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y Microscopía
Histología
Griego histos: tejido; logos:
estudio
Se refiere al estudio morfológico
(anatómico) auxiliándose del
microscopio.
En otras palabras histología es
sinónimo de “anatomía
microscópica”
Breve Historia
Siglo XVII
Robert Hook y Marcello Malpighi utilizaron lentes simples.
Hook denominó“célula” a las celdas observadas e identifico su
núcleo.
Malpighi es considerado “padre de la histología”
Siglo XIX
Invención del micrótomo, de las técnicas histológicas y
microscopios compuestos mas avanzados.
Teoría celular por Schleiden y Schwann.
Virchow distingue los 4 tejidos básicos
Elementos a considerar para el estudio de los tejidos
1- Obtención de la Muestra
2- Fijación
3- Deshidratación
4-Aclaramiento
5- Inclusión
6-- Corte
7-- Tinción o Coloración
8-- Montaje
1) Obtención De La Muestra
Capturar un corte
histológico o espécimen
de un animal
anestesiado o después
de la muerte.
En humanos es posible
en cirugías al extirpar
tejidos enfermos
2) Fijación
El propósito es CONSERVAR el protoplasma con
el menor grado de alteración posible. Evita la
autolisis por enzimas liberadas por el propio tejido.
ACLARADORES:
Xilol
Cloroformo
Benceno
Aceite de cedro
3) Inclusión (embebimiento)
Se coloca el tejido en un medio de inclusión
(embebimiento) y luego se prepara el bloque dejando
solidificar el medio de inclusión para tener una masa
homogénea firme que contiene el tejido incluido.
Finalidad de la inclusión:
Proporcionar un soporte rígido (bloque de tejido) para
facilitar el corte.
Medios de inclusión:
Parafina
Celoidina
4) Corte
Se Secciona el bloque de
parafina endurecida en el
MICRÓTOMO, se realizan
cortes de 3-10 µm de
espesor que pasan al
portaobjetos con albúmina
de huevo en su superficie
(para adhesión)
5) Tinción (coloración)
Requisitos:
1) Aclarar (eliminar parafina) con XILOL,
TOLUENO u otro agente aclarador
2) Pasar por concentraciones DECRECIENTES de
alcohol
Propósito:
Destacar el contraste natural y hacer más evidentes
los componentes celulares y tisulares del CORTE
6) Montaje
- Se quita el exceso de colorante lavando con agua o alcohol
(según solvente del colorante)
-Se deshidrata (alcohol en concentraciones CRECIENTES)
-Se aclara: pasar el corte por una solución con el aclarador.
-se coloca una gota de medio de montaje, esta posee INDICE
DE REFRACCIÓN IGUAL AL VIDRIO
Medio de montaje:
Bálsamo de Canadá
Coloración ROJO-ROSADO
Coloración AZUL-VIOLETA
Colorantes ácidos Colorantes básicos para
para teñir citoplasma:
teñir núcleo y algunas
Eosina
organeras
Ácido pícrico
Ácidos azoicos
Hematoxilina
Hematoxilina férrica
Cromotropo
Colorantes de anilina
Ácidos diazoicos
Azul de trípano Azur A
Rojo de tripano Azul de toluidina
Azul de metileno
Rojo neutro
Verde de Janus
Métodos de Coloración
Coloración Directa
Afinidad entre el colorante y el objeto.
Coloración Indirecta
Requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que
la coloración tenga lugar.
Coloración Progresiva
Se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo.
Coloración Regresiva
Se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto
del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo
denomina Diferenciación.
Coloración Simple
Se colorean solamente algunos elementos del preparado (núcleo,
fibras elásticas, etc.).
Coloración Combinada
Se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos
recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores
básicos y ácidos que contrastan por sus colores. Ej.: H y E
Coloración Panóptica
Es una coloración combinada realizada sucesivamente por
colorantes neutros (May- Grünwald-Giemsa).
Coloración Pancrómica
En un solo baño colorante actúan todos los colorantes
neutros que se necesiten.
Histoquímica
Campo de la investigación cuyo objetivo es la localización de
compuestos químicos ya conocidos en regiones especificas o
componentes celulares por análisis bioquímico, que producen
sustancias coloreadas insoluble. Gracias a las propiedades
químicas o físicas inherentes del tejido.
componente: Metodo:
Iones hierro Azul de Prusia (adaptación)
ADN Reacción de Feulgen
Proteoglucanos Reacción del ácido peryódico de Schiff (PAS)
Lípidos Sudán III, IV, B negro
Enzimas in vivo Sustrato + enzima = Producto coloreado
Glucógeno Carmín de Best o PAS
Métodos más modernos
Inmunocitoquímica
Basada en inmunoflourescencia de complejos antigeno-anticuerpo
Histoquímica con lectinas
Para observacion de hidratos de carbono
Radioautografia
Sustitución de una molécula determinada por su isótopo radioactivo
Hibridación in situ
Para ácidos nucleicos. Se marcan con isótopos radioactivos cadenas
monocatenarias que se unen a segmentos de las cadenas de
ácidos nucleicos.
Artefactos
Debido a la manipulación del tejido durante la técnica
histología no todos los cortes son perfectos. Una mala
manipulación durante la preparación puede llevar a
alteraciones que se llaman artefactos. Las cuales le
quitaran calidad al corte dificultando su interpretación.
• Encogimientos
• Precipitados
• Pliegues y arrugas
• Defectos de cuchilla
• Manejo poco cuidadoso
• Degeneración post-morte
Microscopio
Instrumento mas importante de la
histología que mediante un sistema óptico
de lentes aumenta varias veces una imagen.
Su utilidad depende de:
Poder de resolución (capacidad del
microscopio de separar dos puntos que
están muy unidos. Es el mas importante
porque de este depende que se vean mejor
los DETALLES
Aumento: relación entre el tamaño de la
imagen y el objeto en valores lineales. No
mejora los detalles con su incremento
oMicroscopio óptico
oMicroscopio de polarización
oMicroscopio de contraste de fases
Microscopios de luz
oMicroscopio de interferencia
visible
oMicroscopio de campo oscuro
oME de
transmisión
oMicroscopio electrónico (ME)
oME de barrido
oMicroscopio de luz UV
Microscopios de luz
invisible
Microscopia óptica (luz visible)
Es el más utilizado
Trabaja en dos etapas
Primer aumento: OBJETIVO
Segundo aumento: LENTE DEL OCULAR
El haz de luz de la fuente se concentra en un punto por el CONDENSADOR
que lo dirige a la muestra que es atravesada y llega hasta el OBJETIVO (1era
etapa)
Generalmente son 4 objetivos
Pequeño aumento x 10
Mediano aumento x 25
Gran aumento x 40
Inmersión en aceite x100
Se multiplica por el aumento que brinda el LENTE (generalmente x 10)
ENTONCES
Microscopio de interferencia
Se envían dos haces de luz que se unen en la muestra, provocando un retraso
que permite medir el grosor del espécimen