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Laboratorio de Biotecnología
Informe No. 2.

Grupo No. 3
Integrantes: Laura Andrea Vera Álvarez – Juan Diego Neira Vásquez
Fecha en que realizó el laboratorio: 4/08/2020

Extracción y electroforesis de ADN de microorganismos aislados de suelo de la Universidad de la

Sabana

1. Resultados obtenidos:

1.1. Adjunte la foto del gel de electroforesis (resultados entregados por el profesor) obtenido para la extracción de
ADN de 7 aislados de la clase pasada.

Imagen 1. Gel de electroforesis obtenido para la extracción de ADN de 7 aislados

2. Discuta los resultados obtenidos, ¿fue lo esperado o existen incoherencias?

2.1. Haga un esquema de la técnica de aislamiento por agotamiento usada para purificar colonias de
microorganismos en cultivo puro. Explique brevemente cada paso en el mismo esquema.

Paso 1: Se esteriliza el asa con ayuda de un mechero y se deja enfriar.

Paso 2: Se escoge una muestra de una colonia aislada de la placa de agar para posteriormente esparcirla
por la nueva placa. (Se recomienda hacer varias estrías en el primer cuadrante de la placa para obtener
un mejor resultado más adelante).
Paso 3: Se vuelve a pasar el asa a través del fuego con el fin de prevenir que se contamine.
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Paso 4: Se gira la placa 90 grados y se esparce el asa a través del área inoculada o del cuadrante 2 sin
solapar las estrías anteriores.
Paso 5: Esterilizar y dejar enfriar el asa nuevamente.
Paso 6: Repetir el paso 4 en el cuadrante 3.
Paso 7: Esterilizar y dejar enfriar el asa nuevamente.
Paso 8: Esparcir el asa en el cuadrante 4 donde se espera obtener la colonia aislada.
Paso 9: Se incuba la placa bajo las condiciones adecuadas y se observan los resultados de las colonias
aisladas.

Imagen 2. Paso1, 3, 5 y 7. Imagen 3. Paso 2.

Imagen 4. Paso 2. Imagen 5. Paso 4.

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Imagen 6. Paso 6. Imagen 7. Paso 8.

Imagen 8. Paso 9.
2.2. Describa brevemente el protocolo usado en la presente práctica, explicando el proceso que va ocurriendo en
cada paso (máximo 2 párrafos).

Para realizar el proceso de extracción del ADN se deben seguir 4 pasos básicos: la lisis celular, la
separación del ADN de desechos celulares como proteínas y lípidos, la purificación del ADN de interés
de proteínas solubles y otros ácidos nucleicos y la visualización del ADN. La lisis celular consiste en
modificar o destruir las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la membrana celular
y nuclear permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Por otra parte, la separación de ADN de los
desechos celulares consiste en separar el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y
ciclos de centrifugación; acá se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos
en medios acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos. [1]

De igual manera, la purificación del ADN de interés de proteínas solubles se da una vez se eliminan los
lípidos y las proteínas y se recupera el ADN. Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas
concentraciones de iones de sodio o amonio que “se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las
fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo
insoluble”. Finalmente, para visualizar el ADN, se hace uso de la electroforesis en gel en donde el ADN
se separa en fragmentos (u otras macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga,
permitiendo la visualización y caracterización de este. [2]
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2.3. Cuantifique de forma aproximada la cantidad de ADN que tiene en cada carril del gel, usando como referencia
el marcador de peso molecular. Discuta (máximo un párrafo).
Pista 1: Se solicita cuantificar la concentración de ADN (ng/ul), NO el tamaño de los fragmentos.
Pista 2: En la foto del gel viene la concentración de cada banda del marcador de peso molecular. Comparando la
intensidad de las bandas de su muestra versus la intensidad de las bandas del marcador de referencia, y teniendo
en cuenta el volumen que se cargó de marcador y cada muestra, se puede extrapolar la concentración.

𝑉𝑚
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝐴𝐷𝑁 = 𝑁𝐶 ∗ 𝐶𝑚 ∗ ( )
𝑉𝑀
Donde:
NC: Número de veces de aumento de la concentración
Cm: Concentración del marcador
Vm: Volumen del marcador
VM: Volumen de la muestra
Tabla 1. Concentración de ADN para cada muestra.
Muestra Kb Concentración (ng/uL)
M1 6 300
M2 10 500
M3 6 300
M4 10 500
M5 - -
M6 10 500
M7 6 300

2.4. ¿Obtiene la misma cantidad de ADN en todas sus muestras? Discuta (máximo un párrafo).

No se obtiene la misma cantidad de ADN en todas las muestras, pues en la tabla 1 se puede observar que
las concentraciones de ADN varían para cada muestra, esto también se puede corroborar con la imagen
1 donde se visualiza que la intensidad de la señal no es la misma para todas las muestras.

3. CONSULTAR:

3.1. Cuál es la importancia de adicionar beta-mercaptoetanol en el inicio de la extracción (máximo 2 párrafos).

La importancia de adicionar beta-mercaptoetanol en el inicio de la extracción radica en la forma como actúa de

agente reductor de enlaces disulfuro (Cys-S-S-Cys) a grupos tioles (Cys-SH) y agentes caótropos, que como la
urea, rompen puentes de hidrógeno [3]. Además, facilita así la desnaturalización completa y el desplegado de las
moléculas de proteína. Además, se separarán las subunidades de la proteína si es que los disulfuro las mantenían
unidas. Al tratar las muestras con mercaptoetanol, el resultado de la electroforesis mostrara las subunidades
componentes de las proteínas.

3.2. Busque protocolos para realizar extracción de ADN cromosomal directamente de geles de agarosa y
describalos (máximo 2 párrafos).
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Se manejan dos protocolos o métodos para la extracción de ADN en el gel de agarosa, uno de ellos es la
recuperación por electroelución el cual consiste en cortar el fragmento a fragmento del ADN que se quiere extraer
e introducirlo en una bolsa de diálisis con un buffer y someterlo a un campo eléctrico, extraerlo para posteriormente
purificarlo. De igual manera, otro de los métodos es realizar una electroforesis con un gel de agarosa de bajo punto
de fusión para poder cortarlo y fundirlo y retirar el gel mediante separaciones orgánicas para poder extraer el ADN
purificado. [4]

3.3. Que es y cómo se extrae el ADN plasmídico de una bacteria? (máximo 2 párrafos).

Los plásmidos son moléculas de ADN generalmente circular (recientemente se han identificado plásmidos
lineales) capaces de replicar independientemente del cromosoma. Los plásmidos usualmente se encuentran
distribuidos en bacterias (se pueden transmitir entre las distintas células bacterianas), aunque también pueden
encontrarse en algunos hongos y levaduras. Comúnmente no son esenciales, sin embargo, en casos particulares
proveen a las células ventajas selectivas que posibilitan su supervivencia. Los plásmidos son empleados en la
biotecnología y la biología molecular para clonación de AND, debido a su reducido tamaño respecto a los
cromosomas, lo cual facilita su extracción y su manipulación. Adicionalmente, sus propiedades de replicación y
conjugación contribuyen al análisis genético. [5]

Existen diversas técnicas de aislamiento de ADN plasmídico, una de las metodologías más utilizadas es el método
de extracción por lisis alcalina (se rompen las células mediante un choque alcalino y un detergente, y se precipita
el plásmido con etanol), este aprovecha las diferencias en el tamaño y superhelicidad (grado de torsión que sufre
el ADN plasmídico en contraste con el cromosoma). La mayoría de los cromosomas bacterianos, son moléculas
circulares extremadamente grandes (no presentan superenrollamiento); los plásmidos son moléculas pequeñas y
superenrolladas. Durante el proceso de extracción, se busca desnaturalizar el ADN plasmídico y cromosomal, para
posteriormente renaturalizarlo, evitando que este pueda ser atrapado por complejos proteicos, dado que el ADN
plasmídico se renaturaliza rápidamente y adquiere su conformación natural. Usando la extracción por lisis alcalina
es posible obtener entre 100-500 µg de ADN partiendo de 1.5 mL de cultivo de bacterias en fase exponencial con
un número estimado de copias entre 10 a 20 por bacteria. Así mismo, la pureza y cantidad del ADN dependerá del
tamaño del plásmido (mayor tamaño, menor cantidad y pureza de AND), número de copias del plásmido (mayor
número de copias, mayor cantidad de AND). Las cepas con elevada producción de carbohidratos deterioran la
pureza del ADN e interfieren con la actividad de las enzimas de restricción. [5]

3.4. Que es y cómo se extrae el ADN metagenómico de una muestra ambiental? (máximo 2 párrafos).

La metagenómica es el estudio de comunidades bacterianas que no pueden ser cultivadas mediante los métodos
tradicionales, siendo estos de gran importancia para su estudio [6]. Así mismo, hace referencia al análisis genómico
a partir de toda una comunidad [7]. El procedimiento consiste en aislar el material genético del organismo de
interés, extraerlo, manipularlo e identificarlo para luego reportar este gen en una librería metagenómica de la
muestra tomada.

Para la extracción del ADN se debe aislar una muestra representativa, existen los métodos físicos y los químicos,
dentro de los físicos se encuentran la congelación-descongelación o con el uso de kits comerciales,
homogeneización por base de perlas y ultra sindicación; los químicos está el SDS (dodecilsulfato sódico)
posteriormente se rompen las células de los microorganismos y se procede a cortar el fragmento extraído mediante
enzimas de restricción (endonucleasas) introduciéndose estas secciones en el vector para insertarlo en un
organismo que pueda expresar el gen de interés en condiciones de laboratorio [8].

3.5. Cuando se mide la pureza del ADN, cómo se mide y cómo se interpreta el parámetro de A260/A280? (máximo
2 párrafos).

Empleando la espectrofotometría es posible determinar la concentración y pureza de una muestra de AND, basado
en la absorbancia de un compuesto en solución a una longitud de onda dada. Así mismo, la concentración de la
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muestra de ADN se estima teniendo en cuenta la absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260 nm. Por otra
parte, la relación de absorbancias A260/280 y A260/230 se utilizan para evaluar la pureza de las muestras [9]. La
relación A260/280 es considerada muy estable (un ADN de pureza óptima tiene un valor entre 1.8-2.0). Teniendo
en cuenta lo anteriormente mencionado, un ADN de pureza aceptable tiene al menos una relación A260/280 > 1.6,
un valor por encima este número indica una posible contaminación por compuestos aromáticos como fenoles y
proteínas. Un radio A260/280 > 2.1 puede considerarse como la presencia de ARN en la muestra. [10]

3.6. Por qué se recomienda usar guantes durante el proceso de extracción de ADN (máximo un párrafo).

Los guantes deben utilizarse debido al uso del transiluminador (UVP illuminator) debido a que trabaja con luz
ultravioleta de onda media (302 nm), por lo que debe evitarse al máximo mirarla directamente durante la
visualización del ADN, además la exposición debe ser mínima por esto hay que utilizar protección para cara, ojos
y manos. [11] También deben utilizarse los guantes para la manipulación de reactivos que puedan afectar la salud
como el bromuro de etidio que es mutágeno y cancerígeno.

NOTA: Citar bibliografía de acuerdo a la rúbrica entregada.

Bibliografía

[1] Alejos, L., Arangón, M., & Romero, A. (s.f.). Extracción y purificación del ADN. Obtenido de
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
[2] Academy, K. (s.f.). Electroforesis en gel. Obtenido de https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-
dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis

[3] Maldonado-Alconada, A. M., & Jorrin-Novo, J. V. (2001). Electroforesis desnaturalizante en geles de

poliacrilamida. Análisis de proteínas de hojas de Arabidopsis thaliana. Dep. Bioquim. y Biol. Mol. Campus Univ.
Rabanales, 1-16.
[4] Contreras, J. Orfa, M. Pinilla, G. Moises, W. (1993) Comparación de métodos para la recuperación de ADN a
partir de geles de agarosa. Vol 13. N°3.
[5] Checa, A. (19 de 02 de 2018). Método: Extracción de ADN plasmídico (Lisis alcalina modificado). Recuperado
el 25 de 03 de 2020, de Conogase: http://conogasi.org/articulos/metodo-extraccion-de-adn-plasmidico-lisis-
alcalina-modificado/
[6] Henao, J. (2013) Estandarización de técnicas de biología molecular y bioinformática para la obtención de
enzimas endoglucanasas. pp(12-16).
[7] Cueto, M. De la Fuente, N. Luevanos, M. (2016) Fronteras en microbiología aplicada, Universidad Autónoma
de Cohulta. pp(5-10).
[8] Alguacil S. (2010) Metagenómica: La microbiología del futuro. Ministerio de Ciencia Innovación y
universidades.
[9] Cuantificación de Oligonucleótidos y Acidos Nucleicos por Espectroscopía de UV. (s.f.). Recuperado el 25 de
03 de 2020, de Universidad Nacional Autónoma de México: http://www.ibt.unam.mx/sintesis/cuantificacion.html
[10] Banco Nacional de ADN Carlos III. (s.f.). Programa control de calidad de muestras. Recuperado el 25 de 03
de 2020, de Universidad de Salamanca: http://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-muestras.pdf
[11] Castro, J. E. Z. (2005). Manual de técnicas básicas de biología molecular (Vol. 7). UADY.