CITOQUIMICA

APLICADA A LA HEMATOLOGIA

Bqca. Ivan Mara Victoria

Hematologa Clnica
2013
 La citoqumica estudia la composicin qumica de la
clula y permite detectar la localizacin topogrfica
de algunos principios inmediatos: enzimas, metales
pesados, sustancias orgnicas molculas de depsito y
otras sustancias.

MORFOLOGA <-----> BIOQUMICA

Son un complemento de las tinciones hematolgicas.

Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias
inorgnicas.
As se mejora la diferenciacin celular.
Tambin sirven para el diagnstico
CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx
DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS

CITOMORFOLOGIA. 70-80%

CITOQUIMICA. 90-95%

INMUNOFENOTIPO
MAS 99-
MICROSC. ELECTRN. 100%

CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR

MUESTRAS UTILIZADAS
EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFRICA

PUNCION DE MDULA SEA

PUNCION DE GANGLIOS

LCR
 TIPOS DE TINCIONES
Se pueden clasificar en:

Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que

se pretende colorear, se pueden dividir en vitales y
no vitales.

Atendiendo al momento en el que empezaron a ser

utilizadas para el Dx hematolgico, se dividen en
tradicionales y especiales.
 TINCIONES VITALES Y NO VITALES
Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se
practican sobre clulas que estn vivas.

Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre

clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un
colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son
colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno.

Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre

clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo
del que proceden.

Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La

coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de
fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su
estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del
portaobjetos.
TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES
Colorantes cidos: tienen una especial afinidad por las
estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la
hemoglobina (eosina).

Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad por las

estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los
cidos nucleicos (azul de metileno).

Colorantes neutros: son sales de un cido y de una base

coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de
otro (eosinato de azul de metileno).

Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por

estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y
tien a aquellas sustancias que tienen un poder de
disolucin superior al del lquido empleado para preparar la
solucin colorante (Sudn III)
Tambin hay combinaciones de colorantes
que dan lugar a tinciones polcromas.

Una coloracin es panptica cuando se utilizan

sucesivamente sustancias colorantes neutras.
(May-Grnwald-Giemsa)

Y es pancrmica cuando se aplican todas las

sustancias colorantes neutras juntas (azul de
metileno, eosina, Wright)
Las reacciones citoqumicas pueden tambin
clasificarse segn el mecanismo qumico
involucrado
1-Progresivas estables: Son reacciones que
exigen un tiempo mnimo pero no un mximo.

2-Progresivas indefinidas: En estas la reaccin

contina y puede hacer ilegible el preparado o
conducir a valores errneos.

3-Fugaces: Son las que pierden color

rpidamente y no pueden conservarse mucho
tiempo.
CLASIFICACION DE LAS TCNICAS
CITOQUMICAS

CITOQUMICA CLSICA

CITOQUMICA ELCTRNICA CITOQUMICA FLUORESCENTE

INMUNOCITOQUMICA
NO FLUORESCENTE

CITOQUMICA AUTOMATIZADA
Citoqumica Clsica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse e
interpretarse con el microscopio ptico comn.

Citoqumica electrnica: Se caracteriza por ser una metodologa de elevada sensibilidad

Citoqumica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoqumica, se fijan sobre distintas

estructuras de las clulas y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores

Inmunocitoqumica no fluorescente:Se basa en la marcacin de anticuerpos con

sustancias que son capaces de dar reacciones citoqumicas intensamente coloreadas que permiten su revelacin.

Fisicocitoqumca electrofortica Permite reconocer determinados componentes

de las organelas celulares obtenidas en solucin mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un
campo elctrico y la identificacin por reacciones citoqumicas, permite identificar complejos isoenzimticos,
mientras que los mtodos citoqumicos simples revelan una enzima en bloque.

Citoqumica automatizada: Es el fundamento de la CMF que utiliza la citoqumica

fluorescente
CITOQUIMICA ELECTRONICA:
CITOQUIMICA FLUORESCENTE:

INMUNES

NO INMUNES
S
INMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTE
Inmunocitoqumica con deteccin
indirecta y enzimtica. La seccin
se obtiene de tejido previamente
fijado. Inmediantemante despus
se incuban en una solucin de
bloqueo que satura los posibles
sitios de unin inespecfica, gracias
a una alta concentracin de
protena como la albmina de suero
bovino. Tras cada paso de unin de
anticuerpos o del complejo avidina-
biotina-peroxidasa se procede a
lavar los cortes en una solucin
tamponada de fosfato (tampn
fosfato), en la que tambin van
disueltos los anticuerpos. La
reaccin de la peroxidasa convierte
unos sustratos, la diaminobencidina
y el perxido de hidrgeno, en un
producto insoluble y coloreado
visible con el microscopio tico.
CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:
Definicin de reaccin citoqumica

Es la reaccin que por el mtodo de uno o mas

reactivos qumicos: aplicados a la clula en
condiciones definidas; determina la formacin de
productos coloreados; insolubles; no difusibles;
que permiten el reconocimiento microscpico; de
sustancias o grupos qumicos definidos; en su
real ubicacin citolgica; para lo cual no deben
destruir a la clula, y si lo hacen deben
reemplazar a la sustancia identificada en su
topografa
Las finalidades primordiales

El reconocimiento y diagnostico celular

El estudio de la fisiologa y la fisiopatologa

celulares

El Dx de la patologa
ESTANDARIZACION DE METODOS EN
CITOQUIMICA
Preparacin estricta de los reactivos

Practicas permanentes de las reacciones con preparados testigos

Realizacin, la fijacin y conservacin adecuada de los preparados y

reactivos

Determinacin de tiempos exactos para cada uno de los pasos

dem de temperatura (especial para enzimas)

Tiempo y condiciones de la inmersin para la lectura

Dimetros y conservacin idneos de los elementos sobre los cuales

se lleva a cabo la determinacin
 Tres pasos fundamentales:
Fijacin: preservar las estructuras y reactividad funcional de las
clulas.

Incubacin en el medio de reaccin: como consecuencia se generan

productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado.

Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de

reaccin .

Las reacciones deben tener 3

caractersticas:
sensibilidad, especificidad y
reproductibilidad.
 Pueden ser reconocibles.

SUSTANCIAS RECONOCIBLES: ENZIMAS RECONOCIBLES

1-DNA Y RNA. 1-MIELOPEROXIDASAS (MPO)

2-PROTEINAS. 2-FOSFATASA ALCALINA (FAL)
3-HEMOGLOBINA. 3-FOSFATASA ACIDA (FAC)
4-HIDRATOS DE CARBONO. 4-ESTERASAS (EST)
5-LIPIDOS. 5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO
6-FOSFOLIPIDOS. RESISTENTE (FAC-TR)
7-METALES 6-DEHIDROGENASAS (DH)
 CITOQUIMICA CLASICA
reconocimiento por:
principios no enzimticos principios enzimticos
Hidratos de carbonos: PAS MPO

Fe hemosidernico: PERLS FAL

Lpidos: Red Ol/Sudan Black FAL

Hemoglobina fetal: elucin acida ESTEARASAS

CATALASAS
ENZIMAS HIDROLITICAS
TINCIONES CLASICAS

1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO
ENZIMATICOS
TINCIN DE PAS
(Peryodic Schiff Acid)
Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los
carbohidratos por la accin del cido perydico, potente
agente oxidante, liberndose grupos aldehdo que al
combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de
color rojo prpura intenso.

-C-C- ALDEHIDOS PURPURA

ACIDO PERYODICO SCHIFF

RESULTADOS: clulas (+) con patrn difuso fucsia
intenso, lacunar y granular de acuerdo a la progenie

Serie granulocitica normal: (+) difusa en toda la serie

mieloide

Basfilos: (+) con patrn lacunar o () hasta un 50%

Serie eritroide normal: negativa

Serie megacariocitica normal: (+) en plaquetas con un

patrn difuso mas granular o bloques

Precursores linfoides: (-), hasta llegar a linfocito en el

que un 30% es (+) en corona de grnulos
NEUTROFILO Y ERITROBLASTOS NORMALES
MEGACARIOCITOS Y PLAQUETAS NORMALES
LINFOBLASTOS LEUCEMICOS PAS (+)
LMA6 en MO PAS (+)
 TINCION DE PERLS
Se basa en la liberacin de los iones frricos de su
unin con las protenas por la accin del cido
clorhdrico; dichos iones frricos al reaccionar con
el ferrocianuro potsico dan un precipitado azul
verdoso de ferrocianuro frrico.

Por esta reaccin se detecta el Fe hemosidernico, que

es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que
es hidrosoluble.
Sideroblastos en anillo
Reflejando una anormalidad
en la acumulacin de Fe en
las mitocondrias
(azul de Prusia)
HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN
 En el estudio del Fe medular hay que valorar
conjuntamente 3 parmetros:
n de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe
macrofgico.
Bsicamente se presentas 3 patrones:
1) n sideroblastos alto y Fe de depsito aumentado: es
frecuente hallarlo en estados anmicos que cursan con
sobrecarga frrica.

2) n sideroblastos bajo y Fe de depsito disminuido o

ausente: es el patrn caracterstico de la anemia
ferropnica pura; de aparicin muy precoz en un balance
frrico negativo.

3) n sideroblastos bajo con acmulo de Fe en los

macrfagos medulares. Este patrn disociado es propio de
entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los
macrfagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los
eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.
 Hemocromatosis
(cortes histolgicos de
hgado)
HEMOGLOBINA FETAL
Test de Kleihauer-Betke
La hemoglobina fetal (HbF o 22) es cido y lcali
resistente. Por consiguiente, sometiendo un
preparado fresco de sangre a una elucin cida
ser arrastrada la hemoglobina A y retenida la
fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce
por la coloracin de estos ltimos.

Los hemates con hemoglobina fetal se colorean con

eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina
A han sido reducidos a sus membranas vacas y
aparecen como sombras.
Esta prueba se usa para determinar si hay GR
del feto en una mujer embarazada con un
grupo sanguneo Rh(-).
SUDAN BLACK / RED OIL

Ambas se utilizan para la deteccin de lpidos,

en el caso del Sudan Black este tie los
fosfolpidos y esteroles de membrana de los
grnulos.

Es un colorante lipofilo que se une de forma

irreversible a un componente granular indefinido
en los granulocitos, en los eosinofilos y en algunos
monocitos.
 El producto de
la reaccin es
negro y
granular

Tie tanto los grnulos azurfilos

inespecficos como los especficos
de los neutrofilos
LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tincin de
las clulas en maduracin y de los grnulos de
los eosinofilos anormales.
2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS
ENZIMATICOS
MIELOPEROXIDASA
La demostracin citoqumica de esta enzima se
basa en la accin oxidante de la peroxidasa sobre
un sustrato (bencidina) en presencia de perxido
de hidrgeno, apareciendo un precipitado azul en
el lugar del citoplasma en donde se ha producido
la reaccin.

BENCIDINA

H2O2
MPO
Resultados.
siempre patrones granulares!
ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS (etanol)

GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : (+) patrn granular intenso en

toda la serie granuloctica mieloide y en menos del 3% de los blastos en
MO. Los blastos mieloides dan un patrn caracterstico polar, en casquete.

EOSINFILO (+) en la membrana granular, el fondo del granulo

conserva la coloracin parda.

BASFILO (+) en 50%

LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS

MONOCITOS: (+) patrn granular escaso o disperso

NORMALES..
PATOLOGICOS
 ESTRES OXIDATIVO
Scorificacin de MPO en granulocitos:
Se categorizaron los neutrfilos de acuerdo al contenido de
grnulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4,
en orden creciente.
Grado 1: Escasas granulaciones teidas
Grado 0: Sin granulaciones teidas. (fig. 1 y dispersas (fig.3 y 4)
2)
Grado 2: Regulares granulaciones sin Grado 3: abundantes granulaciones teidas en
cubrir el ncleo (fig. 5) todo su citoplasma sin llegar a cubrir
completamente el ncleo. (fig.6 )
Grado 4: granulaciones que cubren la clula completamente dndoles un
aspecto de casquete. (fig.8 y 9)
 FOSFATASA ALCALINA
La FA es una fosfomonoesterasa que es activa francamente a
ph alcalino y acta sobre grupos esteres fosforados liberando
el ion fosfato.

La actividad de la FA granuloctica es marcadora de la

granulacin especifica de los neutrfilos.

Inicialmente se pens que la FA estaba localizada en grnulos

especficos (secundarios), pero se demostr que esta asociada
con un componente membranoso del citoplasma identificado
como una estructura tubular de forma irregular distinta de los
grnulos 1 o 2 y de otras organelas citoplasmticas.
 Alfa-naftil fostato
ph alcalino
FAL

naftilo fosfato
Colorante
diazoico
Compuesto diazotado
Cuidados:
Efectuar la reaccin en frotis de no mas de 24 hs.
Conservar los preparados en heladera envueltos en
papel absorbente con un desecador.
Ph de la reaccin
 Se encuentran actividad FA en
. algunas clulas maduras y
semimaduras de la
granulopoyesis neutrofilica
(segmentados y bandas)

La actividad granulocitica de la FA se
manifiesta en forma de un
precipitado de color pardo negruzco
localizado en el citoplasma
 ndice de actividad de FAL
Es la suma de los grados de positividad de 100
neutrfilos.
Score: 95+/-20
Grado 0: sin reaccin

Grado I: coloracin difusa o con pequeos puntos coloreados

Grado II: mayor densidad cromtica, por lo general en la zona del hilio nuclear.

Grado III: mayor granulacin oscura, tie todo el citoplasma.

Grado IV: completamente oscuro

 Su mximo inters se centra en el estudiode
los sndromes mieloproliferativos: LMC valores
muy bajos o nulos. Su determinacin es muy til
para establecer el diagnstico diferencial
entre LMC y reacciones neutroflicas
secundarias que cursan con valores
elevadsimos.
Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna
Hipofosfatemia hereditaria.
 FOSFATASA ACIDA
Se basa en la hidrlisis del substrato
naftol-AS-Bi-fosfato.

La aplicacin prctica del estudio de la FA se refiere sobre

todo al estudio de los sndromes linfoproliferativos
crnicos (LPC) y leucemia aguda linfoblstica (LAL), dnde
existe una buena correlacin entre el tipo de positividad y
el fenotipo de membrana.
 FAC LT(+) Y LB (-)

El 90% de las LAL de origen T dan una reaccin + intensa de localizacin

centrosmica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores
elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa
actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.
 Tricoleucemia: Tincin fosfatasa cida (+) tartrato resistente

LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN

MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.
ESTEARASAS
Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar
una variedad de esteres alifticos u aromticos
en condiciones neutras o cidas.
Se distinguen tres tipos:
Esterasa especfica para lnea granuloctica
Esterasa monoctica
Esterasas comunes: son expresadas por varias
clulas hematopoyticas
 La demostracin citoqumica de las esterasas
leucocitarias se basa generalmente en la habilidad de
reaccionar con el grupo ester del Naftol AS.

Los sustratos para las esterasas de uso comn en

hematologa incluyen:
Naftol AS-D Cloroacetato
Naftol AS-D acetato ( NASDA)
-Naftil acetato
-Naftil butirato

Estos sustratos al ser hidrolizados en presencia de una

sal diazoica dan un precipitado insoluble en el lugar de
la reaccin.
CLOROACETOESTEARASA (CEA)
SUSTRATO ESPECIFICO: Naftol AS-D Cloroacetato
Es una esterasa que muestra una actividad especfica
para la lnea granuloctica.
Aparece ontognicamente posterior a
mieloperoxidasa por lo que es menos sensible para
los blastos muy inmaduros.
Los eosinoblastos que son positivos para peroxidasa
no muestran actividad para esta reaccin.
Las lneas monoctica, eritroide, linfoide y
megacarioctica son negativa.
 NAFTOL AS-D ACETATO ( NASDA)

Detecta las 3 esterasa: granulocticas: N, Eo, Ba

Monoctica comunes

La esterasa granuloctica es resistente a la inhibicin con

Fna mientras la monoctica es sensible al FNa.

Las esterasas comunes tienen un comportamiento variable

frente al FNA.

Los precursores de la lnea eosinofila son normalmente

negativos sin embargo la LMA M4 Eo es consistentemente
positiva a esta reaccin ( inv 16).
-NAFTIL ACETOESTERASA (ANAE)

Detecta las esterasas monoctica y esterasas

comunes.
Las esterasas granulocticas son normalmente no
reactivas.
El patrn observado en las esterasas monocticas es
difuso moderado a intenso y sensible a la inhibicin
con
FNa.
Las esterasas comunes muestran diferentes grados
de sensibilidad al FNa y presentan patrones de
reaccin granular o focal.
-Naftil butirato

Es el sustrato especfico para las esterasas

monoctica pero a pesar de su aparente
especificidad no es recomendado por el Comit
Internacional de Hematologa por su costo
EN RESUMEN..
Granulocitos Linfocitos Monocitos Plaquetas Eritrocitos

Mb Lbl Mbl Mg Pq PEbl

Seg Lin Mon GR

PAS

Fe

MPO

FAL

FAC

ANAE

NCAE

Sudan
Black
Progenie linfoide normales (-) Hasta llegar al linfocito donde un
30% es (+) en corona de
grnulos
Linfoblastos leucmicos (+) Positividad en mazacotes
Serie roja normal (-) Serie roja anormal (+) [LMA6]
Serie granulocitica (+) difusa

PAS en neutrofilos con un

patrn difuso
 Reaccin de PAS, mdula
sea. Grnulos gruesos en el
citoplasma de los
linfoblastos.
LMA6 (eritroide) MO PAS: todos los precursores eritroide
contienen glucgeno, nunca los normales.
 La demostracin citoqumica se basa en la hidrlisis
de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos
productos intermedios que combinados con una sal
diazoica dan un precipitado coloreado.