«FUNDAMENTOS DE CIENCIAS BIOLÓGICAS» ENFERMERIA

UNIVERSITARIA

UNIDAD 3
METODOS DE ESTUDIO EN BIOLOGIA CELULAR

Dra Albornoz Milva

 CONTENIDO
UNIDAD 3. Métodos de Estudio en Biología Celular
• Niveles de organización celular: Nomenclatura.
• Unidades de medida en microscopía.
• Microscopios. Métodos de observación de células y tejidos vivos: Observación in
vivo e in vitro.
• Coloraciones vitales y supravitales. Cultivos de células y tejidos. Métodos de
observación de células y tejidos post mortem.
• Toma de muestras. Fijación. Inclusión en parafina. Corte histológico. Coloración con
hematoxilina y eosina. Montaje. Concepto de acidofilia, basofilia, metacromasia.
• Técnica para microscopía electrónica: principales diferencias.
 CELULA PROCARIOTA
• NO tienen núcleo
• El ADN está compuesto por
un único cromosoma circular,
contenido en el NUCLEOIDE.
• Posee PARED CELULAR
compuesta por
peptidoglicanos y membrana
plasmática.
• FLAGELO
• PILIS
• RIBOSOMAS LIBRES
• VACUOLAS
CELULA EUCARIOTA
 TEORIA CELULAR

1. Todos los organismos consisten en una o más

células.
2. La célula es la unidad básica de la estructura de
todos los organismos.
3. Todas las células se originan únicamente a partir de
células preexistentes.
 TAMAÑO CELULAR

El tamaño de las distintas células es muy variable .

El tamaño promedio de las células varía entre 10-60x10 -
11m (1 flm = 1/1000 mm)
 COMPONENTES QUIMICOS DE LA CELULAS

Los componentes químicos de la célula pueden clasificarse en

inorgánicos (agua y sales) y orgánicos (proteínas, hidratos de carbono,
Lípidos y ácidos nucleicos).

La mayor parte de la célula está compuesta por agua (70- 80%),

mientras que casi la totalidad del resto está formado por compuestos
orgánicos (sólo alrededor del 1 % es material inorgánico).
 HISTOLOGIA

La palabra histología significa estudio del tejido, y se refiere

al análisis de la composición microscópica y las respectivas
funciones de los organismos pluricelulares
 TEJIDO

Se forman tejidos cuando las células, por lo general de distinto

tipo (especialización), se agrupan para llevar a cabo
determinadas funciones
 METODOS HISTOLOGICOS
Los métodos histológicos puede clasificarse en dos grupos, a saber: los
que se basan en la observación directa de células y tejidos vivos, y los
que analizan material muerto o inanimado.

En la zona gris intermedia se ubican las técnicas de aislamiento de los

componentes de células vivas mediante métodos de centrifugación.

Primero se describe el análisis microscópico, de importancia

fundamental para todos los métodos histológicos
El microscopio (óptico) es el instrumento
más importante en la histología
 PODER DE RESOLUCION Y AUMENTO
Poder de resolución y aumento son dos conceptos empleados para determinar la
utilidad de un microscopio.

PODER DE RESOLUCIÓN (D):es la distancia mínima entre dos puntos del objeto
que pueden ser visualizados separados por el respectivo objetivo.

AUMENTO: se define como la relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño

del objeto en valores lineales.
 MICROSCOPIO ELECTRONICO
Con el microscopio electrónico, se logra un muy notable incremento del aumento y el poder de
resolución.

En principio, se debe a que se reemplaza la luz visible, de longitud de onda de alrededor de 500
nm, por un haz de electrones de longitud de onda del orden de 0,005 nm.

Las lentes de un microscopio electrónico están compuestas por bobinas electromagnéticas.

La formación de la imagen en el microscopio electrónico se debe, sobre todo, a la dispersión

de los electrones
 OTROS TIPO DE MICROSCOPIOS
Microscopio de campo oscuro
Microscopio de contraste de fase
Microscopio de luz polarizada
Microscopio de interferencia
Microscopio de fluorescencia
Microscopio de barrido confocal
Microscopio de luz ultravioleta
microscopio electrónico de transmisión
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
Microscopio de barrido de efecto túnel (MBET) y microscopio de fuerza
atómica (MFA)
Difracción de rayos X
CULTIVO DE CELULAS Y TEJIDO
El cultivo de tejido es un importante método para el estudio de poblaciones celulares vivas
fuera del organismo. El método se menciona a menudo como cultivo in vitro, dado que se
refiere a tubos de ensayo o frascos de vidrio (Iat. vitro,vidrio), a diferencia de in vivo, es decir, en
el organismo vivo.

El cultivo de tejido se clasifica en tres categorías:

1) El cultivo de células comprende el de células aisladas, no organizadas en un tejido.

Las células pueden transportarse a frascos nuevos con medio de cultivo a medida que crece su
número.

2) El cultivo de tejido comprende la transferencia de un trozo de tejido embrionario

3) El cultivo de órganos comprende el explante de órganos embrionarios o maduros (totalmente

desarrollados), ya sea como órganos completos o sus partes. Se intenta mantener la estructura
del órgano y sus funciones normales, además de su posible evolución ulterior
 CULTIVO DE CELULAS Y TEJIDO
Las primeras células de mamíferos observadas en estado vivo fuera del
organismo fueron las sanguíneas.

Después de agregar el medio nutritivo, es posible mantener las células en un

cultivo en suspensión, donde flotan en el medio, o pueden transferirse a una
superficie de vidrio o de plástico, al que se adhieren. Sobre esta superficie
crecen las células y forman una capa única, denominada monocapa.

La composición del medio nutritivo es de importancia crítica para el éxito del

cultivo de tejido.
TIPOS DE TINCIONES
 Tinción vital y supravital
Algunos colorantes relativamente inocuos son captados en forma selectiva por determinadas
células vivas.
En consecuencia, la localización del colorante puede utilizarse para detectar estas células o
determinados orgánulos, a los que se une el colorante después de ser captado. Así también es
posible identificar algunas sustancias intercelulares.
 TINCIÓN VITAL
Para la tinción vital se inyecta el colorante en el animal vivo.
Se introducen en el organismo mientras las células aún se encuentran vivas. Para
conseguir el efecto deseado, el colorante usualmente se utiliza en soluciones muy
diluidas que van entre 1:5.000 a 1:50.000. Ej: Azul de Metileno
 TINCIÓN SUPRAVITAL
Para la tinción supravital se agrega el colorante a las células o el tejido vivo
después de su extracción del organismo.
Involucra el coloreo de células o estructuras que han sido removidas de su
contexto biológico.
Tincion supravital utilizada en
hematología, para el recuento de
reticulocitos. Su fundamento se
basa en que el colorante se
absorbe y el ARN se precipita
como una sustancia
reticulofilamentosa visible en los
eritrocitos como unos gránulos
amorfos intracelulares que se
tiñen de un color azul profundo.
PREPARACIÓN E INVESTIGACIÓN DE TEJIDOS MUERTOS

Para estudiar las estudiar las células y

tejidos se utiliza con mucha mayor
frecuencia el tejido muerto, que se
mantiene mediante acciones químicas
inmediatamente después de extraído y
se corta en secciones muy delgadas,
denominadas cortes histológicos.
 TECNICA
HISTOLÓGICA

Obtención de la Muestra
1) FIJACIÓN
2) DESHIDRATACIÓN
3) ACLARACIÓN
4) INCLUSIÓN
5) CORTE
6) REHIDRATACIÓN
7) COLORACIÓN
8) MONTAJE
OBTENCION DE LA MUESTRA
 PREPARACIÓN DE TEJIDOS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA

FIJACIÓN: Las células se matan con la fijación para detener los procesos celulares dinámicos
con la mayor rapidez posible y mantener la estructura con las mínimas modificaciones
factibles. Esto se logra por agentes químicos denominados FIJADORES (FORMALDEHÍDO Y EN
ESPECIAL EL GLUTARALDEHÍDO)

La fijación también produce la inactivación de algunas de las enzimas celulares que de otro
modo iniciarían la auto digestión o autolisis y conducirían a la degeneración post mórtem

EVITA LA AUTOLISIS
 PREPARACIÓN DE TEJIDOS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
INCLUSIÓN Y CORTE. El tejido fijado se corta en secciones delgadas que permiten el paso de la
luz. La mayoría de los preparados para microscopia óptica tienen un espesor de alrededor de 1-
10 pm, para lo que se requiere un micrótomo, instrumento similar, en principio, a una
cortadora de fetas.

Es necesario incluir antes el tejido en un material, por lo general parafina

 PREPARACIÓN DE TEJIDOS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA

TINCIÓN. Los cortes de tejido se montan sobre portaobjetos y se tiñen.

La mayoría de los colorantes histológicos se utilizan en solución acuosa, por lo que los cortes
incluidos en parafina deben ser "desparafinados" mediante un tratamiento con xileno y
rehidratados por pasajes por concentraciones decrecientes de alcohol en agua antes de ser
teñidos.

Los cortes por congelación pueden teñirse inmediatamente después de seccionados.

 PREPARACIÓN DE TEJIDOS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
El método de tinción más utilizado es la combinación de HEMATOXILINA Y EOSINA (HE), que
tiñe los COMPONENTES NUCLEARES DE AZUL VIOLÁCEO, mientras que LAS ESTRUCTURAS
CITOPLASMÁTICAS ADQUIEREN UNA TONALIDAD ROJIZA

La tinción histológica es un procedimiento químico y se ha producido un gran desarrollo en los

métodos que informan sobre la composición química de las células y los tejidos.
ACIDOFILIAY BASOFILIA
 METACROMASIA

Cuando se tiñen ciertos componentes tisulares, por

ejemplo la matriz cartilaginosa, con el colorante azul de
toluidina, se modifica el color azul original a púrpura o
rojo violáceo por unión con el tejido. Esta variación
cromática se denomina metacromasia(gr. meta, variación;
kroma, color) y los colorantes capaces de sufrir esta
transformación se denominan colorantes
metacromáticos.

Pertenecen a este tipo de agentes ciertos colorantes

básicos, de los cuales los más importantes son los
derivados tiazÍnicosazul de toluidina y tionina.
 PREPARACIÓN DE TEJIDOS PARA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Para la fijación, suele utilizarse glutaraldehído, por lo general seguido de tetróxidode osmio.

Después de la fijación, se deshidrata y se incluye el tejido con resinas epoxi y distintos

materiales plásticos, que adquieren gran dureza después del secado y permiten la sección
de CORTES ULTRAFINOS, SE NECESITA UN ULTRAMICRÓTOMO.

Después de la sección, los cortes ultrafinos se montan sobre una pequeña rejilla de cobre,
denominada "grilla",
Microscopia
electrónica