron de

embriones E13.5.
Se cultivaron células asincrónicas utilizando métodos estándar en medio
Eagle modificado por Dulbecco que contenía suero bovino fetal al 10%
(FBS), L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U / ml y estreptomicina 50 g /
ml.
Las células sometidas a privación de suero se cultivaron en el medio
descrito anteriormente, excepto que solo contenía FBS al 0,1%.

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Metodología.
Inducción de daño al ADN

Los MEF sometidos a radiación gamma se colocaron en placas a baja densidad.

Al día siguiente, se cambió el medio antes de la exposición a una fuente de cobalto
60 hasta que se recibió una dosis de 15 Gy.
El medio se cambió nuevamente a la mañana siguiente, y las células se cosecharon
48 h después del tratamiento.
Las células tratadas con cisplatino y H2O2 se colocaron en placas a baja densidad
en el pase 4 y luego al día siguiente se cambiaron a medio que contenía el fármaco
indicado a una concentración de 1 M para cisplatino y 250 M para H2O2.
Las células se incubaron en el medio que contenía el fármaco durante 48 h antes de
la cosecha para aplicaciones posteriores.

Michael J. Thwaites et al 5
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Metodología.
Análisis del ciclo celular.

Las células se pulsaron con BrdU en diferentes condiciones de crecimiento:

• Cultivo asincrónico
• Suero privado
• Estimulado con suero
• Diversas fuentes de daño en el ADN durante un período de 2 h.

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Metodología.
Cuantificación de ARNm.

Se aisló ARN bo utilizando el reactivo TRIzol

Los niveles de ARNm de p27 se analizaron mediante qRT-PCR utilizando
la supermezcla verde iQ Sybr (Bio-Rad) y los siguientes cebadores contra
p27 y gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH):
• p27 Fwd (5 = AGATACGAGTGGCAGGAGGT 3 =)
• p27 Rev (5 = ATGCCGGTCCTCAGAGTTTG 3 =)
• GAPDH Fwd (5 = GCACAGTCAAGGCCGAGAAT 3 =)
• GAPDH Fwd. (5 = GCCTTCTCCATGGTGGTGAA 3 =)
Los niveles de expresión se normalizaron a actina.
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Metodología.
Ensayo 3T3.

MEF se sembró en placas a una densidad de 1,106 células por placa de cultivo de 10 cm en medio
Eagle modificado por Dulbecco que contenía suero bovino al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 50
U / ml y estreptomicina 50 g / ml.
Tres días después del enchapado, las células se contaron y se volvieron a colocar a la misma
densidad.
El aumento de la población se calculó de acuerdo con la fórmula: log10 (recuperado / sembrado) /
log10 2.
Las células se consideraron inmortalizadas con éxito si el crecimiento de la población era positivo al
final de los 20 pasajes.

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Metodología.
Análisis de interacción de proteínas y Western blot.

Los extractos nucleares se prepararon a partir de MEF.

Los anticuerpos generados contra p27 (C-19; sc-528) y la histona H3 (ab70550) se usaron para el
Western blot.
Los complejos que contienen pRB fueron inmunoprecipitado de extractos de células enteras usando
anti-E2F3 C-18 (Santa Cruz) unido a perlas de G-Sepharose (GE Healthcare).
Las IP se balancearon durante 1 hora a 4 ° C y luego se lavaron dos veces con tampón de lavado IP
(Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 2 mM, NP-40 al 0,1%) y se hirvieron
en SDS-PAGE muestra de tampón.
Las muestras se transfirieron mediante técnicas estándar. PG2 (Upstate) detectó E2F3, G3-245 (BD
Pharmingen) detectó pRB y se detectó actina con el anticuerpo monoclonal AC-74 (Sigma).

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Metodología.
Análisis fenotípico de animales.

Se han descrito Cdkn1b / ratones (B6.129S4-Cdkn1btm1Mlf / J) previamente y se

obtuvieron del Laboratorio Jackson y se genotiparon.
Los ratones Rb1G / G se genotiparon.
Todos los animales fueron alojados y manipulados según lo aprobado por el
Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.
Los ratones fueron monitorizados para el desarrollo de tumores.
Los ratones fueron sacrificados en el punto final natural.
Para los experimentos de daño en el ADN, las madres embarazadas en el día 13.5 de
gestación fueron sometidas a 10 Gy IR seguido de un pulso de 2 h de BrdU 4 h
después del tratamiento con IR.

Michael J. Thwaites et al 10
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Metodología.
Ensayos de actividad de la quinasa CDK2.

Los extractos nucleares se centrifugaron a 14,000 rpm durante 30 minutos para separar la proteína de los restos
celulares.
La proteína (250 g) de cada muestra se prefiltró durante 1 hr utilizando Dynabeads que giraban a 4 ° C. Luego,
las muestras se dividieron por la mitad y se incubaron durante una hora con Dynabeads previamente unido con
IgG o anti-CDK2 (Millipore).
Los complejos se lavaron dos veces con tampón de lavado IP (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, MgCl2 1,5
mM, EDTA 2 mM, NP-40 al 0,1%) y dos veces con tampón de quinasa (Tris 50 mM, pH 7,5, MgCl2 10 mM,
ditiotreitol 1 mM) y luego resuspendido en 49.1 de tampón de quinasa que contiene 4 g de histona recombinante
H1 (Santa Cruz).
El ATP radiomarcado con 32P (10 Ci) se incubó con inmunoprecipitados durante 20 minutos a 30 ° C, seguido
de ebullición en tampón SDS-PAGE para detener la reacción.
Luego, las muestras se procesaron en un gel al 15%, se tiñeron con Coomassie para verificar la carga, y se
secaron y se expusieron a una placa fosfosensible para determinar la incorporación de 32P.

Michael J. Thwaites et al 11
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Resultados.

Aumento de la expresión de p27 en

REF1G / G MEFs privados de suero.
Inmunotransferencia
Los
Las
En
PCR
Se fibroblastos
células
las se reestimularon
decondiciones
realizó transcripción
Western de
se
de extractos
privaron
para
inversa
cultivo
blot para nucleares
de
entrar en donde
(qRT-PCR) la aislados
suero,
el ciclo celular.
evaluar Los
detención sededeterminaron
ycultivos
usando
la MEF
de laprivados
fueron marcados
cebadores
expresión inanición delos
por
para
relativa suero
pulsos
de
de
con BrdU,
usando cosechados
anticuerpos en los puntos
generados de tiempo
contra indicados,
p27 e y analizados
histona H3. por citometría de flujo.
suero
detectar
niveles
pRB
Aunque en Cdkn1b.
lasalida
que del
relativos
y laE2F3. lasLos
células
de valores
cicloARNm de tipo
celular se
esde presentan
salvaje,
los genes
normal, pRB Rb1G
enaumento
relación
/ G yla knockout
indicados cony GAPDH.
se de
expresión sep27
Después
privaron dede la
suero privación
durante de
60 de suero
h.Rb1 de
laslacélulas los
lasde cultivos
tipo salvajeque proliferan
ydeRb1G
La
en
Las PCR
demostró
los MEF permanece
que
de Rb1 muestra
inmunoprecipitaciones
G/G igual
que
privados que suero de
anti-E2F3restringen
G/G células
presenta
se la un de
activación
transfirierontipo
defecto en la/ G
salvaje
E2F
para
de forma
reducen
durante
durante lalalaasíncrona,
entrada del ciclolos
incorporación
privación de MEF
desuero, de
lo Rb1G
bromodeoxiuridina
celular después que / G (BrdU)
de laindica demostraron
estimulación decambio
que elsérica manera un
se ve
represión
pRB. similar al de
aumento
comprometida
equivalente,
observado modesto
mientras
probablementeenque
en las células loslasniveles
Rb1 células
G/G
se deba de
, y entran
Rb1a proteína
en el ciclo
/ son
un p27
defectuosas
efecto coincidentes
celular con(Fig.
una 1A).
postraduccional
Rb1-/-
Las mutaciones
cinética similar a la de R461E y K542E
los controles knockoutcodificadas
(Fig. 1C). por el alelo
con la detención de G1 (Fig. 1E).
(Fig.
Rb1G1F).
evitan interacciones estables con E2F.
(Fig 1D)
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Resultados.

Susceptibilidad al
cáncer en Rb1G / G;
Cdkn1b / ratones.

(C)Genotipado
(A)
(D)
(B) Imágenes
Imagen
Análisis dedemacroscópicas
Rb1G
de ADN doblede
/ G tumoral
Kaplan-Meyer mutante
de y de
pituitarias
cola en
aislado
supervivencia de
adultosderatones
Rb1Gde/;de
jóvenes;
libre los genotipos
Cdkn1b
Ratones
tumor /
para
indicados
Cdkn1bmouse.
ratones en
/ (G)
de lagenotipos
losque necropsia.
demuestran pérdida
indicados.
deLas barrasdoble
de escala
heterocigosidad
Mientras enson
mutante de 1 cm. Las
el tejido
necropsias
Rb1G de estosmuestran
G/G/;Cdkn1b-/-
tumoral.
Rb1 G; Cdkn1b /ratones
ratonesrevelaron
son
un
masas tumorales
altamente
desarrollo normal,hipofisarias
propensos losalcohortes
cáncer. de
Elcaracterísticas
análisis
ratones dedobles
animales
del genotipo
mutantes con
dey la PCR
simples
deficiencia
reveló
Rb1G que
/ G; la de Rb1 / ratones
pérdida
Cdkn1b de la copia de
sucumben
tipo salvajehipofisarios
a tumores de Rb1 es omnipresente
con una en
estos tumores libre de tumor promedio
supervivencia
de 214 días

Michael J. Thwaites et al 13
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Resultados.

Para determinar si la expresión de p27 en células Rb1G / G es responsable del mantenimiento del control del
ciclo celular, las cruzas de ratones Rb1G / G con animales con deficiencia de p27 (Cdkn1b-/-).
Los ratones mutantes compuestos muestran una viabilidad al destete similar a la del genotipo Rb1G / G solo
y sin defectos anatómicos obvios, lo que sugiere que la deficiencia de la combinación de Rb1G / G y
Cdkn1b / no es diferente de cualquier mutante solo solo
Michael J. Thwaites et al 14
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Resultados.

Compuesto mutante
Rb1G / G; Cdkn1b / MEFs entran en
reposo.
(C) La actividad de la cinasa CDK2 se determinó por incubación
(B) Las células proliferantes se privaron de suero
(A)
de los Los MEF
complejos de crecimiento
inmunoprecipitados de CDK2asincrónico
aislados de los se
durante 60 hy se marcaron con pulso con
genotipos indicados de las células en condiciones de BrdU
crecimiento
marcaron
durante 2(AS)
asincrónico
por
h, seguido pulsos
de sin
y condiciones
con
tinción BrdU
para la
suero (SS).
durante
La 2 h, seguido
respuesta
incorporación de tinción
incompleta
de BrdU en para
células
y citometría la Rb1-/-
de flujo.
incorporación
Mientras
indica queseeste
realiza deunproceso
es un BrdU
cicloyasincrónico,
análisis
dependiente por
Rb1G
de citometría
pRB / que
G doble
Rb1Gdemutante;
flujo.
/ G; Cdkn1bCdkn1b -/- / son
MEF
Los niveles
exhiben
capaces de basales de
unejecutarse.
aumento incorporación
deDelcélulas
mismo fasedeS el
en modo,
BrdU para
mientras
análisis cada
la genotipo
deproliferan,
actividad de mientras
y estas células
CDK2 porprolifera
pudieron
los
activamente,
restringir
ensayos y muestra
delaIP-cinasa
entrada de laRb1G
revelan / G;
faseque
S lasCdkn1b
después de /
células
y Rb1
la
Rb1 G/G/ ytienen
privación deniveles ade
unincorporación
sueromutantes
Cdkn1b-/- nivelsimples
equivalentede
BrdU
al
también estadísticamente
de los fibroblastos
fueron capaces deelevados.
tipo
de salvaje
inhibir la
actividad de la cinasa CDK2

Michael J. Thwaites et al 15
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Resultados.

Mutante Rb1G / G; Los Cdkn1b / MEF muestran un

control defectuoso del ciclo celular en respuesta al daño
del ADN.

(B) Tinción
(C) con yoduro
Los ensayos de propidio
de cinasa (PI) de MEF
se realizaron tratados
usando CDK2con aisladas
15 Gy de de
radiación
célulasdedeionización que muestra
crecimiento asíncronoel contenido de ADN de
(AS) y después dellastratamiento
células. Loscon
(A) Los
cuadros MEF
rojos
radiación se trataron
delimitan
ionizante con
un área de
(IR). agentes
contenido que dañan
de ADN 4N, y elel ADN.
número 48 horas
representa después,delas
el porcentaje células
células en esefueron
cuadro. pulsadas con BrdU, teñidas
El análisis
y analizadas
Los MEF de delRb1
contenido
por de de
citometría ADN mostró
flujo. que ambos
Se observó Rb1G/G de
la capacidad dedoble mutación;
Rb1 G/G Cdkn1b-/-
de mutante simple y doble;
Rb1-/- Cdkn1b-/-
MEF exhiben
G/G y Cdkn1b-/- mutante único pudieron reducir la actividad de la quinasa CDK2 a niveles de fondo,
MEF una
para
alta proporción
detener
mientraselque
ciclo
Rb1de células
celular en con
G/G doble
contenido
respuesta
mutante; de ADN
alCdkn1b-/-
daño 8N, lo
del ADN, yaque
y Rb1-/- queimplica
MEF un un fuerte
defecto
solo defecto
en esta
pudieron en la
respuesta
restringir regulación
podría delalaadquisición
facilitar
parcialmente replicación
la actividad de la
del
de ADN
nuevasdespués
quinasa CDK2 del
mutaciones. daño.
Michael J. Thwaites et al 16
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Resultados.

Rb1G / G;Cdkn1b-/- MEF sufren una inmortalización rápida

en respuesta al estrés oxidativo.

(B
(A)aPorcentaje
F) El crecimiento de laque
de cultivos población de MEF deenlos
se inmortalizaron 20
genotipos
pasajes delindicados se representó en función del número de
cultivo 3T3.
pasaje.
Todos de tipo salvaje,
La inmortalización mutantecomo
se definió simple
el ycrecimiento
Rb1G/G; Laspositivo
células
Cdkn1b-/-
continuo dedoble mutante después
la población entrarondeenuna
la senescencia,
disminucióncomo
en el
lo demuestran
número las tendencias
de células en pasajes negativas
intermedios.de crecimiento.

De este análisis observamos que todos los intentos de

inmortalizar Rb1G/G; Cdkn1b-/- y Rb1-/- MEF tuvieron
éxito

Michael J. Thwaites et al 17
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Resultados.

Rb1G / G doble mutante; Cdkn1b-/-

pituitarias embrionarias exhiben
síntesis de ADN radiorresistente.

(B)
(C)
(A)LasEl secciones
porcentaje
Imágenes de células
de tejido depositivas
se tiñeron
representativas con TUNEL, y
pituitarias
las
paracélulas
E13.5 BrdU positivas
teñidas el dentro
encon lóbulo
BrdU del lóbulo
controlintermedio
deintermedio o de lade
la hipófisis se
embriones cuantificaron en los genotipos
irradiados.
pituitaria se determinó a partir de los
indicados con o sin irradiación
Las madres embarazadas .
fueron expuestas a
genotipos indicados de ratones de los
La
una regulación
dosiscontrol de E2F
de 10 Gy por pRB,
de radiación así como
ionizante 4h
grupos o irradiados.
el control
antes de CDK acon
de la inyección través
BrdUde p27, son
y se
Embriones de WT y mutante simple
sacrificaron
individualmente2 h másprescindibles
tarde. para el
mostraron
Se cortaron una reducción robusta en la
control delsecciones de tejido
ciclo celular, y ladepérdida
embriones
incorporación
para exponerde de BrdUendespués
la hipófisis del daño
desarrollo,
simultánea ambos conduce a unay las
en el ADN,
secciones según para
se tiñeron se determinó contando
detectar BrdU
insensibilidad a la señalización del daño
núcleos
El lóbulo positivos
intermedioparade laBrdU en el
pituitaria estálóbulo
del ADN
delineado y a
en de una
líneas predisposición
discontinuas. al
intermedio la hipófisis
cáncer.

Michael J. Thwaites et al 18
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Conclusiones.

• Nuestros hallazgos respaldan la existencia de un vínculo entre el control de crecimiento mediado por
pRB y la regulación de CDK que es independiente del control de transcripción de pRB-E2F.
• El defecto similar en la detención del crecimiento inducida por daño de ADN entre Rb1G/G;Cdkn1b-/- y
Rb1 implican que el control del crecimiento independiente de E2F por pRB depende de CDK regulado
por p27.
• La unión defectuosa de E2F por pRB o la pérdida de p27 se tolera individualmente en la mayoría de los
ensayos de detención, lo que sugiere que sus funciones son algo intercambiables.
• En ausencia de p27, el alelo Rb1G es aproximadamente equivalente a un nulo Rb1. En conjunto, estos
datos apuntan a una fuerte interdependencia de la regulación CDK y E2F.
• El grado de interrupción es similar a la eliminación completa de pRB, y esto implica que p27 se
encuentra rio abajo de pRB en una vía de detención del crecimiento independiente de E2F.

Michael J. Thwaites et al 19
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Conclusiones.

• pRB interactúa con más de 100 proteínas, por lo que la pérdida completa de pRB interrumpe a todos estos
socios de unión, ocultando el papel de las interacciones individuales.

• La pérdida de la represión transcripcional pRB-E2F funciona en paralelo con p27 en el control del
crecimiento y la supresión tumoral.

• La interrupción de las interacciones pRB-E2F actúa sinérgicamente con la eliminación de p27 para
provocar una pérdida de control del ciclo celular.

• La interacción entre pRB y p27 identificados en este estudio también puede proporcionar información
importante sobre la utilización de terapias dirigidas con el objetivo de restaurar el control del ciclo celular.

Jesús Pastrana 20