Técnicas Histológicas

Microscopia
 Técnicas histológicas
• Histología: Estudio del tejido, análisis de la
composición microscópica y las funciones de los
organismos pluricelulares.

• Técnicas histológicas: Pasos necesarios para

obtener las muestras aptas para su observación.

-Células y tejidos vivos (cultivos)

- Material muerto o inanimado.
 Un poco de Historia…
• Antonie Van Leewenhoek (1632-1723): inventor del microscopio.

• Marcello Malpighi (1628- 1694) Fundador de la histología

• Hooke (1635-1702): Descubrió que el tejido vegetal está formado por

pequeñas cámara o celdas a las que llamo células.

• 1838: Teoria celular ( reino vegetal)

• 1839: Teoria celular ( reino animal)

Célula: Elemento fundamental del organismo, los cuales están formados

por agrupaciones de las mismas.
 Técnicas Histológicas
• Tejido: Agrupación de células (de distinto tipo),que
llevan a cabo determinadas funciones.
Células + matriz extracelular
4 tejidos básicos: - Epitelial
- Conectivo
- Muscular
- Nervioso
• Organos: Unidades funcionales mayores
compuestos por distintos tipos de tejidos.
 ESTUDIO DE MUESTRAS VIVAS:
IN VIVO

ESTUDIO DE MUESTRAS MUERTAS

IN VITRO
 Estudio ‘’In vivo’’
No requiere fijación o inclusión

• Examen en fresco:
- preparaciones húmedas: organismos acuáticos.
Gota de liquido entre porta y cubre.
- gota pendiente: portaobjetos excavado para
evitar compresión de microorganismos
- examen en fresco con nigrosina: bacterias
incoloras
 Estudio ‘’In vivo’’
• Coloración vital
- permite mejor observación con colorantes
- no tiñe, se acumula.
- ej; azul de metileno
 Estudio ‘’IN VITRO’’
Procedimiento para observación en
MOC
 Técnicas histológicas de rutina
Preparación del tejido para MOC

1) Obtención del tejido:

- Biopsia: .punción-aspiración con aguja fina (2mm diam)
.Trucut. Biopsia quirúrgica abierta con aguja gruesa
(diagnostico de enfermedades hepáticas)
. Excisional: extirpación completa
. Inciscional: extirpa parte de la lesión
- Necrocirugía.

- Raspado (Citología exfoliativa).

La muestra debe procesarse lo antes posible para evitar la

degeneración que ocurre luego de la extracción.
2) Fijación:
Objetivo: Mantener la estructura del tejido con las mínimas
modificaciones posibles .

- Frena en el metabolismo celular.

- Estabilidad de las proteínas.
- Inactivación de enzimas que inician la autodigestión.
- Eliminar microorganismos patógenos.

Puede ser Química: Formalina, Formol 10%, Formaldehído 5%

Física: Congelación. Aplicación de calor.

* Fijación por inmersión

* Fijación por perfusión
3) Preparación de la muestra para inclusión:
• Lavado y deshidratación: eliminar el agua del tejido. Se
pasa sucesivamente por soluciones acuosas de etanol
en concentraciones crecientes.

• Aclaramiento: Elimina el alcohol del tejido. Se usan

solventes orgánicos: Xileno- Tolueno.

En esta etapa hay riesgo de que se produzcan

artefactos por desgarros y retracciones del tejido.
4) Inclusión:
Se coloca el tejido en parafina liquida. 24hs a 56/60°C
- Disuelve los solventes orgánicos.
- Ingresa al tejido.
- Cuando se enfría, se endurece y forma el taco.
5) Corte:
• Se realiza con un micrótomo
• Corta al tejido con un espesor de 3 -10µm.
• Los cortes se montan sobre un portaobjetos de
vidrio.
6) Preparación para coloración:
• Extracción de la parafina del tejido con xileno o
tolueno.
• Rehidratación del tejido, mediante soluciones de
alcohol con concentración decreciente.

7) Tinción:
• Capacidad que tiene los colorantes, de teñir de manera
selectiva los componentes tisulares.
• Los de uso mas frecuente son hematoxilina y eosina.
• Montaje en un medio no acuoso (Bálsamo de Canadá)
previa deshidratación en alcoholes crecientes.
• Se cubre con un cubreobjetos y se etiqueta.
Coloraciones y técnicas
especiales
 LAS TINCIONES
1.Tinción directa o simple.
Requiere preparación de la muestra, fijado y tinción que
posibilita distinguir estructuras
2. Tinción indirecta o negativa.
bacteriología . se realiza una suspensión para frotis, no
en agua, sino en un colorante que inunde el campo pero
deje sin teñir a las bacterias. los colorantes usados son
nigrosina o tinta china..
3.Tinción diferencial.
más de un colorante
procesos de decoloración, lavados, tinción de Gram:
permite clasificar a las bacterias en Gram + o Gram –
4. Tinción selectiva.
Conociendo la afinidad tintorial de un tejido, se aplica un
colorante que permite diferenciarlo de otro tejido..
 Hematoxilina y eosina

• Eosina:
-Tiñe de color rosa/rojo.
- Coloración Ácida.
- Carga negativa (anión).
- Reacciona con los componentes catiónicos de las
células y tejidos. “Acidofilia”
- Los componentes de los tejidos que reaccionan con
los colorantes ácidos se denominan acidófilos.
 Eosinofilia

- Filamentos citoplasmáticos
(células musculares).

- Componentes membranosos
intracelulares y citoplasma.
(mitocondrias, REL, proteínas)

- MEC (fibras)
• Hematoxilina :

- Tiñe de color azul/violeta.

- Colorante básico
- Tiene carga positiva (catión).
- Reacciona con los componentes aniónicos de la
célula y los tejidos. “Basofilia”.
- Los componentes de la célula que se colorean con
hematoxilina se denominan basófilos.
Metacromasia
Si se tiñe un corte con una solución de un colorante básico ( azul
de toluidina), el mismo forma enlaces electrostáticos con los
componentes aniónicos y las moléculas del colorante se
acumulan donde estos grupos están mas cercanos, en
consecuencia el color se modifica ( Vira al rojo-purpura)
Tinción
 Técnica por congelación

• Se usa para biopsias intraoperatorias y tj. Adiposo.

• Rápida, permite corte sin fijación
• Menor variación estructural
• Conserva la actividad enzimática
• Se congela un trozo de tejido en nitrógeno líquido,
anhídrido carbónico o se sumerge en un liquido frió
(- 50ºC).
• Se corta en un criostato a bajas temperaturas.
• Se seca por evaporación.
 Artificios
• Estructuras del preparado que no existen en el tejido vivo,
aparecen durante el proceso de preparación.

Retracciones

Precipitados
Fijación inadecuada Normal

Plegamientos Cuchillas defectuosas

 Tinción de PAS
Reacción de PAS (Acido peryódico de shiff)
Tiñe carbohidratos y macromoléculas con abundancia de los
mismos.
Color rojo-purpura.
Se usa para detectar: - Glucógeno en las células.
- Membrana Basal.
- Fibras reticulares
 Tinción de SUDAN
• Sudan:
Luego de la fijación con formalina se realizan cortes por
congelación (se evita extraer los lípidos con los solventes
orgánicos).

- Rojo Sudan ------- Adipocitos. (Triglicéridos).

- Negro Sudan----- Vainas de mielina ( Lipoproteínas).
H-E Sudan Rojo Sudan negro
 Tinción de FEULGEN
• Feulgen: Tiñe ADN
 Método histoquímico
Permite obtener información sobre la localización de
las estructuras celulares y tisulares.
Se utilizan distintos métodos con diferentes
propiedades químicas y físicas que interaccionan con
los componentes tisulares y celulares.

Los colorantes de rutina son Hematoxilina y Eosina

 Inmunohistoquímica

Antígeno: sustancia extraña (Moléculas proteícas, polisacaridos)

Anticuerpo: proteínas que interaccionan con los antígenos.

Se basa en la interacción de un antígeno con un
Anticuerpo marcado con unas sustancia visible.
 Técnicas histológicas para ME
Preparación del tejido para ME
1)Fijación:
• Glutaraldehído: fija las proteínas.
• Tetraóxido de osmio: interacciona con los lípidos.
2) Preparación de los tejidos para la inclusión: Ídem MO
3) Inclusión: Se realiza con resinas epoxi que al secarse le dan
gran dureza, y permiten cortes ultra finos.
4) Corte: 20-100 nm. Se usan cuchillas de diamante o vidrio
5) Coloración: Se usan iones de metales pesados, que
imparten densidad electrónica.
Se busca aumentar el contraste.
Microscopia
Microscopio:
instrumento que aumenta el tamaño de una imagen y
permite ver detalles que no son posibles ver a simple
vista.

• El poder de resolución es la distancia que debe haber

entre 2 puntos del objetos para verse separados.
depende de la longitud de onda y el limite de
resolución
Ojo humano: 0.2mm (200 a 500 µm )
MO: 0.2 µm / 200nm
ME: 0.05 nm/1 nm
Microscopio Optico Compuesto
 Microscopio Óptico Compuesto
Componentes.

» Opticos: - Condensador: enfoca el haz de luz a la altura de la

muestra.
- Lente objetivo: recoge la luz que ha atravesado la
muestra. Aumenta el tamaño del objeto y lo proyecta sobre
el ocular.
- Lente ocular: examina la imagen formada por la
lente objetivo, aumenta el tamaño de la imagen y la proyecta
a la retina del operador.

» Mecánicos: - Pie
- Brazo: Tornillo macro y micrometrico
- Tubo: Lente ocular y revolver
- Platina: se coloca el portaobjetos.
- Fuente luminosa: iluminación de la muestra.
 MOC
• Limite de resolución: 0,2 µm ( pero con los preparados de rutina
rara vez es > 0,5 µm).
• Las lentes del objetivo tienen distintos aumentos ( 4, 10, 20 y 40
X).
• El lente ocular tiene un aumento de 10 X.

• Aumento total resultante: producto entre los aumentos del

objetivo y el ocular
 Tipos de MOC
De luz ultravioleta
• La longitud de onda mas corta corresponde al
espectro ultravioleta (180 a 400nm)
• Como el poder de resolución es inversamente
proporcional a la long de onda. En estos mo el
poder de resolución es mayor.
• No requiere tinción.
• La imagen se observa en fotografías etc.
De fluorescencia
• Las sustancias fluorescentes bajo acción de radiaciones
de onda corta (uv) emiten radiaciones con mayor
longitud de onda (fluorescencia)
• Este tipo de microscopia detecta sustancias
fluorescentes bajo la acción de radiaciones de onda
corta como la luz ultravioleta sobre un fondo oscuro.
• Microscopia:
-primaria: muestra fluorescente
-secundaria: muestra marcada con sustancias
fluorescentes
-inmunofluorescencia: mas común, detecta
reacciones inmunológicas
De contraste de fases

• Permite la observación de células o bacterias vivas

• La muestra tiene baja capacidad de absorción de luz
• Observación homogénea sin diferencia de
luminosidad ni observación de detalles, aprovecha
las pequeñas diferencias en los índices de refracción
de las partes de la célula
• Se utiliza en preparaciones húmedas o gota
pendiente
De campo oscuro:

• partículas pequeñas con poco contraste con el MO, o

por debajo del limite de resolución.
• La muestra se ve iluminada sobre fondo oscuro
• Por el condensador pasa un cilindro hueco de luz
• Se utiliza para microorganismos sin teñir suspendidos
en liquido: preparaciones húmedas o gota pendiente
• El objetivo recibe luz dispersa por las estructuras de la
muestra
De Polarización

• Es un MOC al que se le coloca uno o dos

polarizadores entre la fuente de luz y el
condensador. Tiene analizador entre objetivo y
ocular.
• Para sustancias birrefringentes sobre campo
oscuro
• Se utilizan en petrografia y mineralogia
• Permite identificar cristales de acido úrico en
liquido sinovial para diagnosticar Gota.
Cristales de urato
monosódico
De luz reflejada

• Se denomina moc metalográficos porque se

utilizan para observación de minerales
metálicos
• Tiene un foco de luz polarizada que incide
perpendicularmente a la superficie
 Microscopio Electrónico
El poder de resolución es 1000 veces mayor al del MOC

MET MEB
Microscopio electrónico de transmisión

- Reemplaza la luz visible (fotones) por un haz de electrones

(e-).
- Poder de resolución 0.2 nm.
• Componentes:
- Fuente de e- (cátodo)
- Ánodo (atrae los e-)
Lentes electromagnéticas:
- Lente condensadora
- Lente objetivo
- Lente proyectora
- Pantalla fluorescente
• Las partes de la muestra que han sido atravesadas por los electrones
aparecen claras
• Las partes que han absorbido y dispersado los electrones aparecen oscuras.
• No permite observación de microorganismos vivos porque el MO trabaja al
vacío.
• Técnicas: tinción negativa, congelación
Microscopio electrónico de barrido

- Los e- no atraviesan la muestra. No importa el grosor.

- La imagen se forma por la captación puntual de detalles
en la superficie del preparado.
- El preparado debe cubrirse con un metal, para darle
propiedades conductoras.
- La muestra es barrida por el haz de e-
- Los e- reflejados por la superficie ( retodispersados) y los
e- expulsados (e- secundarios), son recogidos por un
detector y procesados para formar una imagen en una
pantalla de TV.
- El PR es menor pero la imagen tiene mayor nitidez.
Imagen tridimensional.
MEB
MUCHAS GRACIAS